Dentre as espécies conhecidas do gênero Arcobacter, as espécies A. butzleri, A. cryaerophilus e A. skirrowii são consideradas potecialmente zoonóticas, podendo ser transmitidas por alimentos de origem animal. O presente estudo teve como objetivos isolar e caracterizar fenotipica e genotipicamente cepas de Arcobacter spp. provenientes de carcaças de suínos e amostras de ambiente de abatedouro localizado no Estado de São Paulo. As cepas isoladas foram submetidas a reação em cadeia pela polimerase para a identificação e detecção de um grupo de genes de virulência. A concentração inibitória mínima frente a nove antimicrobianos usados para o controle da infecção pelo agente foi determinada e as cepas foram analisadas através do PFGE e pelo AFLP. Dentre as 30 carcaças avaliadas, 25 foram positivas para o agente e 70 cepas foram selecionadas e identificadas como Arcobacter spp. As espécies isoladas foram A. butzleri (n=61), A. cryaerophilus (n=7) e A. skirrowii (n=2). A frequência dos possíveis genes de virulência encontrada variou de 71,4% a 100% para os genes tlyA, pldA, cj1349, ciaB, cadF e mviN. Não foram detectados os genes hecA, hecB e irgA. O perfil de virulência ciaB/ cj1349/ mviN/ cadF/ pldA/ tlyA foi o mais frequente e detectado em 66% das cepas. Todas as cepas foram sensíveis à gentamicina e tetraciclina e 77,1% foram multirresistentes, dentre estas o perfil mais frequente foi de resistência a azitromicina/ florfenicol/ ácido nalidíxico/ telitromicina/ clindamicina Houve grande diversidade genotípica entre as cepas através do PFGE e do AFLP, e ambas a técnicas apresentaram o mesmo poder discriminatório na análise das cepas isoladas. / Among the known species of the genus Arcobacter, the species A. butzleri, A. cryaerophilus and A. skirrowii are considered potentially zoonotic and can be transmitted by food of animal origin. This study aimed to isolate and characterize phenotypically and genotypically strains of Arcobacter spp from swine carcasses and slaughterhouse environment samples located in the State of São Paulo. The isolated strains were subjected to polymerase chain reaction for identification and detection of a group of putative virulence genes. The minimum inhibitory concentration was determined against nine antimicrobials indicated for the control of infection by the agent and the strains were analyzed by PFGE and by AFLP. Among the 30 carcasses evaluated, 25 were positive for the agent and 70 strains were selected and identified as Arcobacter spp. The isolated species were A. butzleri (n = 61), A. cryaerophilus (n = 7) and A. skirrowii (n = 2). The frequency of virulence genes found ranged from 71.4 % to 100 % for genes tlyA , pldA , cj1349 , ciaB , cadF and mviN . The genes hecA, hecB and irgA were not detected. The virulence profile ciaB/ cj1349/ mviN/ cadF/ pldA/ tlyA was the most frequent and detected in 66 % of the strains. All strains were susceptible to gentamicin and tetracycline and 77.1% were multirresistant, among these the most common profile of resistance was azithromycin/ florfenicol/ nalidixic acid/ telithromycin/ clindamycin There were large genotypic diversity among strains by PFGE and AFLP and both techniques showed the same discriminatory power in the analysis of the isolated strains.

