Les cellules souches embryonnaires (ES) sont des cellules pluripotentes, capables de s'auto-renouveller indéfiniment dans des conditions de culture appropriées. Cela signifie que ces cellules restent dans un état prolifératif et indifferencié en culture et ont le potentiel de se différencier dans les trois feuillets embryonnaires, à savoir l'ectoderme, le mésoderme et l’endoderme, et leurs dérivés. Cette capacité à se différencier dans tous les types cellulaires, souligne la diffculté à contrôler la différenciation des cellules ES in vitro et à les guider vers un lignage spécifique. Mon projet de thèse porte sur la différenciation des cellules ES murines. Une étape importante du développement embryonnaire est le choix entre l’ectoderme et le mésendoderme. Dans ce but, j'ai développé une lignée ES qui permet de suivre exclusivement l'expression de Brachyury (T) dans le mésendoderme à l'exclusion de la notochorde: la lignée TRepV. Pour cela, jai cloné un fragment de 1 kb du promoteur murin de Brachyuryen amont du rapporteur Venus (YFP). Avant d'utiliser cette lignée, j’ai cherché à la valider. Malheureusement l'expression du rapporteur TRepV ne reproduit pas fidèlement l'expression endogène de T. Une hypothèse est que le fragment de 1kb ne contient pas tous les éléments de régulation de T nécessaires pour expression fidèle in vitro. De manière surprenante, j’ai observé que le rapporteur TRepV est exprimé de façon hétérogène dans les cellules ES non différenciées. Au cours de mon travail de thèse, je me suis intéressée à cette expression hétérogène. J'ai montré que les cellules ES TRepV+ représentent une sous-population distincte des cellules souches, qui peut être maintenue séparément exprimant le rapporteur de manère stable, à la difference d'autres gènes exprimés de manière hétérogène dans les cellules ES. Nous avons trouvé un marqueur d'une population distincte parmi les cellules ES et de nouveaux gènes impliqués dans pluripotence, qui seront abordés dans des études futures. / Embryonic stem cells (ESCs) are a powerful system to investigate developmental processes in vitro, and a promising tool to generate specific cell types for cellular therapies and regenerative medicine. ESCs are self-renewing, pluripotent cells, maintaining a proliferative and undifferentiated state in culture, while retaining the capacity to differentiate into the three embryonic lineages: ectoderm, mesoderm and endoderm, and all their derivatives. Here, I established a primitive streak specific Brachyury/T Reporter ESC line (TRepV) to investigate early ESC differentiation. In contrast to previously published Tknock-in line, we established a transgene T ESCs reporter line, in order to avoid the disruption of the T locus, which may result in a hapoinsuficient phenotype. During the validation process, I observed discrepancies in expression between the TRepV and the endogenous T locus. I followed upon these observations with a more detailed analysis and obtained evidence that T is regulated differently in the ESC system compared to in vivo development. Against expectations, I also observed heterogeneous expression of the TRepV reporter in undifferentiated ESCs. Undifferentiated ESCs were found to be a mix of TRepV+ and TRepV- cells. This finding became the focus of my studies: I found TRepV+ cells represent a distinct population of ESCs with a unique identity. Unlike other heterogeneous ESC populations (such as Stella or Nanog), TRepV+ cells do not interconvert in their fate and represent an explicit, stable subpopulation of ESCs. Finally, I performed a microarray analysis of TRepV+ and TRepV- ESCs and identifed new genes which may be involved in the regulation of self-renewal and pluripotency.

