Submitted by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2017-03-16T14:11:57Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Reprodução Não Autorizada.pdf: 47716 bytes, checksum: 0353d988c60b584cfc9978721c498a11 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2017-03-16T14:12:14Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Reprodução Não Autorizada.pdf: 47716 bytes, checksum: 0353d988c60b584cfc9978721c498a11 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2017-03-16T14:15:32Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Reprodução Não Autorizada.pdf: 47716 bytes, checksum: 0353d988c60b584cfc9978721c498a11 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-16T14:15:32Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Reprodução Não Autorizada.pdf: 47716 bytes, checksum: 0353d988c60b584cfc9978721c498a11 (MD5) Previous issue date: 2016-06-24 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The Bothrops asper is one of the main species of Central America because of its medical importance in countries such as Panamá and Costa Rica, where they cause a high number of accidents. A great number of basic phopholipase A2 (PLA2s, EC 3.1.1.4) this species have been characterized, but a few number of studies have been carried out with acidic isoforms. Moreover, as the snake venom is a rich source of bioactive, the investigation of the biotechnological potential is required. Therefore, from the B. asper venom, this study shows three main lines of research: the caracterization of novel PLA2s isoforms; the study of PLA2s in poisoning pathophysiology and the study of potential antiparasitic of PLA2s. The snake venom was fractionated on three chromatographic methods that have proved effective in purification: ion exchange, hydrophobic interaction and reversed phase, giving rise to nine PLA2, four acidic (BaspAc-I, BaspAc-II, BaspAc-III e BaspAc-IV) and five basic (BaspB-I, BaspB-II, BaspB-III, BapsB-IV e BaspB-V). The molecular weight was determined by mass spectrometry (MALDI-TOF) showed values ranging between 13.8 and 14.3 kDa. The isoelectric point of the acidic PLA2 were determined by 2D SDS-PAGE, showing pI values between 4.6 and 5.0. The N-terminal sequence of nine PLA2 was determined, and 05 are new [four Asp49 (BaspAc-I, BaspAc-II, BaspAc-III and BaspAc-IV) and one Lys49 (BaspB-II)]. The enzymatic activity and the evaluation of the preferred substrates by PLA2 Asp49 was performed using fluorescent phospholipids which was observed that, among the tested phospholipids, acid PLA2 catalyzed all substrates, however, the basic PLA2 showed the highest specificity for phosphatidyl glycerol and phosphatidic acid. A discussion about the role of acidic PLA2 in case of poisoning by snake bite is performed based on myotoxicity assay. Moreover, it is demonstrated the antiparasitic action of these molecules, since the acidic PLA2 (BaspAc-I, BaspAc-II, BaspAc-III and BaspAc-IV) showed effects against epimastigote and pomastigotes forms of Trypanossoma cruzi and Leishmania infantum respectively. On the other hand, the basic PLA2, BaspB-II and IV-BaspB showed activity against Plasmodium falciparum. Furthermore, for the first time it demonstrated the synergistic action between Lys49 and Asp49 PLA2s against the malaria parasite, demonstrating that these molecules might be important targets in the development of new therapeutics. Keywords: Snake Venoms, Bothrops Asper, Phospholipase A2, Venomics, Synergism in Parasiticide Action / A serpente Bothrops asper é uma das espécies mais importantes da América Central, principalmente, por sua importância médica em países como Panamá e Costa Rica, onde causam um número elevado de acidentes. Diversas fosfolipases A2 (PLA2s, EC 3.1.1.4) básicas desta espécie já foram caracterizadas, porém poucos estudos foram realizados com as isoformas ácidas. Além disso, sendo o veneno de serpente uma rica fonte de bioativos, faz-se necessária a investigação de seu potencial biotecnológico. Desta forma, a partir do veneno de B. asper, o presente trabalho teve objetivos principais: a caracterização de novas isoformas de PLA2s, o estudo das PLA2s na fisiopatologia do envenenamento e o estudo do potencial antiparasitário das PLA2s. Para tanto, o veneno foi fracionado em três métodos cromatográficos que se mostraram eficientes na purificação: troca iônica, interação hidrofóbica e fase reversa, dando origem a nove PLA2 isoladas, quatro ácidas (BaspAc-I, BaspAc-II, BaspAc-III e BaspAc-IV) e cinco básicas (BaspB-I, BaspB-II, BaspB-III, BapsB-IV e BaspB-V). As massas moleculares foram determinadas por espectrometria (MALDI TOF) com valores variando entre 13,8 e 14,3 kDa. Os pontos isoelétricos das PLA2s ácidas foram determinados por 2D-SDS-PAGE com valores de pI variando entre 4,6 e 5,0. A sequência N-terminal das nove PLA2s foram determinadas, sendo observado que dentre as nove, 05 são inéditas [quatro Asp49 (BaspAc-I, BaspAc-II, BaspAc-III e BaspAc-IV) e uma Lys49 (BaspB-II)]. A atividade enzimática e a avaliação dos substratos preferenciais das PLA2s Asp49 foram realizadas utilizando-se fosfolipídeos fluorescentes e observou-se que, dentre os fosfolipídeos testados, as PLA2s ácidas catalisaram a degradação de todos os substratos, entretanto, para a PLA2 básica houve preferência para o fosfatidilglicerol e ácido fosfatídico. Uma discussão a respeito do papel das PLA2s ácidas no envenenamento ofídico é conduzida com base no ensaio de miotoxicidade. Ademais, é demostrado a ação antiparasitária dessas moléculas, já que as PLA2s ácidas (BaspAc-I, BaspAc-II, BaspAc-III e BaspAc- IV) tiveram ação contra as formas epimastigotas de T. cruzi e formas promastigotas de L. infantum e as PLA2s básicas BaspB-II e BaspB-IV apresentaram atividade contra Plasmodium falciparum. Posto isto, pela primeira vez, foi demonstrado a ação sinérgica entre uma PLA2 Lys49 e uma PLA2 Asp49 contra o parasita da malária, demonstrando que estas moléculas podem ser importantes alvos no desenvolvimento de novos terapêuticos.