Tendo sido comprovada a existência da famílias molecularmente distintas de M. avium circulando em suínos de região sul do Brasil, e havendo dúvidas a respeito da importância da transmissão horizontal como mecanismo de manutenção da doença, o presente teve por objetivo estudar a virulência dessas estirpes, informação importente para o aperfeiçoamento dos métodos de controle. As estirpes emergiram do estudo caso-controle, onde as tipagens moleculares por RFLP mostraram a existência de quatro famílias de M. avium (PIG-A, B, C e D). Um estirpe representante de cada família foi inoculada pela via intra-peritoneal em 48 hamsters com uma dose de 30.000 U.F.C. por animal. Após 2, 13, 26 e 40 dias da inoculação, 12 hamsters inoculados de cada família foram anestesiados, sacrificados e os agentes foram quantificados no fígado, baço e pulmão. A presença das estirpes foi verificada no sangue e também foram realizados exames histológicos. As estipers PIG-A, B, C e D desenvolveram lesões granulomatosas no fígado e baço nos quatro tempos experimentais; disseminaram-se pela via linfo-hemática, multiplicando-se em fígado, baço e pulmão. Nos quatro tempos experimentais houve diferença entre as contagens de U.F.C./g entre os órgãos (T1: p<0,001; T2: p<0,001; T3: p<0,001 e T4: p<0,001) e as obtidas do baço foram sempre superiores às do fígado e pulmão. Nos quatro tempos experimentais houve diferença entre as contagens de U.F.C./g entre as estirpes (T1: p<0,001; T2: <0,001; T3: p<0,001 e T4: p<0,001) e foi possível construir a seguinte escala decrescente de virulência: PIG-B > PIG-A > PIG-D > PIG-C. / Given that the existence of molecularly different families of M. avium circulating in swine of the south area of Brazil has been proved, and that some doubts remain regarding the importance of the horizontal transmission as mechanism of maintenance of the disease, this work aimed to study the virulence of those strains, an important information for the improvement of the control methods. The strains emerged from a case-control study, when the RFLP molecular typification showed the existence of four families of M. avium (PIG-A, B, C and D). A strain representative of each family was inoculated by intra-peritoneal route in 48 hamsters with a dose of 30.000 C.F.U./animal. After 2, 13, 26 and 40 days post-infection, 12 inoculated hamsters of each family were anesthetized, euthanized and the bacteria were quantified in the liver, spleen and lung. The presence of the strains was verified in the blood and also histological exams were accomplished. The strains PIG-A, B, C and D developed granulomatous lesions in the liver and spleen in the four experimental times; they were disseminated by the linfo-haematic route, multiplying in liver, spleen and lung. In the four experimental times there was difference among the countings of C.F.U./g among the organs (T1: p<0,001; T2: p<0,001; T3: p<0,001 and T4: p<0,001) and that obtained of the spleen were always superiors to the one of the liver and lung. In the four experimental times there was difference among the countings of C.F.U./g among the ancestries (T1: p<0,001; T2: p<0,001; T3: p<0,001 and T4: p<0,001) and was possible to build the following order of decreasing virulence: PIG-B > PIG-A > PIG-D > PIG-C.

As bactérias são reconhecidas pelos macrófagos através dos receptores do tipo Toll (TLR), que ativam as vias do NF-&#954;B e das MAPKs, resultando em respostas como a fagocitose e a produção de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio (ROS/RNS), que causam a morte do microrganismo. P. aeruginosa, uma causa comum de pneumonia associada à ventilação mecânica, é uma bactéria que utiliza diversas estratégias de virulência e defesa, incluindo mecanismos antioxidantes. O objetivo deste trabalho foi verificar a relação entre o papel da 1-Cys peroxirredoxina LsfA está envolvida na virulência de P. aeruginosa. Linhagens mutantes com deleção em lsfA ou com uma mutação pontual neste gene (troca da Cys45 por Ala, RB302) foram construídas, sendo mais sensíveis a peróxido de hidrogênio que a linhagem selvagem PA14, como verificado pelo halo de inibição de crescimento. A atividade peroxidásica de LsfA foi medida in vitro pelo ensaio de tiocianato férrico e apenas a proteína com a sequência selvagem foi ativa, enquanto uma mutação na Cys45 aboliu completamente a sua atividade. Infecção de macrófagos J774 com as linhagens &#916;lsfA ou C45A resultaram em uma diminuição da morte dos macrófagos, aumento do clearance bacteriano e aumento da secreção de TNF-&#945; em comparação aos macrófagos infectados com a linhagem PA14, sugerindo uma maior ativação das vias do NF-&#954;B e das MAPKs nos macrófagos infectados com as linhagens mutantes. Para verificar se LsfA poderia alterar o estado oxidativo dos macrófagos, eles foram infectados com as linhagens PA14 ou RB302 (C45A) e incubadas com carbóxi-H2DCFDA, um indicador que se torna fluorescente quando oxidado. Macrófagos infectados com a linhagem mutante demonstraram um maior estado oxidativo em comparação aos macrófagos infectados com a linhagem selvagem, confirmando que LsfA limita a ativação dos macrófagos, resultando numa menor produção de TNF-&#945; e diminuição da citotoxicidade. A via das MAPKs e do NF-&#954;B são requeridos para a produção máxima de TNF-&#945; nos macrófagos infectados com a linhagem RB302, o que foi demonstrado utilizando-se de inibidores farmacológicos