Streptococcus suis est une bactérie encapsulée causant des pertes économiques majeures dans l’industrie porcine en provoquant la méningite et la septicémie chez le porc. C’est aussi un important agent zoonotique. Depuis de nombreuses années de recherche sur des vaccins, aucun n’est efficace et commercialement disponible. En effet, les bactérines (bactéries entières inactivées) autogènes sont les plus couramment utilisées sur le terrain, mais demeurent avec des résultats controversés. Pourtant, S. suis exprime de nombreux composants immunogéniques pouvant être potentiellement utilisés pour des vaccins sous-unitaires. Cependant, tester la capacité immunogénique de ces nombreux candidats vaccinaux ainsi qu’évaluer le meilleur adjuvant pour la formulation d’un vaccin contre S. suis est un processus long et onéreux qui requiert l’utilisation d’un nombre élevé d’animaux. En effet, les essais vaccinaux contre S. suis débutent par un premier dépistage chez la souris pour ensuite être testés chez le porc. Il est donc nécessaire de développer des stratégies permettant d’avancer et de faciliter la recherche. Dans cette optique, un système in vitro a été développé utilisant des cellules dendritiques (DC) différenciées à partir des cellules souches de la moelle osseuse de fémur de porc. Ce modèle permettra l’analyse des candidats vaccinaux et de leur potentiel immunogénique ainsi que l’évaluation préliminaire des adjuvants. Ce système in vitro pourrait réduire le nombre d’animaux utilisés pour les essais précliniques en délivrant des connaissances immunologiques fondamentales sur les formulations de vaccins testés, dont ceux retenus mériteront une étude approfondie chez l’animal. Pour développer ce modèle in vitro, l’utilisation de plusieurs cultures de DCs, dérivées des cellules souches de la moelle osseuse de 10 porcelets différents, ont été utilisées afin de tenir compte du polymorphisme génétique de chacun. Différents composants antigéniques de S. suis, dont leurs pouvoirs immunogéniques ont déjà été évalués lors des essais vaccinaux, ont été choisis. Parmi eux, une protéine de surface de S. suis a été sélectionnée : l’énolase. In vivo, elle a été reconnue comme ayant une forte immunogénicité, cependant la protection conférée par cette protéine dépend de l’adjuvant utilisé dans la formulation vaccinale. La capsule polysaccharidique (CPS) de S. suis, l’antigène le plus exposé en surface de la bactérie et en première ligne de contact avec le système immunitaire, est le deuxième antigène à être sélectionné pour cette étude. Étant donné la faible immunogénicité de la CPS, reliée à sa nature polysaccharidique, un prototype glycoconjugué a été précédemment développé dans notre laboratoire et son effet protecteur a été validé chez le porc. Le glycoconjugué et ses dérivées ont aussi fait l’objet de cette présente étude. Finalement, la capacité des DCs à répondre à des bactérines a aussi été évaluée. Différentes catégories d’adjuvants ont été sélectionnées (Poly I:C, Quil A, Alhydrogel 2%, TiterMax Gold et Stimune) et leurs effets ont été comparés. L’activation des DCs a été évaluée par la production de cytokines de type 1 (IL-12 et TNF-α) et de type 2 (IL-6). Il a été observé que les adjuvants intensifiaient l’activation des DCs par une augmentation de production des cytokines par rapport aux antigènes seuls. De plus, il a été constaté que les DCs distinguaient un adjuvant de type 1 ou de type 2 par l’observation d’un profil cytokinique spécifique à chaque type de réponse suite à leur activation par les adjuvants combinés aux différents antigènes. Il a aussi été constaté que l’ampleur de la production de cytokines variait selon la nature de l’antigène présent avec les adjuvants. Enfin, il a été noté que les DCs répondaient différemment selon la nature chimique des antigènes. En conclusion, ce système in vitro a permis d’évaluer la capacité immunogénique de candidats vaccinaux, mais aussi de présélectionner les meilleurs adjuvants favorisant la réponse immunitaire désirée contre S. suis. À cette fin, ce modèle pourrait permettre la réduction du nombre d’animaux utilisés en test préclinique, en permettant une présélection des candidats vaccinaux à tester in vivo ou en fournissant des connaissances scientifiques additionnelles sur des choix des candidats cibles. Sur le long terme, ce modèle facilitera la découverte des vaccins sous-unitaires contre S. suis. / Streptococcus suis, an encapsulated bacterium, is a major swine pathogen and an important zoonotic agent mainly causing septicemia and meningitis. Despite decades of vaccine research, no effective vaccine is currently commercially available. Indeed, autogenous bacterins (whole inactivated bacteria) are the most commonly used vaccines in the field; however, their protective capacity remains controversial. Nevertheless, S. suis expresses many immunogenic constituents that may have potential as sub-unit vaccines. However, testing the immunogenic potential of the many S. suis candidates and appropriate adjuvants is a long and costly process requiring the use of many animals. Indeed, studies of vaccines against S. suis start with a first screening in mice prior to evaluation in pigs. Therefore, it is necessary to develop strategies to advance and facilitate the research. Hence, an in vitro porcine bone marrow-derived dendritic cell (DC) culture was developed as a model for screening vaccine candidates, evaluation of their immunogenicity, and assessment of the best(s) adjuvant(s) to be used. This model could reduce the number of animals used in pre-clinical trials by providing fundamental immunological knowledge on selected vaccine formulations that would deserve further analysis in animal trials. To develop this model, porcine bone marrow-derived DC cultures from 10 different pigs were used to take into account the genetic polymorphism of individual animals. Different antigenic components of S. suis, the immunogenic properties of which have already been evaluated in vaccine trials, were selected. Among them, a surface protein of S. suis was selected: enolase. In vivo, this protein has been recognized as having high immunogenicity; however, the protection conferred by this protein depends on the adjuvant used in the vaccine formulation. The S. suis capsular polysaccharide (CPS), the most exposed antigen on the surface of the bacterium and the first line of contact with the immune system, is the second antigen selected for this study. Given the low immunogenicity of CPS, linked to its polysaccharide nature, a prototype glycoconjugate vaccine was previously developed in our laboratory and its protective effect validated in pigs. This glycoconjugate and its derivatives have also been the subject of this study. Finally, the ability of DCs to respond to bacterins was also evaluated. Different categories of adjuvants (Poly I:C, Quil A, Alhydrogel 2%, TiterMax Gold, and Stimune) were compared. The activation of DCs was evaluated by the production of type 1 (IL-12 and TNF-α) and type 2 (IL-6) cytokines. It was observed that adjuvants amplify DC activation as demonstrated by an increase of cytokine production when compared to the antigen alone. Moreover, DCs distinguish type 1 or 2 adjuvants in combination with different S. suis antigens, according to the cytokine profile observed. It has also been found that the extent of cytokine production varies depending on the nature of the antigen present with the adjuvants. Finally, it was observed that DCs respond differently depending on the chemical nature of the antigens. In conclusion, this in vitro model allows the evaluation of the immunogenic potential of vaccine candidates while also screening for adjuvants favoring the desired immune response against S. suis. Therefore, this model could permit a reduction in the number of animals used in pre-clinical trials by allowing a preselection of candidates to be tested in vivo or by providing additional scientific knowledge as a basis for the target choices. As a result, the list of candidates to be screened in the natural host in vivo would be reduced, facilitating the discovery of a subunit vaccine against S. suis.