Submitted by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2017-10-19T13:15:55Z No. of bitstreams: 2 Tese - Edailson A. Correa.pdf: 7761566 bytes, checksum: 1872d5e4f92092f139b776f75cc18e5e (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2017-10-19T13:16:10Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Edailson A. Correa.pdf: 7761566 bytes, checksum: 1872d5e4f92092f139b776f75cc18e5e (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-10-19T13:16:10Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese - Edailson A. Correa.pdf: 7761566 bytes, checksum: 1872d5e4f92092f139b776f75cc18e5e (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2016-06-08 / Venom components from snakes of the Bothrops genus have a wide range of biological actions that are not yet fully identified or understood. Of these compounds, phospholipases A2 have shown different potential for biotechnological applications. The objectives of this study were to isolate and biochemically and biologically characterize a Lys49 phospholipase A2 from Bothrops neuwiedi urutu venom. The protein was obtained with an elevated degree of purity after two chromatographic steps, the first being anion exchange (DEAE column) and the second reverse phase in a C18 column. The degree of purity and relative molecular mass were assessed by SDS-PAGE, obtaining a typical molecular mass of an svPLA2 of approximately 14 kDa, which was later confirmed by Mass Spectrometry, obtaining a mass value (m/z) of 13,733 Da. Analysis of the phospholipase activity, carried out on the substrate 4N3OBA showed that the isolated PLA2 is enzymatically inactive. The analyses using the Edman degradation method and that of the peptide fragments allowed for the identification of 108 of the toxin’s amino acid residues; high identity was observed with other phospholipases present in the venom of other species of snakes of the Bothrops genus. The data confirmed that it is a novel PLA2-Lys49 isoform from B. n. urutu venom, called BnuTX-I. The modeling in the dimeric form of the molecular structure of the toxin showed about 99.15% homology with PLA2-homologue 1 from Bothrops jararacussu (PDB code: 3I03) and identified the tertiary structure and active site. Biological assays in murine models revealed that both BnuTX-I and the venom were able to induce edema and myotoxic responses. Hemorrhagic activity was only observed for the venom. The antimicrobial and parasitic assays with the venom and BnuTX-I showed, mostly, the growth inhibition of P. aeruginosa strains and L. amazonensis promastigote forms with a CC50 of 22.91 μg/mL and a selectivity index (SI) of 0.44. As for the cytotoxic effects of BnuTX-I in murine macrophages, the toxin presented cytotoxicity at different concentrations (μg/mL), and the production of IL 1β cytokines was observed. The results allowed for the identification and characterization of a new myotoxin isoform with potential for future biotechnological applications. / Os componentes do veneno de serpentes do gênero Bothrops apresentam uma variada gama de ações biológicas ainda não completamente identificadas ou esclarecidas. Dos compostos, as fosfolipases A2 vêm demonstrando diferentes potenciais para aplicações biotecnológicas. Os objetivos deste estudo foram isolar e caracterizar bioquímica e biologicamente uma fosfolipase A2 Lys49 do veneno da serpente Bothrops neuwiedi urutu. A proteína foi obtida com elevado grau de pureza após duas etapas cromatográficas, sendo a primeira de troca aniônica (coluna DEAE) e a segunda de fase reversa em coluna C18. O grau de pureza e a massa molecular relativa foram avaliados por SDS-PAGE, obtendo-se uma massa molecular típica de svPLA2 de aproximadamente 14 kDa, que foi posteriormente confirmada por Espectrometria de Massa obtendo-se o valor de massa (m/z) de 13.733 Da. A análise da atividade fosfolipásica, realizada sob o substrato 4N3OBA, mostrou que a PLA2 isolada é enzimaticamente inativa. As análises pelo método de degradação de Edman e dos fragmentos peptídicos permitiram a identificação de 108 resíduos de aminoácidos da toxina, sendo observada elevada identidade com outras fosfolipases presentes no veneno de outras espécies de serpentes do gênero Bothrops. Os dados confirmaram tratar-se de uma isoforma inédita de PLA2-Lys49 do veneno de B. n. urutu, denominada BnuTX-I. O modelamento, na forma dimérica, da estrutura molecular da toxina mostrou homologia com cerca de 99,15% com a PLA2-homóloga 1 de Bothrops jararacussu (código PDB: 3I03), bem como a identificação das estruturas terciária e do sítio ativo. Os ensaios biológicos mostraram, em modelos murinos, que tanto a BnuTX-I quanto o veneno foram capazes de induzir respostas edematogênica e miotóxica. A atividade hemorrágica foi observada somente para o veneno. Os ensaios antimicrobianos e parasitários realizados com veneno e BnuTX-I mostraram majoritariamente a inibição do crescimento das cepas de P. aeruginosa e de formas promastigota de L. amazonensis com CC50 de 22,91 μg/mL e com índice de seletividade (IS) de 0,44. Quanto aos efeitos citotóxicos, da BnuTX-I sobre macrófagos murinos, observou-se que a toxina apresentou citotoxidade em diferentes concentrações (μg/mL) e produção de citocinas IL 1β. Os resultados possibilitaram a identificação e caracterização de uma nova isoforma de miotoxina com pontecial para futuras aplicações biotecnológicas.