para essas vias. Como esperado, quando os macrófagos foram infectados com a linhagem RB302 na presença do antioxidante N-acetil-cisteína, houve uma redução da produção de TNF-&#945; a níveis semelhantes dos macrófagos infectados com a linhagem selvagem. Em modelo de pneumonia aguda, todos os camundongos infectados com a linhagem PA14 morreram 48h pós-infecção, enquanto os camundongos infectados com a linhagem RB302 sobreviveram por mais de 60 dias após a infecção. Houve uma redução do número de bactérias nos pulmões, baço e fígado nos camundongos infectados com a linhagem RB302 em comparação aos camundongos infectados com a linhagem PA14. Também foi observado um aumento na produção de citocinas pró-inflamatórias nos camundongos infectados com a linhagem RB302 em comparação aos camundongos infectados com PA14. Com isso, foi demonstrado pela primeira vez o envolvimento de uma 1-Cys peroxirredoxina de bactérias na virulência, com a modulação da resposta imune do hospedeiro in vitro e in vivo. / Bacteria are recognized by macrophages via Toll-Like Receptors (TLR), leading to a signaling pathway that activates NF-&#954;B and MAPKs. Killing in phagossomes is achieved by reactive oxygen and nitrogen species (ROS/RNS) generation. P. aeruginosa is a common cause of ventilator associated pneumonia and it uses several strategies for virulence and defense, including antioxidant mechanisms. In this work, we show for the first time that the 1-Cys peroxiredoxin LsfA is implicated in P. aeruginosa virulence. Mutant strains with a deletion in lsfA or with a mutation (Cys45 to Ala, RB302) were constructed and they were more sensitive to H2O2 than the wild type strain PA14, as verified by a growth inhibition assay. In vitro peroxidasic activity of LsfA was measured by ferric-thiocyanate assay, and while the wild-type protein was active, the mutation in Cys45 abolished its activity. Infection of J774 macrophages with &#916;lsfA or C45A strains resulted in lower cell death, increased bacterial clearance and higher TNF-&#945; production in comparison to PA14-infected macrophages, suggesting a higher level of MAPKs and NF-&#954;B activation due to the mutant strains. To verify whether LsfA could modify the oxidative state of infected macrophages, they were infected with PA14 or RB302 strains and incubated with carboxy-H2DCFDA, an indicator that emits fluorescence when oxidized. Macrophages infected with mutant strains showed a higher oxidative state in comparison to PA14-infected cells, thus confirming that LsfA limits macrophages activation that leads to TNF-&#945; production and cytotoxic activity. MAPKs and NF-&#954;B pathways are required to full production of TNF-&#945; in macrophages infected with RB302, as shown using pharmacological inhibitors for those pathways. When macrophages were infected with RB302 in the presence of the antioxidant N-acetyl-cysteine, there was a reduction in TNF-&#945; production as compared to PA14, as expected. In an acute pneumonia model, all PA14-infected mice died at 48h post-infection, while C45A-infected mice survived as long as 60 days. There was also reduction in bacterial counts in the lungs, spleen and liver of mice infected with RB302, in comparison to PA14-infected mice. A greater pro-inflammatory cytokine production was observed in mice infected with mutant strain in comparison to mice infected with PA14. Altogether, this work shows for the first time the role of a bacterial 1-Cys Prx that modulates host immune response in vitro and in vivo.

O amplo espectro da candidíase e respectiva importância clínica da infecção impulsionam as pesquisas que visam esclarecer os mecanismos de patogenicidade e identificação dos fatores de virulência de Candida sp. Portanto, o objetivo deste estudo foi verificar através de testes fenotípicos e moleculares a capacidade de adesão, atividade de proteases e variabilidade genética de isolados clínicos de C. albicans e C. tropicalis. A capacidade de adesão às glicoproteínas de matriz extracelular laminina e fibronectina foi avaliada utilizando-se a técnica de ELISA (Enzyme-linked imunosorbent assay). A pesquisa de proteases foi realizada pelos métodos semiquantitativo, em placa de ágar com albumina bovina, e quantitativo, em solução-tampão com hemoglobina. A presença dos genes ALS2, ALS3, SAP1, SAP3 e PLB1 foi verificada pela Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) e os polimorfismos intra e interespécies pela técnica do DNA Polimórfico Amplificado ao Acaso (RAPD). Todos os isolados de C. albicans e C. tropicalis apresentaram ligação a laminina e a fibronectina imobilizadas. Os isolados Ca33 e Ct13 apresentaram índice de adesão relativa significativamente maiores em relação aos demais isolados para as duas glicoproteínas (p < 0,001). A atividade de proteases foi observada em todos os isolados de C. albicans tanto pelo método semiquantitativo quanto pelo método quantitativo. A atividade de proteases dos isolados de C. tropicalis foi melhor evidenciada através do método quantitativo. A amplificação de fragmentos dos genes relacionados à adesão (ALS2 e ALS3), atividade de proteases (SAP1 e SAP3) e fosfolipase (PLB1) foi observada em todos os isolados de C. albicans. Os isolados de C. tropicalis não apresentaram produtos de amplificação para os genes pesquisados. A variabilidade genética avaliada pela técnica do RAPD revelou uma população heterogênea em ambas as