Die entzündliche Kardiomyopathie ist eine heterogene Erkrankung. Die häufigste Ursache ist eine Virusinfektion, wobei Parvovirus B19 (B19V) der bedeutendste Erreger ist. In dieser Arbeit wurden potenzielle Therapie für die speziellen klinischen Verläufe und deren Phänotypen untersucht. In vitro konnte gezeigt werden, dass Telbivudin in B19V-infizierten/B19V-non-structural protein-1-stimulierten humanen mikrovaskulären Endothelzellen (HMEC-1) endothelial-protektiv wirkt. In einem klinischen Versuch wurden dann 4 Patienten, bei denen eine aktive Transkription des B19V nachgewiesen wurde, für 6 Monate mit Telbivudin behandelt. Alle Patienten verbesserten sich. Ein anderes klinisches Szenario stellt die schwere Entzündung des Myokards dar, welche gewöhnlich mit einer inaktiven/persistierenden Infektion des B19V verbunden ist. Eine Behandlung mit Immunsuppressiva ist hier umstritten, da eine Reaktivierung des Virus befürchtet wird. Um diesen Aspekt weiter zu untersuchen, würde eine Therapie mit Prednisolon in Kombination mit Azathioprin bei 51 B19V-positiven und 17 B19V-negativen Patienten angewandt. Beide Gruppen profitierten in ähnlichem Maße von der Kombinationstherapie, wobei sich die Virusmenge nicht signifikant veränderte. Bei B19V-negativen Patienten konnte über die Persistenz von CD20+ B-Lymphozyten in den EMBs die Untergruppe der „Steroide non-responder“ klassifiziert werden. Im weiteren Verlauf wurden 6 Patienten mit Rituximab, einem monoklonalen Antikörper, der spezifisch gegen CD20+ B-Lymphozyten gerichtet ist, behandelt. Hiervon zeigten 5 Patienten eine ausgezeichnete klinische Verbesserung. Ein Patient mit Myokarditis-induzierten kardiogenen Schock zeigt, dass die Entlastung des linken Ventrikels mittels eines Mikroaxialpumpensystems zu einer rapiden Abnahme der Entzündungszellen führt. Zusammenfassend liefert diese Arbeit Belege für die Wirksamkeit und die Notwendigkeit einer phänotypbasierten Behandlung bei der entzündlichen Kardiomyopathie. / Inflammatory cardiomyopathy is a heterogenous disease. Viral etiologies are the most common, with parvovirus B19 (B19V) being the most prominent culprit. Currently, no specific treatment for inflammatory cardiomyopathy exists. In this study, tailored treatment strategies were investigated as potential therapies for specific clinical scenarios. The antiviral drug telbivudine was investigated in the setting of EMB-proven B19V-associated inflammatory cardiomyopathy. In cell culture, telbivudine exhibited endothelial-protective effects on B19V-infected/B19V-non-structural protein-1-stimulated human microvascular endothelial cells (HMEC-1). Clinically, four B19V-positive patients improved following six-month telbivudine regimen in a single-patient use approach. The results were translated to the “PreTOPIC” clinical study, for further evaluation in a randomized placebo-controlled setting. In a different clinical scenario, severe myocardial inflammation is usually associated with inactive/persistent B19V. Here, the use of immunosuppression is controversial, fearing viral flare-up. We investigated combined prednisolone/azathioprine therapy in 51 B19V-positive and 17 B19V negative patients in a single-center observational study. Both groups gained similar benefit, while viral loads did not significantly vary. Among virus-negative phenotypes, EMB-proven CD20+ B lymphocyte persistence characterized a subgroup of steroid non-responders. In this cohort, six patients were treated with rituximab, a monoclonal antibody selectively targeting CD20+ B lymphocytes. Five patients showed outstanding clinical improvement parallel to CD20+ B lymphocyte depletion. Lastly, in a single case of myocarditis-induced cardiogenic shock, mechanical left ventricular unloading via axial flow pump proved to exert disease-modifying effects. In conclusion, this thesis provides evidence for the efficacy and need for phenotype-based inflammatory cardiomyopathy treatment.