Suite à une ischémie, de nombreux acteurs moléculaires et cellulaires concourent pour promouvoir la revascularisation post-ischémique afin de limiter les lésions tissulaires. Des cellules progénitrices et inflammatoires originaires de la moelle osseuse sont notamment recrutées au niveau du tissu ischémique où elles activent et participent à la régénération vasculaire et tissulaire. Leurs capacités pro-angiogéniques et pro-vasculogéniques suscitent d’ailleurs un grand intérêt pour l’élaboration de nouvelles stratégies thérapeutiques. L’objectif de ce travail de thèse aura été d’améliorer notre compréhension des mécanismes qui régissent la mobilisation et le recrutement des cellules progénitrices originaires de la moelle osseuse et de mettre en évidence l’efficacité d’un traitement basée sur l’utilisation de cellules souches pour promouvoir la revascularisation post-ischémique. Dans un premier travail nous avons mis en évidence que les catécholamines (dopamine -DA- et norépinephrine –NE-) du système nerveux sympathique régulent la mobilisation des cellules progénitrices originaires de la moelle osseuse via une signalisation dépendante de la eNOS. Nous avons montré que la DA et la NE augmentent le nombre de cellules médullaires recrutées dans le tissu ischémique et stimulent leur différenciation en cellules à phénotype endothéliale ou inflammatoire favorisant ainsi la revascularisation post-ischémique. Le recrutement des cellules médullaires dépend également des chimiokines, et plus particulièrement de CXCL12 qui est connue pour attirer les cellules exprimant son récepteur CXCR4. Le deuxième travail de cette thèse a montré que le pouvoir chimioattractant de CXCL12 est également régulé par sa capacité à se lier aux héparan-sulfates (HS), et donc à adhérer à la matrice extracellulaire. En effet, de fortes interactions CXCL12/HS induisent une augmentation de la régénération vasculaire post-ischémique corrélée à un meilleur recrutement des cellules d’origine médullaires dans le tissu lésé.Une fois recrutées dans le tissu ischémique, les cellules souches, de part leurs capacités remarquables d’auto-renouvellement, de prolifération, de différenciation et leur activité paracrine sont d’excellents activateurs de la revascularisation post-ischémique. La troisième étude de cette thèse met en évidence l’efficacité des cellules souches embryonnaires humaines multipotentes pour traiter l’ischémie critique du membre inférieur. Nous avons également révélé que ce potentiel thérapeutique dépend du miR-21.Ces travaux ont permis de démontrer que la régulation de la mobilisation et du recrutement des cellules souches contrôle la revascularisation post-ischémique et de souligner l’efficacité d’un traitement basé sur l’utilisation de cellules souches pour promouvoir la revascularisation post-ischémique. / Following ischemia, many molecular and cellular mechanisms compete to promote post-ischemic revascularization to minimize tissue damage. Bone marrow-derived progenitor and inflammatory cells are especially recruited into the ischemic tissue where they activate and participate in vascular and tissue regeneration. Their pro-angiogenic and pro-vasculogenic capacity also generate great interest in the development of new therapeutic strategies. The objective of this thesis has been to improve our understanding of the mechanisms governing the mobilization and recruitment of bone marrow-derived progenitor cells and to highlight the effectiveness of a treatment based on the use of stem cells to promote post-ischemic reperfusion. In a first work we have demonstrated that catecholamines (dopamine -DA- and norepinephrine -NE-) of the sympathetic nervous system regulate the mobilization of bone marrow-derived progenitor cells via eNOS-dependent signaling. We have shown that DA and NE increase the number of bone marrow-derived cells recruited into the ischemic tissue and stimulate their differentiation into endothelial or inflammatory phenotype cells, which promots post-ischemic revascularization.The recruitment of bone marrow cells also depends on chemokines, and particularly CXCL12 which is known to attract cells expressing CXCR4. The second work of this thesis has shown that the chemoattractant capacity of CXCL12 is also regulated by its ability to bind to heparan sulfate (HS), and thus, to adhere to the extracellular matrix. Indeed, strong interactions between CXCL12 and HS induce an increase in post-ischemic vascular regeneration correlated with better recruitment of bone marrow-derived cells in the injured tissue.Once recruited into the ischemic tissue, stem cells, because of their remarkable capacity of self-renewal, proliferation, differentiation and paracrine activity are excellent activators of post-ischemic revascularization. The third study of this thesis highlights the effectiveness of pluripotent human embryonic stem cells to treat critical limb ischaemia. We also found that their therapeutic potential depends on the miR-21.These studies have demonstrated that the regulation of the mobilization and recruitment of stem cells control the post-ischemic revascularization and highlight the effectiveness of a treatment based on the use of stem cells to promote post-ischemic revascularization.

