A fragmentação e a invasão de florestas tropicais e a crescente concentração de assentamentos humanos aumentaram exponencialmente as chances de exposição a vírus emergentes e emergentes. Dado o grande potencial de espalhamento de patógenos em população humanas, a identificação e caracterização de agentes patogênicos circulantes podem melhorar a atenção primária e as capacidades de diagnóstico para um agente emergente futuro. As abordagens moleculares e metagenômicas que utilizam as tecnologias de sequenciação da próxima geração levaram a descoberta e caracterização de muitos vírus emergentes na última década. Além disso, as abordagens in silico também podem ajudar a identificar vírus emergentes usando apenas dados de sequenciamento publicamente disponíveis. Além disso, estimar a ascendência filogenética e até mesmo analisar as mudanças no uso de codons são ferramentas adicionais que podem melhorar a nossa compreensão de vírus emergentes ou reemergentes. Este projeto visou aplicar essas ferramentas em ambos os vírus que poderiam estar circulando no Brasil: Parvovírus B19 e vírus da Febre Amarela. Também exploramos as aplicações de modelos ocultos de Markov e índice de adaptação de codons usando dados publicamente disponíveis. Esperamos que este trabalho forneça uma prova de conceito para futuros projetos metagenômicos e demonstre a utilidade das várias técnicas moleculares e bioinformáticas no estudo de vírus emergentes. / Fragmentation and encroachment of tropical rainforests and the growing concentration of human settlements have exponentially increased chances of exposure to re-emerging and emerging viruses. Given the large potential for pathogens to spillover and spread in a population, identifying and characterizing circulating human pathogens could improve the readiness and diagnostic capabilities for a future emergence. Molecular and metagenomic approaches using next-generation sequencing technologies have led to the discovery and characterization of many emerging viruses over the last decade. In complement, in silico approaches can also help identify emerging viruses using only publicly available sequencing data. Moreover, estimating the phylogenetic ancestry and even analyzing changes in codon usage are additional tools that can improve our understanding of an emerging or re-emerging virus. This project aimed to apply these tools to two viruses that could be circulating in Brazil: Parvovirus B19 and Yellow Fever virus. We also explored the applications of Hidden Markov models and codon adaptation index using publicly available data. We expect this work to provide a proof-of-concept for future metagenomic projects, and demonstrate the utility for several molecular and bioinformatics techniques in the study of emerging viruses.

Hantaviren (Familie Bunyaviridae) sind Erreger, die von Nagetieren auf den Menschen übertragen werden und Hämorrhagische Fieber mit Renalem Syndrom (HFRS) auslösen. Die vorgelegte Arbeit beinhaltet derartige Ergebnisse zu zwei europäischen Hantaviren, dem Dobravavirus (DOBV) und dem Tulavirus (TULV). DOBV ist ein wichtiger HFRS-Erreger in Europa. DOBV Stämme kommen in mindestens zwei Nagerspecies, der Gelbhalsmaus (Apodemus flavicollis) und der Brandmaus (A. agrarius) vor. In Übereinstimmung mit diesen natürlichen Wirten bilden die Virusstämme zwei genetische Linien: DOBV-Af und DOBV-Aa. Die phylogenetischen Analysen von den Nukleotidsequenzen der S-, M- und L-Segmente von sympatrisch vorkommenden DOBV-Af und DOBV-Aa Stämmen aus Mitteleuropa zeigten das Vorkommen von Reassortmentprozessen der Genomsegmente während der Evolution der Virusspecies. Ausserdem, wurde die virale Nukleotidsequenz aus einem DOBV-seropositiven HFRS-Patienten aus Detschland amplifiziert. Damit wurde erstmalig der molekulare Beweis erbracht, dass DOBV in Mitteleuropa HFRS auslöst und dass die DOBV-Aa Linie humanpathogen ist. Aus einer in der Slowakei gefangenen A. agrarius Maus haben wir ein neues Virusisolat gewonnen, welches "Slovakia (SK/Aa)" genannt wurde. SK/Aa ist das bisher einzige Virusisolat, das die DOBV-Aa Linie repräsentiert. Es wurde gemeinsam mit einem Isolat der DOBV-Af Linie zur vergleichenden Typisierung der Antikörper von mitteleuropäischen HFRS-Patienten mittels Fokusreduktionsneutralisationstest eingesetzt. Die Seren der meisten Patienten zeigten die höchsten neutralisierenden Antikörpertiter gegenüber SK/Aa, was die Schlussfolgerung zulässt, dass DOBV-Aa Stämme für die meisten DOBV-Infektionen in Mitteleuropa verantwortlich sind. TULV wird durch die Feldmaus (Microtus arvalis) beherbergt. Die Fähigkeit zur Auslösung von HFRS war bisher wenig bekannt. Wir haben den ersten Fall von HFRS gefunden, der mit einer TULV Infektion assoziiert ist. Aus demselben geographischen Gebiet in Nordostdeutschland konnten aus Feldmäusen TULV Nukleotidsequenzen amplifiziert werden. In phylogenetischen