Streptococcus suis est un important pathogène porcin et agent zoonotique responsable de méningites et de septicémies. À ce jour, les mécanismes impliqués dans la réponse immunitaire de l’hôte lors de l’infection par S. suis sont peu connus; et il en est de même pour les stratégies utilisées par S. suis afin de déjouer cette réponse. L’augmentation de l’incidence et de la sévérité des cas humains souligne le besoin d’une meilleure compréhension des interactions entre S. suis et le système immunitaire afin de générer une réponse immunitaire efficace contre ce pathogène. Les cellules dendritiques (DCs) sont de puissantes cellules présentatrices d’antigènes qui stimulent les lymphocytes T et B, assurant la liaison entre l’immunité innée et l’immunité adaptative. L’objectif principal de ce projet était d’évaluer le rôle joué par différents facteurs de virulence de S. suis sur la modulation de la fonction des DCs et de la réponse T-dépendante. Nous avons examiné l’effet des facteurs clés pour la virulence de S. suis, dont la capsule polysaccharidique (CPS), les modifications de la paroi cellulaire (D-alanylation de l’acide lipotéichoïque et N-déacétylation du peptidoglycane) et la toxine suilysine, sur l’activation et la maturation de DCs murines dérivées de la moelle osseuse (bmDCs). Suite à l’infection par S. suis, les bmDCs sont activées et subissent un processus de maturation caractérisé par l’augmentation de l’expression de molécules de co-stimulation et la production de cytokines pro-inflammatoires. La CPS est le principal facteur interférant avec la production de cytokines, même si les modifications de la paroi cellulaire et la suilysine peuvent également moduler la production de certaines cytokines. Enfin, la CPS, les modifications de la paroi cellulaire et la suilysine interfèrent avec la déposition du complément à la surface des bactéries et, en conséquence, avec le « killing » dépendant du complément. Les résultats ont été confirmés à l’aide de bmDCs porcines. Nous avons aussi voulu identifier les récepteurs cellulaires impliqués dans la reconnaissance de S. suis par les DCs. Nous avons démontré que la production de cytokines et l’expression des molécules de co-stimulation par les DCs sont fortement dépendantes de la signalisation par MyD88, suggérant que les DCs reconnaissent S. suis et deviennent activées majoritairement via la signalisation par les récepteurs de type Toll (TLRs). En effet, on remarque une diminution de la production de plusieurs cytokines ainsi que de l’expression de certaines molécules de co-stimulation chez les DCs TLR2-/- ou TLR2-/- et TLR9-/- double négatives. Finalement, le récepteur NOD2 semblait jouer un rôle partiel dans l’activation des DCs suite à une infection par S. suis.Enfin, nous avons évalué les conséquences de la modulation des fonctions des DCs sur le développement de la réponse T-dépendante. Les splénocytes totaux produisent plusieurs cytokines en réponse à S. suis. Des analyses in vivo et ex vivo ont permis d’observer l’implication des cellules T CD4+ et le développement d’une réponse de type « T helper » 1 (TH1) bien que la quantité de cytokines TH1 produites lors de l’infection in vivo par S. suis demeure assez basse. La CPS de S. suis interfère avec la production de plusieurs cytokines par les cellules T in vitro. Expérimentalement, l’infection induite par S. suis résulte en de faibles niveaux de production d’anticorps anti-S. suis, mais aussi d’anticorps dirigés contre l’ovalbumine utilisée comme antigène rapporteur. Cette interférence est corrélée avec la sévérité des signes cliniques, suggérant que S. suis interfère avec le développement d’une réponse immunitaire adaptative appropriée qui serait requise pour contrôler la progression de l’infection. Les résultats de cette étude mèneront à une meilleure compréhension de la réponse immunitaire de l’hôte lors de l’infection par S. suis. / Streptococcus suis is an important swine pathogen and an emerging zoonotic agent of septicemia and meningitis. Knowledge of host immune responses towards S. suis, and strategies used by this pathogen for subversion of these responses is scarce. Increased severity of S. suis infections in humans underscores the critical need to better understand the interactions between S. suis and the immune system to generate an effective immune response against this pathogen. Dendritic cells (DCs) are powerful antigen-presenting cells. Once activated, they stimulate T cells and B cells, linking innate and adaptive immunity. Thus, the main objective of this project was to evaluate the role of different S. suis virulence factors on the modulation of DC functions and the T cell-dependent response. Initially, we investigated the effect of S. suis key virulence factors, including the capsular polysaccharide (CPS), the cell wall modifications (D-alanylation of the lipoteichoic acid and N-deacetylation of the peptidoglycan) and the toxin suilysin, on the activation and maturation of mouse bone-marrow derived DCs (bmDCs). We observed that following S. suis infection, bmDCs are activated and go through a complex maturation process characterized by the up-regulation of the surface expression of costimulatory molecules and the production of pro-inflammatory cytokines. The CPS is the main virulence factor interfering with cytokine production, even if cell wall modifications and suilysin can also modulate the production of cytokines. Finally, CPS, cell wall modifications and suilysin were shown to interfere with complement deposition on S. suis, and consequently with complement-dependent killing. Results were confirmed using porcine bmDCs. We also aimed to identify the cellular receptors involved in S. suis recognition by DCs. Production of cytokines and expression of co-stimulatory molecules by DCs were shown to strongly rely on MyD88-dependent signaling pathways, suggesting that DCs recognize S. suis and become activated mostly through Toll-like receptor (TLR) signaling. Supporting this fact, TLR2-/- or double negative TLR2-/- and TLR9-/- DCs were severely impaired in the release of several cytokines and the surface expression of certain costimulatory molecules. In addition, NOD2 receptor also seems to play a partial role in DC activation by S. suis. Finally, we evaluated the consequences of the modulation of DC functions on T cell activation. In response to S. suis infection, total splenocytes readily produced several cytokines ex vivo. Ex vivo and in vivo analysis revealed the involvement of CD4+ T cells and development of a T helper 1 (TH1) response. Nevertheless, levels of TH1-derived cytokines during S. suis infection were very low. The bacterial CPS was shown to interfere with the release of several T cell-derived cytokines in vitro. As a consequence, a clinical infection resulted in low levels of not only anti-S. suis antibodies but also of those directed against ovalbumin, used as reported antigen. This interference was correlated with the presence of severe clinical signs of S. suis disease. These data suggest that S. suis impairs the development of an efficient adaptive immune response, which is required to control the infection progress. Overall, these results will permit a better comprehension of the host immune response during S. suis infection.

