Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:15Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-02-11Bitstream added on 2014-06-13T19:21:45Z : No. of bitstreams: 1 melo_lms_dr_sjrp.pdf: 6146654 bytes, checksum: 861736c4cd6f9884be922b051977e3fb (MD5) / O presente estudo avaliou a resposta de anticorpos contra diferentes antígenos de merozoíto e esporozoíto de Plasmodium vivax, relacionando com as variantes da porção repetitiva do domínio central do gene da Proteína Circunsporozoítica (CSP) do parasito (VK210, VK247 e P. vivax-like) e com os polimorfismos do HLA-DRB1 no hospedeiro humano. A resposta de anticorpos foi avaliada para peptídeos das regiões conservadas e centrais variáveis da CSP, da porção N-terminal da Proteína de Superfície do Merozoíto 1-MSP1 (Pv200L), e recombinante do Antígeno 1 de Membrana Apical (AMA-1) e a Proteína de ligação ao Duffy (DBP) por ELISA, em amostras de plasma de pacientes naturalmente infectados com P. vivax. Inicialmente nós avaliamos a distribuição destas variantes da CSP em cinco diferentes áreas da Amazônia a fim de entender sua atual dinâmica de transmissão. A variante VK210 continua sendo a mais prevalente em todas as áreas estudadas. No entanto, pela primeira vez documentamos a presença das variantes VK247 e P. vivax-like como infecções simples na Amazônia brasileira evidenciando um novo perfil distribuição destas, o que possa sugerir um processo de adaptação das mesmas. Quando comparamos a resposta de anticorpos e a infecção pelas variantes de P. vivax, não foram observadas associações significativas entre a presença de determinada variante da CSP e a freqüência de resposta de anticorpos contra os três peptídeos do merozoíto analisados, MSP1 (Pv200L), AMA-1 e DBP e nem contra as frações conservadas da CSP no esporozíto, N-terminal [N] e C-terminal [C]. A falta de associações significativas entre resposta sorológica contra esses peptídeos fornece informações promissoras quanto à utilização destes antígenos para o desenvolvimento de uma vacina contra malária. Todavia, a variação na porção central da CSP deve ser considerada... / The present study evaluated the antibody response against merozoite and sporozoite antigens of Plasmodium vivax and its relationship with the variants of the repetitive central region of the gene for Circunsporozoite protein (CSP) in parasite (VK210, VK247 and P. vivax-like) and, with the HLA-DRB1 polymorphisms in human host. The antibody response to synthetic peptides of the CSP conserved and variable regions and of the N-terminal portion of Merozoite surface protein - MSP1 (Pv200L), and, to recombinants peptides of the Apical Membrane Antige 1 (AMA-1) and of the Duffy Binding Protein (DBP) was evaluable by ELISA in plasma samples of malaria patients naturally infected with P. vivax. Firstly, we evaluated the CSP variants distribution among five different areas from Brazilian Amazon, in order to understand their current dynamic of transmissions. VK210 variant remains the most prevalent in all study areas. However, it is the first detection of VK247 e P. vivax-like variants as simple infection in the Brazilian Amazon, showing a new distribution profile, which may suggest an adaptation process of them. When comparing the antibody response and infection by variants of P. vivax, there were no significant associations between the presence of particular CSP variant and the frequency of antibody response against all three merozoite peptides analyzed, MSP1 (Pv200L), AMA-1, DBP and against the CSP conserved fractions in the sporozoite, N-terminal and C-terminal. The lack of significant associations among immune response against these peptides provides promising information regarding the use of these antigens for malaria vaccine development. On the other hand, the central variability of CSP should be considered to employment of this region as an immunogen, since the antibody response appears to be variant-specific. In order to evaluate the polymorphisms... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2015-04-09T12:28:27Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-02-27Bitstream added on 2015-04-09T12:47:32Z : No. of bitstreams: 1 000812646.pdf: 3278478 bytes, checksum: eebfd378cb8c54ce9d512fd14c333c5e (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / A malária é uma das principais causas de morbidade e mortalidade nas áreas tropicais e subtropicais do mundo. O desenvolvimento de uma resposta imune eficaz é capaz de reduzir a mortalidade e os sintomas clínicos da doença. No entanto, este é um processo complexo, e um dos objetivos dos imunologistas é entender as razões pelas quais os indivíduos diferem em suas respostas imunes contra o parasito. O objetivo do presente estudo foi