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-09-19T12:25:23Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Pedro Henrique Alves - 2016.pdf: 2763667 bytes, checksum: ed46b206ebbbad30bdfc2a13fa22abab (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-09-19T13:13:54Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Pedro Henrique Alves - 2016.pdf: 2763667 bytes, checksum: ed46b206ebbbad30bdfc2a13fa22abab (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-19T13:13:55Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Pedro Henrique Alves - 2016.pdf: 2763667 bytes, checksum: ed46b206ebbbad30bdfc2a13fa22abab (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2016-03-22 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Goiás - FAPEG / The proline-riche-oligopeptides (PROs) were identified in the crude venom of snakes Bothrops jararaca (Bj), Bothrops cotiara (Bc) and Bothrops fonsecai (Bf). Previous studies have shown hypotensive/antihypertensive effects of the PROs in normotensive and hypertensive (SHR) rats. However, the direct effect of PROs in the aorta and heart isolated, as well as, the action mechanisms involved in these effects is unknown. In the presenty study, were evaluated the cardiovascular effect of six PROs, Bj-PRO-5a,-7a,-10c, Bc-PRO-10e, Bf-PRO-10d,-10f. The aortic rings, with (E+) or without (E-) endothelium, were preconstricted with phenylephine (Phe, 0.1 μmol/L), following increasing concentrations of PROs (0.1 nmol/L – 1 μmol/L) in presence or absence of a nonselective antagonist muscarinic receptors (Atropine, 3µmol/L), M1 muscarinic receptor antagonist (Pirenzepine, 1 µmol/L), synthase nitric oxide inhibitor (L-NAME, 1 µmol/L), adenylyl cyclase inhibitor (MDL 12.330A, 3 µmol/L), guanylyl cyclase inhibitor (ODQ, 3µmol/L) or argininosuccinate synthetase inhibitor (MDLA, 1 µmol/L). To evaluated the coronary and cardiac contractility effects of PROs, the hearts were perfused according Langendorff technique. The hearts were perfused for a basal period with Krebs Ringer solution containing the PROs (0.05 or 5 nmol/L) in presence or absence of L-NAME (10 nmol/L), ODQ (200 nmol/L) or MDL (1 µmol/L). The PROs utilized in this study induced endothelium-dependend vasorelaxation in aortic rings of Wistars and SHRs. Atropine and pirezenpine blocked the vasorelaxant effect of Bj-PRO-7a in isolated aorta from Wistar and SHR. L-NAME, ODQ or MDL inhibited the aortic vasorelaxation induced by Bj-PRO-7a and Bj-PRO-10c in both strains. MDLA inhibited the Bj-PRO-10c-induced vasorelaxation in aortic rings of SHR, but not in Wistar. Just the peptides Bj-PRO-7a and Bj-PRO-10c promoted a significant coronary vasodilatation in isolated heart from Wistar and SHR rats. The coronary vasodilatation induced by Bj-PRO-7a was inhibited in the presence of L-NAME in isolated heart from Wistar. Already in isolated heart from SHR this effect was abolished by L-NAME, ODQ or MDL. The Bc-PRO-10e and Bf-PRO-10f did not induce significant effects on cardiac contractility. However, the Bj-PRO-5a, -7a, -10c and Bf-PRO-10f promoted negative inotropic effect in the isolated hearts from Wistar and/or SHR. This effect in isolated hearts perfused by Bj-PRO-7a was inhibited in the presence of L-NAME in Wistars. Differently, the effect of Bj-PRO-10c was blocked by L-NAME, ODQ or MDL in both strains. Sumarizing, the PROs utilized in this study induced endothelium-dependend vasorelaxation. The data demonstrated participation of pathways NO/GCs/GMPc and AC/AMPc in the vasorelaxant effect of peptides Bj-PRO-7a and Bj-PRO-10c. In addition, the muscarinic receptors are involved in the vasorelaxant effects induced by peptide Bj-PRO-7a in aortic rings from Wistar and SHR rats. Moreover, the negative inotropic effect induced by Bj-PRO-7a and Bj-PRO-10c is linked with activation of NO in cardiomyocyte of normotensive and hypertensive rats. / Os oligopeptídeos ricos em prolina (PROs) foram identificados no veneno bruto das serpentes Bothrops jararaca (Bj), Bothrops cotiara (Bc) e Bothrops fonsecai (Bf). Estudos anteriores demonstram que os PROs promoveram efeitos hipotensor/anti-hipertensivo em ratos normotensos e espontaneamente hipertensos (SHR). No entanto, os efeitos diretos dos PROs em aorta e coração isolado, bem como, os mecanismos de ação envolvidos nestes efeitos são desconhecidos. No presente estudo, foram avaliados os efeitos cardiovasculares de seis PROs, Bj-PRO-5a, Bj-PRO-7a, Bj-PRO-10c, Bc-PRO-10e, Bf-PRO-10d e Bf-PRO-10f. Os anéis de aorta com (E+) e sem endotélio (E-) foram pré-constritos com fenilefrina (Phe, 0,1 µmol/L), seguido de concentrações cumulativas dos PROs (0,1 nmol/L – 1 µmol/L) na presença ou ausência de um antagonista não seletivo dos receptores muscarínicos (atropina, 3 µmol/L), antagonista do receptor muscarínico M1 (pirezenpina, 1 µmol/L), inibidor da óxido nítrico sintase (L-NAME, 3 µmol/L), inibidor da adenilato ciclase (MDL12,330a, 3 µmol/L), inibidor da guanilato ciclase (ODQ, 3 µmol/L) ou inibidor da argininosuccinato sintetase (MDLA, 1 µmol/L). Para avaliar os efeitos dos PROs na coronária e contratilidade cardíaca, os corações foram perfundidos de acordo com a técnica de Langendorff. Os corações foram perfundidos por um período basal com solução Krebs Ringer contendo os PROs (0,05 ou 5 nmol/L) na presença ou ausência de L-NAME (10 nmol/L, ODQ (200 nmol/L) ou MDL (1µmol/L). Todos os PROs utilizados neste estudo induziram vasorelaxamento dependente do endotélio em anéis de aorta de ratos Wistar e SHR. Atropina e pirenzepina bloquearam os efeito vasorelaxante do Bj-PRO-7a em aorta isolada de ratos Wistar e SHR. L-NAME, ODQ e MDL inibiram o vasorelaxamento induzido pelo Bj-PRO-7a e Bj-PRO-10c em ambas as linhagens. O MDLA inibiu o vasorelaxamento induzido pelo Bj-PRO-10c somente em anéis de aorta de SHRs. Somente os peptídeos Bj-PRO-7a e Bj-PRO-10c promoveram uma vasodilatação coronariana em corações isolados de ratos Wistar e SHR. A vasodilatação coronariana induzida pelo Bj-PRO-7a foi inibida na presença de L-NAME em corações de ratos Wistar. Já em corações isolados de SHRs este efeito abolido por com L-NAME, ODQ ou MDL. O Bc-PRO-10e e Bf-PRO-10f não induziram efeitos significantes na contratilidade cardíaca. No entanto, o Bj-PRO-5a, Bj-PRO-7a, Bj-PRO-10c e Bf-PRO-10f promoveram efeito inotrópico negativo em corações isolados de ratos Wistar e/ou SHRs. Este efeito desencadeado pelo Bj-PRO-7a foi inibido na presença de L-NAME em corações isolados de Wistar. Diferentemente, o efeito do Bj-PRO-10c foi bloqueado pelo L-NAME, ODQ ou MDL em ambas as linhagens. Sumarizando, os PROs utilizados neste estudo induziram vasorelaxamento dependente do endotélio. Os dados demonstram a participação das vias NO/GC/GMPc e AC/AMPc nos efeitos vasorelaxantes promovidos pelos peptídeos Bj-PRO-7a e Bj-PRO-10c. Além disso, os receptores muscarínicos estão envolvidos nos efeitos vasorelaxantes do peptídeo Bj-PRO-7a em anéis de ratos Wistar e SHRs. O efeito inotrópico negativo induzidos pelo Bj-PRO-7a e Bj-PRO-10c está relacionado com a ativação do NO em cardiomiócitos de ratos normotensos e hipertensos.