Les gliomes sont les tumeurs primitives les plus fréquentes du cerveau et restent de mauvais pronostic en raison de l’inefficacité des traitements actuels. Des cellules souches cancéreuses ont été isolées à partir de gliomes de haut grade de l’adulte. Ces cellules souches de gliomes (GSC) peuvent fournir tous les sous-types cellulaires qui composent la tumeur. De nombreuses données indiquent que la résistance aux traitements est due en grande partie aux GSC. Cibler les GSC et leurs propriétés souches constitue donc un enjeu thérapeutique important. [...] Une solution pertinente de ciblage thérapeutique est de forcer les GSC à quitter leur état souche. Dans ce cadre, mes principaux travaux ont eu pour but de caractériser les changements épigénétiques des marques d’histones qui accompagnent la répression des propriétés des GSC par un groupe de micro-ARN, miR-302-367. [...] L’étude de cette plasticité par notre équipe a abouti à l’identification de miR-302-367. Son expression forcée, à l’aide de lentivirus, bloque de façon irréversible les propriétés souches et initiatrices de tumeur des GSC. L’effet suppresseur de tumeur exercé par miR offre la possibilité d’identifier les mécanismes qui régulent le maintien ou la perte des propriétés des GSC. A l’aide d’un modèle formé par une lignée de GSC et de sa contrepartie dépourvue des propriétés souches et tumorigènes GSC-miR-302-367, je me suis attachée à caractériser les méthylations de l’histone H3, qui font parties du code d’histone associé à une transcription génique respectivement active ou réprimée. Je me suis axée sur la triméthylation de la lysine 4 (H3K4me3) et de la lysine 27 (H3K27me3), respectivement permissive et répressive de la transcription. Une analyse par ChIP-seq (Immunoprécipitation de la chromatine-séquençage) des gènes associés à ces marques a été associée à la caractérisation des transcriptomes des cellules par exon-array. Nos résultats montrent que l’expression du groupe de miR-302-367 ne modifie pas de façon globale les taux des marques H3K4me3 et H3K27me3. Par contre, des changements dans des groupes de gènes circonscrits ont pu être identifiés. La corrélation positive observée entre les marques d’histones et les taux d’expression des gènes montre une conservation du code d’histone dans les cellules cancéreuses, au moins pour les marques étudiées. L’analyse des termes GO (Gene Ontology) indique que la perte des propriétés induites par miR-302-367 s’accompagne d’un engagement de GSC dans une voie de différenciation. Les gènes portant la marque répressive dans les GSC-miR-302-367 participent notamment à des catégories fonctionnelles associées à l’expression de propriétés souches et tumorigènes. L’analyse du groupe de gènes portant une marque permissive dans les GSC et répressive dans les GSC-miR-302-367, a révélé un réseau de facteurs de transcription susceptible de participer au contrôle des propriétés souches des GSC. La répression à l’aide de siRNA d’un des membres de ce réseau, le facteur de transcription ARNT2, nous a permis de révéler son rôle dans le maintien des capacités prolifératives des GSC issues de gliomes distincts et dans l’expression du facteur de transcription Nanog, connu pour son rôle central dans le contrôle des propriétés souches des GSC. Nos résultats montrent que l’analyse des changements de marques d’histone offre donc non seulement une vue d’ensemble des différents réseaux moléculaires associés au maintien ou au contraire à la répression des propriétés des GSC, mais permet d’identifier de nouveaux acteurs. L’effet stimulateur d’ARNT2 sur la croissance cellulaire et l’expression de Nanog, dans des GSC dérivées de gliomes différents aux altérations génomiques distinctes, indique que ce facteur de transcription tient une place centrale, insoupçonnée jusqu’à présent, dans la hiérarchie des gènes qui gouvernent les propriétés des GSC. / Gliomas, the most frequent primary brain tumors, are resistant to current therapies and the survival rate of patients is very low. Within high-grade gliomas, a cell sub-population bearing stem-like properties has been isolated. These cells, called glioma stem cell (GSC), are capable of generating all glioma cellular sub-types. Recent data indicates that resistance of these aggressive tumors to therapies is mostly due to GSCs. Thus, targeting the GSCs and their stem-like properties is imperative in order to improve current therapies. [...] Another effective solution to treat GSCs is to force them to lose their stem-like properties. In this context, the aims of my major project were to characterize the epigenetic modifications of histone marks accompanying the loss of GSC stem-like properties under the influence of a cluster of micro-RNA, miR-302-367. GSCs are endowed with an exceptional plasticity, allowing them to gain or lose their stem-like state in response to modifications in their micro-environment. Our results identified the implication of miR-302-367 in the regulation of GSC plasticity. Its stable expression using lentivirus inhibits in an irreversible manner the stem-like and tumorigenic properties of GSC. The tumor-suppressor effect of this miR offers the possibility to decipher the mechanisms responsible for the maintenance or the loss of GSC stem-like properties. Using the model of GSC and their counterparts, GSC-miR-302-367, who lost their stem-like and tumorigenic properties, my aim was to identify the methylation status of histone H3 of the histone code which is known to be associated