Analysen clustern sie mit Stämmen aus Polen und bilden mit diesen gemeinsam eine eigene, neue genetische Linie. Ausser dem hier untersuchten DOBV und dem länger bekannten Puumalavirus ist TULV offenbar das dritte Hantavirus, das in Mitteleuropa HFRS hervorruft. / Hantaviruses (Bunyaviridae family) are rodent-borne bunyaviruses that cause hemorrhagic fever with renal syndrome (HFRS) in Eurasia. This thesis presents novel data about two European hantaviruses, Dobrava virus (DOBV) and Tula virus (TULV). DOBV is an important etiologic agent of HFRS in Europe. DOBV strains were found to be hosted by at least two different rodent species, yellow-necked mouse (Apodemus flavicollis) and striped field mouse (A. agrarius). According to their natural hosts they form the distinct genetic lineages DOBV-Af and DOBV-Aa, respectively. We have determined and analysed the complete S and M, and partial L segment nucleotide sequences of sympatrically occurring DOBV-Af and DOBV-Aa strains from Central Europe. Molecular phylogenetic analyses gave evidence for genetic reassortment in the evolution of the virus species. Moreover, we amplified a DOBV-Aa nucleotide sequence from a DOBV-seropositive HFRS patient from Germany. This is the first molecular identification of human infection by DOBV in Central Europe and the first direct proof that a virus strain related to the DOBV-Aa lineage, carried by A. agrarius rodents, is able to cause HFRS. Under biosafety level 3 conditions, we have established a DOBV isolate named Slovakia (SK/Aa) from an A. agrarius animal captured in Slovakia. SK/Aa, as the only isolate clearly belonging to the DOBV-Aa lineage, can be taken as the representative of this virus lineage. The new virus isolate, in comparison to a DOBV-Af strain, was used for serotyping neutralising antibodies of HFRS patients in Central Europe by the use of a focus reduction neutralisation assay. Most patients'' sera exhibited a higher end-point titer towards SK/Aa suggesting that DOBV-Aa strains are responsible for most of the DOBV HFRS cases in this region. TULV is carried by European common voles (Microtus sp.). Its pathogenic potential for humans was rather unknown. We have described the first case of HFRS which can be associated with TULV infection. Moreover, TULV strains detected in M. arvalis near the home village of the patient in North-East Germany clustered with strains from Poland and represent a new, well-supported genetic lineage within the TULV species. In addition to DOBV and longer known Puumala virus, TULV is most likely an additional causative agent of HFRS in Central Europe.

Mit zunehmendem Alter verringert sich die Fähigkeit des menschlichen Organismus Infektionen erfolgreich zu bekämpfen und, z.B. nach Impfung, einen protektiven Schutz aufzubauen. Es wird vermutet, dass die Alterung des Immunsystems eine Rolle dabei spielt. Wichtige Ergebnisse liefern dazu vor allem tierexperimentelle Studien, welche jedoch die Komplexität menschlicher Immunität nur bedingt abbilden. Nur ansatzweise erforscht ist der Einfluss immunologischer Alterungsprozesse auf die primäre Immunantwort im Menschen. Um ein besseres Verständnis über primäre Immunantworten im Alter zu erlangen, haben wir junge (n=11, Med=26 Jahre) und ältere (n=12, Med=60 Jahre) Erwachsene mit einem viralen Erreger experimentell infiziert und die akute Immunreaktion und Entwicklung langlebiger Protektion eingehend untersucht. Dafür verwendeten wir den attenuierten Lebendimpfstoff gegen Gelbfieber, der ein hervorragendes Modelsystem darstellt um anti-virale Primärantworten im Menschen zu erforschen. Wir konnten zeigen, dass ältere Impflinge weniger Gelbfiebervirus-(GFV)-neutralisierende Antikörper produzierten, schwächere GFV-spezifische CD8+ T-Zellantworten erzeugten und quantitativ als auch qualitativ veränderte GFV-spezifische CD4+ T-Zellantworten generierten. Zudem wiesen ältere Impflinge häufiger eine vergleichsweise späte Virämie auf. Unsere systembiologische Untersuchungen zeigten, dass die niedrige Zahl von frisch aus dem Thymus ausgewanderten naiven CD4+ T Zellen, sogenannten CD4+ Recent thymic emigrants, sowie der Mangel an dendritischen Zellen vor bzw. am Beginn der Infektion ausschlaggebend für die schlechtere Immunreaktion und niedrigere Langzeit-Immunität bei Älteren war. Daraus schließen wir, dass in älteren Menschen die Verfügbarkeit eines breiten Repertoires naiver CD4+ T-Zellen und eine effektive Induktion des angeborenen Immunsystems in der frühen Phase einer primären Infektion kritisch für die akute Abwehr viraler Erreger und die Ausbildung protektiver Immunität ist. / The immunological competence to fight infections and to generate protective immunity, for example upon vaccination, progressively declines with advancing age. Although the aged immune system has been extensively studied at steady state and in aged animal models, there is only rudimentary