Von regenerativen Zellen freigesetzte vesikuläre Strukturen mit einer Lipiddoppelmembran, sogenannte extrazelluläre Vesikel (EVs), stellen einen vielversprechenden Ansatz dar zukünftig Herz-Kreislauf-Erkrankungen zu behandeln. In diesem Zusammenhang untersuchte die vorliegende Arbeit die Eignung von EVs allogener humaner Herzzellen (CardAP-Zellen) als mögliches Therapeutikum für Erkrankungen des Herzens. Zu diesem Zwecke wurden die EVs durch differentielle Zentrifugation aus dem konditionierten Medium von CardAP-Zellen nach Kultivierung mit oder ohne pro-inflammatorische Zytokine gewonnen. Die so isolierten EV- Präparationen beider Konditionen zeigten vergleichbare Konzentrationen und verfügten sowohl über charakteristische vesikuläre Strukturen als auch transportierte Moleküle, wie die Tetraspanine. Allerdings wiesen stimulierte EVs im Gegensatz zur nichtstimulierten Vergleichsgruppe ein größeres Repertoire an miRNAs und kleinere Durchmesser auf. In verschiedenen in vitro Analysen konnte zudem nachgewiesen werden, dass EVs von CardAP-Zellen i) die Angiogenese fördern, ii) die Apoptose von Herzzellen vermindern, iii) nur schwach immunogen sind und iv) induzierte Immunreaktionen verringern können. Dabei wurden teils deutliche Unterschiede zwischen den induzierten Effekten von EVs aus stimulierten und nichtstimulierten Konditionen dokumentiert, die darauf schließen lassen, dass verschiedene Mechanismen in der Empfängerzelle angeregt werden durch die Interaktion mit den jeweiligen EVs. Insbesondere konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass CD14+ Immunzellen eine essentielle Rolle bei der immunmodulierenden Wirkung der EVs in induzierten Immunreaktionen besitzen. Zusammenfassend stellen EVs von allogenen CardAP-Zellen ein aussichtsreiches therapeutisches Werkzeug für Herz-Erkrankungen dar und zukünftige Studien werden klären, ob eine Anwendung im Menschen möglich ist. / From cells released vesicular structures with a lipid bilayer, the so-called extracellular vesicles (EVs), cannot reproduce but can affect important processes in a recipient cell. EVs of regenerative cells represent a promising therapeutic approach. In this context, the present work investigated whether heart diseases could be treated in the future by using EVs from allogeneic regenerative human cardiac cells (CardAP cells). For this purpose, EVs were isolated by differential centrifugation from the conditioned medium of CardAP cells cultured with or without pro-inflammatory cytokines. These obtained EV preparations from both EV biogenesis conditions exhibited comparable concentrations, characteristic vesicular structures, and characteristic transported molecules, such as the tetraspanins. However, stimulated EVs showed a larger repertoire of miRNAs and smaller diameters in contrast to their unstimulated counterpart. Most importantly, different in vitro analysis demonstrated that the isolated EVs from CardAP cells i) promote angiogenesis, ii) decrease cardiac cell apoptosis, iii) have a low immunogenicity, and iv) can reduce induced immune responses. Interestingly, differences were documented in these beneficial features between stimulated and unstimulated EV preparations, suggesting that different mechanisms in the recipient cell are stimulated by the interaction with the respective EVs. Moreover, CD14+ cells (mainly monocytes) were shown to play an essential role in the detected immunomodulation of EVs. In summary, EVs from CardAP cells appear to be a promising therapeutic tool for cardiac diseases and further studies will clarify open questions such as the efficacy in the organism.

