Submitted by Cláudia Bueno (claudiamoura18@gmail.com) on 2016-01-20T16:01:25Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Luaciana Silva Lobo - 2011.pdf: 1289874 bytes, checksum: 72f8fd364b738135e2d30a5d5322d572 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-01-21T06:45:14Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Luaciana Silva Lobo - 2011.pdf: 1289874 bytes, checksum: 72f8fd364b738135e2d30a5d5322d572 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-01-21T06:45:14Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Luaciana Silva Lobo - 2011.pdf: 1289874 bytes, checksum: 72f8fd364b738135e2d30a5d5322d572 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2011-11-16 / Aedes aegypti is the principal vector of dengue virus in the tropics. Metropolitan Goiânia had the highest incidence of this arbovirose in Central Brazil between 2010 and 2011. Improved integrated control strategies are necessary in order to face vector resistance to chemicals. The entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae is effective against A. aegypti eggs, larvae and adults under laboratory conditions. There is still little knowledge on specific formulation and application techniques to control this mosquito with this and other fungi. The present study reports on the impact of substrates, previously treated or not with vegetable oil, diatomaceous earth and/or M. anisopliae IP 46 conidia on oviposition and survival of A. aegypti under laboratory conditions. In addition, the study presents results on field tests carried out in the city of Goiânia with adapted ovitraps. Laboratory reared adult A. aegypti females and males were exposed in cages to oviposition devices equipped with water, mud or filter paper. Moistened or dry filter paper treated with additives (vegetable oil Graxol® or diatomaceous earth KeepDry®) and/or M. anisopliae s. l. IP 46 conidia were tested as mono or poly-optional assays. Mortality and quantitative oviposition were assessed up to 15 days of exposure and eclosion of larvae after submersion of eggs in water up to 10 days. Field tests were run with adapted ovitraps treated with conidia of IP 46 formulated with water or oil-water. Females never laid eggs on dry filter paper and few eggs on water. Quantitative oviposition decreased at higher oil concentrations and gravid females laid eggs on fungus-treated filter paper regardless of the conidial concentration (poly-optional tests). Adult mortality reached 42.1% at a 15 day incubation when testing filter paper treated with oil-in-water conidia and this formulation reduced larval eclosion (mono-opcional tests). Under field conditions, eggs were detected on filter paper treated or not with water or oil-in-water formulated conidia. Gravid females detected gradient of humidity and oil but they were not influenced by the presence of the conidia. Toxicity of vegetable oil and virulence of IP 46 increased with time of exposure. M. anisopliae applied in a simulated breeding device and formulated in oil showed to be promising against A. aegypti under laboratory and Aedes sp. under field conditions. / Aedes aegypti é o principal vetor do vírus da dengue nos trópicos. A cidade de Goiânia teve a maior incidência dessa arbovirose no Centro-Oeste do Brasil entre 2010 e 2011. Melhores estratégias de controle integrado são necessárias para enfrentar a propagação da resistência desse vetor a produtos químicos. O fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae é efetivo contra ovos, larvas e adultos de A. aegypti em condições de laboratório. Entretanto, há pouco conhecimento sobre formulações e técnicas de aplicação específicas para controlar esse mosquito com esse e outros fungos. O presente estudo reporta o impacto de substratos previamente tratados ou não com óleo vegetal, terra diatomácea e/ou conídios de M. anisopliae s. l. IP 46 sobre a oviposição e sobrevivência de A. aegypti em condições de laboratório e apresenta resultados sobre testes de campo realizados na cidade de Goiânia em 2010 e 2011 com ovitrampas adaptadas. A. aegypti adultos colocados em laboratório foram expostos em gaiolas e expostos a dispositivos para oviposição equipados com água, lama ou papel filtro. Papel filtro úmido ou seco tratado com aditivos (óleo vegetal Graxol® ou terra diatomácea KeepDry®) e/ou conídios de IP 46 foram testados em ensaios de escolha poli ou mono-opcional. A mortalidade e oviposição quantitativa foram avaliadas até 15 dias de exposição e eclosão de larvas após submersão de ovos em água, até 10 dias. Os testes de campo foram executados com ovitrampas tratadas com conídios formulados em água ou óleo-água. Fêmeas ovipuseram mais sobre lama e papel filtro úmido, pouco sobre água e não ovipuseram sobre papel filtro seco. A oviposição quantitativa decresceu em concentrações mais elevadas do óleo, e fêmeas grávidas ovipuserm sobre papéis filtro tratados independente da concentração de conídios (testes poli-opcionais). A mortalidade de adultos alcançou até 42,1% em 15 dias de incubação ao testar papel filtro tratado com IP 46 formulado em óleo-água, e esse formulado reduziu a eclosão larval (testes mono-opcionais). Em condições de campo, ovos foram encontrados sobre papel filtro tratado ou não com conídios formulados em água ou óleo-água. Fêmeas grávidas de A. aegypti detectaram um gradiente de umidade e de óleo, mas não foram influenciadas pela presença de conídios. A toxicidade do óleo vegetal e a virulência de IP 46 aumentaram com o tempo de exposição. M. anisopliae formulado em óleo e aplicado em criadouro simulado mostrou ser promissor contra A. aegypti em condições de laboratório e contra e Aedes sp. em condições de campo.