understanding on how aging affects the immune response to a primary infection in humans. Involving complex individual systemic immune properties, such investigations have been very challenging particularly with the given restrictions of experimental infections in humans. In our study, we explored age-related changes in human immunity during experimental, primary immunization with live-attenuated yellow fever (YF) vaccine. In 11 young (median age: 26 years) and 12 elderly (median age: 60 years) vaccinees, we assessed individual viral burden and compared humoral and cellular immunity by advanced flow cytometric analysis over the entire course of the acute infection and up to 3 years after it. We discovered that aged subjects developed fewer neutralizing antibodies, mounted diminished YF-specific CD8+ T-cell responses and showed quantitatively and qualitatively altered YF-specific CD4+ T-cell immunity. A comparatively late peak in YF viremia suggested impaired infection control and viral clearance in the elderly. Among numerous immune signatures, low in vivo numbers of naive CD4+ recent thymic emigrants (CD4+ RTE) prior immunization and peripheral dendritic cells (DCs) in the early phase of the innate response phase were indicative for reduced acute responsiveness and altered long-term persistence of human cellular immunity to YF vaccination in the elderly. Thus, we reveal by this study that essential elements of immune responses such as CD4+ RTEs and DCs affect productive immunity in the elderly, explaining conclusively diminished responsiveness to vaccination with neo-antigens and infection with de novo pathogens in aged people.

Introdução e Objetivo: No Brasil, procedimentos valvares representam no mínimo 30% das cirurgias cardíacas realizadas no país. Em nosso meio ainda predominam as lesões valvares decorrentes da febre reumática e doenças degenerativas. Nos pacientes reumáticos, a valva mitral é a mais acometida, predominando a estenose devido à fusão comissural e lesões no plano subvalvar; porém espessamento e retração de cúspides também são comuns, determinando dupla lesão ou insuficiência desta valva. Em processos degenerativos, as cordas tendíneas podem se apresentar alongadas. Na tentativa de utilização futura do laser como método auxiliar na correção cirúrgica dessas valvopatias, iniciamos estudo experimental com o objetivo de comparar histologicamente o tecido valvar mitral de suínos (cordas tendíneas e cúspides) submetido com e sem o laser de alta potência (LAP). Métodos: Foram estudadas cordas tendíneas e cúspides mitrais de suínos jovens e saudáveis, divididos em 6 grupos: G1-Aplicação do laser em cordas tendíneas com o tempo de 15 s; G2- Aplicação do laser em cordas tendíneas com o tempo de 20 s; G3- Aplicação do laser em cordas tendíneas com o tempo de 30 s; G4- Grupo controle relacionado a G1, G2 e G3; G5- Grupo cúspide submetido a corte com lâmina de bisturi; G6- Grupo cúspide submetido a corte com laser. As cordas tendíneas dos grupos G1, G2 e G3 receberam tratamento com laser de diodo (=980 nm, P=3,0 W) e o grupo G6 com laser de diodo em outros parâmetros (=980 nm, P=9,0 W, T=12s). Termografia e tomografia por coerência óptica foram utilizadas durante o experimento. Parte da amostra foi preservada em formaldeído e glutaraldeído para análise microscópica e a outra parte foi preservada em solução fisiológica 0,9% para análise mecânica. Resultados: Houve um decréscimo significante no comprimento das cordas tendíneas após aplicação do laser quando comparado ao comprimento inicial (p=0,005 em G1 e G2 e p=0,004 em G3). À microscopia óptica, G1, G2 e G3 apresentaram áreas hialinas ocupando quase a totalidade da espessura da corda, quando coradas pela Hematoxilina-Eosina (HE), áreas vermelho-escura na região central da corda quando coradas pelo Tricrômico de Masson e áreas com birrefringência diminuída quando coradas pelo Picrosírius vermelho. Na avaliação mecânica, os grupos lasers apresentaram diminuição da rigidez do material, assim como na força máxima durante a ruptura, entretanto o deslocamento foi maior em relação ao grupo controle (p=0,005). No G5, evidenciamos ausência de qualquer alteração histológica. No G6 foram identificadas áreas de menor birrefringência do colágeno quando corado pelo Picrosírius vermelho, áreas estas que apresentavam aspecto basofilico hialino no HE e coloração vermelho-escura ao Tricrômico de Masson. Conclusão: As cordas tendíneas de valvas mitrais de suínos submetidas ao laser de alta potência apresentaram redução do seu comprimento final, diminuição na birrefringência e alteração na distribuição dos feixes de colágeno. Além disso, apresentaram queda da rigidez, maior fragilidade de rotura e maior deslocamento ao teste de tração mecânica quando comparada ao grupo controle. Com relação às cúspides, os danos térmicos encontrados no grupo corte com laser de alta