Chemotherapien verursachen DNA-Schäden in Krebszellen, was zur Apoptose der meisten Zellen führt. Die überlebenden Zellen können in eine Therapie-induzierte Seneszenz (TIS) eintreten, die zum Zellzyklusarrest führt. Zellen in TIS weisen einen Seneszenz-assoziierten sekretorischen Phänotyp (SASP) auf – eine erhöhte Proteinproduktion, die proteotoxischen Stress bedingt. Verbliebene seneszente Zellen könnten jedoch wieder in den Zellzyklus eintreten und ihr SASP kann entzündungsfördernd wirken. Da seneszente Zellen besonders auf Proteinabbau angewiesen sind, um eine zu hohe Proteotoxizität zu vermeiden, zielten wir auf Proteindegradierungswege mit einer sekundären Therapie ab, um TIS Zellen zu eliminieren. Mittels Bcl2-überexprimierender Lymphome aus dem transgenen Eμ-myc Maus-Modell, die nach Chemotherapie in Seneszenz eintreten, und des Vergleichs mit Lymphomen, die aufgrund einer genetischen Läsion nicht seneszent werden können. identifizierten wir eine verringerte proteasomale Aktivität in TIS, die mit Kennzeichen von proteotoxischem Stress korrelierte. Dabei hängt die daraus folgende Empfindlichkeit von TIS Zellen für proteasomale Hemmung von NF-κB regulierter SASP Produktion ab. Die Kombination aus proteasomaler Hemmung durch Bortezomib und einem Autophagieblocker zeigte einen additiven Effekt auf den Zelltod von TIS Zellen. Diese Ergebnisse konnten in vivo anhand verbesserten Überlebens durch TIS-nachfolgende Sekundärtherapie von mit Lymphomen inokulierten Mäusen bestätigt werden. Schließlich konnte das Prinzip der Seneszenz-spezifischen Beseitigung von Tumorzellen unter Einsatz von Bortezomib in zwei humanen Lymphomzelllinien untermauert werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass seneszente Zellen auf eine intakte Proteinabbau-Maschinerie angewiesen sind und auf Veränderungen in proteasomaler Aktivität empfindlich reagieren. Diese Angreifbarkeit könnte in einer neuartigen, synthetisch lethalen Strategie ausgenutzt werden, um maligne Zellen effektiv zu eliminieren. / Chemotherapy causes DNA damage in cancer cells, causing apoptosis in most, but not all cells. Surviving cells can undergo therapy-induced senescence (TIS), an emergency mechanism that arrests the cell cycle. Cells in TIS exhibit a senescence-associated secretory phenotype (SASP) - a massive increase in protein production leading to proteotoxic stress. Sustained senescent cells might reenter the cell cycle, and their SASP can stimulate dangerous inflammation. Aiming to eliminate remaining TIS cells, we reasoned that they need to reduce their excessive protein burden and avoid proteotoxicity and we therefore targeted protein degradation pathways with a secondary treatment. Using Bcl2-overexpressing lymphomas from the Eμ-myc mouse transgenic model, which become senescent after chemotherapy, and comparing them to lymphomas that do not become senescent due to a genetic impairment, we found reduced proteasomal activity in TIS, correlating to hallmarks of proteotoxic stress, such as accumulation of protein aggregates and oxidized proteins. The consequential sensitivity of TIS cells to proteasome inhibition was dependent on NF-κB governed SASP production. Very significantly, combining proteasome inhibition by bortezomib with autophagy inhibition had an additive effect on susceptibility to rapid death after TIS. These findings were confirmed by in vivo treatments improving survival of mice carrying lymphomas that had been treated into TIS. Lastly, the senescent-specific clearance of cells by bortezomib following TIS induction was confirmed using two human, lymphoid cell lines, supporting the proof-of-principle. This study suggests that senescent cells are highly dependent on protein disposal and are hypersensitive to changes in proteasome activity. This vulnerability might be exploited in a novel synthetic lethality strategy to fully eliminate malignant cells.