either to an active or to a repressive gene transcription. I focused on the trimethylation of lysine 4 (H3K4me3) and lysine 27 (H3K27me3), which are associated with an activation or repression of gene transcription, respectively. We performed a ChIP-seq (Chromatin-immunoprecipitation-sequencing) analysis of the respective associated genes followed by a transcriptomic (exon-array) analysis of both cell lines. Our results show that miR-302-367 expression does not alter in a global manner the expression levels of H3K4me3 and H3K27me3. On the contrary, we were able to detect modifications in a discrete group of genes. At least for the studied marks, the positive correlation between the identified histone marks and the gene expression levels indicates that the histone code is well preserved in cancer. GO (Gene Ontology) analysis indicates that miR-302-367-induced loss of stem-like properties is accompanied with activation of the differentiation process in GSC. Genes implicated in the regulation of stem-like and tumorigenic properties were found to bear the repressive histone mark in GSC-miR-302-367. From our analysis of the group of genes bearing the active histone mark in GSC and the repressive one in GSC-miR-302-367, emerged a network of transcription factors that could possibly participate in the regulation of GSC stem-like properties. Down-regulation using siRNA of a member of this network, namely ARNT2, highlighted its role in the maintenance of the proliferative dynamic, as well as the expression of the transcription factor Nanog (a major regulator of GSC stem-like properties), in GSC derived from distinct gliomas. Our histone mark modification analysis, not only elucidated the molecular pathways implicated in the maintenance or, on the contrary, in the loss of GSC stem-like properties, but also, highlighted the implication of new actors in these processes. The activator effect of ARNT2 on GSC proliferation, as well as on the expression of Nanog, observed in GSC bearing distinct genetic alterations and derived from different glioma, indicates that this transcription factor plays a major role, not documented thus far, in the regulation of GSC stem-like properties.

Les capacités de cicatrisation de la gencive en font un modèle de régénération tissulaire naturelle. Ces capacités sont liées en grande partie à l’activité des fibroblastes. Composante cellulaire principale du tissu conjonctif gingival, ils sont au cœur de la régulation des réponses inflammatoires et des processus de cicatrisation. Nous avons supposé que ce tissu pouvait contenir des cellules souches, pouvant expliquer en partie, ces capacités de réparation. Au cours de cette thèse, nous avons pu mettre en évidence la présence de cellules souches mésenchymateuses aux propriétés communes avec les cellules souches adultes dérivées des crêtes neurales. Ces cellules expriment des marqueurs spécifiques des cellules souches et des crêtes neurales. Par ailleurs, elles présentent des capacités d’auto-renouvellement et de multipotence. Elles sont, en effet, capables de se différencier en adipocytes, ostéocytes et chondrocytes. Nous nous sommes plus particulièrement intéressés à la différenciation chondro/endochondrale. La culture des cellules, sous forme de sphères en suspension, a permis de mettre en évidence leurs capacités de différenciation en tissus cartilagineux et articulaires. Elles s’organisent spontanément en plusieurs types cellulaires différents, générant notamment des chondrocytes hypertrophiques et des synoviocytes selon leur localisation au sein des sphères et du milieu de culture utilisé. Le comportement de ces cellules soumises à ces conditions a permis de montrer leurs facultés à reproduire, in vitro, des processus proches de ceux retrouvés au cours du développement. Ces résultats permettent une meilleure compréhension des phénomènes de différenciation des cellules souches adultes, ouvrant ainsi de nouvelles perspectives pour des applications en thérapie cellulaire articulaire et osseuse. / The healing capacity of the gingiva makes it a model of natural tissue regeneration. These capabilities are largely related to the fibroblast activity. They are the main cellular component of the gingival connective tissue and they regulate inflammatory responses and healing process. We hypothesized that this tissue could contain stem cells, which could explain, in part, these repair capabilities. In this thesis, we were able to demonstrate the presence of mesenchymal stem cells with properties shared with the neural crest-derived adult stem cells. These cells express specific markers of stem cells and neural crest. Moreover, they do have the capacity to self-renew and multipotency. They are, indeed, able to differentiate into adipocytes, chondrocytes and osteocytes. We have particularly focused on the chondro / endochondral differentiation. When cultivated as micromasses cultures in suspension, cells were able to differentiate into cartilage and joint tissues. They organize themselves spontaneously into several different cell types, including hypertrophic chondrocytes and synoviocytes depending on their location within the micromasses and the culture medium used. The behavior of these cells under these conditions has shown their ability to replicate in vitro, close to those found during the development process. These results allow a better understanding of adult stem cells differentiation, opening new perspectives for applications in joint and bone cell therapy.