potência foram maiores do que em relação ao bisturi de lâmina, quando evidenciados pela microscopia óptica / Introduction and Objective: In Brazil, valvar procedures represent at least 30% of cardiac surgeries performed in the country. It still predominate valvar lesions resulting from rheumatic fever and degenerative diseases. In rheumatic patients, the mitral valve is the most affected, predominantly stenosis due to commissural fusion and lesions in the subvalvar plane, however, thickening and retraction of the leaflets are also common, causing double lesion or mitral insufficiency. In degenerative process, the chordae tendineae may present elongated. In an attempt to further use of the laser as an auxiliary method in the surgical correction of valvar heart disease, we started experimental study with the purpose of comparing the histological swine tissue mitral valve (chordae tendineae and cusps) with and without high-power laser (HPL) application. Methods: Normal porcine mitral valve chordae and cups were studied and divided randomly into the following 6 groups: G1- Laser in the chordae tendineae with time of 15s; G2- Laser in the chordae tendineae with time of 20s; G3- Laser in the chordae tendineae with time of 30s; G4- Control Group; G5- Cusp group cut with a scalpel blade; G6- Cusp group cut with laser. Chordae tendineae from G1, G2 e G3 received diode laser (=980 nm, P=3,0 W) and G6 diode laser with other parameters (=980 nm, P=9,0 W, T=12s). Termography and optical coherence tomography were included during the procedure. Part of the sample was preserved in formaldehyde and glutaraldehyde for microscopic analysis and another part was stored in 0.9% saline for mechanical analysis. Results: There was a significant decrease in chordae length after laser application when compared to the initial length (p=0,005 to G1 and G2; p=0,004 to G3). In laser groups, histological analysis revealed a typical hyaline areas occupying almost the entire thickness of the chordae, when stained with Hematoxylin-Eosin (HE); dark red central areas when stained with Masson Trichrome and a birefringence decrease when stained with Picrocirius red. In mechanical analysis, we found lower stiffness, maximum rupture force decrease and larger displacement compared with the Control Group (p=0,005). In G5, was evidenced absence of any histological abnormality and a homogeneous blue appearance, typical of the cusp. However in G6, a basophilic hyaline aspect was found focally when stained with HE, dark red areas when stained with Masson Trichrome and a birefringence decrease when stained with Picrocirius Red. Conclusion: Chordae tendineae of normal porcine submitted to a high-power laser presented with reduced length, birefringence decrease and the collagen bundles organized into different orientations. Besides, presented lower stiffness, maximum rupture force decrease and larger displacement compared with the control group. Regarding cups, thermal changes were bigger in the cusp group cut with laser compared cusp group cut with scalpel blade, observed by optical microscopy

Submitted by admin tede (tede@pucgoias.edu.br) on 2017-04-27T14:37:47Z No. of bitstreams: 1 ROSEMARY DE CARVALHO ROCHA KOGA.pdf: 1840064 bytes, checksum: 5be7272271d61789b6dc93e32af0b7a3 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-27T14:37:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ROSEMARY DE CARVALHO ROCHA KOGA.pdf: 1840064 bytes, checksum: 5be7272271d61789b6dc93e32af0b7a3 (MD5) Previous issue date: 2017-03-15 / Introduction: Chikungunya fever (FCHIK) is a disease of abrupt onset, transmitted by arthropod mosquitoes intermediate hosts of the Chikungunya virus (CHIKV). The illness has a significant impact on the quality of life of the affected person. Since a disease causes intense and prolonged symptoms of polyarthralgia and myalgia, it requires health care, during a recovery, more than other arboviruses. The objective of this study was to study clinicians and clinicians suggestive of FCHIK, residing in the States of Amapá and Goiás, aiming to correlate the results of laboratory tests with the presented symptomatology. Materials and methods: The study was carried out at the Center for Immunological Studies and Research of the Pontifical Catholic University of Goiás, Goiânia, and in Emergency Care Units in the cities of Macapá, Oiapoque and Santana-AP. The study population consisted of 80 individuals with suspected FCHIK and for investigators of inflammatory markers, the control group consisted of 20 blood samples from healthy donors from Goiana Central de Serologia e Imunohematologia. Viral RNA extraction was performed, followed by RNA detection by Real-Time Polymerase Chain Reaction. In addition to ELISA for detection of IgM and IgG against Chikungunya virus. Participants symptoms were correlated with serology and Creactive protein (CRP), which