Submitted by Cássia Santos (cassia.bcufg@gmail.com) on 2015-02-03T09:59:04Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Thiago Souza Azeredo Bastos - 2014.pdf: 2662232 bytes, checksum: 6d11a68317a80555fa7005a2f51b625b (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-02-05T13:29:30Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Thiago Souza Azeredo Bastos - 2014.pdf: 2662232 bytes, checksum: 6d11a68317a80555fa7005a2f51b625b (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-02-05T13:29:30Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Thiago Souza Azeredo Bastos - 2014.pdf: 2662232 bytes, checksum: 6d11a68317a80555fa7005a2f51b625b (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2014-02-24 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Insects of Lutzomyia genus have considerable importance in the transmission of diseases such as bartonellosis, arboviruses, and especially visceral and cutaneous leishmaniasis, both diseases present in the city of Goiás, place chosen to capture insects using CDC traps during twelve months in order to study the existing population of sandflies. Traps were placed throughout the urban area repeatedly for three nights in the last weekend of each month between September 2012 and August 2013. At the same time of trapping insects, relevant eco-epidemiological data were collected. After captures, all sandflies were identified. Were encountered in the city of Goiás eight species, in a total of 370 captured. The species were: Lutzomyia longipalpis, Lutzomyia whitmani, Lutzomyia intermédia, Lutzomyia lenti, Lutzomyia shannoni, Lutzomyia peresi, Lutzomyia baculus and Lutzomyia goiana. The results obtained through analysis by Kruskal -Wallis test and Poisson distribution showed significance for the relationship formed between the amount of gathered sandflies with season and rural area characteristic. Although few sandflies were obtained, the presence of female L. longipalpis was associated with the human and canine visceral leishmaniasis cases. / Os insetos do gênero Lutzomyia tem considerável importância na transmissão de doenças como bartonelose, arboviroses e, principalmente, a leishmaniose visceral e a leishmaniose tegumentar amer icana, ambas presentes na cidade de Goiás, local escolhido para realizar capturas de insetos com armadilhas tipo CDC durante doze meses, a fim de estudar a população de flebotomíneos existentes. As armadilhas foram posicionadas ao longo de toda a área urbana, repetidamente por três noites seguidas, no último final de semana de cada mês, entre setembro de 2012 e agosto de 2013. Além da captura de insetos, foram coletados dados eco-epidemiológicos. Após a captura, todos os flebotomíneos foram identificados. Ao final, foram identificados oito espécies na cidade de Goiás, de um total de 370 capturados. As espécies identificadas foram: Lutzomyia longipalpis, Lutzomyia whitmani, Lutzomyia intermédia, Lutzomyia lenti, Lutzomyia shannoni, Lutzomyia peresi, Lutzomyia baculus e Lutzomyia goiana. Os resultados obtidos, através de análise feita pelo Kruskal-Wallis e pelo modelo linear generalizado com distribuição de Poisson, apresentaram significância para a relação formada entre a quantidade de flebotomíneos capturados e o estágio lunar, estação do ano e as áreas com características rurais. Apesar de terem sido capturados poucos flebotomíneos, contatou-se a presença de fêmeas da espécie L. longipalpis além de caso humano e canino de leishmaniose visceral.

Made available in DSpace on 2015-04-20T12:31:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 jonathan.pdf: 3096267 bytes, checksum: 8d8efe41b3d0eaa2b1ee28e28f9ebb5e (MD5) Previous issue date: 2012-09-21 / Plasmids are extrachromosomal genetic elements that generally are not essential for survival of the bacteria , however , provide unique advantages ( as resistance to antibiotics) for the organism. For genetic engineering, naturally occurring plasmids have been modified extensively for the production of vectors with the desired characteristics. Promoters are elements of a vector which may have a profound effect on the strength and duration of transcription and, consequently, the protein yield . The mRNA synthesis starts when RNA polymerase binds the promoter sequence adjacent to the target gene. Sigma factors are proteins that regulate transcription in bacteria , and they can be activated in different environmental conditions . The sigma factor ( S ) is seen as a master regulator of the general stress response , encoded from the gene RpoS in late stationary phase . This factor is the primary regulator of the genes stationary phase . Prosecutors based metabolic regulators of stationary phase represent a class of promoters metabolically controlled and can be exploited for the design of expression vectors . This project were developed three expression cassettes for construction of expression vectors , which have promoters with affinity for sigma factor S , in order to evaluate the expression profile of recombinant proteins in Escherichia coli . To evaluate the strength of promoters and expression profiling , we used the green fluorescent protein ( GFP ) as a reporter gene . The three vectors constructed, which were named p26 , p53 and PFS expressed GFP in the correct formation of the fluorophore , and the vector p26 and p53 showed overexpression of the recombinant protein when compared to the vector pGS21a . Furthermore , it was observed that the vectors constructed here are contributing to the reduction in the rate of growth and filamentation of E. coli. This gives the morphological plasticity bacterium higher storage capacity of the recombinant protein expressed . / Plasmídeos são elementos genéticos extracromossomais, que no geral não são essenciais para a sobrevivência da bactéria, entretanto, conferem vantagens peculiares (como resistência à antibióticos) para o organismo. Para engenharia genética, plasmídeos de ocorrência natural têm sido modificados extensivamente para produção de vetores com as características desejadas. Promotores são elementos de um vetor que podem ter um profundo efeito na força e duração da transcrição, e consequentemente, no rendimento proteico. A síntese de mRNA inicia quando a RNA polimerase se liga a sequência promotora , adjacente ao gene alvo. Fatores sigma são proteínas que regulam a transcrição em bactérias, e os mesmos podem ser ativados em diferentes condições ambientais. O fator sigma (S) é visto como um regulador mestre de resposta ao estresse geral, codificado a partir do gene RpoS na fase estacionária tardia. Este fator é o regulador primário dos genes de fase estacionária. Promotores baseados em reguladores metabólicos de fase estacionária representam uma classe de promotores controlados metabolicamente e que podem ser explorados para o design de vetores de expressão. Neste projeto foram desenvolvidos três cassetes de expressão para a construção de vetores de expressão, os quais possuem promotores com afinidade pelo fator sigma S, com o objetivo de avaliar o perfil de expressão de proteínas recombinantes em Escherichia coli. Para a avaliação da força dos promotores e do perfil de expressão, utilizou-se a proteína verde fluorescente (GFP) como gene repórter. Os três vetores construídos, os quais foram denominados de p26, p53 e pFS expressaram a GFP com a correta formação do fluoróforo, sendo que os vetores p26 e p53 apresentaram superexpressão da proteína recombinante, quando comparados ao vetor pGS21a. Ademais, observou-se que os vetores aqui construídos estão contribuindo para a redução da taxa de crescimento e filamentação da E. coli. Esta plasticidade morfológica confere à bactéria maior capacidade de armazenamento da proteína recombinante expressa.