La sclérodermie systémique (ScS) est une maladie rare et incurable, caractérisée par une fibrose cutanée et la production d’auto-anticorps (maladie auto-immune). Le pronostic vital est engagé dans les formes diffuses et rapidement progressives de la maladie, responsables de fibrose pulmonaire. Par leurs propriétés immunomodulatrices et anti-fibrotiques, les cellules souches mésenchymateuses (CSM) constituent une approche prometteuse pour traiter la ScS. Ce travail a pour objectif d’évaluer le potentiel thérapeutique des CSM dans un modèle préclinique de forme diffuse de la maladie (d-ScS).Patients et Méthodes : Nous avons évalué l’effet de différentes modalités d’injections des CSM par voie intraveineuse dans le modèle murin de ScS-HOCl. Ce modèle, basé sur l’injection d’acide hypochloreux (HOCl), induit un phénotype proche des formes d-ScS. Nous avons notamment comparé un traitement préventif et curatif, des approches syngénique, allogénique et xénogénique, et l’utilisation de CSM d’origine adipocytaire (ASC) à celle de CSM de moelle osseuse (CSM-MO).Résultats : Le modèle ScS-HOCl est caractérisé par l’installation d’un phénotype de d-ScS, avec fibrose cutanée, pulmonaire et production d’anticorps anti-topoisomérase 1. Nous montrons l’effet bénéfique d’une injection préventive ou curative de CSM syngéniques, réduisant la fibrose cutanée et pulmonaire. Cet effet thérapeutique passe par une diminution de la réponse immune réduisant l’inflammation tissulaire et la production d’auto-anticorps, ainsi que par l’induction du remodelage tissulaire via l’activation de métalloprotéases, et l’augmentation des défenses anti-oxydantes. Un bénéfice similaire est obtenu lors d’approches allogénique et xénogénique. Les ASC présentent des capacités immunosuppressives et de remodelage supérieures aux CSM-MO.Discussion et conclusion : Nos travaux démontrent l’effet anti-fibrotique des CSM dans un modèle préclinique pertinent de ScS, mimant les formes diffuses et rapidement progressives de la maladie, pour lesquelles les besoins thérapeutiques sont importants. Le mode d’action pléiotropique des CSM, combinant propriétés anti-inflammatoires, pro-remodelage et anti-oxydantes, est prometteur en vue des applications cliniques à venir dans cette maladie.Mots-clés : sclérodermie systémique, cellules souches mésenchymateuses, HOCl / Systemic sclerosis (SSc) is a rare intractable disease characterized by skin fibrosis and autoimmunity. Diffuse and rapidly progressive SSc (d-SSc) is associated with life-threatening involvements such as lung fibrosis, where there still is an unmet medical need. Displaying immunomodulatory and antifibrotic properties, mesenchymal stem cells (MSC) are an attractive cure for SSc. In this study, we aim at evaluating the therapeutic potential of MSC in a preclinical model of d-ScS.Patients and Methods: We evaluated the effects of MSC infusion in the murine model of ScS-HOCl, based on repeated injections of hypochlorite (HOCl). We compared several approaches using MSC in a preventive and curative approach, in syngeneic, allogeneic and xenogeneic settings, and using MSC isolated from adipose tissue (ASC) or bone marrow (BM-MSC).Results: ScS-HOCl is close to d-ScS phenotype, leading to skin and lung fibrosis, together with anti-topoisomerase 1 antibody production. We show beneficial effects of a preventive or curative injection of syngeneic MSCs, reducing tissue fibrosis. Fibrosis reduction following MSC treatment involves immunosuppressive effects, tissue remodeling via metalloprotease activation, and anti-oxydant activity. Similar benefits are observed in allogeneic and xenogeneic settings. ASC display greater immunosuppressive and remodeling capacities than BM-MSCs.Discussion and conclusion: Our study demonstrates the anti-fibrotic effects of MSCs in a relevant preclinical model of ScS, mimicking diffuse and rapidly progressive ScS. Pleiotropic capabilities of MSCs, combining anti-inflammatory, remodeling and antioxidant properties, are promising for future clinical applications in this disease.Keywords: systemic sclerosis, mesenchymal stem cells, HOCl

Ce travail de thèse a porté sur l'étude de l'équilibre entre la prolifération et la différenciation dans le cadre de la myogenèse embryonaire et postnatale. Chez l'embryon, le sortie du cycle cellulaire est contrôlé par p57 et p21 pendant la myogenèse. Nous avons montré que la voie de signalisation Notch ainsi que les facteurs de régulation myogéniques (MRFs) régulent l'expression de p57 dans les cellules progénitrices et les myoblastes en différentiation. Chez l'adulte, p21 et p57 ne sont pas exriés dans la population quiescente de cellules souches du muscle (cellules satellites - SCs). p21 et p57 sont rapidement induits après activation et durant la différentiation des SCs. Ex vivo, les myoblastes déficients pour le gène p21 présentent des défauts de prolifération et de différenciation. In vivo, l'étude de la régénération musculaire chez les mutants p21 a montré une réduction précoce des SCs, avec un retard de reconstitution du tissu musculaire. Afin de pouvoir étudier le rôle de p57 après la naissance (les mutants p57 meurent à la naissance) nous avons généré un modèle murin permettant de muter le gène p57 de manière spatio-temporelle avec le système de recombinaison Cre/LoxP. Nous avons combiner notre allèle p57 conditionnel avec une Cre exprimée de manière ubiquitaire, et observé des phénotypes identiques aux phénotypes décrits précédemment chez les souris présentant une perte du p57. L'ablation conditionnelle de p57 dans les