espécies. No entanto, C. tropicalis apresentou maior diversidade genética que C. albicans. / The wide spectrum of candidiasis and its clinical importance encourage the research with the purpose of clarifying the mecanisms of pathogenicity and identification of virulence factors of Candida sp. Therefore, the aim of this study was to verify through phenotypic and molecular assays the adhesion, enzymatic activity e genetic variability of clinical C. albicans and C. tropicalis isolates. The adhesion ability to the extracellular matrix glycoproteins laminin and fibronectin was evaluated using the ELISA technique (Enzyme-linked imunosorbent assay). The research of proteases was carried out in agar plate containing bovine albumin and through a quantitative method in buffer solution containing hemoglobin. The presence of ALS2, ALS3, SAP1, SAP3 and PLB1 was verified using polimerase chain reaction (PCR) and intra and interespecies polimorphisms through Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) technique. All C. albicans and C. tropicalis isolates binded to immobilized laminin and fibronectin. Ca33 and Ct13 isolates had relative adhesion index significantly higher than the other isolates for both glycoproteins (p < 0,001). Protease activity was observed in all isolates of C. albicans using either the semi-quantitative or quantitative assay. The protease activity of C. tropicalis was better detected through the quantitative assay. The amplification of genes related to adhesion (ALS2 and ALS3), proteases (SAP1 and SAP3) and phospholipase (PLB1) activity using PCR was observed in all C. albicans strains. PCR amplification products were not observed in C. tropicalis isolates for the researched genes. The genetic variability by RAPD revealed an heterogeneous population in both species. Nevertheless, C. tropicalis presented higher genetic variability than C. albicans strains.

Ureases (EC 3.5.1.5) são metaloenzimas dependentes de Ni2+que hidrolisam ureia para produzir amônia e CO2. Estas enzimas são encontradas em fungos, bactérias e plantas, compartilhando estruturas similares. Nosso grupo vem demonstrando que ureases possuem propriedades biológicas independentes da atividade ureolítica que potencialmente contribuem para a patogenicidade de micro-organismoss produtores de urease. A presença de urease em bactérias patogênicas (p.e. Helicobacter pylori, Proteus mirabilis) está correlacionada com a patogênese em algumas doenças humanas. Alguns fungos de importância médica também são produtores de urease entre eles Cryptococcus neoformans, Coccidioides immitis, Histoplasma capsulatum, Sporothrix schenckii. Cryptococcus gattii é um dos agentes etiológicos da criptococose em humanos e animais e acomete mais frequentemente indivíduos imunocompetentes. A maioria dos isolados produzem urease e vários autores sugerem que a liberação de amônia pela atividade da urease de Cryptococcus tem papel importante na patogenia da doença favorecendo uma maior permeabilidade que proporciona a transmigração das leveduras para o sistema nervoso central (SNC). No presente trabalho, para analisar o potencial de virulência da urease de C. gattii foram construídos mutantes com inativação do gene estrutural URE (ure1) e dos genes que codificam as proteínas acessórias (URED, UREF – ure4 e ure6 respectivamente). Assim como já descrito para H. pylori, a urease de C. gattii desempenha papel importante na virulência independente da atividade enzimática. Esta função ocorre anterior a invasão do SNC diminuindo a multiplicação da levedura em macrófagos, aumentando a carga infecciosa no sangue e atenuando a mortalidade tanto no mutante ure1Δ como no mutante ure6Δ em camundongos infectados por via intranasal. / Ureases (EC 3.5.1.5) are metalloenzymes Ni2+ dependents that hydrolyze urea to produce ammonia and CO2. These enzymes are found in fungi, bacteria and plants, show very similar structures. Our group has shown that plant and bacterial ureases display biological properties independent of their ureolytic activity that may contribute to the pathogenesis of urease-producing microrganisms. The presence of urease in pathogenic bacteria (e.g. Helicobacter pylori, Proteus mirabilis) strongly correlates with pathogenesis in some human diseases. Many medically important fungi also produce urease, among which are Cryptococcus neoformans, Coccidioides immitis, Histoplasma capsulatum, Sporothrix schenckii. Cryptococcus gattii is one of the etiologic agent that causes criptococcosis in human and animals, which often affects immunocompromised patients. The majority of clinical isolates produce large amounts of urease, and several authors suggest that the ammonia realease from urease activity might introduce a local damage of the endothelium, thus increasing permeability which provides yeast transmigration to central nervous system (CNS). To analyse virulence potential of C. gattii urease, mutants inactivating structural URE (ure1) gene and coding genes for accessory proteins required to assemble the Ni2+-containing active site (URED, UREF – ure4 and ure6 respectively ). As already described to H. pylori urease, the C. gattii urease play important roles in virulence independent of ureolytic activity before CNS invasion, reducing yeast multiplication in macrophage, decreasing blood burden and also attenuating mortality either ure1Δ and accessory ure6Δ mutant in mice intranasal infection.