O manejo de fitoviroses muitas vezes é realizado com o uso de inseticidas para o controle do vetor. Para o patossistema Frankliniella zucchini / Cucurbita pepo / Zucchini lethal chorosis virus (ZLCV) não existe informação na literatura sobre a eficiência do controle da doença por meio do controle químico do vetor. Para tanto foi proposto este trabalho, que tem ainda por objetivo uma melhor compreensão da epidemiologia da doença em seus aspectos temporal e espacial. Os experimentos foram conduzidos na estação experimental de Fitopatologia da Escola Superior de Agricultura \"Luiz de Queiroz\" no período de março de 2010 a dezembro de 2011. Campos de abobrinha de moita foram divididos em parcelas com e sem aplicação do inseticida neonicotinóide Imidacloprid. As avaliações da doença foram feitas com base nos sintomas foliares característicos da doença, em intervalos de três a quatro dias, e confirmados por meio de teste ELISA. A Clorose Letal apresentou incidências de 11,58% e 52,55% em parcelas com inseticida e de 21,36% e 69,89% em parcelas sem inseticida, para os anos de 2010 e 2011, respectivamente. Em todos os casos, o modelo monomolecular apresentou melhor ajuste aos dados temporais e as plantas sintomáticas distribuíram-se aleatoriamente nas parcelas. Esses resultados sugerem que a disseminação primária é o processo predominante na epidemiologia da doença. A disseminação primária, neste caso, dá-se pelo influxo de vetores virulíferos de fora para dentro da plantação. O pequeno efeito benéfico do uso de inseticida está ligado ao controle da disseminação secundária da doença, de planta infectada para planta sadia dentro da plantação. Para o manejo racional da Clorose Letal é importante a determinação de hospedeiros alternativos do vírus e sua importância epidemiológica. O uso de inseticida, feito isoladamente, não é uma maneira eficiente de controlar da doença. / Management of virus diseases is often accomplished with insecticide spray to vector control. For pathosystem Frankliniella zucchini / Cucurbita pepo / Zucchini lethal chlorosis virus (ZLCV) there are no information about the efficiency of disease control by mean of vector chemical control. This research was proposed to fill this gap and, additionally, to better understand the epidemiology of the disease in its temporal and spatial aspects. Experiments were conducted at the experimental station of the Plant Pathology Department of ESA Luiz de Queiroz from March 2010 to December 2011. Fields of zucchini plants were divided into parcels, with and without insecticide application (Imidacloprid). Disease assessments were made based on disease symptoms at intervals of three to four days and confirmed by ELISA test. Lethal Chlorosis presented incidences of 11.58% and 52.55% in parcels with insecticide and of 21.36% and 69.89% in parcels without insecticide, for years 2010 and 2011, respectively. In all cases, the monomolecular model fitted better temporal data and symptomatic plants were distributed at random. These results suggest that primary dissemination is the predominant process in the epidemiology of the disease. Primary dissemination, in this case, is represented by the influx of viruliferous vectors from outside the field. The small effect caused by the use of insecticide is linked to the control of secondary dissemination inside the field. To manage rationally Letal Chlorosis it is important to identify the alternative hosts of virus and to determine its epidemiological relevance. Only to spray insecticide is not an efficient way for disease control in this case.

Huanglonghing (HLB) ou greening dos citros é uma séria doença associada a bactérias do gênero Candidatus Liberibacter, que no Brasil são transmitidas pelo psilídeo Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Psyllidae). Pela inexistência de variedades cítricas resistentes, as medidas de controle de HLB são preventivas, envolvendo o uso de mudas sadias; inspeção e erradicação de plantas sintomáticas e controle do vetor, que tem sido realizado de forma química. A pulverização sistemática de inseticidas para o controle de D. citri tem ameaçado o manejo integrado de pragas em citros, tornando-se necessário desenvolver medidas alternativas para o manejo deste inseto. A aplicação de um filme de partículas à base de caulim sobre as plantas pode substituir inseticidas no controle de ragas, por afetar a orientação à planta hospedeira e sua aceitação pelo inseto. O presente trabalho teve por objetivo avaliar o impacto do filme de partículas de caulim sobre a seleção hospedeira e desenvolvimento do psilídeo D. citri em citros. Em laboratório, realizaram-se estudos de preferência de D. citri para pouso, permanência e oviposição em seedlings de laranja Caipira [Citrus sinensis (L.) Osbeck] tratados com caulim (Surround®WP) a 5%, bem como sobre o efeito deste produto quando aplicado diretamente sobre ovos e ninfas em brotações cítricas. Verificou-se que D. citri rejeita plantas cítricas cobertas com filme de partículas de caulim para fins de pouso, permanência e oviposição, em testes de livre escolha entre plantas tratadas e não tratadas com este produto. Machos e fêmeas de D. citri se comportam de forma semelhante, rejeitando plantas cobertas com caulim e preferindo a face abaxial das folhas de plantas não tratadas. Na ausência de escolha, um número significativo de indivíduos de D. citri pousa e permanece por vários dias sobre plantas cítricas cobertas com caulim, porém inferior ao observado sobre plantas não tratadas. Havendo chance escolha entre plantas inteiramente cobertas com o filme de partículas, parcialmente cobertas (com brotos novos desprotegidos), e plantas não tratadas, verificou-se maior número de psilídeos sobre plantas com brotos desprotegidos do que em plantas inteiramente cobertas com o produto, indicando que a emissão de brotos em plantas tratadas reduz a eficácia do tratamento. A oviposição por