Streptocuccus suis (S. suis) gehört zu den wichtigsten bakteriellen Erregern bei Schweinen, stellt als Zoonoseerreger aber auch eine Gefahr für den Menschen dar. Bis zu 100% aller Schweine sind symptomlos kolonialisiert. Allerdings kommt es auch zu schwerwiegenden invasiven Erkrankungen, gekennzeichnet durch Meningitis, Arthritis, Serositis oder plötzliche Todesfälle, hauptsächlich bei Ferkeln zwischen 4 und 10 Wochen. S. suis exprimiert die Cysteinprotease IdeSsuis, die spezifisch nur porzines IgM spaltet, was zur Komplementevasion beiträgt. Allerdings ist das Vorhandensein von IdeSsuis nicht essenziell für die Eigenschaft eines Stammes, experimentelle invasive Erkrankungen hervorzurufen. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Charakterisierung der IdeSsuis-abhängigen Interaktion von S. suis mit porzinen B-Zellen. Dabei lag der Fokus auf dem IgM-B-Zellrezeptor (BCR) und der IgM-Sekretion durch IgM+ B-Zellen. Vor dem Hintergrund der Spaltung löslichen IgMs wurde die Arbeitshypothese untersucht, dass IdeSsuis auch in der Lage ist, den IgM-BCR zu spalten, was zu einer Beeinträchtigung der B-Zellfunktion durch gestörte IgM-BCR-Signalwege führt. Verschiedene IdeSsuis-Varianten sowie muramidase-released protein (MRP) als weiteres von S. suis stammendes Protein wurden rekombinant in Escherichia coli exprimiert und aufgereinigt. Die mögliche Spaltung des IgM BCR nach Inkubation porziner B-Zellen mit Medium, rIdeSsuis_homologue oder rIdeSsuis_homologue_C195S sowie aufkonzentriertem Kulturüberstand von S. suis Stamm 10 oder der isogenen Punktmutante 10ΔIdeSsuis∇IdeSsuis_C195S wurde in der Durchflusszytometrie untersucht, genauso wie nach Injektion in regionale Lymphknoten. Die Wiederherstellung der BCR-Expression auf der Zelloberfläche nach Spaltung durch rIdeSsuis_homologue sowie die Auswirkungen der BCR-Spaltung auf die intrazelluläre Signalkaskade verschiedener B-Zell-Subpopulationen (CD21+ und CD21-) wurde ebenfalls mittels Durchflusszytometrie ausgewertet. Dabei wurden B-Zellen mit intaktem oder gespaltenem BCR mit einem IgM-BCR-spezifischen Antikörper oder intrazellulär und damit BCR-unabhängig durch Pervanadat stimuliert. Um funktionelle Konsequenzen der BCR-Spaltung zu untersuchen, wurden porzine Blutzellen mit den verschiedenen rekombinanten Proteinen inkubiert, für 3 Tage mit R848 und Interleukin-2 stimuliert und dann die Anzahl an IgM-sekretierenden Zellen im Enzyme-linked Immuno Spot Assay (ELISpot) bestimmt. Parallel dazu wurde der Gehalt an löslichem, in den ELISpot-Kulturüberstand sekretierten IgM mittels Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) analysiert. Um eine Aussage über die Bindung der verschiedenen rekombinanten Proteine an IgM+ B-Zellen zu treffen, wurden diese mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert, mit Zellen inkubiert und der Anteil an dadurch fluoreszierenden IgM+ B-Zellen mittels Durchflusszytometrie bestimmt. Der IgM-BCR wurde in vitro und ex vivo durch rIdeSsuis sowie aufkonzentrierten Kulturüberstand von S. suis Stamm 10 gespalten, jedoch nicht durch rIdeSsuis_homologue_C195S oder den Kulturüberstand der isogenen Punktmutante. Die Wiederherstellung der Oberflächenexpression des IgM-BCR nach Spaltung benötigte ca. 20 Stunden. BCR-spezifische und -unspezifische Stimulation direkt nach Spaltung durch rIdeSsuis_homologue zeigte, dass die Signalweiterleitung am BCR gestört ist, die intrazellulären Komponenten der Signalkaskade allerdings weiterhin funktionsfähig sind. Die CD21+ und CD21- IgM B-Zell Subpopulationen unterschieden sich weder in der Effektivität der Rezeptorspaltung noch in ihrer Reaktion auf Stimulation. 3 Tage nach Inkubation mit rIdeSsuis_homologue, und in geringerem Umfang auch rIdeSsuis_C-domain, waren sowohl die Anzahl an IgM-sekretierenden Zellen als auch die Level an sekretiertem IgM reduziert, was nicht auf ein verändertes Überleben der Zellen zurückzuführen war. Obwohl rIdeSsuis_homologue_C195S keine Spaltung des BCR bewirkte, führte eine Inkubation ebenfalls zu einer Reduktion der IgM-sekretierenden Zellen. RIdeSsuis_homologue_C195S zeigte eine deutlich stabilere Bindung an IgM+ B-Zellen als die anderen rekombinanten Proteine. Das IgM-degradierende Enzym von S. suis, IdeSsuis, spaltet den IgM-BCR in vitro sowie ex vivo auf B-Zellen aus Blut und Lymphknoten. Diese Spaltung führt in vitro zu einer Störung der intrazellulären Signalweiterleitung und resultiert nach 3 Tagen in einer reduzierten B-Zellfunktion. Dabei scheint die Störung der B-Zellen nicht nur durch IgM-BCR-Spaltung, sondern auch durch starke Bindung allein zustande zu kommen. Zusammenfassend legen diese Ergebnisse einen weiteren Mechanismus der Modulation der porzinen Immunantwort durch S. suis nahe, der v.a. bei der Kolonialisierung und frühen Infektionsphasen eine entscheidende Rolle spielen könnte.:Directory ............................................................................................................................. I Abbreviations ........................................................................................................................... III 1. Introduction .......................................................................................................................... 1 2. Literature ............................................................................................................................ 2 2.1. Streptococcus suis .............................................................................................. 2 2.1.1. General characteristics and epidemiology ........................................................... 2 2.1.2. Disease in pigs .................................................................................................... 3 2.1.3. Disease in humans .............................................................................................. 3 2.1.4. Pathogenesis with focus on colonization ............................................................. 4 2.1.5. IdeSsuis and its comparison to other streptococcal immunoglobulin proteases ...... 5 2.2. The immune system with focus on IgM and B cells ........................................... 18 2.2.1. The complement system and complement evasion strategies ........................... 18 2.2.2. Immunoglobulins/antibodies with focus on IgM .................................................. 20 2.2.2.1. IgM .................................................................................................................... 21 2.2.2.2. Other immunoglobulin classes ........................................................................... 23 2.2.2.2.1. IgG .................................................................................................................... 23 2.2.2.2.2. IgA and immune exclusion ................................................................................ 23 2.2.2.3. Course of IgM and IgG in the piglet after weaning and role of IgM in the protection against S. suis ................................................................................................... 25 2.2.3. B cell populations with focus on IgM+ B cells ..................................................... 26 2.2.3.1. B cell development and B cell populations in the mouse ................................... 