Introdução: O câncer gástrico é a segunda causa mais comum de mortes relacionadas à neoplasia no mundo. Apesar de o Helicobacter pylori ser classificado como um carcinógeno grupo I, a presença dessa infecção não é um fator que, isoladamente, possa levar ao desenvolvimento de câncer gástrico, sendo que, entre as possíveis justificativas, está a existência de diferentes linhagens de Helicobacter pylori com diferentes graus de virulência. Material e métodos: Foram pareados, por sexo e por idade, 29 pacientes com adenocarcinoma gástrico distal e 58 pacientes submetidos à endoscopia digestiva alta, cujo diagnóstico não fosse câncer gástrico. Em todos os pacientes, foi pesquisado o status da infecção por Helicobacter pylori (através de teste da urease, histopatológico e PCR para os genes ureA e 16S-rRNA), além de determinação do status de infecção por linhagem cagApositiva do Helicobacter pylori (através de PCR para o gene cagA). Resultados: A porcentagem de pacientes com infecção por Helicobacter pylori foi idêntica nos dois grupos (68,9%). Quando avaliamos a presença de infecção pelo Helicobacter pylori linhagem cagA-positiva, verificamos que a freqüência desta é significativamente mais alta no grupo caso, quando comparado com o grupo controle, ocorrendo em 62,1% e 29,3% desses, respectivamente (OR=3,95; IC 95% 1,543-10,096). Ao avaliarmos apenas os pacientes Helicobacter pylori-positivos, a freqüência de infecção por linhagem cagApositiva também é mais elevada no grupo caso (90%), quando comparado com o grupo controle (42,5%) (OR=12,18; IC 95% 2,71-52,9). Conclusões: Existe associação entre infecção por Helicobacter pylori linhagem cagApositiva e adenocarcinoma gástrico distal, independente do status de infecção pelo Helicobacter pylori. / Background: Gastric cancer is the second most common cause of cancer related death worldwide. Although Helicobacter pylori has been classified by the World Health Organization as a class I carcinogen, the presence of the infection is not a factor that alone is able to lead to gastric cancer, and one of the possible explanations for this is the existence of different strains of Helicobacter pylori with different degrees of virulence. Materials and methods: 29 patients with gastric cancer were matched by sex and age (+/- 5 years) with 58 patients without gastric cancer, submitted to upper gastrointestinal endoscopy. All patients were evaluated for the status of infection by Helicobacter pylori (through urease test, histological analysis and PCR for the genes ureA and 16S-rRNA) and for the status of infection by cagA-positive strain (through PCR for the gene cagA) Results: evaluating the presence of infection by cagA-positive Helicobacter pylori, it was verified that the rate of infection was significantly higher in the group with gastric cancer when compared with the matched controls, occurring in 62,1% and 29,3%, respectively (OR=3,95; IC 95% 1,543-10,096). Evaluating only Helicobacter pylori-positive patients, the rate of infection by cagA-positive strains was also significantly higher in the group with gastric cancer (OR=12,18; IC 95% 2,71-52,9). Conclusions: There is association between cagA-positive Helicobacter pylori and risk of gastric cancer, independent of the status of infection by Helicobacter pylori.