D. citri é drasticamente reduzida sobre brotações cítricas cobertas com caulim, mesmo em condições de confinamento. Para avaliar o efeito no desenvolvimento de D. citri, caulim a 5% foi aplicado diretamente sobre ovos e ninfas de ínstares iniciais (1º-3º ínstar) e finais (4º-5º ínstar). A aplicação sobre brotações cítricas contendo ovos ou ninfas de diferentes estádios afetou o desenvolvimento de D. citri, reduzindo o numero de ninfas e/ou adultos produzidos. A eficiência de aquisição de Candidatus L. asiaticus por D. citri foi reduzida em plantas cobertas com caulim, sugerindo que o caulim possa também afetar a sua alimentação. Os resultados desta pesquisa indicam que a tecnologia de filme de partículas tem bom potencial para o manejo de D. citri, podendo ser testada em campo. / Huanglonghing (HLB) or Citrus greening is a serious disease associated to the phytopathogenic bacteria Candidatus Liberibacter spp., which in Brazil are transmitted by the Asian citrus psylla, Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Psyllidae). Due to the inexistence of resistant varieties, control measures of this disease are preventive, involving planting of healthy nursery trees, inspection and eradication of symptomatic plants and vector control. The frequent spraying of insecticides for controlling D. citri has threatened the integrated pest management in citrus, and the development of alternative methods for managing psyllid populations became a research priority. The particle film technology based on kaolin has shown to be effective for controlling some agricultural pests, because it affects host plant finding and acceptance by the insects. This research was carried out to assess the impact of kaolin particle films on host selection and development of D. citri on citrus. Laboratory studies were conducted to evaluate landing, permanence and oviposition of D. citri on sweet orange [Citrus sinensis (L.) Osbeck] seedlings treated with kaolin (Surround®WP) at 5% concentration in water, in relation to non-treated plants, as well as the effect of this product on psyllid development when applied directly on eggs and nymphs. It was found that D. citri rejects citrus plants covered with kaolin, in choice tests between treated x untreated plants. This behavior was the same for D. citri males and females, which preferred to land and remain on the leaf abaxial surface of untreated plants. In non-choice tests, significant numbers of psyllid adults landed and remained for several days on citrus covered with kaolin, but the population observed on non-treated plants was higher. In choice tests among citrus seedlings entirely covered with kaolin, partially covered (with uncovered young shoots) and untreated plants, higher number of psyllids were found on plants with uncovered shoots than on entirely covered plants, showing that the emission of young shoot on treated plants decrease treatment efficacy. Oviposition by D. citri is drastically reduced on kaolin-treated young shoots, even in non-choice (confinement) tests. To test the effect on D. citri development, kaolin was applied direclty on eggs, early-instar (1st-3rd instar) nymphs and late-instar (4th-5th instar) nymphs. The treatment on young citrus shoots containing eggs or nymphs of different stadia affected the development of D. citri, reducing the number of nymphs and adults produced per shoot. Acquisition efficiency of Candidatus L. asiaticus by D. citri was reduced on kaolin-treated plants, suggesting that this treatment may also affect vector feeding. Overall, the results of this research indicate that the particle film technology is a promising tool for managing D. citri populations in citrus groves, which could be tested for efficacy under field conditions.

O fator IX (FIX) da coagulação sanguínea é uma proteína dependente de vitamina K de grande valor farmacêutico no tratamento da Hemofilia B, o qual é baseado na administração do fator de coagulação derivado de plasma humano ou da proteína recombinante produzida em células murinas. A terapia baseada nestas abordagens apresenta alto custo e está associada às contaminações com vírus e príons, além do desenvolvimento de inibidores de FIX. Esses efeitos aumentam o risco de morbidade e mortalidade relacionadas às hemorragias. Neste trabalho, clonamos o cDNA do FIX em um vetor lentiviral e avaliamos a expressão da proteína recombinante em duas linhagens celulares humanas. A clonagem do cDNA do FIXh no vetor de expressão lentiviral 1054 foi confirmada através da análise com enzimas de restrição específicas obtendo-se as bandas esperadas de 1407 pb e 10054 pb visualizadas em gel de agarose. As linhagens celulares 293T e SK-Hep-1 foram transduzidas com o vetor lentiviral 1054-FIX gerado em nosso laboratório e as células que apresentaram maior expressão de EGFP foram selecionadas e separadas por citometria de fluxo. A quantificação da expressão de FIXrh foi realizada por ensaios de ELISA e cromogênico. A quantificação de FIXrh total foi de 500 ng/106 células para a linhagem 293T e 803 ng/106 células para a linhagem SK-Hep-1. A atividade biológica específica de FIXh nas células 293T e SK-Hep-1 foi 0,047 UI/106 células e 0,186 UI/106 células, respectivamente. Com o intuito de avaliar o perfil de produção de FIXrh ativo ao longo do tempo, foi realizado um acompanhamento de 180 dias, no qual foi observado que a linhagem SK-Hep-1 cessou a expressão de FIX, enquanto as células 293T mantiveram a expressão durante o período. O FIXrh foi caracterizado por western blot confirmando a presença de uma banda imunoreativa esperada de 57 kDa. As linhagens 293T e SK-Hep-1 apresentaram 7,67 e 17 cópias do vetor inserido/célula, respectivamente. Considerando a importância do processo de ?-carboxilação, foi realizada uma análise da expressão gênica dos genes envolvidos neste processo, tais como o VKORC1, ?