avaliar a influência de polimorfismos em genes coestimulatórios do sistema imune na resposta imune humoral contra proteínas de estágio sanguíneo do Plasmodium vivax, principal espécie causadora de malária no Brasil. Para tanto, nós genotipamos, pelo método de PCR-RFLP, nove SNPs em sete genes (CD28, CTLA4, ICOS, CD86, CD40, CD40L e BLYS). A amostra foi constituída por 227 indivíduos infectados com P. vivax no município de Goianésia do Pará, no Estado do Pará. As respostas de anticorpos IgG específicos contra as proteínas N- (ICB2-5) e C-terminal (MSP-119) da MSP-1, da DBP e da AMA-1 do P. vivax foram determinadas por ELISA. IgM e as subclasses de IgG contra a ICB2-5 também foram avaliadas. Para estudar os polimorfismos dos genes coestimulatórios, nós primeiramente investigamos o impacto da estratificação da população na distribuição dos polimorfismos com o auxilio de marcadores informativos de ancestralidade e demonstramos que a frequência dos SNPs ICOS +1564T>C, CD40L -726T>C e CD86 +1057G>A varia de acordo com a ancestralidade. Polimorfismos em genes coestimulatórios foram associados com a resposta de anticorpos contra proteínas do estágio sanguíneo do P. vivax, mais especificamente contra a DBP, e as porções N- e C-terminal da MSP-1. Além disso, haplótipos formados pelos genes CD28, CTLA4 e ICOS foram associados com a resposta de anticorpos IgG4 contra a região N-terminal da MSP-1. Este é o primeiro estudo de associação genética envolvendo polimorfismos em genes ... / Malaria is one of the main causes of morbidity and mortality in the tropics and subtropics areas of the world. Although the immunity is only partial, it is important in reducing the amount of illness and death caused by malaria. However, the immunity against malaria is complex, and one of the main goals of vaccine developers is to understand why people differ in their immune response to the parasite. The present research aims to investigate the genetic mechanisms related to humoral immune response against P. vivax blood stages antigens, predominant malaria species in Brazil. Nine single nucleotide polymorphisms (SNPs) in 7 genes (CD28, CTLA4, ICOS, CD86, CD40, CD40L e BLYS) were determined by PCR-RFLP. A total of unrelated 227 individuals infected with P. vivax from the Goianésia do Pará, Pará state, participated in this study. Level and prevalence of IgG antibodies against N-terminal (ICB2-5) and C-terminal (MSP-119) regions of MSP-1, DBP and AMA-1 of P. vivax were measured by ELISA. First, we evaluate the influence of genomic ancestry on distributions of co-stimulatory genes polymorphisms in an admixed Brazilian population using ancestry informative markers. ICOS, CD40L and CD86 polymorphisms were associated with genomic ancestry. There were significant association between CD28 -372G>A, ICOS +1564T>C, and CD40L -726T>C SNPs with antibodies anti-DBP prevalence. Moreover, CD40 -1C>T and CD86 +1057G>A SNPs were associated with antibody levels anti-PvMSP-119. The CD28 -372G>A and CD40 -1C>T SNPs were associated with IgM prevalence against ICB2-5. Haplotypes formed by polymorphisms in CD28, CTLA4, and ICOS genes were associated with IgG4 antibodies against ICB2-5. This is the first study to associate polymorphisms in costimulatory genes with humoral immune response against P. vivax. These data may add important information for understanding the immunological aspects involved in vivax malaria

Orientador: Ricardo Luiz Dantas Machado / Banca: Mauro Toledo Marrelli / Banca: Carlos Eugênio Cavasini / Resumo: Responsável por 300 a 500 milhões de novas infecções e 1,5 a 3 milhões de mortes por ano no mundo inteiro, a malária continua sendo a principal doença parasitária. Se importante é o combate contra os parasitos, importante também é o conhecimento dos aspectos de incidência, distribuição, especificidade de hospedeiros, além do conhecimento de fatores biológicos e moleculares que determinam a distribuição destes. Neste cenário, um dos principais parâmetros analisados para o controle e monitoramento da malária é a detecção de espécies de Plasmodium nos vetores capazes de infectarem humanos. Embora existam diversas metodologias com este fim, a maioria delas apresenta algumas limitações. O objetivo do presente estudo foi desenvolver um método que permita a identificação do P. falciparum, do P. malariae e das variantes do P. vivax no vetor. Uma PCR foi padronizada, utilizando iniciadores contra regiões específicas do gene CS. A PCR-RFLP foi utilizada para distinguir as variantes do P. vivax. A eficiência da metodologia desenvolvida foi comparada com uma nested-PCR, utilizando Anopheles infectados experimentalmente. Um total de 90 mosquitos foram infectados artificialmente com P. vivax (n = 30), P. falciparum (n = 30) e P.malariae (n = 30). Estes mosquitos infectados, juntamente com outros 30 não infectados foram avaliados em relação a identificação do Plasmodium por nested PCR e com o CS-PCR. A nested PCR para o P. vivax, P. falciparum e P. malariae identificou 19, 16 e 21 mosquitos positivos, respectivamente; enquanto o CS-PCR detectou em 17, 14 e 16 mosquitos, respectivamente. A comparação entre os dois métodos revelou uma boa concordância (κ = 0,723, 0,867 e 0,657, respectivamente, para P. vivax, P. falciparum... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Malaria remains the most serious vector-borne disease, affecting some 300-500 million people annually, causing 1.5-3 million deaths. Is important the fight against the parasites, but it is also important the knowledge of the incidence, host specificity, molecular and biological factors determining the distribution of these parasites. In this scenario, identification of the human-specific Plasmodium species in the mosquito host is an essential component for planning and monitoring of malaria control operations. However, most of the detection methods show some potential limitations. The objective of this study was development an effective assay for detecting Plasmodium falciparum, Plasmodium malariae and Plasmodium vivax variants in Anopheles mosquitoes. A PCR was development targeting the CS gene. A PCR-RFLP was used to distinguish the P. vivax variants VK210, VK247 and P. vivax-like. The new PCR assay was compared against a nested PCR using artificially infected Anopheles mosquitoes. A total of 90 mosquitoes were artificially infected with P. vivax (n = 30), P. falciparum (n = 30) and P. malariae (n = 30). These infected mosquitoes along with another 30 unfed mosquitoes were checked for the identification of Plasmodium by nested PCR and with the CS-PCR. Nested PCR for P. vivax, P. falciparum and P. malariae detected positive infection in 19, 16 and 21 mosquitoes respectively; whereas CS-PCR detected in 17, 14 and 16 mosquitoes, respectively. The comparison revealed a close agreement between the two assays (κ = 0.723, 0.867 and 0.657, respectively for P. vivax, P. falciparum and P. malariae groups). Subsequently, PCR-RFLP efficiently discriminate P. vivax variants... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Malaria remains a major responsible factor for morbidity and mortality in many tropical and subtropical countries. Due to the several attempts to control this protozoan infection, vaccines have been subject of intensive research, since this seems to be a promising way for the effective control of malaria. Individuals, who are frequently exposed to the parasite by living in endemic areas, develop specific immune responses, leading to a reduction of parasite load and clinical manifestations. Moreover, the serum of such individuals may impair fertilization of gametes in the mosquito, blocking the transmission of this parasite into the vector. The Pvs48/45 protein is found on the surface of gametocytes and used as a target of antibodies enabling this strategy a transmission blocking vaccine. The aim of this study is to evaluate the antibody response in naturally acquired infections by Plasmodium vivax against Pvs48/45 protein. The research of antibodies IgG anti- Pvs48/45 was performed by ELISA in sera from 281 samples of malarial patients living in the Brazilian Amazon. The cutoff point was established using serum from volunteers who never had contact with the plasmodium, establishing the mean optical density (OD) plus three standard deviations. Samples were analyzed in duplicate and the mean OD was divided by cutting point to establish the reactivity index (RI), while samples with IR ≥ 1 are considered positive. Of 281 sera analyzed, in 22.4% were found specific antibody response anti-Pvs48/45 and indices of parasitemia and gametocyte did not influence the antigenic recognition of this protein. With the analysis of the subgroups was obtained that the CTerminal + Central region of Pvs48/45 was the one with the highest antigenic recognition in the study sample. Therefore, studies using this region of the protein may facilitate the understanding of the immunogenic potential of this antigen. This study aims to contribute to the development of an efficient transmission blocking vaccine against Pvs48/45 protein in future trials. / A malária continua sendo responsável por grande morbidade e mortalidade em muitos países tropicais e subtropicais. Diante de várias tentativas de controle dessa protozoose, as vacinas têm sido alvo de intensa pesquisa, uma vez que esse parece ser o caminho promissor para o controle efetivo da malária. Indivíduos que estão frequentemente expostos ao parasito, por habitarem áreas