26 2.2.3.2. B cell development and B cell populations in the pig ......................................... 30 2.2.4. B cell surface receptors important for the interaction with pathogens ................ 33 2.2.4.1. B cell receptor (BCR) ........................................................................................ 33 2.2.4.2. Other receptors ................................................................................................. 35 3. Publications ....................................................................................................................... 37 3.1. Immunoglobulin M-degrading enzyme of Streptococcus suis (IdeSsuis) impairs porcine B cell signaling .................................................................................................................. 37 3.2. The immunoglobulin M-degrading enzyme of Streptococcus suis (IdeSsuis) leads to a long-lasting inhibition of activation of porcine IgM-secreting B cells. ...................................... 52 4. Discussion ......................................................................................................................... 69 5. Zusammenfassung ............................................................................................................ 75 6. Summary .......................................................................................................................... 77 7. References ........................................................................................................................ 79 8. Appendix ........................................................................................................................ 109 8.1. Supplementary Material to Breitfelder et al. 2023: Immunoglobulin M-degrading enzyme of Streptococcus suis (IdeSsuis) impairs porcine B cell signaling ................................... 109 8.2. Supplementary Material to Breitfelder et al. 2024: The immunoglobulin M-degrading enzyme of Streptococcus suis (IdeSsuis) leads to a long-lasting inhibition of activation of porcine IgM-secreting B cells. ...................................................................................... 122 8.3. Table 3: murine B cell populations ............................................................................... 126 8.4. Presentations given during the development of this thesis ........................................... 134 / Introduction S. suis is one of the most important bacterial pathogens in pigs, with zoonotic potential. Up to 100% of all pigs are colonized, but S. suis can also cause severe invasive disease manifesting as meningitis, arthritis, serositis or sudden death, mainly in piglets between 4 and 10 weeks of age. S. suis expresses the cysteine protease IdeSsuis, which specifically cleaves porcine IgM. This cleavage contributes to complement evasion, but IdeSsuis expression is not crucial for the ability of a strain to cause signs of invasive disease after experimental infection. Aim The aim of this work was to characterize the IdeSsuis-dependent interaction of S. suis with porcine B cells. In this context, I focused on IgM B cell receptor (BCR) cleavage and IgM secretion by IgM+ B cells. On the background of the previously demonstrated cleavage of soluble IgM, I investigated the working hypothesis that IdeSsuis also cleaves the IgM B cell receptor, which might lead to a disturbed B cell function by inhibiting the BCR signaling. Material and Methods Different IdeSsuis variants as well as muramidase-released protein (MRP) as another streptococcal control protein were recombinantly expressed in Escherichia coli. IgM BCR cleavage after incubation of porcine B cells with medium, rIdeSsuis_homologue, rIdeSsuis_homologue_C195S or concentrated culture supernatant of S. suis strain 10 or the respective point-mutant was investigated in flow cytometry. Putative IgM BCR cleavage was also confirmed after injection of rIdeSsuis_homologue in whole regional lymph nodes. BCR recovery after cleavage as well as the consequences of IgM BCR cleavage on intracellular signaling was investigated in flow cytometry. To address BCR-specific and BCR-independent signaling, B cells were stimulated with a BCR-specific antibody or pervanadate. To assess functional consequences of BCR cleavage, cells were incubated with the different recombinant proteins, followed by 3 days stimulation with porcine IL-2 and R848. The number of IgM-secreting cells was determined using an Enzyme-linked Immuno Spot Assay (ELISpot) and the corresponding levels of soluble IgM were investigated in an Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA). Finally, the different recombinant proteins were labeled with a fluorescent dye to investigate binding to IgM+ B cells using flow cytometry. Results The IgM BCR was cleaved in vitro and ex vivo by rIdeSsuis_homologue or concentrated culture supernatant of S. suis strain 10, but not by rIdeSsuis_homologue_C195S or the supernatant of the corresponding point mutant. IgM BCR recovery took at least 20 hours. BCR-specific and BCR-independent stimulation directly after cleavage demonstrated a defect in BCR-mediated signaling, while the intracellular signaling cascade was still intact. CD21+ and CD21- B cell subsets did not differ in IgM BCR cleavage efficiency or the reaction to stimulation. Three days after incubation with rIdeSsuis_homologue, rIdeSsuis_homologue_C195S and, to a lesser extent, also rIdeSsuis_C-domain, and subsequent stimulation with IL-2 and R848, the number of IgM-secreting cells as well as total levels of secreted IgM were reduced. This was not due to decreased cell viability. Interestingly, rIdeSsuis_homologue_C195S bound significantly stronger to IgM+ B cells than the other recombinant proteins. Conclusion The IgM-degrading enzyme of S. suis, IdeSsuis, cleaves the IgM BCR in vitro and ex vivo on B cells originating from blood or lymph nodes. This cleavage leads to a disturbed intracellular BCR signaling in vitro and results in an impaired B cell function after 3 days. In this context, also protein binding seems to be sufficient to disturb the B cells. In conclusion, the results suggest a modulation of the porcine immune response by S. suis, which could play a role especially during colonization and early invasion.:Directory ............................................................................................................................. I Abbreviations ........................................................................................................................... III 1. Introduction .......................................................................................................................... 1 2. Literature ............................................................................................................................ 2 2.1. Streptococcus suis .............................................................................................. 2 2.1.1. General characteristics and epidemiology ........................................................... 2 2.1.2. Disease in pigs .................................................................................................... 3 2.1.3. Disease in humans .............................................................................................. 