was evaluated in healthy subjects and in people with FCHIK. Results: No data presented for detection of viral RNA by RT-qPCR for CHIKV, but three samples were positive in this technique for zika virus and one for dengue subtype 1 (DENV1). In an enzyme-linked immunosorbent assay, 26 samples were positive for IgG and 3 for IgM. Regarding the stage of the disease, 10 were in the acute phase, 04 in the subacute phase and 12 in the chronic phase. Correlated the results of the serology with a symptomatology it was observed that the acute phase, all have fever, 90% headache, 70% arthralgia and 60% edema. (100%), myalgia and edema (75%). (100%), arthralgia (92%) and myalgia (75%). When comparing participants with negative serology, n = 54, the most prevalent symptoms were rash, headache, fever, and arthralgia. The CRP levels in individuals infected with more than four symptoms were higher when compared with healthy individuals. Conclusion: The study focused on people with a clinical picture characteristic of FCHIK. The most common symptom in the three phases presented for arthralgia, followed by edema and myalgia, a fever was frequent only in the acute phase. All participants were negative in the evaluation of viral RNA by RT-qPCR for CHIKV, for the virus has a short duration in the body, and this methodology is limited to the time of symptom onset and sample collection, DENV and ZIKV. IG G. Those with negative serology for CHIKV, despite taking into account the joints, symptoms common to other arboviruses. CRP levels have been shown to be high relative to healthy subjects. / Introdução: A Febre Chikungunya (FCHIK) é uma doença de início abrupto, transmitida por mosquitos artrópodes hospedeiros intermediários do vírus Chikungunya (CHIKV). A enfermidade representa um significativo impacto na qualidade de vida da pessoa afetada. Uma vez que a doença causa sintomas intensos e prolongados de poliartralgia e mialgia, requerendo atenção de saúde, durante a recuperação, mais do que outras arboviroses. Objetivou-se estudar aspectos clínicos e sorológicos de indivíduos apresentando quadro clínico sugestivo de FCHIK, residentes nos Estados de Amapá e Goiás, visando correlacionar os resultados de testes laboratoriais com a sintomatologia apresentada. Materiais e métodos: O estudo foi realizado no Núcleo de Estudos e Pesquisa Imunológica da Pontifícia Universidade Católica de Goiás, em Goiânia, e em Unidades de Pronto Atendimento de Saúde das cidades de Macapá, Oiapoque e Santana-AP. A população de estudo foi constituída de 80 indivíduos com suspeita de FCHIK e para comparar os marcadores inflamatórios, o grupo controle foi constituído de 20 amostras de sangue de doadores saudáveis da Central Goiana de Sorologia e Imunohematologia. Foi realizada a extração do RNA viral, seguido de detecção do RNA por meio de Reação em Cadeia de Polimerase em Tempo Real. Além de ELISA para detecção de IgM e IgG específicos para o CHIKV. Os sintomas dos participantes foram correlacionados com o resultado da sorologia e da proteína C reativa (PCR), que foi avaliada em indivíduos saudáveis e em pessoas com FCHIK. Resultados: Nenhuma amostra apresentou limiar de detecção do RNA viral por RT-qPCR para CHIKV, porém três amostras foram positivas nessa técnica para vírus zika (ZIKV) e uma para dengue subtipo 1 (DENV1). Em ensaio imunoenzimático, 26 amostras foram positivas para IgG e 3 dessas para IgM. Em relação ao estágio da doença, 10 encontravam-se em fase aguda, 04 em fase subaguda e 12 em fase crônica. Correlacionados os resultados da sorologia com a sintomatologia observou-se que os de fase aguda, todos tiveram febre, 90% cefaleia, 70% artralgia e 60% edema. Enquanto que, os de fase subaguda tiveram: artralgia e cefaleia (100%), mialgia e edema (75%). Os de fase crônica tiveram edema (100%), artralgia (92%) e mialgia (75%). Quando comparados os participantes com sorologia negativa, n=54, os sintomas mais apresentados foram exantema, cefaleia, febre e artralgia. Os níveis de PCR nos indivíduos infectados e que apresentavam mais de quatro sintomas foram maiores quando comparados com indivíduos saudáveis. Conclusão: O estudo focou em pessoas com quadro clínico característico para FCHIK. O sintoma mais comum nas três fases apresentadas foi a artralgia, seguido de edema e mialgia, a febre foi frequente somente na fase aguda. Todos os participantes foram negativos na avaliação do RNA viral por RT-qPCR para CHIKV, pois o vírus tem uma curta duração no organismo, e esta metodologia é limitada ao tempo de início dos sintomas e coleta de amostra, ainda assim foi encontrado RNA viral do DENV e ZIKV. Alguns participantes foram positivos para sorologia IgG. Aqueles com sorologia negativa para CHIKV, apesar de terem dor nas articulações, tinham sintomas comuns a outras arboviroses. Os níveis de PCR demonstraram-se elevados em relação aos indivíduos saudáveis.