In dieser Arbeit, wurden Endozytose und intrazellulären Transportwegen für zwei verschiedene biologisch relevante Nanopartikel (dendritisch Polyglycerolsulfat (dPGS-np) und Polyethylenimin beschichtete Goldnanopartikel (PEI-np)) mit Kryo-Röntgentomographie untersucht. Diese Untersuchungen zeigten, beide Nanopartikeln über Makropinozytose endozytiert werden und dass die meisten Nanopartikel in Endosomen, multivesikulären Körpern und Lysosomen lokalisiert sind. Trotz dieser Ähnlichkeiten im Verhalten beider Partikel gab es auch Unterschiede die zeigten. Im Gegensatz zu PEI-np, wurden einige dPGS-np in Lipidtröpfchen gefunden. Weiterhin verursachen die PEI-np bei einer Konzentration von 0,13 nM ein Zerplatzen von Lysosomen in erheblichem Ausmaß wodurch die Nanopartikel in das Zytoplasma entweichen und teilweise in den Zellkern eindringen. Im Unterschied dazu konnte kein Nachweis für ein Zerplatzen von Lysosomen durch dPGS-np erbracht werde. Interessanterweise wurde ein Wechsel des Endocytose-Weges von der Makropinozytose zu einer mutmaßlichen Caveolae-vermittelten Endozytose beobachtet, wenn die PEI-np-Konzentration um das Zehnfache reduziert wurde. Unter diesen Bedingungen induzierten PEI-np kein Zerplatzen von Lysosomen mehr. Das Ausbleiben von zerplatzten Lysosomen bei dieser niedrigeren Konzentration korreliert mit einer verringerten Zellschädigung und hat somit wichtige Auswirkungen auf die Verwendung von PEI beim Gentransfer. Überraschenderweise stellte sich heraus, dass beide Nanopartikelarten eine bisher nicht beobachtete umfassende zytoplasmatische Veränderungen in den Zellen induzierten. Insbesondere wurden nach der Inkubation mit beiden Diese zytoplasmatischen Veränderungen könnten wichtige physiologische Veränderungen widerspiegeln, jedoch ist hierzu zusätzliche Forschung erforderlich. Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass das Verhalten biologisch relevanter Nanopartikel in Zukunft vorhersehbarer werden kann durch weitere systematische Studien. / In this thesis, the endocytosis and trafficking pathways of two different biologically relevant nanoparticles, namely dendritic polyglycerol sulfate coated gold nanoparticles (dPGS-np) and polyethyleneimine coated gold nanoparticles (PEI-np) were investigated via cryo soft X-ray tomography. Both nanoparticles were found to be endocytosed predominantly via macropinocytosis, and most nanoparticles became localized to endosomes, multivesicular bodies and lysosomes. Despite these similarities in trafficking, there were also key differences. Some dPGS-np were found in lipid droplets but no PEI nanoparticles were found in this compartment. At a concentration of 0.13 nM, PEI-np were observed to induce extensive rupture of lysosomes, leading to significant levels of cytoplasmic escape and nuclear entry. In contrast, no evidence for lysosomal rupture with dPGS-np was detected, and concomitantly very low levels of cytoplasmic escape and no nuclear entry were found. Interestingly, when the PEI-np concentration was reduced by ten-fold, a switch in the endocytosis pathway from macropinocytosis to a putative caveolae-mediated endocytosis was observed. Importantly, under these conditions, PEI nanoparticles no longer induced lysosomal rupture. This lack of lysosomal rupture at the lower concentration was correlated with reduced cellular damage, and so has important implications for use of PEI in gene delivery. Most surprisingly, both nanoparticle types were found to induce similar global cytoplasmic alterations in the cells. These cytoplasmic alterations could reflect important physiological changes, but further work is required to determine this. Our observations suggest that the behavior of biologically relevant nanoparticles might become more predictable in the future by further application of systematic studies.