Foram coletadas amostras de água de piscinas térmicas e não térmicas na cidade de Porto Alegre, RS, Brasil entre os meses de maio de 2006 e março de 2007, com o objetivo de determinar a presença do gênero Acanthamoeba, bem como realizar a caracterização fenotípica e genotípica dos isolados. Amebas foram isoladas em cultivo monoxênico com Escherichia coli. A identificação dos isolados foi baseada na morfologia dos cistos e trofozoítos e na amplificação por PCR com oligonucleotídeos gênero-específico. O potencial patogênico foi avaliado usando testes de osmotolerância e termotolerância. Das 65 amostras analisadas, 13 (20%) foram positivas para amebas de vida livre e identificados morfologicamente como pertencentes ao gênero Acanthamoeba. Destas, 9 possuíam características compatíveis com o grupo morfológico II e 4 com o grupo III. Todos os isolados identificados morfologicamente quando submetidos à Reação de PCR, confirmaram pertencer ao gênero Acanthamoeba e 38% (5/13) dos isolados foram considerados potencialmente patogênicos a partir dos testes de osmotolerância e termotolerância. Neste estudo, o método molecular de RAPD ("Random Amplified Polymorphic-DNA") foi utilizado para investigar a relação genética entre os 13 isolados de piscinas e dois isolados de referência da ATCC. De 10 oligonucleotídeos decaméricos testados, quatro foram selecionados por gerarem produtos de amplificação passíveis de análise. A similaridade entre os isolados foi calculada utilizando-se o coeficiente de Jaccard e o dendrograma construído pelo método da média das distâncias entre grupos ("Average Linkage"). Quatro grupos distintos (G1-G4) de isolados foram formados de acordo com a similaridade genética entre eles. Sugeriu-se que os isolados do G1 por agruparem-se aos isolados de referência de A. castellanii (ATCC 30010 e 50492) possam pertencer a esta espécie. Os dados fenotípicos, tais como, morfologia e testes de tolerância foram relacionados aos dados genotípicos de RAPD e permitiram a caracterização dos isolados. Os resultados deste primeiro estudo de isolamento e caracterização de Acanthamoeba de água de piscinas na cidade de Porto Alegre-RS, Brasil confirmam a presença de isolados potencialmente patogênicos que podem representar um risco à saúde humana. / Water samples were collected from both heated and unheated swimming pools in the city of Porto Alegre, RS, Brazil between May 2006 and March 2007, to determine the presence of Acanthamoeba in the water of swimming pools as well as perform the phenotypic and genotypic characterization of the isolates. Amoebae were isolated in monoxenic culture with Escherichia coli. The identification of the isolates was based on the trophozoites and cysts morphology and on the amplification through PCR with genus-specific oligonucleotides. The potential pathogenic was assessed by osmotolerance and temperature tolerance assays. From the 65 samples analyzed, 13 (20%) were positive for free-living amoebae, and the isolates morphologically identified as belonging to the genus Acanthamoeba. Out of these, 9 presented characteristics compatible with morphological group II, and 4 with group III. All the morphologically identified isolates, when submitted to PCR, were confirmed as belonging to the genus Acanthamoeba, and 38% (5/13) of the isolates were considered potentially pathogenic according to osmotolerance and temperature tolerance assays. In this study, the molecular RAPD method (Random Amplified Polymorphic-DNA) was used to investigate the genetic relationship among 13 isolates from swimming pools and two strains from the ATCC reference. From the ten decameric oligonucleotides tested, four were selected for generating products of amplification possible to be analyzed. The similarity between isolates was calculated using the Jaccard coefficient and the dendrogram constructed by using the method of the average distances between groups ("Average Linkage"). Four distinct groups (G1-G4) of isolates were separated according to genetic similarity between them. It was suggested that the isolates from G1 once group up with the reference isolates of A. castellanii may belong to this species. The phenotypic data such as morphology and tolerance tests were related to RAPD genotypic data and led to the characterization of isolates. The results of this study about isolation and characterization of Acanthamoeba in swimming pools water at Porto Alegre, RS, Brazil confirm the presence of potentially pathogenic isolates which can present risks to human health.