Made available in DSpace on 2015-03-04T18:50:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeseRubem.pdf: 3958802 bytes, checksum: 559985052b43efb925ede65de47826ff (MD5) Previous issue date: 2011-08-26 / This thesis aims at presenting a systematic study of resolution of two-dimensional problems of electromagnetic wave scattering, by conducting and homogeneous or non-homogeneous dielectric media, involving singular sources, large wavenumbers and absorbing boundary conditions, governed by the scalar Helmholtz equation. The resolution of this class of problems through the Finite Element Method, raises several orders of difficulty. The first one comes from the presence of singular sources, having been overcome by adopting a technique of singularity removal. Another one is related to the undefined character of the Helmholtz operator for large wavenumbers, which results in the so-called pollution error of the approximated solution. This error is minimized through a new formulation of Petrov-Galerkin, using quasi optimal weighting functions, called Quasi Optimal Petrov-Galerkin (QOPG) method. The QOPG method, originally developed for homogeneous media, is extended to treating problems with non-homogeneous media as well. Finally, the effects of Bayliss-Turkel absorbing boundary conditions on the quality of the numerical solutions is also evaluated. / Esta tese tem por objetivo apresentar um estudo sistemático da resolução,em duas dimensões espaciais, de problemas de espalhamento de ondas eletromagnéticas por meios condutores e meios dielétricos homogêneos e heterogêneos, envolvendo fontes singulares, números de onda elevados e condições de contorno absorventes, modelados pela equação de Helmholtz. A resolução dessa classe de problemas pelo Método dos Elementos Finitos apresenta dificuldades de várias ordens. A primeira decorre da presença de fontes singulares, tendo sido superada pela adoção de uma técnica de remoção de singularidades. Uma outra decorre do caráter indefinido do operador de Helmholtz para números de onda elevados, o que resulta em um erro de aproximação denominado erro de poluição. A minimização desse erro foi obtida utilizando-se a nova formulação de Petrov-Galerkin, com funções peso quase ótimas, denominada método Quasi Optimal Petrov-Galerkin (QOPG). O método QOPG, originalmente desenvolvido para meios homogêneos, foi adaptado para tratar problemas em meios heterogêneos. Finalmente, consideram-se os efeitos das condições de contorno absorventes de Bayliss-Turkel sobre a qualidade das soluções obtidas.

A febre reumática é uma das sequelas da infecção causada por Streptococcus pyogenes, afetando notadamente crianças e jovens, com altas taxas de morbidade e mortalidade em várias regiões do mundo, incluindo Brasil. Perfis imunoquímicos desenvolvidos por antígenos celulares e extracelulares desta bactéria e isotipos de anticorpos presentes em pacientes com febre reumática foram averiguados, em virtude da escassez de informação a este respeito na literatura. Na primeira fase do trabalho, as condições para o preparo de antígenos, bem como de técnicas, em especial a técnica super-micro de neutralização de anticorpos (Ac) anti-estreptolisina O (ASLO) foram padronizadas. Na segunda etapa, foram identificadas as bandas de antígenos celulares e extracelulares reconhecidas por 56 soros de pacientes com febre reumática (Grupo A), 91 soros de indivídos sem diagnóstico de sequelas não-supurativas da infecção, mas com títulos baixos, médios e altos de Ac ASLO (Grupo B), e 41 soros de crianças sem infecção (Grupo C). Em pacientes com febre reumática, Acs IgG e IgA foram detectados, mas Acs IgM não foram encontrados. Anticorpos IgG de pacientes do grupo A reconheceram um total de 30 bandas do antígeno celular, sendo específicas 18 (14, 17, 19,22,23,28,29,32,36, 73, 83, 102, 104, 108, 11 0, 116, 118 e 125 kDa). O resto das 12 bandas foram consideradas não específicas por serem reconhecidas por soros do grupo C. Um total de 19 bandas do antígeno extracelular foi reconhecido por Acs IgG do grupo A, sendo apenas 3 bandas (40, 46, 125 kDa) específicas. No grupo C, Acs IgA não foram detectados. Um total de 14 bandas (23, 30, 38, 42, 43, 46, 48, 54, 57, 60, 67, 73, 78 e 116 kDa) do antígeno celular foram identificadas por Acs IgA do grupo A. No antígeno extracelular, 8 bandas (38, 48, 54, 60, 67,\" 73, 78 e 95 kDa) foram reconhecidas por Acs IgA do mesmo grupo. Critério adotado de combinar dados imunoquímicos ou seja, bandas iguais ou maiores que 102 kDa e/ou bandas iguais ou menores que 29 kDa do antígeno celular de S. pyogenes, acrescido da presença de Acs IgA, possibilitaram a discriminação de pacientes com febre reumática e de não infectados, fornecendo máxima sensibilidade, especificidade, eficiência, bem como de valores preditivos de resultados positivo e negativo. Ademais, os achados de Acs IgG contra banda de 28 kDa que está relacionada a antígeno do tecido cardíaco, um dos 6 perfís imunoquímicos fornecidos por antígeno celular e Acs IgG do presente estudo, e a presença de Acs IgA parecem constituir sinais precoces associados à patogênese da febre reumática. Desta forma no grupo B, 9 pacientes revelaram a banda de 23 kDa do antígeno celular, destes 7 apresentaram perfis compatíveis com os do