SCs adultes, a conduit à une diminution de la différenciation myogénique in vitro. Notre travail suggère que p21 et p57 jouent un rôle important dans la régulation de la différenciation et le cycle cellulaire dans le muscle adulte. / This thesis focuses on the coordination of proliferation and differentiation in embryonic and adult myogenesis. During development, we demonstrated that skeletal muscle progenitors interact with the differentiating myoblasts via the Notch pathway to maintain their pool. It has previously been established that p57 and p21 redundantly promote cell cycle exit in developing muscle and we showed that Notch and Myogenic Regulatory Factors act through muscle-specific regulation of p57. We then examined p21 and p57 in adult skeletal muscle stem cells, called satellite cells (SCs). Although absent from quiescent SCs, p21 and p57 are expressed upon activation (including proliferating myoblasts) and differentiation. p21-null myoblasts exhibited proliferation and differentiation defects in myofiber cultures, implicating p21 at the early activation phase. In vivo muscle regeneration studies with p21 mutants showed an early impact on the SC pool, while SCs and muscle structure were re-established by the end of regeneration. Since p57-deficient mice die at birth, we generated a conditional knock-out (KO) allele for postnatal studies using the loxP/Cre recombination system. With a ubiquitous Cre we observed developmental and perinatal phenotypes similar to previously described KO embryos. The new p57 allele also includes a β-galactosidase reporter and we showed that it recapitulates p57 expression profile in embryonic and adult tissues. Conditional ablation of p57 in adult SCs reduced myogenic differentiation in primary myoblast culture. Our work suggests that p21 and p57 are involved in adult myogenesis and cell cycle exit, working at the early steps of satellite cell activation.

Les Encéphalopathies Spongiformes Subaigües Transmissibles (ESST) sont des maladies neurodégénératives caractérisées par une longue période d'incubation asymptomatique à l'issue fatale. Elles sont induites par l'accumulation, au niveau du système nerveux central (SNC), de l'isoforme pathogène de la protéine du prion (PrPSc) entraînant une dégénération des cellules neuronales ainsi qu'une astrogliogénèse. La PrPSc, qui joue un rôle central dans la transmission de la maladie, est produite par conversion de la forme physiologique de la protéine du prion (PrPC). Les mécanismes de conversion de la PrPC et de propagation de la PrPSc sont incertains ainsi que les mécanismes moléculaires à la base des maladies à prions. Dans le cadre de la création et l'amélioration de modèles de culture cellulaire, il a été montré que les Cellules Souches Neurales (CSN) issues du SNC permettent la conversion in vitro de la PrPC en PrPSc. Dans cette étude, nous avons utilisé les CSN pour optimiser et caractériser les conditions d'infection des cellules et émis l'hypothèse que la modification des conditions de culture pouvait moduler la production de PrPSc dans les CSN. Pour cela, nous avons ajouté des facteurs influençant l'identité cellulaire dans nos cultures et avons montré qu'ils étaient capables d'augmenter la propagation du prion. Ces modèles nous permettent l'étude des mécanismes moléculaires pouvant être à l'origine de l'infection. En parallèle, nous avons montré que l'ajout d'HEPES dans nos cultures inhibe la production de PrPSc dans les CSN de façon dose-dépendante. Par ailleurs, à ce jour il n'existe aucune thérapie capable de stopper la progression de la maladie chez l'homme. Ainsi, nous avons utilisé les CSN dans le but d'élaborer une approche thérapeutique permettant de distribuer des anticorps au sein du SNC pour stopper la réplication du prion. Ces cellules permettront, de plus, de réparer les zones endommagées du cerveau combinant ainsi thérapie cellulaire et génique. / Transmissible Spongiform Encephalopathies (TSE) are neurodegenerative disorders with long asymptomatic incubation periods and fatal issue. They are induced by accumulation of the pathogen isoform of the prion protein (PrPSc) in the central nervous system (CNS) resulting in neuronal degeneration and astrogliosis. PrPSc, produced by the conversion of the physiological form of the prion protein (PrPC), plays a key role in the disease transmission. The mechanisms underlying the conversion of PrPC and the propagation of PrPSc are uncertain just as the molecular mechanisms giving rise to prion diseases. In the aim of creating or improving cell culture models, it has been shown that CNS Neural Stem Cells (NSC) could support PrPC conversion into PrPSc in vitro. In this project, we used NSC to improve and characterize cellular infection and hypothesized that modification of culture conditions could modulate PrPSc production in NSC. Hence, we used factors known to influence cellular identity in our culture model and showed that higher amount of prions were produced. These models also allow molecular mechanisms studies that could be at infection origin. During the course of this study, we also demonstrated that HEPES added to our culture medium could stop prion propagation in a dose-dependant manner. Moreover, to date no therapy aimed at stopping disease progression has been established in humans. We therefore used NSC with the ultimate goal to elaborate a therapeutic strategy based on the delivery of antibodies into the CNS to block prion replication. These cells will also able to repair damaged brain area thus combining cell and gene therapy.