3 2.1.4. Pathogenesis with focus on colonization ............................................................. 4 2.1.5. IdeSsuis and its comparison to other streptococcal immunoglobulin proteases ...... 5 2.2. The immune system with focus on IgM and B cells ........................................... 18 2.2.1. The complement system and complement evasion strategies ........................... 18 2.2.2. Immunoglobulins/antibodies with focus on IgM .................................................. 20 2.2.2.1. IgM .................................................................................................................... 21 2.2.2.2. Other immunoglobulin classes ........................................................................... 23 2.2.2.2.1. IgG .................................................................................................................... 23 2.2.2.2.2. IgA and immune exclusion ................................................................................ 23 2.2.2.3. Course of IgM and IgG in the piglet after weaning and role of IgM in the protection against S. suis ................................................................................................... 25 2.2.3. B cell populations with focus on IgM+ B cells ..................................................... 26 2.2.3.1. B cell development and B cell populations in the mouse ................................... 26 2.2.3.2. B cell development and B cell populations in the pig ......................................... 30 2.2.4. B cell surface receptors important for the interaction with pathogens ................ 33 2.2.4.1. B cell receptor (BCR) ........................................................................................ 33 2.2.4.2. Other receptors ................................................................................................. 35 3. Publications ....................................................................................................................... 37 3.1. Immunoglobulin M-degrading enzyme of Streptococcus suis (IdeSsuis) impairs porcine B cell signaling .................................................................................................................. 37 3.2. The immunoglobulin M-degrading enzyme of Streptococcus suis (IdeSsuis) leads to a long-lasting inhibition of activation of porcine IgM-secreting B cells. ...................................... 52 4. Discussion ......................................................................................................................... 69 5. Zusammenfassung ............................................................................................................ 75 6. Summary .......................................................................................................................... 77 7. References ........................................................................................................................ 79 8. Appendix ........................................................................................................................ 109 8.1. Supplementary Material to Breitfelder et al. 2023: Immunoglobulin M-degrading enzyme of Streptococcus suis (IdeSsuis) impairs porcine B cell signaling ................................... 109 8.2. Supplementary Material to Breitfelder et al. 2024: The immunoglobulin M-degrading enzyme of Streptococcus suis (IdeSsuis) leads to a long-lasting inhibition of activation of porcine IgM-secreting B cells. ...................................................................................... 122 8.3. Table 3: murine B cell populations ............................................................................... 126 8.4. Presentations given during the development of this thesis ........................................... 134

Bacteria of the genus Streptococcus are common asymptomatic colonisers of humans and animals. As opportunistic pathogens they can however, depending on their host’s immune status and other circumstances, cause mild to very severe infections. Streptococci are highly intertwined with specific host species, but can also cause zoonosis or anthroponosis in more uncommon hosts. Prolonged and reoccurring infections require immune evasion strategies to circumvent detection and eradication by the host’s immune defence. A substantial part of the immune defence against bacterial pathogens is mediated by immunoglobulins. This thesis is based on work to identify and characterise immunoglobulin degrading enzymes secreted by different Streptococcus species as a means to sabotage and evade antibody-mediated immune responses. Stoichiometric and kinetic analysis of the IgG degrading enzyme IdeS from the important human pathogen S. pyogenes revealed that IdeS cleaves IgG, opposed to previous publications, as a monomer following classical Michaelis-Menten kinetics. The IdeS homologue of S. suis, IdeSsuis, did however not cleave IgG, but was highly specific fo rporcine IgM. S. suis was found to possess yet another protease, IgdE, capable of cleaving porcine IgG. Both of these proteases were shown to promote increased bacterial survival in porcine blood during certain conditions. IgdE is the founding member of a novel cysteine protease family (C113). Novel streptococcal members of this protease family were shown to specifically degrade certain IgG subtypes of the respective Streptococcus species’ main host. The observed substrate specificity of IgdE family proteases reflects the host tropism of these Streptococcus species, thereby giving insights into host-pathogen co-evolution. The abundance of immunoglobulin degrading enzymes among Streptococcus species indicates the importance of evasion from the antibody mediated immune responses for streptococci. These novel identified immunoglobulin degrading enzymes of the IdeS and IgdE protease families are potential valid vaccine targets and could also be of biotechnological use.

This thesis deals with the qualitative text analysis of media discourses related to the 7th January 2015 terrorist attack on French satirical magazine Charlie Hebdo's staff. In accordance with social constructionism theory, the term terrorism is here understood as a social construct and mass media is considered to be one of the social construction agents. The objects of analysis are journalistic texts published during the one-month period of 7th January - 7th February 2015. As a resource for the analysis I have chosen the daily newspaper Lidové noviny, the weekly magazine Týden, online newspaper IHNED.cz and TV programme Události, komentáře. The texts were analysed through the combination of grounded theory method and four steps of foucaultian discourses analysis described by Carla Willig. The aim of this paper is to discover and to interpret the most significant discursive constructions of Charlie Hebdo terrorist attack that appeared in the Czech media, to situate the same discursive object within wider or global discourses, to describe positions that discourses make available or attribute to the subjects and social actors, and to define the practices arising from these discourses. The media event of Charlie Hebdo attack has been closely related to the topics of freedom of speech, 9/11 terrorist...