grupo A, sendo que apenas 1 deles não apresentou Acs IgA. Os dados sugerem que estes pacientes tendem a evoluir para a forma sintomática da febre reumática, requerendo acompanhamento clínico e laboratorial cuidadoso. / The rheumatic fever is one of the sequelae from the Streptococcus pyogenes infection, affecting manly children and young persons, with high rates of morbidity and mortality in many regions of the world. Immunological profiles developed by cellular and extracellular antigens from this bacterium and antibody isotypes found in the patients with rheumatic fever were investigated, due to the scarcity of information about this aspect in the literature. In the first step of this work, conditions to prepare antigens, as well as of techniques, in particular the super-micro technique for the neutralization of antistreptolysin O (ASLO) antibodies (Abs), were standardized. In the second step, bands of cellular and extracellular antigens recognized by 56 serum sera from patients with rheumatic fever (Grupo A), 91 sera from individuals with no diagnosis of supurative sequelae from the infection, but with low, moderate and high ASLO titers (Group B), and 41 sera from children with no infection (Group C) were identified. In patients with rheumatic fever, IgG and IgA antibodies were found, but IgM antibodies were absent. IgG antibodies from rheumatic fever patients recognized 30 bands of the cellular antigens, of these 18 were specific (14,17,19,22,23,28,29,32,36,73,83,102, 104, 108, 110, 116, 118 e 125 kDa). The remaing 12 bands were considered nonspecific because they were recognized by sera from the group C. A total of 19 bands of the extracellular antigen were recognized by IgG Abs from the group A and 3 of these (40, 46 and 125 kDa) were specific. In the group C, no IgA Abs were detected. A total of 14 specific bands (23, 30, 38, 42, 43, 46, 48, 54, 57, 60, 67, 73, 78 and 116 kDa) of the cellular antigen were identified by IgA Abs from the group A. The extracellular antigen had 8 bands (38, 48, 54, 60, 67, 73, 78 and 95 kDa) recognized by IgA Abs from the same group. A criterion adopted of combining immunchemical data, i.e. bands equal or higher than 102 kDa and/or bands equal or lower than 29 kDa of the cellular antigen of S. pyogenes plus the IgA Ab finding, allowed to discriminate rheumatic fever from noninfected individuals, providing maximum sensitivity, specificity, efficiency as well as predictives of positive and negative results. Moreover, the findings of IgG Abs to 23 kDa of the cellular antigen which is associated to the heart tissue antigen, one of those 6 immunochemical profiles provided by cellular antigen and IgG Abs from this study, and the presence of IgA Abs seem to constitute early immunologic signals related to the pathogenesis of the rhematic fever. Thus in the group B, 9 patients revealed a 23 kDa band of cellular antigen, 7 of these showed immunochemical profiIes consistent with those from the group A, and lacking IgA Abs in onIy one of them. The data suggest these patients are prone to deveIop rheumatic fever, requiring a close clinical and laboratory follow-up.

Neste trabalho foi feito uma investigação sorológica em moradores na região amazônica e moradores rurais do sudeste brasileiro, através do teste de inibição da hemaglutinação (HI) para a cepa vacinal da Febre Amarela mais 17 sorotipos diferentes de arbovírus, sendo quatro do gênero Alphavirus (ALP), nove do gênero Flavivirus (FLA) e cinco do gênero Orthobunyavirus (ORT), para verificar qual desses vírus estão circulando nessas regiões. Os resultados do HI foram divididos em quatro áreas: na cidade Machadinho dOeste (Rondônia) (N=285) tivemos para ALP=50 (17,54%), FLA=270 (94,74%), ORT=58 (20,35%) e negativos (NEG)=12 (4,20%). Nas pessoas que moram ao longo do Rio Machado (Rondônia) (N=343) tivemos ALP=99 (28,86%), FLA=229 (66,76%), ORT=41 (11,95%) e NEG=93 (27,10%). Na cidade Teodoro Sampaio (São Paulo) (N=78) tivemos FLA=55 (70,51%) e NEG=23 (29,5%). Na cidade Jacupiranga (São Paulo) (N=149) tivemos ALP=7 (4,7%), FLA=50 (33,56%), ORT=20 (13,42%) e NEG=84 (56,4%). Concluímos que os resultados obtidos sugerem a circulação desses vírus nas regiões estudadas. / In this work we performed a serological investigation in residents of Amazon region and country people who lives in Southeastern of Brazil, by hemagglutination inhibition (HI) for Yellow fever vaccine and 17 different serotype of arboviruses: four from the genus Alphavirus (ALP), nine from the genus Flavivirus (FLA), and five from the genus Orthobunyavirus (ORT), to try to ascertain which of these arboviruses are circulating in these areas. The results of HI were divided into four areas: In Machadinho dOeste city (Rondônia) (N=285) we had to ALP=50 (17,54%), FLA=270 (94,74%), ORT=58 (20,35%) and negatives (NEG)=12 (4,20%). In people who live along the Machado River (Rondônia) (N=343) we had to ALP=99 (28,86%), FLA=229 (66,76%), ORT=41 (11,95%) and NEG=93 (27,10%). In Teodoro Sampaio City (São Paulo) (N=78) we had to FLA=55 (70,51%) and NEG=23 (29,5%). In Jacupiranga City (São Paulo) (N=149) we had to ALP=7 (4,70%), FLA=50 (33,56%), ORT=20 (13,42%) and NEG=84 (56,4%). In conclusion, the obtained data suggest the circulation of these viruses in these regions.