endêmicas desenvolvem respostas imunes específicas, levando a uma redução da carga parasitária e das manifestações clínicas. Além disso, o soro desses indivíduos pode impossibilitar a fertilização dos gametas nos mosquitos, bloqueando a transmissão desse parasito para o vetor. A proteína Pvs48/45 é encontrada na superfície dos gametócitos e utilizada como alvo dos anticorpos viabilizando essa estratégia de uma vacina de bloqueio de transmissão. O objetivo desse estudo é avaliar a resposta de anticorpos naturalmente adquirida em infecções por Plasmodium vivax contra a proteína Pvs48/45. A pesquisa de anticorpos IgG anti-Pvs48/45 foi realizada por ELISA no soro de 281 amostras de pacientes maláricos residentes na região amazônica brasileira. O ponto de corte foi estabelecido utilizando soro de voluntários que nunca tiveram contato com o plasmódio, estabelecendo a média da densidade óptica (DO) mais três desvios padrão. As amostras foram analisadas em duplicatas e a média da DO foi dividida pelo ponto de corte para estabelecer o índice de reatividade (IR), sendo que amostras com IR ≥ 1 são consideradas positivas. Dos 281soros analisados, em 22,4% foram encontradas respostas de anticorpos específicos anti-Pvs48/45 e os índices de parasitemia e os gametócitos não influenciaram o reconhecimento antigênico desta proteína. Na análise dos subfragmentos, obteve-se que a região C-Terminal + Central da Pvs48/45 foi a que apresentou maior reconhecimento antigênico na amostra em estudo (32%). Diante disso, estudos com a utilização dessa região da proteína podem facilitar o entendimento do potencial imunogênico desse antígeno. Esse estudo visa contribuir para o desenvolvimento de uma vacina de bloqueio de transmissão eficiente contra a proteína Pvs48/45 em ensaios futuros.

Made available in DSpace on 2015-04-11T13:54:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Jaquelane.pdf: 1247761 bytes, checksum: c3396b2f5aa59cae9b817bf74a866e28 (MD5) Previous issue date: 2013-08-30 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / High prevalence in Brazil, specifically in the Amazon Region, malária is a parasitic infectious disease with socioeconomic impact sin endemic areas. Plasmodium vivax is the most prevalent agent and has been associated with cases of severe malária before attributed only to Plasmodium falciparum. Genetic variability in host metabolism of antimalárial drugs, influenced by the polymorphism of cytochrome P450(CYP), could lead to significant changes in antimalárial treatment response. Little is known about the influence of genetic factors in the increase of the individual susceptibility of the host to development of severe disease. Therefore, this project aimed to determine the frequency of alleles CYP2B6*6, CYP2C8*3 and CYP2D6*4 in patients with vivax malária, to evaluate the relationship between the alleles found and the occurrence of severe malária and further establish the hematological and biochemical profile among carriers of alleles found. Therefore, we used peripheral blood samples of patients with vivax malária treated at a health care reference in Manaus-AM. Which were extracted leukocyte DNA, which in turn were amplified by real-time PCR using TaqMan ® system for allelic discrimination. The frequencies of the alleles CYP2B6*6, CYP2C8*3 and CYP2D6*4 were 28.26%, 6.7%, 8.87%, respectively. The CYP2D6*4 allele was more prevalent among patients diagnosed with severe vivax malária, and was associated with normal levels of reticulocytes, erythrocytes and hematocrit. Future studies are needed to understand the clinical implications of the polymorphisms found in patients with vivax malária. / De elevada prevalência no Brasil, especificamente na Região Amazônica, a malária é uma doença infecto-parasitária com impactos socioeconômicos em áreas endêmicas. O Plasmodium vivax é o agente de maior prevalência e tem sido associado a casos graves de malária antes atribuída apenas ao Plasmodium falciparum. A variabilidade genética do hospedeiro no metabolismo de fármacos antimaláricos, influenciada pelo polimorfismo de isoformas do citocromo P450 (CYP), poderia levar a alterações significativas na resposta terapêutica antimalárica. Pouco se conhece sobre a influência dos fatores genéticos no aumento da susceptibilidade individual do hospedeiro ao desenvolvimento de formas graves da doença. Portanto este projeto objetivou determinar a frequência dos alelos CYP2B6*6, CYP2C8*3 e CYP2D6*4 em pacientes com malária vivax, avaliar a relação entre os alelos encontrados e a ocorrência de malária grave e ainda estabelecer o perfil hematológico e bioquímico entre os portadores dos alelos encontrados. Para tanto foram utilizadas amostras de sangue periférico de pacientes com malária vivax atendidos numa unidade de saúde de referência na cidade de Manaus-AM. Dos quais foram extraídos o DNA leucocitário, que por sua vez foram amplificado por PCR em tempo real usando o sistema TaqMan® para a discriminação alélica. As freqüências dos alelos CYP2B6*6, CYP2C8*3 e CYP2D6*4 foram 28,26%, 6,7%, 8,87%, respectivamente. O alelo CYP2D6*4 foi o mais prevalente entre os pacientes diagnosticados com malária vivax grave, e também foi associado a níveis normais de reticulócitos, eritrócitos e hematócrito. Estudos futuros são necessários para compreender as implicações clínicas dos polimorfismos encontrados em pacientes com malária vivax.