Staphylococcus aureus é reconhecidamente causador de infecções humanas e um dos principais patógenos alimentares. O regulador gene acessório (Agr) é um sistema central que controla a expressão de diversos fatores de virulência. O polimorfismo do locus agr divide S.aureus em grupos genéticos distintos associados a determinados perfis patogênicos. O objetivo deste estudo foi comparar fenotipicamente e genotipicamente isolados clínicos e alimentares de S.aureus. Um total de 63 S.aureus (34 isolados de cateter venoso central (CVC) e 29 de carne de frango) foram selecionados para o estudo. O gene sea foi encontrado em 44,1% (15/34), seb em 5,9% (2/34) e sec em 8,8% (3/34) dos isolados de CVC. Em isolados de frango, apenas o gene sea foi detectado e foi observado em 31% (9/29). Somente 6% (2/34) dos isolados de CVC formaram biofilme. Já, em isolados de frango, 93% (27/29) foram formadores de biofilme (P<0,01). Nos isolados de CVC, os genes icaA, atlA e sasG envolvidos com a formação de biofilme estiveram presentes em 100% (34/34), 97% (33/34) e 100% (34/34), das amostras respectivamente, enquanto que, em isolados de carne de frango os mesmos genes foram detectados em 93% (27/29), 52% (15/29) e 100% (29/29), respectivamente. Cepas resistentes à penicilina foram detectas em 86,2% dos isolados de carne de frangos e em 88,2%, dos isolados de CVC. Isolados de CVC foram resistentes a oxacilina e multirresistentes em 17,6% (6/34). Com relação ao polimorfismo do locus agr, os S.aureus isolados de CVC foram dividos em 3 grupos, onde 44% (15/34) tiveram o polimorfismo I, 38% (13/34) o II e 18% (6/34) o III. Os S.aureus isolados de carne de frangos, também foram divididos em 3 grupos, onde 86% (25/29) dos isolados tiveram o polimorfismo I, 10% (3/29) o II e 4%o III (1/29) (P<0,05). Entre os isolados de CVC, 88,2% (30/34) produziram a δ-hemolisina, ou seja, expressavam o sistema Agr, já entre os isolados de frangos, apenas 3,3% eram δ-hemoliticos (P<0,05). Conclui-se que os isolados diferiram quanto à capacidade de formação de biofilme, polimorfismo Agr e produção da δ-hemolisina. No entanto, resultados similares foram observados quanto à detecção dos genes das enterotoxinas e os envolvidos com formação de biofilme. A análise molecular mostrou uma elevada similaridade entre os grupos o que pode indicar uma mesma origem destes isolados. / Staphylococcus aureus is recognized as cause of human infections and a one of the important foodborne pathogens. The accessory gene regulator (Agr) is a central system that controls the expression of several virulence factors. The polymorphism of the agr locus divided S. aureus into distinct genetic group associated with determinats of pathogenic profiles. The aim of this study was to the phenotypic and genotypic patterns of S.aureus isolated from clinical and food samples. A total of 63 S. aureus (34 from central venous catheter (CVC) and 29 from poultry meat) were selected for the study. The sea gene was found in 44.1% (15/34), seb in 5.9% (2/34) and sec in 8.8% (3/34) of CVC isolates. In poultry meat isolates, only sea gene was detected and it was observed in 31% (9/29). Only 6% (2/34) of CVC isolates formed biofilm. Further, 93% (27/29) of poultry meat isolates were biofilm formers (P<0.01). In CVC isolates, the icaA, atlA and sasG genes involved in biofilm formation were present in 100% (34/34), 97% (33/34) and 100% (34/34) of the isolates respectively, while in poultry meat isolates the same genes were detected in 93% (27/29), 52% (15/29) and 100% (29/29), respectively.Strains penicillin resistant was detected in 86.2% of poultry meat and 88.2 % CVC isolates. CVC isolates were also oxacillin resistant and multiresistants in 17.6% (6/34). In regard to the polymorphism of agr locus, the CVC isolates were divided into 3 groups, where 44% (15/34) belong to polymorphism I, 38% (13/34) to II and 18% (6/34) to III. The S. aureus strains isolated from poutry meat were also divided into 3 groups, where 86% (25/29) showed the polymorphism I, 10% (3/29) the II and 4% (1/29) the III (P<0.05). Among the CVC isolates 88.2% (30/34) produced δ-hemolysin, i.e., expressed the Agr system, in addition among the poultry meat isolates, only 3.3% were δ-hemolytic (P<0.05). In conclusion, S.aures isolated from CVC and poultry meat showed differences in their ability to form biofilm, Agr polymorphism and production of δ-hemolysin. In conclusion, S.aures isolated from CVC and poultry meat showed differences in their ability to form biofilm, Agr polymorphism and production of δ-hemolysin. However, similar results were observed in relation to enterotoxin genes and those involved in biofilm formation.The molecular analysis show high genotypic similarity to S.aures isolated from CVC and poultry meat, suggesting a common origin of these isolates, possible the human microbiota.