Neste trabalho descrevemos o isolamento, a caracterização funcional e estrutural de uma metaloprotease hemorrágica, denominada BjussuMP-I. A proteína foi isolada da peçonha de Bothrops jararacussu por combinação de dois passos cromatográficos, utilizando filtração molecular em Sephacryl S-200, equilibrada em tampão Tris-HCl (0,01 M, pH 7,0) seguida de cromatografia de interação hidrofóbica em Phenyl-Sepharose CL-4B, equilibrada em tampão Tris-HCl (0,01 M, pH 7,6 mais NaCl 4 M) e eluída com gradiente de NaCl (4-0 M) a 25°C no mesmo tampão. BjussuMP-I é uma proteína com massa molecular de 60 kDa e pI 5,6, a qual induziu hemorragia após injeção intradérmica em camundongos, com uma dose hemorrágica mínima (DHM) de 4,5 g. A atividade hemorrágica da BjussuMP-I foi totalmente inibida após incubação com um agente quelante (EDTA), confirmando a dependência de metal da enzima para esse efeito. BjussuMP-I possui atividade proteolítica sobre a caseína e fibrinogênio e nenhum efeito sobre a gelatina. Por outro lado, demonstrou alta especificidade pela cadeia do fibrinogênio enquanto que a cadeia somente foi hidrolisada na presença de altas concentrações da metaloprotease. A protease foi ativa sobre o fibrinogênio em pH neutro e alcalino e inativada a 75 °C. A dependência de metal da enzima foi demonstrada pela inibição exercida por EDTA, EGTA e 1,10 fenantrolina. Verificou-se uma inibição parcial pelo ?-mercaptoetanol e PMSF, enquanto que leupeptina e aprotinina não afetaram a atividade fibrinogenolítica. A enzima foi ativada na presença de íons Ca++ e Mg++, sendo inibida por Mn++, Fe++, Zn++, Co++ e Ni++. Além disso, baixas concentrações da enzima produziram lise no coágulo de fibrina. BjussuMP-I também demonstrou inibição da agregação plaquetária induzida por colágeno e ADP e atividade bactericida sobre Escherichia coli e Staphylococcus aureus. Verificou-se que as atividades hemorrágica e proteolítica da BjussuMP-I foram neutralizadas pelo diterpenóide clerodane (Bt-CD) de Bacharis trimera. Também se observou uma inibição total do efeito hemorrágico, utilizando o extrato aquoso de Pentaclethra macroloba (EPema). A enzima foi reconhecida por anticorpos antineuwiedase, com uma reação de identidade imunológica parcial. A seqüência completa do cDNA da BjussuMP-I com 1540 pb codificou para uma proteína de 547 resíduos de aminoácidos, que conservou os domínios comuns a metaloproteases hemorrágicas de alto peso molecular da classe PIII: (i) pré-pró-peptideo, (ii) metaloprotease, (iii) disintegrina-símile e (iv) domínio rico em cisteína. / In this study the isolation, functional and structural characterization of a hemorrhagic metalloprotease, named BjussuMP-I is reported. The protein was isolated from Bothrops jararacussu snake venom by a combination of two chromatographic steps, using gel filtration on Sephacryl S-200 (0.01 M Tris-HCl, pH7.6 buffer) and Phenyl-Sepharose CL-4B chromatography (0.01 M Tris-HCl plus 4 M NaCl, pH7.6 buffer) followed by a concentration gradient from 4 to 0 M NaCl at 25°C in the same buffer. BjussuMP-I is a 60 kDa protein with a pI 5.6, which induced hemorrhage after intradermal injection in mice with a minimum hemorrhagic dose (MHD) of 4.5 g. The hemorrhagic activity of BjussuMP-I was totally abolished after incubation with a chelating agent (EDTA), corroborating the metal-dependence of this effect. BjussuMP-I shows proteolytic activity on casein, collagen and fibrinogen, although no effect on gelatin was observed. In addition, it presented a high specificity toward the -chain of fibrinogen, while the -chain was only hydrolyzed at high concentrations of the metalloprotease. The protease was active against fibrinogen in neutral and alkaline pH and was inactivated at 75°C. The metal dependence of the enzyme was confirmed through inhibition by EDTA, EGTA and 1,10 phenantroline. A partial inhibition was observed with -mercaptoetanol and PMSF, while leupeptin and aprotinin did not inhibit the fibrinogenolytic activity. The enzyme was active in the presence of Ca++ and Mg++ and it was inhibited by Mn++, Fe++, Zn++, Co++ and Ni++. In addition, low concentrations of the enzyme presented lyses in fibrin plate after 12 h of incubation. BjussuMP-I also displayed inhibitory effect on collagen- and ADP-stimulated platelet aggregation, as well as bactericidal activity against Escherichia coli and Staphylococcus aureus. It was reported that both hemorrhagic and proteolytic activities of BjussuMP-I were neutralized by the clerodane diterpenoide (Bt-CD) from Bacharis trimera. Full inhibition of hemorrhage was also observed by using aqueous extract from Pentaclethra macroloba (EPema). The enzyme was recognized by anti-neuwiedase antibodies in a reaction of partial immunologic identity. The complete cDNA sequence of BjussuMP-I with 1540 pb encoded open reading frames of 547 amino acid residues which conserved the common domains of P-III high molecular weight hemorrhagic metalloproteases: (i) pre-pro-peptide, (ii) metalloprotease, (iii) disintegrin-like and (iv) rich cysteine domain.

As doenças neurodegenerativas (DN), incluindo doença de Alzheimer e doença de Parkinson, estão entre as principais causas de mortalidade e morbidade nos países ocidentais. Não há ainda um tratamento definitivo para estas neuropatias, mas os estudos têm apontado para mecanismos comuns de toxicidade, que incluem disfunção mitocondrial, estresse oxidativo e apoptose. Assim, as mitocôndrias constituem alvos importantes para futuras estratégias de neuroproteção visando tratar, prevenir ou retardar a neurodegeneração. A biodiversidade da fauna brasileira representa uma fonte promissora e ainda pouco explorada de novas moléculas com (i) atividade neuroprotetora e, portanto, potencial para originar novos fármacos para o tratamento destas doenças; ou ainda com (ii) atividade neurotóxica, podendo ser utilizadas como ferramentas de estudo de mecanismos de neurotoxicidade. O presente estudo teve por objetivo investigar o possível potencial neuroprotetor e/ou neurotóxico de peptídeos de baixo peso molecular, obtidos a partir do veneno de diferentes espécies de serpentes do gênero Bothrops por meio da investigação dos efeitos destes compostos na função mitocondrial de cérebro de rato. Duas das frações estudadas (obtidas a partir do veneno da B. atrox e da B. jararaca) apresentaram um interessante potencial protetor contra o intumescimento osmótico mitocondrial e a produção de espécies reativas de oxigênio (ERO), eventos associados à transição de permeabilidade mitocondrial e à morte celular. Por outro lado, outra fração, obtida a partir do veneno da B. pirajai, apresentou potencial neurotóxico. Estes achados podem ser úteis para estudos mecanísticos e também no estabelecimento de futuras estratégias de tratamento das doenças neurodegenerativas, tendo as mitocôndrias como alvos terapêuticos (terapia alvo). / The neurodegenerative diseases, including Alzheimer\'s and Parkinson\'s diseases, are among the main causes of morbidity and mortality in Western countries. A definitive treatment for these neuropathies has not yet been found, but studies have indicated common mechanisms of toxicity, including mitochondrial dysfunction, oxidative stress and apoptosis. Therefore, mitochondria represent important targets for the future neuroprotective strategies aimed to treat, prevent or delay the neurodegeneration. The Brazilian fauna biodiversity represents a promising and under explored source of new molecules with (i) neuroprotective activity and potential to originate new drugs for the treatment of these diseases; or yet, with (ii) neurotoxic activity, representing tools to study neurotoxicity mechanisms. The present study aimed to investigate the possible neuroprotective and/or neurotoxic potential of low-molecular-mass peptides extracted from the venom of different species of Bothrops genus snakes by investigating their effects on rat brain mitochondrial function. Two of the studied fractions (from B. atrox and B. jararaca venoms) presented an interesting protective potential against both the mitochondrial swelling and reactive oxygen species (ROS) production, events associated with mitochondrial permeability transition and cell death. On the other hand, other fraction (from B. pirajai venom) presented a neurotoxic potential. These findings might be useful for mechanistic studies and also for the establishment of future strategies of neurodegenerative diseases treatment, using mitochondria as therapeutic targets (targeted therapy).