Made available in DSpace on 2015-04-11T13:54:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Camila Fabbri.pdf: 1702364 bytes, checksum: aad2c6cd689b654fb570e596447becf9 (MD5) Previous issue date: 2012-01-19 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The human malaria is an infectious disease, febrile, acute or chronic, caused by protozoa transmitted by vectors, being the disease more widely distributed in the world and one of the most prevalent parasitic diseases today. About 300 to 500 million cases occur annually and about 1 to 2 million people - mostly children - die from malaria. In the state of Amazonas, between january 2007 and march 2009, 22,081 cases of malaria were diagnosed and reported, with the largest record (14,249) in 2007. Although Plasmodium vivax malaria is considered a benign form of the disease with a low mortality rate in relation to Plasmodium falciparum, it can cause a serious disease where complications such as jaundice, severe anemia, renal failure and pulmonary complications are described. Oxidative stress occurs when there is an imbalance in the concentration of oxidants, free radicals, and antioxidants, such as enzymes, vitamins C and E, β-carotene. During the malaria disease, oxidative stress may be developed by two mechanisms: by the parasite, when it is to reproduce, generates reactive species and the host immune system, which makes use of these reactive species to try to combat the parasite. In order to study oxidative stress in patients with severe vivax malaria who developed jaundice in the course of the disease in plasma and erythrocytes, and also to check the influence of this high concentration of bilirubin in oxidative stress, the following groups of patients was studied: non-severe malaria , severe malaria presenting jaundice, concurrent malaria and dengue, healthy patients with no history of malaria (control group) and one patient with deficiency in the enzyme glucose-6-phosphate dehydrogenase which contracted malaria. In all patients were measured the levels of antioxidant enzymes and lipid peroxidation marker malondialdehyde on day zero (when diagnosed with malaria) and on day fourteen (free of symptoms and parasitemia). The levels of malondialdehyde and the enzymes celuroplasmin, lactate dehydrogenase and glutathione reductase were increased (p <0.02) in plasma of patients with severe malaria compared with the control group, unlike the enzymes catalase, superoxide dismutase and thioredoxin reductase where levels were decreased (p <0.03) compared to the control group. The levels of glutathione reductase and malondialdehyde marker also showed significantly higher levels in severe malaria groups when compared with non-severe malaria group. The correlation between glutathione reductase and total bilirubin was significant (p < 0.0001) in all patients of each group. Patients who developed malaria and dengue fever showed levels of oxidative stress similar to patients with severe malaria. With all these results, we conclude the patients with severe vivax malaria who developed jaundice had a higher oxidative stress than the patients who contracted the disease in milder form. Thus, these high concentrations of bilirubin may develop the role of signaling to oxidation in patients with malaria / A malária humana é uma doença infecciosa, febril, aguda ou crônica, causada por protozoários transmitidos por vetores, sendo a doença mais amplamente distribuída no mundo e uma das doenças parasitárias mais prevalentes da atualidade. Cerca de 300 a 500 milhões de casos ocorrem anualmente e cerca de 1 a 2 milhões de pessoas - na maioria crianças - morrem de malária. No estado do Amazonas, entre janeiro de 2007 a março de 2009, foram diagnosticados e notificados 22.081 casos de malária, com maior registro (14.249) em 2007. Embora a malária por Plasmodium vivax seja considerada a forma benigna da doença, com uma taxa de letalidade baixa em relação ao Plasmodium falciparum, ela pode causar uma doença grave, onde complicações como icterícia, anemia grave, insuficiência renal e complicações pulmonares