-carboxilase e o inibidor calumenina, nas linhagens celulares. Os resultados demonstraram razões elevadas entre os genes VKORC1 e calumenina e VKORC1 e ?-carboxilase nas duas linhagens. A cinética de crescimento das células foi realizada por um período de 7 dias apresentando diferenças significativas entre as células SK-Hep-1 transduzidas e não transduzidas, enquanto que as células 293T não presentaram diferenças estatísticas no crescimento celular. A suplementação do meio de cultura com íons Ca+2 e Mg+2 foi testada para avaliar sua influência na expressão de FIXrh ativo. As células 293T apresentaram melhor desempenho nas concentrações de 0,5 mmol/L de Ca+2 e 1,0 mmol/L de Mg+2 e as células SK-Hep-1 no meio de cultura não suplementado. Nossos dados indicam que a linhagem hepática SK-Hep-1 é a melhor produtora de FIXrh funcional e as comparações realizadas entre os dois tipos celulares são importantes na caracterização do comportamento de linhagens geneticamente modificadas voltadas para a expressão de proteínas recombinantes heterólogas e abre novos caminhos para futuros estudos que visam o melhoramento da produção desse tipo de proteína. / Blood coagulation factor IX is a vitamin K-dependent protein, and it has become a valuable pharmaceutical in the treatment of Hemophilia B which is based on the plasma-derived coagulation factors or recombinant protein produced in murine cells. Coagulation therapy based on these approaches has high costs and is closely associated with prion and virus contamination besides the FIX inhibitors development. These effects increase the risk for bleeding-related morbidity and mortality. The purpose of this study was to clone hFIX into a lentiviral vector and evaluate the expression of the recombinant protein in two human cell lines. The cloning of the hFIX cDNA into 1054 lentiviral expression vector was confirmed by enzymatic restriction obtaining the expected 1407 bp and 10054 bp bands in agarose gel. The 293T and SK-Hep-1 cell lines have been stable transduced with 1054-FIX lentiviral vector generated in our laboratory and the cells with higher expression of EGFP were selected and separated by flow cytometry. The quantification of the expression of rhFIX was performed by ELISA and chromogenic assays. The concentration of total rhFIX was 500 ng/106 cells in 293T cell line and 803 ng/106 cells in SK-Hep-1 cell line. The biological activity of FIX secreted by 293T and SK-Hep-1 was 0,047 UI/106 cells and 0,186 UI/106 cells, respectively. In order to evaluate the active rhFIX production profile over time, we conducted a monitoring of 180 days, which was noted that the SK-Hep-1 cell line ceased FIX expression, while 293T cells maintained the expression during this period. rhFIX was characterized by western blot analysis confirming the presence of a expected 57 kDa immunereactive band. The 293T and SK-Hep-1 cell lines showed 7.67 and 17 integrated vector copies/cell, respectively. Considering the importance of the ?-carboxylation process, we performed a gene expression analysis of genes involved in this process, such as VKORC1, ?-carboxylase and calumenin, in cell lines. The results showed high ratios among the genes VKORC1 and calumenin and among VKORC1 and ?-carboxylase in both cell lines. The cell growth kinetics was performed by a 7-day period, showed significant differences between SK-Hep-1 transduced cells and non-transduced cells, whereas 293T cells showed no difference in cell growth. Enrichment of culture medium with Ca +2 and Mg +2 ions was tested to evaluate its influence on the expression of active FIX. 293T cells showed better performance in 0.5 mmol/L Ca+2 and 1.0 mmol/L Mg +2 concentrations and SK-Hep-1 cells in culture medium control. Our data indicate that transduced SK-Hep-1 cells are the best producer of functional rhFIX, and comparisons between these two cell lines are important in characterizing the behavior of genetically modified cell lines focused on the heterologous expression of recombinant proteins and opens new avenues for future studies aimed at improving the production of this type of protein.

Made available in DSpace on 2016-08-17T15:00:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Paulo Adriano Dias.pdf: 333147 bytes, checksum: 43e74d9d8545a20d163895a21cf14b1b (MD5) Previous issue date: 2008-01-25 / This list of species is the first study dealing with bat flies in the Maranhão State. The work was done at seven different areas in the cities Bacabeira, São Luis, Santa Inês and Tufilândia. The bats were captured in mists nets and the parasites were collected with tweezers. A total of 559 bat flies belonging to 25 species, (22 species of the family Streblidae and 2 of Nycteribiidae), were colleted from 118 bats belonging to 22 species, 13 genera and 4 families. Trichobius joblingi Wenzel, 1966 was the most frequent species with 28.7% of the collected individuals. This study registered a high number of species of bat flies in the state, evidencing the importance of the area for studies of biodiversity, as well as aspects related to host-parasite relationships. / Esta lista preliminar de espécies de moscas ectoparasitas de morcegos é o primeiro estudo com esse grupo no Estado do Maranhão. O levantamento foi realizado em sete localidades nos municípios Bacabeira, São Luis, Santa Inês e Tufilândia. Os morcegos foram capturados em redes de neblina e os parasitas retirados destes com pinças. No total foram capturadas 559 moscas pertencentes a 25 espécies (11 gêneros), sendo 22 espécies da família Streblidae e duas da Nycteribiidae. Trichobius joblingi Wenzel, 1966 foi a espécie mais freqüente, representando 28.7% dos indivíduos coletados. As moscas encontravam-se infestando 118 morcegos pertencentes a 22 espécies, 13 gêneros e 4 famílias. Este estudo registrou uma alta riqueza de espécies de moscas e de morcegos no estado, evidenciando a importancia da região para estudos em biodiversidade, bem como aspectos relacionados à relação parasito-hospedeiro.