A infecção por Cryptosporidium serpentis é uma das enfermidades mais importantes em répteis e se caracteriza por infecção crônica, clínica ou subclínica, e presença de gastrite hipertrófica severa, regurgitação, perda de peso progressiva, mortalidade eventual e eliminação contínua e intermitente de oocistos em fezes. O objetivo deste estudo foi padronizar um teste imunoenzimático (ELISA) indireto para detecção de anticorpos contra C. serpentis, e acompanhar a evolução clínica, parasitológica e da resposta imune humoral em serpentes naturalmente infectadas com C. serpentis. Foram utilizadas 21 serpentes naturalmente infectadas com C. serpentis e alojadas no Instituto Butantan, São Paulo, Brasil. As análises clínica e parasitológica foram realizadas em 21 serpentes por meio do registro diário dos sinais clínicos apresentados e pesquisa mensal da eliminação fecal de oocistos, em lâminas coradas pela técnica de Kinyoun. A avaliação sorológica foi realizada mensalmente utilizando o ELISA indireto para pesquisa de anticorpos anti-C. serpentis, pelo período de 12 meses em 8 animais, 8 meses em 3 animais e 6 meses em 1 animal. O ELISA indireto foi padronizado em bloco com utilização de antígeno produzido a partir de oocistos de C. serpentis, IgY de galinha anti-gamaglobulinas de serpentes e conjugado contendo IgG de coelho anti-IgY de galinha ligada à peroxidase. Os sintomas clínicos observados foram regurgitação, inapetência alimentar e perda de peso progressiva. A análise parasitológica revelou eliminação de quantidade variável de oocistos, de forma intermitente, em todas as serpentes, com positividade de 92% (116/126). O ELISA indireto apresentou positividade em 42,9% (54/126) das amostras. Foi observada resposta imune humoral na maioria dos animais, no entanto, com presença título flutuante de anticorpos e alternância de resultados positivos e negativos, em um mesmo animal. / Infection by Cryptosporidium serpentis is one of the most important diseases in reptiles, and is characterized by chronic infection, clinical or subclinical, and the presence of severe hypertrophic gastritis, food regurgitation, progressive weight loss, mortality, and intermittent and continuous shedding of oocysts in feces. The objective of this study was to standardize an indirect enzyme immunoassay (ELISA) to detect antibodies against C. serpentis, and evaluate the clinical, parasitological and humoral immune response in snakes naturally infected with C. serpentis. Twenty one snakes naturally infected with C. serpentis and housed at the Instituto Butantan, São Paulo, Brazil, were used for accomplish clinical and parasitological analyzes of C. serpentis infection, through the daily record of clinical signs and monthly survey of fecal shedding of oocysts using Kinyoun staining technique. The serological evaluation was performed monthly using the indirect ELISA for the detection of anti-C. serpentis antibodies, for a period of 12 months in eight animals, eight months in three animals, and six months in one animal. The indirect ELISA was standardized on the basis of block titration using antigen produced from oocysts of C. serpentis, chicken IgY anti-snake gamaglobulins and a conjugate containing rabbit IgG anti-chicken IgY linked to peroxidase. Clinical symptoms consisted in food regurgitation, inappetence, and progressive weight loss. The parasitological analysis revealed intermittent fecal shedding of variable number of oocysts in all snakes, with positivity in 92% (116/126) of the samples. The indirect ELISA was positive in 42.9% (54/126) of the samples. Humoral immune response was observed in most animals, however, fluctuating antibodies levels with rotation of positive and negative results were observed in some snakes.