são descritas. O estresse oxidativo ocorre quando há um desequilíbrio na concentração de substâncias oxidantes, os radicais livres, e antioxidantes, como enzimas, vitaminas C e E, β-caroteno. Na malária, o estresse oxidativo pode ser desenvolvido por dois mecanismos: através do parasita quando este ao se reproduzir gera espécies reativas e o sistema imunológico do hospedeiro, que lança mão dessas espécies reativas para tentar combater o parasita. Com o intuito de estudar o estresse oxidativo em pacientes com malária vivax grave que desenvolveram icterícia ao decorrer doença no plasma e eritrócitos, além de verificar a influência desta alta concentração de bilirrubina no estresse oxidativo, os seguintes grupos de pacientes foram estudados: malária não grave, malária grave apresentando icterícia, malária e co-infeccão com dengue, pacientes saudáveis sem histórico de malária (grupo controle) e um paciente portador da deficiência na enzima glicose-6-fosfato desidrogenase que contraiu malária. Em todos os pacientes foram mensurados os níveis de enzimas antioxidantes e o marcador de lipoperoxidação malondialdeído no dia zero (quando diagnosticado com malária) e no dia quatorze (livre de sintomas e parasitemia). Os níveis de malondialdeído e das enzimas celuroplasmina, lactato desidrogenase e glutationa redutase estavam aumentados (p < 0,02) no plasma de pacientes com malária grave em comparação ao grupo controle, diferentemente das enzimas catalase, superóxido dismutase e tioredoxina redutase onde os níveis estavam diminuídos (p < 0,03) em comparação ao grupo controle. Os níveis da enzima glutationa redutase e do marcador malondialdeído também mostraram níveis significativamente mais elevados no grupos malária grave quando comparado com o grupo malária não grave. A correlação entre os níveis de bilirrubina e glutationa redutase foi significativa (p < 0.0001) em todos os pacientes de cada grupo. Pacientes que desenvolveram malária e dengue apresentaram níveis de estresse oxidativo semelhante aos pacientes com malária grave. Com todos estes resultados, podemos concluir que os pacientes com malária vivax grave que desenvolveram icterícia apresentaram um maior estresse oxidativo do que os pacientes que contrairam a doença na forma mais branda. Dessa forma, estas altas concentrações de bilirrubina podem estar desempenhando a função de sinalizadoras do processo oxidativo em pacientes com malária

Malaria has consistently been rated as the worst parasitic disease in the world. This disease affects an estimated 5 billion households annually. Malaria has a high mortality rate leading to distorted socio-economic development of the world at large. The major challenge pertaining to malaria is its continuous and rapid spread together with the emergence of drug resistance in Plasmodium species (vector agent of the disease). For this reason, researchers throughout the world are following new leads for possible drug targets and therefore, investigating ways of curbing the spread of the disease. Cysteine proteases have emerged as potential antimalarial chemotherapeutic targets. These particular proteases are found in all living organisms, Plasmodium cysteine proteases are known to degrade host hemoglobin during the life cycle of the parasite within the human host. The main objective of this study was to use various in silico methods to analyze the hemoglobinase function of cysteine proteases in P. falciparum and P. vivax. Falcipain-2 (FP2) of P. falciparum is the best characterized of these enzymes, it is a validated drug target. Both the three-dimensional structures of FP2 and its close homologue falcipain-3 (FP3) have been solved by the experimental technique X-ray crystallography. However, the homologue falcipain-2 (FP2’)’ and orthologues from P.vivax vivapain-2 (VP2) and vivapain-3 (VP3) have yet to be elucidated by experimental techniques. In an effort to achieve the principal goal of the study, homology models of the protein structures not already elucidated by experimental methods (FP2’, VP2 and VP3) were calculated using the well known spatial restraint program MODELLER. The derived models, FP2 and FP3 were docked to hemoglobin (their natural substrate). The protein-protein docking was done using the unbound docking program ZDOCK. The substrate-enzyme interactions were analyzed and amino acids involved in binding were observed. It is anticipated that the results obtained from the study will help focus inhibitor design for potential drugs against malaria. The residues found in both the P. falciparum and P. vivax cysteine proteases involved in hemoglobin binding have been identified and some of these are proposed to be the main focus for the design of a peptidomimetric inhibitor.