A cultura do maracujazeiro tem sido afetada por um grande número de pragas e doenças, que exigem dedicação e esforços urgentes, no sentido de minimizar as perdas e evitar sua disseminação. O vírus da pinta verde do maracujazeiro (PVM) (Passion fruit green spot virus PFGSV) caracteriza-se por induzir a formação de pequenas manchas verdes em frutos e em folhas, e lesões necróticas em ramos. Exames de secções ultrafinas de tecidos infectados ao microscópio eletrônico de transmissão consistentemente revelam a presença de partículas baciliformes em cisternas do retículo endoplasmático e viroplasma denso no citoplasma. Os efeitos citopáticos encontrados, a relação com o ácaro vetor, Brevipalpus phoenicis, e a comparação com outros vírus transmitidos por Brevipalpus (VTB), como o da leprose dos citros, classifica o vírus como sendo do tipo citoplasmático. Seu relato inicial deu-se há cerca de 10 anos em Vera Cruz-SP, mas em 1994 foi relatada uma doença no Estado da Bahia chamada de definhamento precoce do maracujazeiro (DPM), que apresenta sintomas, efeitos citopáticos e vetor semelhantes ao da pinta verde, tendo sido sugerida a possibilidade de serem duas denominações para uma mesma doença. Atualmente a PVM/DPM encontra-se em vários outros Estados como Minas Gerais, Rio de Janeiro, Sergipe, Rondônia, Maranhão, Rio Grande do Norte, Paraíba e Pará, além do Distrito Federal. Sua diagnose ainda depende dos sintomas observados, infestação por ácaros Brevipalpus e microscopia eletrônica. Para se desenvolver um método de diagnose molecular, que permita detectar o vírus causador da PVM/DPM de maneira rápida e confiável, em grande número de amostras, foi feita uma Biblioteca de cDNA a partir do RNA dupla fita do vírus, extraído de tecidos sintomáticos de maracujazeiros infectados com um isolado do PFGSV encontrado em Limeira-SP. Com o sequenciamento parcial do genoma viral, foram desenhados primers específicos que amplificam partes dos genes putativos da p24 e aqueles que codificam a proteína de movimento (MP) e a Replicase (Rep) de diferentes isolados do PFGSV. Primers do PFGSV e de dois outros VTBs do tipo citoplasmático (VTB-C) para os quais se dispõe de primers para sua detecção por RT-PCR (vírus da leprose dos citros C - CiLV-C; mancha anelar de Solanum violaefolium - SvRSV) foram testados em reações homólogas e heterólogas. Ocorreram amplificações por RT-PCR gerando fragmentos de tamanho esperados apenas para os vírus homológos, mas não nas reações heterólogas, indicando que PFGSV deve diferir do CiLV-C e SvRSV. Assim, tem-se agora uma ferramenta molecular que detecta especificamente o PFGSV. Um estudo inicial sobre a variabilidade genética do PFGSV foi feito a partir da extração do RNA total, seguido de RT-PCR utilizando os primers específicos, purificação dos fragmentos obtidos e uso da técnica de Single Strand Conformational Polymorphism (SSCP). Foram analisados isolados procedentes de diferentes regiões brasileiras e em geral a variabilidade foi maior para as amostras do Estado de São Paulo. Logrou-se transmitir experimentalmente o PFGSV com ácaros para uma espécie silvestre de maracujá (Passiflora morifolia). / In Brazil, passion fruits are affected by several diseases and pests which affect their yield. Among them, a recently recognized viral disease, caused by Passion fruit green spot virus (PFGSV), is characterized by the presence of green spots on fruits and senescent leaves, and necrotic lesions on branches. When the infection is early, stem lesions may coalesce, girdling the branch resulting in the subsequent death of the plant. Electron microscopic examination of the thin sections of infected tissues revealed the presence of short, bacilliform particles in the cistern of the endoplasmic reticulum and dense, vacuolated viroplasma in the cytoplasm. The disease was shown to be transmitted by the mite Brevipalpus phoenicis (Acari: Tenuipalpidae). The localized symptoms, transmission by Brevipalpus mite and the observed cytopathic effect are considered evidences to demonstrate the viral nature of the disease and place it among the socalled cytoplasmic type of Brevipalpus-transmitted viruses (C-BTV), whose prototype is the Citrus leprosis virus C (CiLV-C). Though the first report of the disease occurred more than 10 years ago at Vera Cruz-SP, little is known about PFGSV, though it has been found in several passion flower growing areas in Brazil. In 1994 was report a disease named of DPM (definhamento precoce do maracujazeiro) was reported state of Bahia, with characteristics similar to that of the PVM and it has been suggested that DPM and PVM are the same disease. Subsequently the PVM/DPM has been found in several others Brazilian States as Minas Gerais, Rio de Janeiro, Sergipe, Rondônia, Maranhão, Rio Grande do Norte, Paraíba, Pará and Distrito Federal. Diagnosis has been made by symptoms, association with Brevipalpus mites and the time consuming transmission electron microscopy. This work reports the results of efforts to generate a quick and precise method to detect the virus for the diagnosis of the disease, evaluate the variability of the PFGSV isolates from different regions of the country and determine the taxonomic position of this virus. From the dsRNA present in extracts of the PFGSV-infected passion flower plant tissues, a cDNA library was obtained and its sequencing permitted to identify part of the viral genome. Based on these sequences, particularly of p24 and the putative genes that code for the movement protein (MP) and replicase (Rep), specific primers were designed which specifically detected PFGSV by RT-PCR in extracts of PFGSV-infected tissues. Evaluation of the variability of different isolates of PFGSV was made by single strand conformational polymorphism (SSCP) of the amplified fragments of the viral genome. In general, it a larger variation was found in isolates from São Paulo state. PFGSV seems to differ from two other C-BTV with available primers, CiLV-C and the Solanum violaefolium ringspot virus (SvRSV), since RT-PCR assays do not cross amplify their genomes. Experimental transmission of PFGSV by mites to woodland passion flower (Passiflora morifolia) was achieved.