Descrições morfológicas são os primeiros passos para compreender a fisiologia dos organismos e seus sistemas. A biologia do desenvolvimento e a ontogenia da hematopoese de serpentes são pouco conhecidas, sendo a hematopoese embrionária inteiramente desconhecida. Os principais objetivos deste trabalho foram caracterizar o desenvolvimento e a hematopoese embrionária da serpente falsa-coral Oxyrhopus guibei (Dipsadidae: Xenodontinae) a partir da oviposição, através da análise de caracteres morfológicos externos para a classificação dos estágios de desenvolvimento embrionário, de 30 embriões com 1-3, 15, 25, 30, 45, 65 e ~75 dias de ovipostura (d.o.) (quando eclodem), e de cortes histológicos de 29 ovos (ou embriões) de 1-3, 15, 25, 30, 45, 60d.o. e de filhotes do dia da eclosão e com uma semana de nascimento para a caracterização da hematopoese embrionária. Os embriões de 1-3d.o. foram classificados entre os estágios (st.) 17 e 23, com ausência da formação ocular até a presença de olhos sem pigmentação; de 15d.o. no st. 26, com olhos pigmentados e ductos endolinfáticos calcificados; de 25d.o. no st. 31, com escamas no corpo não pigmentado e a musculatura dos flancos não fusionada na linha mediana ventral; de 30d.o. entre os st. 31 e 33, que em adição à formação descrita no período anterior, apresentam membrana palpebral completa e musculatura fusionadas na linha mediana ventral na região pré-cardíaca; de 45d.o. entre os st.34 e 36, com musculatura completamente fusionada na linha mediana ventral e começando a desenvolver um padrão de pigmentação; de 65d.o. no st. 37 (último da tabela) com o padrão de pigmentação bem desenvolvido de coral em tríades, típico da espécie, e com o dente do ovo, e com ~75d.o. os ovos eclodiram com filhotes sadios, que apresentam cicatriz umbilical e o dente do ovo permanece presente até dois dias após a eclosão. A hematopoese em ovos de 1-3 e 15d.o. foi caracterizadas como hematopoese extraembrionária, ocorrendo nos vasos das membranas extraembrionárias e na fenda vitelínica, e hematopoese intraembrionária, na região AGM (aorta gonadal mesonéfrons), principalmente no interior da artéria aorta dorsal, que continua como local hematopoético embrionário até no período de 30d.o., porém com estruturas mais diferenciadas; com 45d.o. o principal local hematopoético passa a ser medula óssea, com foco hematopoético de multi-linhagem sanguínea a partir de 60d.o., nos seios vertebrais e medula costal, constituindo o local hematopoético definitivo. Foi observada a atividade hematopoética junto ao tecido renal, com o desenvolvimento da região AGM, entre os períodos de 15 a 30d.o., o timo e baço apresentam diferenciação linfocítica, observados a partir de 30 e 45d.o., respectivamente e o fígado não apresenta hematopoese embrionária. Esta é a primeira descrição do desenvolvimento embrionário de uma serpente Caenophidia ovípara e da hematopoese embrionária de Serpentes, contribuindo para o conhecimento da fisilogia destes processos e indicando a necessidade de estudos tanto para um melhor entendimento do desenvolvimento embrionário, quanto para a compreensão da ontogenia da hematopoese das serpentes. / Morphological descriptions are the first steps to understand the physiology of organisms and their systems. Developmental biology and ontogeny of hematopoiesis of snakes are poorly known, and the embryonic hematopoiesis is completely unknown. The main goals of this study were to characterize the embryonic and hematopoiesis development of the false coral snake Oxyrhopus guibei (Dipsadidae: Xenodontinae) since oviposition. Analysis of external morphological characters regarding the classification developmental stages for developmental stages classification has been made for 30 embryos with 1 -3, 15, 25, 30, 45, 65 and ~ 75 days after oviposition days (o.d.) (when hatched), and histological sections of 29 eggs (or embryos) from 1-3, 15, 25, 30, 45, 60o.d. and one day neonates and one week after birth for the characterization of embryonic hematopoiesis. The embryos with 1-3o.d. were ranked between 17 and 23 stages (st.), with the absence of eye formation to the presence of unpigmented eyes; with 15o.d. in 26 st., with pigmented eyes and calcified endolymphatic duct; with 25o.d. in 31 st., with unpigmented body scales and muscles of the flanks not fused in the midline, with 30o.d. between 31 and 33 st., which in addition to the preceeding form, have full eyelid membrane and muscles fused at midline in the pre-cardiac region; with 45d.o. between 34 and 36 st., with muscles completely fused in the midline and beginning the development of pigmentation pattern, with 65o.d. in 37 st. (last stage of table) with the distinctive pigmentation tricolor-triad pattern , and the egg tooth, and ~ 75 d.o. health newborns have hatched, exhibiting the umbilical scar and the egg tooth up to two days after hatching. The hematopoiesis in eggs of 1-3 and 15o.d. was characterized as extraembryonic hematopoiesis, occurring in the vessels of extraembryonic membranes and in yolk clef, and intraembryonic hematopoiesis, in the AGM (gonad mesonefron aorta), mainly within the dorsal aorta, which continues as the embryonic hematopoietic site until the 30o.d., although with better differentiated structures; wth 45o.d. the bone marrow turns the main hematopoietic site, and with a hematopoietic focus of multi-lineage blood beginning in the 60d.o. at vertebral sinus and the ribs marrow, consisting the definitive hematopoietic sites. Hematopoietic activity was observed with the kidney tissue, through development of the AGM region, between the periods of 15 to 30d.o., thymus and spleen lymphocyte differentiation have been observed at 30 . and 45o.d., respectively, and the liver does not displays embryonic hematopoiesis. This is the first description of embryonic development of an oviparous Caenophidia snake and of the embryonic hematopoiesis in Serpentes, contributing to the knowledge the physiology of these processes and demonstrating the need of further studies for a better understanding of both embryonic development and the ontogeny snake.

O efeito inflamatório da jararagina, toxina hemorrágica do veneno de Bothrops jararaca, foi avaliado através de um sistema in vitro (células peritoneais murinas-MPACs) e in vivo (coxim plantar de camundongos), onde foi avaliada a produção de mRNA que codifica as citocinas TNF-a, IL-1b e IL-6 por RT-PCR e a liberação destas no sobrenadante de cultura e no local de injeção (ELISA). Além disso, o domínio da jararagina responsável pela liberação local das citocinas foi estudado. Nossos resultados mostram que a jararagina induziu a expressão de mRNA que codifica para o TNF-a, IL-1b e IL-6 em MPACs, 4 horas após o estímulo, entretanto a ação enzimática da jararagina interferiu com a detecção dstas citocinas no sobrenadante da cultura. A jararagina inibida com EDTA induziu a liberação destas citocinas no modelo in vitro (MPACs). No modelo in vivo foi verificada a liberação local de TNF-a, IL-1b e IL-6 no sobrenadante do homogenato do tecido, sendo a IL-6 a citocina liberada em maior quantidade. Tanto o domínio disintegrina/rico em cisteína, como o metaloproteinase, da jararagina, participam desta liberação. Este estudo mostrou o envolvimento direto de citocinas em um modelo inflamatório, liberadas pela metaloproteinase de veneno botrópico, em cultura de células e também no local da injeção. / The inflammatory effect of jararhagin, a haemorrhagic toxin from Bothrops jararaca venom, was evaluated in an in vitro (Murine Peritoneal Adherent Cells-MPACs) and in vivo system (mouse footpad), through the production of TNF-a, IL-1b and IL-6 mRNA (RT-PCR) and the release of these cytokines in the culture supernatant and locally at the site of injection (ELISA). In addition the domain of jararhagin responsible for the local release of cytokines was studied. Our results showed that the jararhagin can induce the mRNA expression for TNF-a, IL-1b and IL-6 in MPACs at 4 hours after treatment, however the enzymatic activity of jararhagin was found to affect the detection of the cytokines in the culture supernatant. The jararhagin inhibited with EDTA was found to induce the release of these cytokines by MPACs. Concerning the in vivo model, the local release of TNF-a, IL-1b and IL-6 was detected in the footpad homogenate. Both of the jararhagin domains, the metalloproteinase and the disintegrin/cystein rich domains play a role in this release. This study showed the direct involvment of cytokines in an inflammatory model, released by snake venom metalloproteinases in the cell culture and also locally at the site of injection.