Explora la genética poblacional de Plasmodium vivax en la comunidad de Santa Emilia (Iquitos, Loreto), una comunidad aislada en medio de la Amazonía Peruana. Para ello, se realizó un seguimiento de un año a un total de 213 habitantes de la comunidad, a partir de los cuales se seleccionaron 103 muestras, y se identificó una elevada proporción de infecciones asintomáticas (74%) y no detectables por microscopía (72%). A pesar del aislamiento geográfico, la diversidad genética encontrada en Santa Emilia (He=0.61) fue comparable con la reportada en otras localidades de la Amazonía que presentan menores restricciones de flujo génico. No obstante, también se encontró niveles significativos de desequilibrio de ligamiento (ISA=0.19, p<0.001). Diversos análisis de estructuración y diferenciación genética revelaron la presencia de 4 subpoblaciones de P. vivax en Santa Emilia, y a su vez se detectó la ocurrencia de expansiones clonales. Los hallazgos de este estudio sugieren que Santa Emilia representaría un riesgo importante para la reintroducción y mantenimiento de la malaria en otras localidades de la Amazonía Peruana, por lo cual sería necesario la implementación de estudios a mayor escala y la combinación de distintas estrategias para el control de la enfermedad. / Tesis

La malaria causada por Plasmodium vivax es la más predominante en los diferentes casos reportados en el Perú, siendo característico las infecciones asintomáticas y las muestras con baja parasitemia. La poca cantidad de ADN parasitario que se recupera de muestras de baja parasitemia de P. vivax (sub-microscópicas) limita la inclusión de esta población parasitaria en estudios de genética y genómica de poblaciones. La subestimación de la diversidad genética sesga el entendimiento de la transmisión de P. vivax, especialmente en condiciones de baja endemicidad, donde las infecciones sub-microscópicas son predominantes. Diferentes métodos han sido desarrollados para sobrellevar este problema, siendo la Amplificación selectiva del genoma completo (SWGA) una herramienta promisoria. Sin embargo, su efectividad aún no ha sido reportada en muestras de baja parasitemia de P. vivax. El objetivo de la tesis fue optimizar y estandarizar preliminarmente el método SWGA en muestras sub-microscópicas o de baja concentración de ADN de P. vivax. Para ello, se modificaron las condiciones del ciclado y componentes del método propuesto por Cowell et al. (2017) para mejorar el enriquecimiento de ADN parasitario, se calculó la cantidad mínima de ADN para una amplificación genómica exitosa, se evaluó la fidelidad del SWGA y se aplicó el método optimizado en ADN almacenado (-20°C) de 20 muestras de campo. Primero se modificaron diferentes componentes y parámetros del método SWGA, se cuantificó el ADN parasitario y humano por PCR tiempo real antes y después de la amplificación genómica; así se calculó el enriquecimiento del ADN parasitario. El método optimizado permitió que las muestras del panel (muestras simuladas) incrementaran su concentración de ADN parasitario (>805 veces) y porcentaje de ADN parasitario (>218 veces) en comparación a su estado inicial. La concentración mínima de ADN parasitario, para generar una amplificación genómica exitosa de más 1200 moléculas/µL, fue 1.29 moléculas/µL. Luego de la aplicación del método SWGA optimizado, el 97.22% de todos los alelos no presentaron diferencias en sus tamaños y solo hubo una pérdida de datos del 3.57%. El 80% de la muestras de campo tuvieron una amplificación genómica exitosa. Se demostró que el método optimizado mejoró su desempeño en el enriquecimiento del ADN de P. vivax a partir de ADN total, provenientes de muestras de baja densidad parasitaria, y así permitió una mayor cobertura de las muestras para ser incluidas en los análisis genéticos. / International Center of Excellence for Malaria Research / VLIR-UOS / Universidad Peruana Cayetano Heredia (Lima) / Tesis