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Streptococcus suis et Streptococcus du groupe B (GBS) sont deux bactéries encapsulées qui induisent des pathologies similaires chez l’homme et/ou l’animal, incluant septicémies et méningites. La capsule polysaccharidique (CPS) est un facteur de virulence clé de ces deux pathogènes et les anticorps (Ac) anti-CPS présentent un bon potentiel protecteur. Néanmoins, ces molécules sont faiblement immunogéniques et les mécanismes de la génération de la réponse humorale anti-CPS demeurent méconnus. L’objectif principal de cette thèse était d’évaluer les caractéristiques et les mécanismes du développement de la réponse Ac dirigée spécifiquement contre les CPS de S. suis et GBS, ainsi que l’effet de la biochimie de la CPS dans cette réponse. Nous avons étudié S. suis types 2 et 14 et GBS types III et V, dont les CPS présentent plusieurs similarités dans leurs compositions et leurs structures, incluant la présence d’acide sialique, un sucre potentiellement immunosuppresseur, tout en possédant une antigénicité propre. Nous avons tout d’abord analysé la nature de la réponse Ac anti-CPS sérique face à la bactérie entière. Les souris infectées par S. suis développent une réponse très faible (S. suis type 2) voire insignifiante (S. suis type 14) de profil isotypique restreint à l’IgM et sont incapables de monter une réponse mémoire efficace face à une seconde infection. Un profil similaire est obtenu chez le porc infecté par S. suis type 2. On détecte des titres d’IgM anti-CPS significatifs chez les souris infectées par GBS (type III ou V). Toutefois, la magnitude de la réponse reste globalement faible et aucune commutation de classe n’est observée. Nous avons ensuite examiné l’influence de la biochimie de la CPS sur ces profils de réponse en conduisant des expériences avec la CPS hautement purifiée de ces pathogènes. Tandis que la CPS de GBS type III administrée aux souris conserve des propriétés immunogéniques similaires à celles observées durant l’infection par la bactérie intacte, les CPS de S. suis type 2 et GBS type V perdent toute capacité à induire une réponse Ac spécifique. L’analyse de l’interaction in vitro des CPS avec les cellules dendritiques (DC) murines, des acteurs clés dans la détection des pathogènes et l’orchestration des réponses immunitaires subséquentes, révèle que ces molécules stimulent la production de niveaux conséquents de chémokines via différents récepteurs. Néanmoins, les CPS sont inaptes à induire la sécrétion de cytokines et elles interfèrent avec la capacité des DC à exprimer BAFF, une cytokine clé dans la différenciation des lymphocytes B en plasmocytes. L’utilisation de CPS chimiquement désialylées démontre que l’acide sialique ne joue aucun rôle immunosuppresseur majeur dans le développement de la réponse Ac dirigée contre les CPS purifiées de S. suis ou GBS, ni sur l’interaction des CPS avec les DC in vitro, ni sur profil de la réponse in vivo. D’autres propriétés biochimiques intrinsèques à ces CPS seraient responsables de l’inaptitude de l’hôte infecté à monter une réponse Ac adéquate et les identifier constituera un outil précieux pour une meilleure compréhension de l’immunopathogénèse de S. suis et GBS ainsi que pour développer des moyens de lutte efficaces contre ces bactéries. / Streptococcus suis and Group B Streptococcus (GBS) are two encapsulated bacteria that induce similar pathologies in humans and/or animals, including septicemia and meningitis. The capsular polysaccharide (CPS) is a major virulence factor for both pathogens and CPS-specific antibodies (Ab) display a good protective potential. However, CPSs are weak immunogenic molecules and the mechanisms of the generation of the CPS-specific humoral response remain poorly known. Thus, the main objective of this thesis was to evaluate the characteristics and the mechanisms of the development of the Ab response directed against S. suis and GBS CPSs, as well as the influence of the biochemistry of the CPS on this response. We worked with S. suis types 2 and 14 and GBS types III and V, whose CPSs present several similarities in their compositions and structures, including the presence of sialic acid, a potentially immunosuppressive sugar, while being very distinct antigens. Initially, we analyzed the features of the CPS-specific serum Ab response to whole bacteria. S. suis-infected mice developed a very low (S. suis type 2) to undetectable (S. suis type 14) response restricted to the IgM isotype, and were unable to mount an efficient memory response after a secondary infection. A similar profile of response was obtained in S. suis type 2-infected pigs. We detected significant CPS-specific IgM titers in GBS-infected mice (type III or V). Nonetheless, the magnitude of the response remained globally low and no isotype switching was observed. Then, we examined the influence of the biochemistry of the CPS on these response profiles by conducting experiments with highly purified CPSs from these pathogens. Whereas the purified GBS type III CPS administrated to mice retained similar immunogenic properties as those observed during the infection with the intact bacteria, purified S. suis type 2 and GBS type V CPSs were no longer able to induce a specific Ab response. The analysis of the in vitro interaction between the CPSs and murine dendritic cells (DCs), crucial actors in the detection of pathogens and the orchestration of subsequent immune responses, revealed that these molecules stimulate the production of significant levels of chemokines through different receptors. Nevertheless, CPSs were unable to induce cytokine secretion and interfered with the ability of DCs to express BAFF, a key cytokine for B lymphocyte differentiation into plasma cells. The use of chemically desialylated CPSs demonstrated that sialic acid does not play a major immunosuppressive role in the development of the Ab response specific to purified S. suis or GBS CPSs, neither on the in vitro interaction between CPSs and DCs, nor on the profile of the in vivo response. Other biochemical properties intrinsic to these CPSs would be responsible for the inaptitude of the infected host to mount an adequate Ab response, and their identification will be a precious tool for a better understanding of the immunopathogenesis of S. suis and GBS, as well as for the development of efficient strategies to fight against these bacteria.