As serpentes são um grupo altamente diversificado, encontradas em praticamente todas as regiões do planeta, ocupando diferentes ambientes. Sua diversidade adaptativa indica a grande variabilidade dos órgãos sensoriais, adaptados ao hábitat e hábitos de cada espécie. Estudos sobre o sistema visual das serpentes são escassos e tem grande importância na compreensão de caracteres ecológicos, comportamentais e filogenéticos. Nos vertebrados as informações visuais são projetadas na retina e inicialmente processadas nessa camada neural, antes do processamento que ocorre no sistema nervoso central. Os tipos de células encontradas na retina, bem como sua densidade e distribuição variam entre as espécies e determinam especializações do sistema visual. Neste trabalho foi feita uma quantificaçao comparativa de fotorreceptores e neurônios da camada de células ganglionares (CCG) de duas espécies de serpentes colubrídeas diurnas, Philodryas olfersii e P. patagoniensis. Para tanto foram utilizadas técnicas de imunohistoquímica de opsinas e de marcação de Nissl. Serpentes adultas obtidas no Instituto Butantan foram anestesiadas com tiopental (30mg/kg) e sacrificadas com CO2. Os olhos foram enucleados e as retinas dissecadas e fixadas em paraformaldeido 4%. Um olho de cada serpente foi utilizado para fazer cortes radiais e testar diferentes tipos e concentrações de anticorpos. Para a preparação das retinas planas foram utilizados o anticorpo JH455, produzido em coelhos contra opsinas sensíveis aos comprimentos de onda curto de humanos (cones S) e o anticorpo JH492, produzido em coelhos contra opsinas sensíveis aos comprimentos de onda médio e longo de humanos (cones L/M). Foi utilizado anticorpo secundário biotinilado (gt -rb biot) e a revelação feita com estreptavidina acoplada a molécula florescente CY3. Os cortes radiais e as retinas planas foram observadas em microscópio fluorescente equipado com câmara digital conectada a microcomputador dotado de programa para captura de imagens. A partir de imagens da retina obtidas com espaçamento mínimo de 0,5 mm foram feitas as contagens das células e os mapas de isodensidade celular. A densidade média dos fotorreceptores foi semelhante nas duas espécies (11.183,1 ± 1.107,4 células/mm2 em P. olfersii e 11.531,2 ± 1.054,9 células/mm2 em P. patagoniensis), assim como a proporção dos diferentes tipos de cones (3% cones S e 83% cones L/M em P. olfersii, e 5% cones S e 85% cones L/M em P. patagoniensis). As densidades de células da CCG também foram semelhantes (10.117,5 ± 1.026 células/mm2 em P. olfersii e 9.834,9 ± 2.772,2 células/mm2 em P. patagoniensis). Entretanto, os mapas de isodensidade mostraram diferentes regiões de especialização. P. olfersii apresentou uma faixa horizontal e duas areas centralis de maior densidade celular, uma na região central e uma na região caudal, indicando a melhor acuidade visual nos campos de visão frontal e lateral, o que possivelmente auxilia na locomoção e forrageamento no extrato arbóreo. P. patagoniensis apresentou maior densidade celular na região ventral e rostral, indicando a maior acuidade no campo visual superior e posterior, auxiliando na percepção da aproximação de predadores e animais maiores, importante para a sobrevivência de serpentes terrestres e possivelmente para a percepção de presas localizadas em estrato arbustivo. / Snakes are a diversified group found in almost all regions of the planet, occupying different habitats, with exception to Polar Regions, a few islands and the deeper ocean waters. Its diversity indicates the high variability of sensory organs, which are adapted to the habits and habitats of each species. Studies about snakes visual system are scarce and have a great importance for the understanding of their ecology, behavior and phylogeny. In vertebrates the visual information is projected in the retina and initially processed in this neural tissue, before its processing in the central nervous system. The different kinds of cells present, as well as its density and distribution in the retina, vary between species and determinate specializations of the visual system. In this study we compared the density and distribution of photoreceptors and neurons of the ganglion cells layer (GCL) of two diurnal colubridae snakes, the arboreal Philodryas olfersii and the terrestrial P. patagoniensis, with opsins immunohistochemistry and Nissl staining. Adult snakes obtained in Instituto Butantan were anesthetized with thiopental (30mg/Kg) and the euthanasia was done with CO2. The eyes were enucleated and the retinas dissected and fixed in paraformaldeid 4%. One eye of each species was sectioned to test different antibodies and the counting for the determination of topographic distribution of density was made in flattened wholemount retinas. In the wholemounts retinas it was utilized the antibodies JH455 produced in rabbit against human S cone opsins and JH492 produced in rabbit against human L/M cone opsins. The photoreceptors density were similar in the two species (11,1831 ± 1,107.4 cells/mm2 in P. olfersii and 11,531.2 ± 1,054.9 cells/mm2 in P. patagoniensis), as well as the proportion of the different types of cells (3% S cones and 83% L/M cones in P. olfersii, and 5% S cones and 85% L/M cones in P. patagoniensis). The GCL cells density were also similar (10,117.5 ± 1,026 cells/mm2 in P. olfersii and 9,834.9 ± 2,772.2 cells/mm2 in P. patagoniensis). However, the isodensity maps showed different specializations regions. P. olfersii showed a horizontal streak and two areae (area centralis) with higher density, in the central and in the caudal regions, indicating a better visual acuity in the lateral and in the frontal visual field, what is possibly very important for locomotion and searching for preys (foraging) in the arboreal layer. P. patagoniensis showed a higher cell density in the ventral and rostral regions of the retina, indicating a better visual acuity in the superior and posterior visual field, what is important to perceive the approaching of predators and terrestrial animals and preys located in underbushes above the snake.