Die molekulare Charakterisierung von genetischen Veränderungen der Akuten Myeloischen Leukämie (AML) wurde vor allem bei jungen Patienten vorangebracht, hingegen fehlen Analysen für die AML bei älteren Patienten. Entsprechend ergab sich die Rationale, genetische und epigenetische Alterationen bei älteren AML Patienten zu untersuchen, um spezifische Signaturen zu identifizieren. Wir untersuchten ältere 93 AML Patienten aus dem Study Alliance Leukemia (SAL) Register. Es wurden 555 Gene auf der Illumina HiSeq2000 Plattform sequenziert und DNA Methylierungsprofile mittels dem Illumina 450K Array untersucht. Insgesamt wurden 814 molekulare Alterationen in 281 Genen detektiert. Besonders hohe Mutationsfrequenzen wurden in den Genen DNMT3A (33%), TET2 (24%), SRSF2 (23%) und ASXL1 (21%) notiert. Alterationen in epigenetischen Regulatoren (85%) und in Genen, die in Splicing involviert sind (38%), wurden gehäuft beobachtet. Ältere AML Patienten mit Mutationen in DNMT3A oder DNA Reparaturgenen wiesen eine geringere Lebenserwartung im Vergleich zu der restlichen Kohorte auf. Wir verglichen die Meythlierungsdaten aus der SAL mit denen der TCGA Kohorte, umso die Methylierungsmuster von älteren mit denen von jüngeren Patienten zu differenzieren. Es konnte ein distinktes Methylierungsprofil in den DNA Proben von älteren AML Patienten nachgewiesen werden. Die im Vergleich zu jüngeren AML Patienten unterschiedlich methylierten Regionen bei älteren AML Patienten überlappten mit Genen verschiedener Signalwege, die Hallmarks von Alterungsprozessen und Krebs entsprechen. Zusammenfassend konnten wir für die Kohorte älterer AML Patienten genetische Alterationen nachweisen und mit spezifischen Profilen von Mutationen in epigenetischen Regulatoren korrelieren. Diese molekulare Kategorisierung unterstreicht distinkte biologische Mechanismen in älteren AML Patienten und die Notwendigkeit von spezifischen Therapieansätzen für diese Kohorte mit ungünstiger Prognose. / Despite advances in the characterization of molecular alterations in younger acute myeloid leukemia (AML) patients, comprehensive studies in elderly AML are lacking. Thus, we investigated genetic and epigenetic alterations and probed for specific signatures to understand the unfavorable outcomes of elderly AML. We studied 93 AML patients (65 to 90 years old), enrolled in the Study Alliance Leukemia registry (SAL). To capture a broad spectrum of alterations, we sequenced 555 genes on an Illumina HiSeq2000 platform and investigated DNA methylation profiles using the Illumina 450K array. Overall, we detected 814 molecular alterations in 281 genes, with a median of 7 genes mutated per patient. Particularly high mutation frequencies were identified for DNMT3A (33%), TET2 (24%), SRSF2 (23%) and ASXL1 (21%). We observed frequent alterations in epigenetic regulators (85%) and in splicing factors (38%). Notably, SAL elderly AML patients with mutations in DNMT3A or DNA repair genes (in absence of mutations in NPM1 or splicing factors) had an inferior survival of only 9 months (compared to 17 months for the remaining patients). In addition, for the analysis of elderly AML DNA methylation, we integrated the SAL cohort with TCGA methylation data for comparisons of methylation levels to younger patients. A distinct DNA methylation profile was observed in older AML patients, which correlated with the presence of mutations in IDH1/2, RUNX1 and ASXL1 and epigenetic similarities with TP53/Complex samples. The differential methylated regions of elderly AML (compared to younger AML samples) were shown to overlap genes from several pathways that are hallmarks of both age and cancer. In conclusion, we unraveled distinct patterns of genetic alterations and correlated specific epigenetic profiles of elderly AML to high rate mutated epigenetic regulators. This molecular categorization underscored the distinct biology and the need for specific therapeutic approaches in elderly AML.