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Streptococcus suis est un important pathogène bactérien causant de graves maladies invasives telles que la septicémie, l’endocardite, la méningite et la mort subite chez les porcs. La bactérie est également capable de causer des zoonoses, où la méningite, le choc septique et la mort pourront être observés. Comme il n’existe présentement aucun vaccin universel efficace disponible commercialement, les antibiotiques restent le seul outil efficace permettant de limiter et prévenir les infections par S. suis. Toutefois, une augmentation de la présence de résistance aux antimicrobiens est observée parmi les souches de S. suis. Cette situation est alarmante, d’autant plus que la bactérie pourrait potentiellement agir comme réservoir de gènes de résistance et les transmettre à d’autres streptocoques pathogènes, tels que Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae et Streptococcus agalactiae, ce qui pourrait avoir de graves conséquences pour la santé animale et humaine. Il devient donc crucial d’améliorer les connaissances sur l’établissement de la réponse immunitaire contre S. suis pour pouvoir améliorer le développement de futurs vaccins efficaces. Ainsi, les objectifs de cette thèse sont d’étudier les interactions entre les cellules B et Streptococcus suis, et d’évaluer leur impact sur le développement de la réponse humorale. Dans un premier temps, une caractérisation globale de l’établissement de la réponse humorale et de l’activation des cellules B, ont été effectuées grâce à des infections expérimentales avec S. suis sérotype 2 (sérotype le plus important chez le porc et l’humain) dans un modèle murin. Ceci a permis d’observer que S. suis module la réponse des cellules B et cause un ralentissement de la formation des sites de spécialisation des cellules B activées, les centres germinatifs, accompagné d’une absence de gain d’avidité des IgG chez la souris. Également, il a été observé que les anticorps IgM ciblant la bactérie, et sa capsule polysaccharidique, étaient les plus impliqués dans l’élimination de S. suis sérotype 2 tandis que les IgGs semblaient jouer un rôle mineur. Par la suite, les cellules de la rate de souris, infectées ou non, ont été cultivées pour observer leur réponse, grâce à la production de cytokines, suite à une infection avec S. suis. Des co-cultures composées d’une combinaison de cellules dendritiques ainsi que des cellules T et B isolées à partir de la rate de souris, infectées ou non, ont également été employées pour déterminer la production spécifique des cellules T et B. Les cellules spléniques issues de souris infectées avec S. suis présentaient un profil de production de cytokines altéré, avec une plus forte production d’IL-10 que celles issues de souris naïves, ce qui pourrait partiellement expliquer la modulation de la réponse humorale observée précédemment. Les cellules B ont également été identifiées comme de fortes productrices d’IL-1β, IL-12p70 et IFN-γ, mais nécessitaient d’avoir été préalablement exposées aux antigènes bactériens pour atteindre la production maximale. Les cellules B étaient également capables d’agir de concert avec les cellules dendritiques, et produire plus de cytokines. De plus, il a été observé que la capsule polysaccharidique de la bactérie modulait la production de cytokines par les cellules du système immunitaire. Finalement, le rôle joué par la structure de la capsule polysaccharidique de la bactérie sur l’établissement et le rôle de la réponse immunitaire humorale a été évalué en comparant les capsules des sérotypes 2, 3, 4, 7, 8, 9 et 14 de S. suis. Il a été déterminé que la structure de la capsule influence la protection offerte contre la réponse immunitaire chez la souris. De plus, la CPS influence également la détection des antigènes sous-capsulaires par les anticorps, ce qui entraînerait des conséquences sur l’élimination induite grâce à ceux-ci. Également, la structure de la capsule polysaccharidique de certains sérotypes de S. suis offrirait une protection supérieure à celle d’autres sérotypes, ce qui pourrait influencer la virulence des isolats en plus d’affecter l’efficacité vaccinale grâce au masquage des antigènes de surface. Les résultats obtenus lors de cette thèse apportent de nouvelles connaissances sur le développement des anticorps contre S. suis et sur l’identité des anticorps utiles contre S. suis. De plus, des informations nouvelles ont été obtenues sur la réponse des cellules B face au contact avec S. suis et sur l’impact qu’à la capsule polysaccharidique, ainsi que sa structure, sur la détection de la bactérie par les cellules B et les anticorps. Les connaissances apportées à la communauté scientifique grâce aux travaux décrits dans cette thèse permettent d’élucider des questions importantes au sujet de S. suis et établir les bases permettant de développer des vaccins efficaces contre Streptococcus suis. / Streptococcus suis is an important bacterial pathogen that causes severe invasive diseases such as septicemia, endocarditis, meningitis, and sudden death in pigs. The bacterium is also able to cause zoonosis where meningitis, septic choc and death can be observed. Since there is currently no universal effective vaccine commercially available, antibiotics remain the sole tool available to prevent and limit S. suis infections. However, an increase in S. suis strains showing resistances has been observed. This situation is preoccupying since the bacteria could serve as a reservoir for resistance genes and could pass these genes to other pathogenic streptococci, such as Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae and Streptococcus agalactiae, which could have dire consequences for animal and human health. Thus, it becomes crucial to deepen our knowledge on how the immune response is established against S. suis to help improve the development of future effective vaccines. The objectives of this thesis are to study the interactions between B cells and Streptococcus suis and evaluate their impact on the development of the humoral response. First, a global characterisation of the establishment of the humoral response and the activation of B cell was performed following experimental infections with S. suis serotype 2 (the most important serotype in both pigs and humans) in a mouse model. This permitted the observation that S. suis was able to modulate the response of B cells by impairing the formation of germinal centers, the specialisation sites for activated B cells, and was paired with a lack of IgG avidity increase. Additionally, it was observed that IgM antibodies that target the bacterium, and its CPS, are the ones mainly involved in the elimination of S. suis serotype 2 and IgGs played a lesser role. Following this, the cells from the spleens of mice, infected or naïve, were cultivated to observe their response, by monitoring cytokine production, following infections with S. suis. Co-culture systems comprised of a combination of dendritic cells and T and B cells isolated from the spleens of mice, infected or naïve, were also employed to determine the specific production of cytokines by T and B cells. Splenic cells isolated from mice infected with S. suis presented a cytokine production profile that was altered, and showcased a strong production of IL-10, which could explain the modulation of the humoral response previously reported. B cells were identified as strong producers of IL-1β, IL-12p70 et IFN-γ but needed to be pre-exposed to bacterial antigens to reach maximal production. Additionally, B cells were able to act in synergy with dendritic cells and produce higher amounts of cytokines. It was also observed that the capsular polysaccharide of the bacteria played a significant role and modulated the production of cytokines by immune cells. Next, the role played by the structure of the capsular polysaccharide of the bacteria on the establishment and role of the humoral response was evaluated by comparing the capsules of S. suis serotypes 2, 3, 4, 7, 8, 9 and 14. It was determined that the structure of the capsule influences the protection offered against the immune response of mice and influenced the detection of sub-capsular antigens by antibodies which could limit elimination induced by them. Additionally, the structure of the capsular polysaccharide of some serotypes of S. suis could provide higher levels of protection than other serotypes, which could have implications in the virulence of isolates and vaccine efficacy by masking surface antigens. The results obtained during this thesis bring new knowledge on the development of antibodies targeting S. suis and on the identity of useful antibodies to fight S. suis infections. Additionally, new informations have been obtained on the response of B cells following contact with S. suis and the impact that the capsular polysaccharide, and it’s structure, has on the detection of the bacteria by cells and antibodies. The knowledge brought to the scientific community thanks to the work described in this thesis bring answers to important questions surrounding S. suis and set foundations to help develop efficacious vaccines against Streptococcus suis.