O Passion flower little leaf mosaic virus (PLLMV) foi encontrado causando danos severos em plantios de maracujazeiro (Passilora edulis f. flavicarpa) em dois municípios do Estado da Bahia no ano de 2001. Nesses locais foi constatada que a incidência deste begomovirus estava relacionada à colonização das plantas por Bemisia tabaci, cujo biótipo não foi identificado. Até o momento este vírus não parece constituir grave ameaça a cultura do maracujazeiro, o que aparentemente esta relacionado ao fato de P. edulis f. flavicarpa não ser preferida para a alimentação desse aleyrodídeo. Assim, os objetivos deste trabalho foram: a) selecionar espécies silvestres de Passiflora resistentes a este begomovirus que possam ser úteis em futuro programa de melhoramento genético; b) identificar possíveis hospedeiros alternativos do patógeno entre algumas espécies da vegetação espontânea e cultivadas e c) avaliar se adultos de B. tabaci biótipo B presentes no Estado de São Paulo são capazes de transmitir esse vírus. A reação de espécies silvestres de Passiflora foi avaliada por enxertia em maracujazeiro amarelo infectado que serviu como de fonte de inóculo. As avaliações foram feitas por meio da expressão de sintomas, análise de PCR e teste de recuperação do vírus para maracujazeiro amarelo. As espécies P. alata, P. quadrangularis, P. morifolia, P. serrato-digitata, P. suberosa e P. foetida foram suscetíveis ao PLLMV, enquanto P. caerulea, P. cincinnata, P nitida, P. mucronata e P. giberti se mostraram resistentes a este vírus. No estudo de hospedeiros alternativos, primeiramente o PLLMV foi inoculado mecanicamente nas seguintes espécies vegetais: Capsicum annuum, Chenopodium quinoa, Solanum lycopersicon, S. tuberosum, P. edulis f. flavicarpa, Phaseolus vulgaris, Nicotiana benthamiana e Sida sp.. Somente N. benthamiana foi infectada sistemicamente. Posteriormente foram feitas tentativas de transmissão desse begomovirus por meio de enxertia, usando-se como fonte de inóculo (porta-enxerto), plantas infectadas de N. benthamiana. Foram avaliadas as seguintes espécies vegetais: S. pimpinellifolium, S. lycopersicon, S. tuberosum, N. benthamiana, D. stramonium, C. annuum, N. glutinosa e Sida rhombifolia. O vírus foi transmitido somente para plantas de S. pimpinellifolium. As sucessivas transmissões mecânicas do PLLMV em N. benthamiana permitiram a seleção de uma estirpe fraca e protetora deste begomovirus. B. tabaci biótipo B não foi capaz de transmitir o PLLMV. / The Passion flower little leaf mosaic virus (PLLMV) was found causing severe damage in passion flower (Passilora edulis f. flavicarpa ) orchards in two counties of Bahia state, in 2001. The high incidence of this begomovirus was related to the colonization of plants by Bemisia tabaci, whose biotype was not indentified. To date this virus doesnt seem to be a serious threat to the passion flower cultivation, which apparently is related to the fact that P. edulis f. flavicarpa is not a preferred specie for whitefly feeding. The aim of this work were: a) to select wild species of Passifloraceae resistant to PLLMV, that may be useful in future breeding program; b) to indentify some possible alternative hosts of the pathogen among some weed and cultivaded species and c) to evaluat whether adults of B. tabaci biotype B are capable of transmitting this virus. The reaction of wild species of Passifloracea was evaluated by grafting on infected yellow passion fruit that served as a source of inoculum. The evaluation of these plants were done by means of symptoms, PCR test and biological recovery of the virus to yellow passion fruit. The sepecies P. alata, P. quadrangularis, P. morifolia, P. serrato-digitata, P. suberosa and P. foetida were susceptible to PLLMV, while P. caerulea, P. cincinnata, P nitida, P. mucronata and P. giberti were resistant to this virus. In the study of alternative hosts, at first, PLLMV was mechanically inoculated in the following species: Capsicum annuum, Chenopodium quinoa, Solanum lycopersicon, S. tuberosum, Passiflora edulis f. flavicarpa, Phaseolus vulgaris, Nicotiana benthamiana and Sida sp. Only N. benthamiana was systematically infected. Subsequently, graft transmission of PLLMV was carried out using infected N. benthamiana as source of inoculum (root stock). The following species were evaluated: Solanum pimpinellifolium, S. lycopersicon, S. tuberosum, N. benthamiana, D. stramonium, C. annuum, N. glutinosa and Sida rhombifolia.The virus was transmited only to S. pimpinellifolium. Successive mechanical transmissions of PLLMV in N. benthamiana led to the selection of a mild and protective strain of this begomovirus. B. tabaci biotype B was not able to transmit the PLLMV.