Serotonin gilt als Hauptangriffsstelle gängiger Antidepressiva bei schweren Depressionen, wie bspw. selektive Serotonin-Wiederaufnahmehemmer (SSRI), und -Enhancer (SSRE). Es bleibt offen, ob SSRI / E ausschließlich über die Manipulation des Serotoninspiegels wirken, oder ob alternative Signalwege daran beteiligt sind. Ansatzpunkte hierfür sind beispielsweise die neurotrophen Signalwege (spez. Brain derived neurotophic factor, BDNF) oder die Hypothalamus-Hypophysen-Nebennieren- (HPA) – Signalwege des Stressachsensystems. Ebenfalls wurde in Nagetiermodellen beobachtet, dass mit der Dysregulation des zentralen Serotoninsystems bei schweren Depressionen, ein Rückgang der Neurogenese im Gyrus dentatus des Hippocampus einhergeht. Ziel dieser Arbeit war, das Zusammenspiel von Serotonin, BDNF, adulter Neurogenese und der Stressachse zu untersuchen. Zentrum der Studien ist ein Mausmodell, mit einer genetischen Depletion des zentralen Serotonin-synthetisierenden Enzyms Tryptophanhydroxylase 2 (sog. Tph2-/- Mäuse). Es wurden die physiologische Reaktionen auf die Behandlung mit gängigen Antidepressiva abhängig von der Abwesenheit von Serotonin untersucht, um mögliche alternative Signalwege aufzeigen zu können. Die bekannte Zunahme der Neurogenese nach SSRI/SSRE-Behandlung wurde in Wildtyptieren beobachtet, während die Therapie in Tph2-/- Mäusen keine direkte kausale Wirkung zeigte. Im Gegensatz dazu waren die BDNF-Spiegel in depressionsrelevanten Hirnregionen in Tph2-/- Mäusen nach SSRI, signifikant verringert. Auch zeigen die Studien eine neurobiologische Relevanz von Serotonin im ZNS, bei den antidepressiven Mechanismen einer Elektrokonvulsiven Krampftherapie. Ebenfalls deuten erhöhte Neurogeneseraten bei lebenslanger Abwesenheit von Serotonin im ZNS, Therapiemethoden-unabhängig, möglicherweise auf eine modulierte Stressreaktion hin. Untersuchungen der Parameter des HPA-Stressachsensystems, wiesen auf einen grundlegend veränderten Stresshormonspiegel in Tph2-/- Mäusen hin. / Serotonin, the "molecule of happiness" is an important target for antidepressants. The mainly prescribed drugs in major depression are selective serotonin re-uptake inhibitors (SSRI); but recently, SSR-enhancer (SSRE) have also attracted clinical attention. However, only a quarter of patients responds to treatment. It needs to be determined, whether SSRI/E act solely via manipulating serotonin levels or whether other pathways are involved, e.g. neurotrophic signaling (brain-derived neurotrophic factor, BDNF) or the hypothalamus-pituitary-adrenal (HPA)-axis. Furthermore, in major depression, dysregulation of central serotonin signaling is accompanied with a decline in hippocampal neurogenesis, as has been observed in rodent models. At the center of this thesis is a mouse model deficient in the central serotonin-synthesizing enzyme, tryptophan hydroxylase 2 (Tph2-/- mice). I have investigated physiological responses to antidepressant treatment in the absence of brain serotonin, and the possible role of alternative pathways. I observed the typical increase in neurogenesis upon SSRI treatment in WT mice, while it had no effect in Tph2-/- mice. In contrast, BDNF levels were significantly decreased in Tph2-/- mice after treatment with no effect in WT control mice. Furthermore, my results show a critical role of brain serotonin in the neurobiological effects of electroconvulsive seizure. Surprisingly, in animals lacking central serotonin, increased neurogenesis was observed independently of the treatment. The gathered data indicated an altered stress response; therefore, parameters of the HPA-axis have been studied, indicating a downregulated HPA system in Tph2-/-animals in baseline state, but showed no difference in treatment or feedback control. This thesis gives insight into the mechanisms of antidepressant action and reveals ideas for novel pathways involved in the process that could be used as targets in therapeutic approaches and further research in major depression.