O Antígeno 1 de Membrana Apical (AMA-1) de Plasmodium sp tem sido sugerido como candidato a compor uma vacina contra a malária. No presente estudo geramos cinco proteínas recombinantes baseadas em diferentes regiões do ectodomínio de AMA-1 de Plasmodium vivax, o qual compreende os domínios I a III, com intuito de mapear regiões particularmente imunogênicas da proteína. Cada uma das cinco proteínas recombinantes foi expressa em Eschericha coli a partir do vetor pET-28a em fusão com a cauda de histidina e purificadas por cromatografia de afinidade. As diferentes proteínas recombinantes foram comparadas, por ELISA, quanto ao reconhecimento por anticorpos IgM, IgG e subclasses de IgG de 100 indivíduos infectados por P. vivax procedentes de áreas endêmicas do Estado do Pará e 32 indivíduos não infectados que relataram terem sido acometidos de mais de 10 episódios prévios de malária procedentes do município de Terra Nova do Norte (MT). As freqüências de indivíduos que apresentaram anticorpos IgM foram mais baixas e variaram de 4% (DIII) a 36% (DII-III). Por outro lado, as freqüências de indivíduos que apresentaram anticorpos IgG para DI, DII, DIII, DI-II e DII-III foram 13%, 65%, 12%, 59% e 58%, respectivamente. Podemos observar que as proteínas recombinantes contendo o DII foram particularmente imunogênicas durante a infecção natural. Com o objetivo de avaliar se os epítopos reconhecidos nas cinco proteínas baseadas nos diferentes domínios estão expostos na proteína recombinante correspondente ao ectodomínio (DI-III) gerada previamente, realizamos ensaios de inibição por ELISA utilizando placas sensibilizadas com a proteína DI-III. Nossos resultados sugerem a presença de um maior número de epítopos comuns entre as proteínas recombinantes baseadas nos domínios I-II e ectodomínio de AMA-1. Além disso, observamos que a proporção de indivíduos que apresentaram anticorpos contra DII, DI-II e DII-III aumentou de acordo com o maior número de exposições prévias ao P. vivax. As subclasses de IgG que predominaram contra todas as proteínas foram IgG1, IgG3 e IgG4. Em conjunto, nossos resultados sugerem que as proteínas recombinantes contendo o DII podem ser exploradas em futuros estudos de indução de imunidade protetora contra malária vivax em primatas não-humanos. / The Apical Membrane Antigen 1 (AMA-1) of Plasmodium sp has been suggested as a vaccine candidate against malaria. Herein, to identify novel antigenic epitopes on the Plasmodium vivax AMA-1 ectodomain, we have generated five recombinant proteins, comprising domains I to III. All recombinant proteins were expressed in Escherichia coli using the pET-28a vector system fused to hexahistidine tag for purification by affinity chromatography. Recognition of recombinant proteins by antibodies was evaluated using a panel of sera collected from onehundred P. vivax -infected patients resident in the State of Pará and from thirty-two non-infected individuals, living in the State of Mato Grosso and who have faced a minimum of ten malaria episodes. ELISA analyses demonstrated that protein recognition was highly dependent on IgG antibodies, raging from 13%, 65%, 12%, 59% up to 58%, respectively for DI, DII, DIII, DI-II and DII-III domains. Indeed, we have noticed a lower frequency of recognition, ranging from 4% (DIII) to 36% (DII-III), by sera from those individuals that presented IgM antibodies. Collectively, these data suggest that the DII domain is particularly immunogenic during natural infections. Next, to verify whether the epitopes recognized in these five different recombinant proteins were also expressed in a recombinant protein spanning domains I through III (DI-III), we carried out ELISA inhibition assays using plates coated with the DI-III recombinant protein. Our findings revealed the presence of a higher number of common epitopes among recombinant proteins based on domains I-II and the AMA-1 ectodomain. Moreover, we observed that the proportion of individuals who had presented antibodies against DII, DI-II and DII-III domains increased according to the previous number of P. vivax episodes. Overall, IgG1, IgG3 and IgG4 antibodies were prevalent to all proteins. Taken together, our results demonstrated that DII domain is highly recognized, mainly by IgG antibodies; and open promising perspectives to use this region as an experimental vaccine in non-human primates capable to induce protective immunity against vivax malaria.