Entre as cucurbitáceas cultivadas no Brasil, a abobrinha de moita (Cucurbita pepo L.) apresenta grande importância econômica, notadamente no Estado de São Paulo, a maior área de plantio. No Brasil, já foram encontrados nove vírus capazes de infectar esta espécie. Os mais freqüentes e responsáveis por prejuízos significativos à produção da abobrinha de moita são os do mosaico do mamoeiro – estirpe melancia (Papaya ringspot virus - type W – PRSV-W) e do mosaico amarelo da abobrinha (Zucchini yellow mosaic virus – ZYMV), devido principalmente à sua alta sensibilidade. A premunização das plantas com estirpes fracas vem sendo investigada há mais de 10 anos no Brasil e surge como uma alternativa interessante para controle destas viroses. A premunização de abobrinha de moita só foi estudada até o momento em plantas da variedade Caserta. O presente trabalho teve o objetivo de dar continuidade a estes estudos avaliando o efeito de estirpes premunizantes PRSV-W-1 e ZYMV-M na produção quantitativa e qualitativa de quatro variedades comerciais de C. pepo: Samira, Novita Plus, AF-2847 e Yasmin. Os resultados obtidos em experimentos conduzidos em estufa plástica mostraram que as plantas destas variedades infectadas com a estirpe fraca ZYMV-M, não exibiram sintomas foliares acentuados e não apresentaram alterações na produção quantitativa e qualitativa de frutos, quando comparada com a produção das plantas sadias. No entanto, as plantas dessas mesmas variedades infectadas com a estirpe PRSV-W-1, só ou em mistura com a estirpe ZYMV-M, exibiram sintomas acentuados de mosaico foliar e alteração significativa na qualidade dos frutos, caracterizada pelo escurecimento da casca. Não houve alteração significativa na quantidade de frutos produzidos por essas plantas e no peso médio dos frutos. Quando plantas dessas variedades foram infectadas somente com a estirpe fraca PRSV-W-1 e conduzidas paralelamente em condições de campo e estufa plástica, constatou-se intensificação dos sintomas nos frutos e nas folhas das plantas infectadas conduzidas principalmente em estufa, porém a produção quantitativa mais uma vez não foi alterada. A variedade Samira mostrou-se a mais sensível ao PRSV-W-1 em ambas as condições. Os resultados sugerem que fatores ambientais, além da interação da estirpe fraca com a variedade de abobrinha, parecem interferir na expressão de sintomas nos frutos das plantas infectadas com a estirpe PRSV-W-1. Também foi objeto de estudo desse trabalho a identificação da melhor hospedeira, entre algumas cucurbitáceas, para a multiplicação e manutenção das duas estirpes fracas, e a avaliação da eficiência dos afídeos Myzus nicotianae e M. persicae na transmissão da estirpe ZYMV-M. Os resultados mostraram que a estirpe ZYMV-M parece atingir as maiores concentrações em C. pepo cv. Caserta e em C. melo cv. Casca-de-Carvalho. Para a estirpe PRSV-W- 1, as melhores hospedeiras foram C. pepo cv. Caserta, seguida de C. lanatus cv. Crimson Sweet e C. sativus cv. Safira. M. nicotianae e M. persicae transmitiram a estirpe fraca ZYMV-M para 11,7% e 0% das plantas de abobrinha de moita cv. Caserta, respectivamente. Enquanto a estirpe severa foi transmitida para 47,0% e 80% das plantas teste, respectivamente. / Zucchini squash (Cucurbita pepo L.) is widely cultivated in Brazil, especially in the State of São Paulo, which is the major producer. Nine viruses capable to infect this species have already been described in Brazil. The most frequent and responsible for significant yield losses are the potyviruses Papaya ringspot virus - type W (PRSV-W) and Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV), for which zucchini squash is highly susceptible and intolerant. Preimmunization with mild strains of both viruses have been investigated in Brazil for the last 10 years and appears as and interesting option for the control of these viruses. As preimmunization have been evaluated only for zucchini squash cv. Caserta, the purpose of the present work was to investigate the effect of the mild strains PRSV-W-1 and ZYMV-M on the quantitative and qualitative yield of four other commercial zucchini squash varieties: Samira, Novita Plus, AF-2847 e Yasmin. The results of an experiment carried out under plastic-house showed that mild strain ZYMV-M induced mild symptoms on the leaves of the plants of all varieties, but did not affect the yield of marketable fruits, as compared to those from the respective healthy controls. On the other hand, plants from all varieties exhibited accentuated mosaic and leaf malformation when infected with mild strain PRSV-W-1, alone or in mixture with ZYMV-M. The amount of fruits harvested (number and average weight) from these plants was similar to that from the respective healthy controls. However, the quality of the fruits was severely affected, since the mild strain PRSV-W-1 induced alteration on the texture and color of the skin. When plants infected only with mild strain PRSV-W-1 were grown simultaneously under field and plastic-house conditions, it was noticed that leaf and fruit symptoms were more intense on those maintained in the plastic-house. Once more the quantitative fruit yield was not affected by this mild strain. Zucchini squash cv. Samira was the most sensitive to PRSV-W-1 under both conditions. Together theses results suggest that environmental variables, besides the interaction between the variety and the mild strain, might influence the expression of symptoms shown by plants infected with PRSV-W-1. In addition to this, the present work also tried to identify the most appropriate host, among some cucurbit species/varieties, for multiplication of both mild strains, and the efficiency of two species of aphids (Myzus nicotianae and M. persicae) on the transmission of the mild strain ZYMV-M. The mild strain ZYMV-M attained the highest concentration in C. pepo cv. Caserta and Cucumis melo cv. Casca-de-Carvalho. The most appropriate hosts for multiplication of mild strain PRSV-W-1 were C. pepo cv. Caserta followed by Citrullus lanatus cv. Crimson Sweet and C. sativus cv. Safira. M. nicotianae and M. persicae transmitted the mild strain ZYMV-M to 11.7% and 0% of the test-plants of zucchini squash cv. Caserta. The transmission of the severe strain of ZYMV by both species of aphids occurred for 47% and 80% of the test-plants, respectively.