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une pathologie récessive liée au chromosome X qui résulte d’une mutation sur le gène de la dystrophine aboutissant à l’absence complète de la protéine. Elle correspond à la plus fréquente des dystrophies musculaires et reste aujourd’hui sans traitement curatif. L’UMR a fait la preuve de concept de l’administration systémique d’une population de cellules souches adultes résidentes du muscle, les cellules MuStem canines chez le chien dystrophinopathe, modèle cliniquement pertinent de la DMD. L’objectif de la thèse a consisté à caractériser la population humaine (hMuStem) en terme de phénotype, myogénicité, immunomodulation et de contexte immunologique d’administration in vivo. La population hMuStem se compose de progéniteurs myogéniques précoces d’origine mésenchymateuse-périvasculaire. Elle se définit par une forte capacité proliférative, une oligopotence et une participation à la régénération musculaire après administration dans un muscle lésé. Elles présentent des propriétés immunomodulatrices en interagissant avec l’immunité adaptative et innée par inhibition de la prolifération lymphocytaire et du complément via un ensemble de molécules de surface et/ou de facteurs sécrétés. Enfin, un traitement immunosuppressif restreint à la période d’injection in vivo de la population allogénique s’avère nécessaire mais suffisant pour éviter une réaction immune de l’hôte. L’ensemble de ces résultats aboutit à une meilleure compréhension de l’identité et des modalités d’action de la population MuStem. / Duchenne Muscular Dystrophy is a X-linked recessive disorder that results from mutation in the dystrophin gene leading to a total lack of the protein. It is the most frequent muscular dystrophy with no curative treatment. The lab made a proof of concept of the systemic delivery of a muscle-derived adult stem cell population called MuStem cells in dystrophic dog, the clinically relevant DMD model. The aim of my Ph.D. was to characterize the human population (hMuStem) in terms of phenotype, myogenicity, immunomodulation and immunological context of in vivo delivery. hMuStem cell population is composed of myogenic progenitors with mesenchymal/perivascular imprint. It exhibits a high proliferative capacity, an oligopotency and a participation to muscle regeneration after transplantation into injured muscle. It displays immunomodulatory properties by interacting with adaptive and innate immunity with inhibition of lymphocyte proliferation and complement thanks to expression of surface molecules and/or secreted factors. At last, an immunosuppressive regimen restricted to the allogeneic injection period is necessary but sufficient to avoid host immune response. Collectively, these results allow a better understanding of identity and action modalities of MuStem cell population.