Na cascavel Crotalus durissus terrificus ocorre o armazenamento de longo prazo do esperma (LTSS), no trato genital da fêmea, durante o intervalo entre a cópula (outono) e a ovulação (primavera). Peptídeos e peptidases estão entre os principais componentes que influenciam a atividade espermática em mamíferos. O presente estudo objetivou caracterizar a presença de peptidases em C. d. terrificus, com esta função reconhecida em mamíferos e/ou que clivam peptídeos atuantes nesta função, bem como avaliar a hipótese do envolvimento destas peptidases na preservação dos espermatozóides desta serpente. O aspecto morfo-funcional dos espermatozóides foi comparado na presença dos peptídeos angiotensina II (AngII), arginina vasotocina (AVT), bradicinina (BK), peptídeo promotor da fecundação (FPP) e hormônio liberador de tireotrofina (TRH). Caracterizamos os efeitos de agentes quelante, tiol-redutor, cofator e inibidores, bem como dos peptídeos supracitados, sobre as atividades enzimáticas relacionadas, quais sejam: aminopeptidases ácida (APA), básica (APB), alanil sensível (APN-PS) e insensível à puromicina (APN-PI), cistil (CAP), dipeptidil-peptidase IV (DPPIV), piroglutamil tipo 1 (PAP-I) e prolil-imino- (PIP), bem como da prolil endopeptidase (POP), em frações solúvel (FS) e/ou de membrana solubilizada (FM) do sêmen proveniente do ducto deferente, assim como deste próprio tecido e dos tecidos uterino e vaginal de C. d. terrificus, ou seja, tecidos por onde passam ou armazenam-se os espermatozóides. Verificamos a variação sazonal destas mesmas atividades, nestes tecidos, incluindo o sêmen armazenado no útero durante o LTSS. O sêmen coletado do ducto deferente foi fracionado para avaliação da distribuição destas atividades peptidásicas. Nossos dados mostraram características de liquefação do sêmen e movimento dos espermatozóides da cascavel que os diferenciam do padrão humano. FPP com cálcio e BK melhoraram a preservação da viabilidade espermática, similarmente ao que ocorre em mamíferos. Em todos os tecidos e no sêmen as atividades APB, PIP e POP foram detectadas apenas da FS, enquanto as demais estão presentes em FS e FM, seguindo um padrão de distribuição observado na maioria dos tecidos de mamíferos. Amastatina e bestatina inibiram APB e APN, enquanto a diprotina A foi o inibidor mais eficiente para a DPPIV em FM. PAP-I e PIP foram inibidas, respectivamente, por bestatina e puromicina. Este perfil de inibição também é similar ao encontrado para as aminopeptidases em tecidos de mamíferos. Todas as atividades peptidásicas foram influenciadas por algum dos peptídeos estudados, sugerindo que tais peptídeos são substratos potenciais e/ou moduladores destas atividades na cascavel. As atividades APB e APN foram caracterizadas como metalopeptidases. APB, CAP e DPPIV foram inibidas por MnCl2. CAP e PAP-I foram caracterizadas como enzimas sulfidril-dependentes. As atividades APB, APN-PI e APN-PS predominaram, em relação às demais peptidases, em todas as estações e na maioria dos tecidos e no sêmen, sugerindo sua maior relevância na fisiologia reprodutiva da C. d. terrificus. Os níveis de todas as atividades peptidásicas estudadas variaram sazonalmente, sugerindo que sua ação moduladora sobre peptídeos susceptíveis está integrada ao ciclo reprodutivo desta serpente. O fracionamento do sêmen do ducto deferente revelou a presença de fluido seminal e espermatozóides, bem como de uma estrutura prostassoma-símile, até então somente identificada em mamíferos. Em todas estas frações há atividade peptidásica, predominando a APN-PI no prostassoma-símile e no fluido seminal, e APN-PS e APN-PI na FS e FM dos espermatozóides, caracterizando um envolvimento com a redução da motilidade espermática, tal qual ocorre em mamíferos. Concluimos que as atividades peptidásicas estudadas apresentam características sazonais e tecido-específicas que sugerem uma atuação relevante na preservação dos espermatozóides de C.d. terrificus. / In the rattlesnake Crotalus durissus terrificus occurs the long-term sperm storage (LTSS), in the female tract, during the interval between mating (autumn) and ovulation (spring). Peptides and peptidases are among the main components that influence the spermatic activity in mammals. The present study aimed to characterize the presence of peptidases in C. d. terrificus, that are well-recognized to exert this function and/or that have the ability to hydrolyze peptides that exert this function in mammals, as well to evaluate whether these peptidases are related to the preservation of spermatozoids in this snake. The morphological and functional characteristics of spermatozoids were compared in the presence of angiotensin II (AngII), arginine-vasotocin (AVT), bradykinin (BK), fertilization promoting peptide (FPP) and thyrotropin-releasing hormone (TRH). We have checked the effect of chelating and thiol-reducing agents, cofactor and inhibitors, as well the effect of aforementionated peptides on related enzyme activities such as acid (APA), basic (APB), puromycin-sensitive (APN-PS) and puromycin-insensitive alanyl (APN-PI), cystyl (CAP), pyroglutamyl type 1 (PAP-I) and prolyl-imino (PIP) aminopeptidases, and dipeptidyl-peptidase IV (DPPIV), as well as on prolyl endopeptidase (POP), in soluble (FS) and/or solubilized membrane-bound (FM) fractions of semen from vas deferens, of this own tissue, and vagina and uterus tissues of C. d. terrificus, i.e. tissues where spermatozoids pass through or where they are stored. The seasonal variation of these peptidase activities, in all tissues, including the semen stored in uterus during the LTSS, were evaluated. The semen from vas deferens was fractioned in order to know the distribution of these peptidase activities. The features of seminal liquefaction and movement of spermatozoids were different between the rattlesnake and human. Similar to mammals, FPP plus calcium and BK improved the preservation of the viability of spermatozoids from C. d. terrificus. In all tissues and semen, the APB, PIP and POP activities were detected only in FS, while others peptidases were present in FS and FM, following a similar pattern of distribution usually observed in mammalian tissues. Amastatin and bestatin inhibited APB and APN activities, while diprotin A was the most efficient inhibitor of DPPIV in FM. PAP-I and PIP activities were inhibited by bestatin and puromycin, respectively. This inhibition profile was similar to that of mammalian tissues. All peptidase activities were influenced at least by one of the peptides under study, suggesting these peptides as potential substrates and/or modulators for these peptidases of the rattlesnake. The APB and APN activities were characterized as metallopeptidases. APB, CAP and DPPIV were inhibited by MnCl2. CAP and PAP-I were characterized as sulfhydryl-dependent enzymes. The APB, APN-PI and APN-PS activities were predominant, in relation to the other examined peptidases, in all seasons and in most tissues and semen, suggesting their great relevance in the reproductive physiology of the C. d. terrificus. The levels of all studied peptidase activities were seasonally variable, suggesting that their modulator actions on susceptible peptides are integrated to the reproductive cycle of this snake. The fractionation of C. d. terrificus semen revealed the presence of seminal fluid and spermatozoids, as well a prostasome-like structure, until then identified only in mammals. In all of these fractions, there are peptidase activities, predominating the APN-PI in prostasome and seminal fluid, and the APN-PS and APN-PI in FS and FM of spermatozoids, suggesting their involvement in the reduction of the spermatic mobility, such as in mammals. In conclusion, the studied peptidase activities present seasonal and tissue-specific characteristics, which suggest a relevant role in the preservation of the spermatozoids of C. d. terrificus.