Enterococcus faecalis estão entre as principais causas de infecções hospitalares em todo o mundo e é uma das mais importantes na área clínica devido à presença de inúmeros fatores de virulência que reforçam sua patogenicidade. Estudos mostram que concentrações subinibitórias de antimicrobianos podem alterar a resposta transcricional e fenotípica de bactérias, porém pouco se sabe sobre como a vancomicina pode afetar a expressão gênica nos microrganismos portadores de seus genes de resistência (genes van). Portanto, este trabalho objetivou avaliar presença e expressão de genes vanC em E. faecalis vancomicina-susceptíveis e avaliar o comportamento de isolados Enterococos Vancomicina-Resistentes (EVR) na ausência e presença de concentrações subinibitórias de vancomicina por PCR quantitativa. Identificamos a presença e a expressão de genes vanC em E. faecalis vancomicina-susceptíveis, sendo estes genes específicos para as espécies Enterococcus gallinarum e Enterococcus casseliflavus, sugere-se que o E. faecalis possa tê-los adquirido por transferência horizontal. Verificamos que a presença de vancomicina in vitro é capaz de interferir na modulação de genes de virulência em isolados EVR, porém não interfere na formação de biofilme destes isolados. Embora os dados aqui apresentados refiram-se a testes in vitro, podemos inferir que os genes vanC estão sendo transferidos para outras espécies e que a vancomicina pode estar contribuindo para o aumento na expressão de fatores de virulência in vivo, levando ao agravamento de quadros clínicos. / Enterococcus faecalis are among the leading causes of nosocomial infections worldwide and is one of the most important in the clinical area due to the presence of numerous virulence factors that enhance the pathogenicity. Studies show that sub-inhibitory concentrations of antibiotics can alter the transcriptional and phenotypic response of bacteria, but little is known about the effect of vancomycin in gene expression in microorganism bearers of their resistance genes (genes van). Therefore, this study aimed to evaluate the presence and expression of vanC genes in E. faecalis vancomycin susceptible and evaluate the behavior of vancomycin resistant enterococci (VRE) strains in the absence and presence of sub-inhibitory concentrations of vancomycin for Quantitative-PCR. We have identified the presence and expression of vanC genes in E. faecalis which are specific to Enterococcus gallinarum and Enterococcus casseliflavus species, it is suggested that the E. faecalis may have acquired these genes by horizontal gene transfer. We found that the presence of vancomycin in vitro is able of interfering with modulation of expression of virulence genes in VRE strains but does not interfere in the biofilm formation of these isolates. Although the data presented here were obtained from in vitro tests, we can infer that the vanC genes are being transferred to other species and that vancomycin may be contributing to the increase in the expression of virulence factors in vivo, leading to worseres clinical outcomes.

Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) é uma importante causa de diarreia infantil. EPEC adere no epitélio intestinal e causa uma lesão conhecida como attaching and effacing (A/E). Cepas recombinantes de Mycobacterium smegmatis (Smeg) e Mycobacterium bovis (BCG) foram construídas para expressar BfpA ou Intimina. Os genes dessas proteínas foram amplificadas por PCR do DNA genômico de EPEC e inseridos nos sítios de BamHI/KpnI do vetor pMIP12. Os plasmídeos construídos pMIP-bfpA e pMIP-intimina foram introduzidos, separadamente,nas cepas de Smeg e BCG. Clones recombinantes foram selecionados baseado na resistência a kanamicina e nomeados como rSmeg pMIP (bfpA ou intimina) and rBCG pMIP (bfpA ou intimina). A expressão dos genes bfpA e intimina foram detectados por Western blotting usando anticorpos primários policonais anti-BfpA e anti-intimina. A imunogenicidade dessas proteínas foi avaliada em camundongos C57BL/6 pela presença de anticorpos anti-BfpA e anti-intimina IgA e IgG nas fezes e soro, respectivamente. TNF-a e INF-g foram produzidas in vitro por céulas do baço de camundongos imunizados com a vacina recombinante com BfpA e Intimina. A adesão de EPEC (E2348/69) em células alvo Hep-2 foi bloqueada pelos anticorpos IgA ou IgG de camundongos imunizados com as vacinas recombinantes, mas não por anticorpos de animais não imunizados. Vacinas recombinantes contendo as proteínas BfpA e Intimina de EPEC podem ser candidatas promissoras. / Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) is an important cause of diarrhea in children. EPEC adheres to the intestinal epithelium and causes attaching and effacing (A/E) lesions. Recombinant Mycobacterium smegmatis (Smeg) and Mycobacterium bovis BCG strains were constructed to express either BfpA or intimin. The entire bfpA gene and a portion of the intimin gene were amplified by PCR from EPEC genomic DNA and inserted into the pMIP12 vector at the BamHI/KpnI sites. The pMIP bfpA and pMIP intimin vectors were introduced separately into Smeg and BCG. Recombinant clones were selected based on kanamycin resistance and designated rSmeg pMIP (bfpA or intimin) and rBCG pMIP (bfpA or intimin). The expres-sion of bfpA and intimin was detected by Western blotting using polyclonal anti-BfpA and anti-intimin primary antibodies. The immunogenicity of these proteins was assessed in C57BL/6 mice by assaying the feces and serum for the presence of anti-BfpA and anti-intimin IgA and IgG antibodies. TNF-a and INF-g were produced in vitro by spleen cells from mice immunized with recombinant BfpA, whereas TNF-g was produced in mice immunized with recombinant intimin. The adhesion of EPEC (E2348/69) to Hep-2 target cells was blocked by IgA or IgG antibodies from mice immunized with recombinant BfpA or intimin but not by antibodies from non-immunized mice. Immunogenic non-infectious vectors containing relevant EPEC virulence genes may be promising vaccine candidates.