Streptococcus du Groupe B (GBS) et Streptococcus suis sont deux pathogènes encapsulés qui induisent des pathologies similaires dont la méningite et la septicémie chez les animaux et/ou les humains. Les sérotypes III et V du GBS et les sérotypes 2 et 14 du S. suis (utilisés dans cette étude) sont parmi les plus prévalents et/ou les plus virulents. La capsule polysaccharidique (CPS) définit le sérotype et est considérée comme un facteur de virulence essentiel pour les deux espèces bactériennes. Malgré que plusieurs études aient été réalisées au niveau des interactions entre ces streptocoques et les cellules de l’immunité innée, aucune information n’est disponible sur la régulation de la réponse immunitaire contre ces pathogènes par les cellules dendritiques (DCs) et leur interactions avec d’autres cellules, notamment les cellules ‘natural killer’ (NK). Dans cette étude, différentes approches (in vitro, ex vivo et in vivo) chez la souris ont été développées pour caractériser les interactions entre les DCs, les cellules NK et GBS ou S. suis. L’utilisation de mutants non encapsulés a permis d’évaluer l’importance de la CPS dans ces interactions. Les résultats in vitro avec les DCs infectées par GBS ou S. suis ont démontré que ces deux pathogènes interagissent différemment avec ces cellules. GBS est grandement internalisé par les DCs, et ce, via de multiples mécanismes impliquant notamment les radeaux lipidiques et la clathrine. Le mécanisme d’endocytose utilisé aurait un effet sur la capacité du GBS à survivre intracellulairement. Quant au S. suis, ce dernier est très faiblement internalisé et, si le cas, rapidement éliminé à l’intérieur des DCs. GBS et S. suis activent les DCs via différents récepteurs et favorisent la production de cytokines et chimiokines ainsi que l’augmentation de l’expression de molécules de co-stimulation. Cette activation permet la production d’interferon-gamma (IFN-y) par les cellules NK. Cependant, GBS semble plus efficient à activer les DCs, et par conséquent, les cellules NK que S. suis. La production d’IFN-y, en réponse à la stimulation bactérienne, est principalement assurée par un contact direct entre les DCs et les cellules NK et ne dépend qu’en partie de facteurs solubles. De plus, nos résultats in vivo ont démontré que ces deux streptocoques induisent rapidement la libération d'IFN-y par les cellules NK lors de la phase aiguë de l'infection. Ceci suggère que les interactions entre les DCs et les cellules NK pourraient jouer un rôle dans le développement d’une réponse immune T auxiliaire de type 1 (T ‘helper’ 1 en anglais; Th1). Cependant, la capacité de S. suis à activer la réponse immunitaire in vivo est également plus faible que celle observée pour GBS. En effet, les CPSs de GBS et de S. suis jouent des rôles différents dans cette réponse. La CPS de S. suis empêche une activation optimale des DCs et des cellules NK alors que c’est l’opposé pour la CPS de GBS, indépendamment du sérotype évalué. En résumé, cette étude adresse pour la première fois la contribution des DCs et des cellules NK dans la réponse immunitaire innée lors d’une infection à GBS ou à S. suis et, par extension, dans le développement d’une réponse Th1. Nos résultats renforcent davantage le rôle central des DCs dans le contrôle efficace des infections causées par des bactéries encapsulées. / Group B Streptococcus (GBS) and Streptococcus suis are two encapsulated pathogens that induce similar pathologies, including septicemia and meningitis in animals and/or humans. Serotypes III and V of GBS and serotypes 2 and 14 of S. suis (evaluated in this study) are the most prevalent and/or virulent types. The capsular polysaccharide (CPS) defines the serotype and is considered as a key virulence factor for both bacterial species. Although several studies have addressed the interactions of these streptococci and various cells of the innate immune system, no information is available on the regulation of the immune response against these pathogens by dendritic cells (DCs), and their interactions with other cells, including natural killer (NK) cells. In this study, different approaches (in vitro, ex vivo and in vivo) in mice were developed to characterize the interactions between DCs, NK cells and GBS or S. suis. Non-encapsulated mutants were used to evaluate the importance of the CPS in these interactions. In vitro results with GBS- or S. suis-infected DCs showed that these two pathogens differently interact with these cells. GBS is largely internalized by DCs through multiple endocytosis mechanisms, mainly involving lipid rafts and clathrin. The use of a specific endocytosis pathway might help GBS to survive intracellularly. In contrast, S. suis is poorly internalized and, if the case, rapidly eliminated within the DCs. GBS and S. suis activate DCs through different receptors leading to the release of cytokines and chemokines and increased expression of co-stimulatory molecules. This activation allows the production of IFN- by NK cells. Yet, S. suis capacity to activate DCs and NK cells is lower than that observed for GBS. IFN- release in response to bacterial stimulation was mainly mediated by direct DC-NK cell contact and only partially dependant on soluble factors. In addition, our in vivo results showed that these two streptococcal species rapidly induce the release of IFN- by NK cells during the acute phase of the infection. This suggests that the DC-NK crosstalk might play a role in the development of a T helper 1 (Th1) response. Yet, S. suis capacity to activate the in vivo immune response was also lower than that observed for GBS. In fact, GBS and S. suis CPSs play different roles in this response. S. suis CPS prevents optimal activation of DCs and NK cells whereas it is the opposite for GBS, independently of the serotype tested. In summary, this study addresses for the first time the contribution of DCs and NK cells to the innate immune response against GBS and S. suis infections, and by extension, to the development of a Th1 response. Our results further highlight the central role of DCs in the effective control of infections caused by encapsulated bacteria.