L’organisation de l’ADN sous forme de chromatine joue un rôle crucial dans la régulation de l’identité cellulaire. De par son rôle clé dans l’assemblage de la chromatine couplé à la synthèse d’ADN, le chaperon d’histone CAF-1 apparaît comme un acteur potentiel dans la transmission de l’information portée par la chromatine au cours des générations cellulaires. Bien que CAF-1 soit essentiel pour la survie au stade larvaire chez la Drosophile, les outils génétiques disponibles chez cet organisme permettent d’analyser sa fonction dans des types cellulaires ciblés. Mon travail montre que la grande sous-unité de CAF-1 (P180) est essentielle pour le maintien de la lignée germinale femelle. L’arrêt précoce de l’ovogénèse induit par la perte de P180 dans les cellules germinales a pu être attribué à l’activation de checkpoints, vraisemblablement en réponse à une accumulation d’ADN simple-brin liée à des défauts de réplication. De façon remarquable, les cellules souches germinales (GSCs) traversent une « crise identitaire » en absence de P180 : elles présentent des caractéristiques de cellules en cours de différenciation, dont une abscission incomplète, tout en conservant des propriétés spécifiques aux GSCs. En revanche, mon analyse n’a pas révélé de défaut d’identité des neuroblastes, une autre population de cellules souches, qui continuent de se diviser de façon asymétrique sans P180. De même, les cellules des disques imaginaux se divisant de façon symétrique prolifèrent en absence de P180, bien que plus lentement. Des analyses complémentaires permettront de déterminer si des mécanismes alternatifs d’assemblage de la chromatine compensent la perte de CAF-1 dans ces cellules. / The organization of DNA into chromatin is dynamic and plays important roles in the establishment and the maintenance of cellular identity. By virtue of its central role in replication-coupled chromatin assembly, the histone chaperone CAF-1 constitutes an interesting candidate in a search for molecular players involved in the inheritance of chromatin states in mitotic cells. In Drosophila, dCAF-1 is essential for viability at the larval stage. Yet, the genetic tools available in the fruit fly allow to analyze the function of dCAF-1 in specific tissues. Mainly, my thesis work shows that the large subunit of dCAF-1 (P180) is essential for oogenesis. I have shown that the early arrest of oogenesis observed upon depletion of P180 in germ cells results from the activation of checkpoints pathways and cell death, possibly in response to the accumulation of single-strand DNA as a consequence of replication defects. Strikingly, P180 plays an essential role in the female germline stem cells (GSCs), which upon depletion of P180 enter an “identity crisis” and harbor features of differentiating cyst cells, including incomplete abscission, while maintaining at the same time some GSCs features. In contrast, the loss of P180 does not seem to alter the identity of larval neuroblasts, another population of stem cells, which continue to divide in an asymmetric fashion in its absence. Finally, the cells of the imaginal discs, which divide symmetrically, are able to proliferate upon loss of P180, albeit at a slower rate. Further analyses are required to determine whether alternative chromatin assembly pathways compensate for the loss of dCAF-1 activity in these cells.

Trouver de nouvelles sources de foie pour les transplantations est un vrai enjeu. Les obstacles principaux à la transplantation d'organes sont la pénurie de greffons et les lourds traitements immunosuppresseurs à vie. La possibilité de reprogrammer les cellules du patient et les cultiver donne accès à une quantité virtuellement illimitée de cellules a transplanter, éliminant de ce fait le besoin de donneurs d'organesMon doctorat se divise en deux parties : la première consiste à faire des cellules hépatiques en programmant des cellules souches humaines. La deuxième consiste à transplanter ces dernières dans des foies de souris ayant des insuffisances hépatiques aigues et chroniques pour étudier la régénération du foie. Les nouveautés de ce projet sont le fait d'étudier la première phase d'intégration post transplantation des cellules car cette phase est critique dans la régénération. De plus je comparerai la régénération du foie par les cellules transplantées dans une insuffisance hépatique aigue avec une insuffisance hépatique chronique. Une semaine après transplantation, le foie de ces souris contenait les cellules greffées qui se sont implantées et celles-ci se comportaient comme des cellules de foie bona fide, produisant une protéine, l'albumine humaine. Encore mieux : l'analyse des fonctions du foie a relevé un retour à une fonction normale en 3 jours avec transplantation contre 7 jours sans cellules transplantées. Ces résultats sont très encourageants quant à la possibilité d'utiliser des cellules dérivées de cellules souches à des fins thérapeutiques. / Finding new sources for liver transplants is a real issue. The main obstacles to organ transplantation are the shortage of grafts and heavy immunosuppressive treatment for life. The ability to reprogram the patient's cells and grow them gives access to a virtually unlimited amount of transplanted cells, thereby eliminating the need for an organ donor. My doctorate is in two parts: the first is to make liver cells by programming of human stem cells. The second is to transplant those cells in the livers of mice with acute and chronic liver failure to study liver regeneration. The novel parts of this project are to study the first phase of post-integration cell transplantation because this phase is critical in regeneration. Also I would compare liver regeneration by transplanted cells in acute liver failure with chronic liver failure. One week after transplantation, the liver of these mice contained the grafted cells and which are located if they behaved as bona fide liver cells producing a protein, human albumin. Even better: analysis of liver function noted a return to normal function in three days with seven days without transplantation against transplanted cells. These results are very encouraging when the possibility of using cells derived from stem cells for therapeutic purposes.