Made available in DSpace on 2016-01-26T12:51:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 mariacarolinaferrerisarkismadrid_dissert.pdf: 2834086 bytes, checksum: 6c83e7649397cb555812544b997d81d3 (MD5) Previous issue date: 2007-12-04 / Yellow fever is an infectious disease caused by the yellow fever virus (YFV), a Flavivirus transmitted to humans by Aedes aegypti mosquitoes. Despite the existence of the yellow fever vaccine, the disease is endemic in South America and Africa, causing public health problems such as dispersed outbreaks, epidemics with variable impact and the risk of re-emergency of the urban cycle due to the occurrence of sylvatic disease. Aim. The knowledge of the components of YFV replication complex is still incipient but it is known that there are interactions among viral RNA, viral proteins and host proteins and, due to evidences of the existence of protein-protein interactions related to the NS5 protein of other Flavivirus, the target of our study was YFV NS5 protein. Once protein-protein interactions present basic importance for the activation, the regulation and the control of diverse biologic functions related to these interactions, the identification and the characterization of them are essential for a better comprehension of the pathogenesis and for the rational design of drugs for YFV. Material and Method. The YFV NS5 gene was divided in its two domains, which were independently cloned in a GAL4 DNA-BD plasmid, generating the methyltransferase (MT) and RNA polymerase (RNApol) baits. A two-hybrid system screening in Saccharomyces cerevisiae AH109 strain was performed utilizing RNApol bait and cDNA library of Hela cells, which was cloned in a GAL4 AD plasmid. MT bait showed to be toxic for the yeast. Results. All 204 obtained transformants were tested for activation of reporter genes HIS3, ADE2 and lacZ from AH109 and only 35 samples indicated positivity to, at least, two of the reporter genes assessed. Thirty three distinct cellular protein partners of the RNApol NS5 were identified after the sequencing of the clones and the comparison of its sequences with GenBank. Proteins Snf5, p54NRB, HMG20B, U1A, eIF3S6IP, GIPC PDZ and MIF were chosen for next experiments. A plasmid linkage with these proteins was performed to exclude the possibility of false-positive clones and to confirm the protein-protein interactions identified in the initial screening. RNApol regions responsible for the Snf5 and eIF3S6IP interactions were mapped and a region of approximately 80 aminoacids was identified as the minimum domain requested for the interactions, called fragment A. Conclusion. The prominence of this YFV fragment as a determinant of protein interactions became more evident when its sequence was compared to the sequences of other Flavivirus, signalizing a homology from aminoacid 20 to 80, demonstrating that this fragment is a conserved region. Moreover, the production of a similarity model of RNA polymerase domain of YFV NS5 protein, using the known DENV NS5 protein structure, showed that the region of interaction is exposed and potentially capable of forming interactions. / A febre amarela é uma doença infecciosa causada pelo vírus da febre amarela (yellow fever virus YFV), um Flavivirus transmitido ao homem pela picada do mosquito Aedes aegypti. Mesmo com a existência de uma vacina anti-amarílica, a enfermidade conserva-se endêmica na América do Sul e na África, gerando problemas de saúde pública que incluem surtos isolados, epidemias de impactos variáveis e, principalmente, o risco da possível re-emergência da sua forma urbana a partir da ocorrência de surtos silvestres. Objetivo. Embora sejam mínimas as informações sobre os componentes do complexo de replicação do YFV, sabe-se que nele estão envolvidas interações entre o RNA viral, proteínas virais e proteínas do hospedeiro e, devido às evidências de interações proteína-proteína relacionadas à proteína NS5 de outros Flavivirus, o alvo principal do nosso trabalho foi NS5 do YFV. Como interações protéicas são de fundamental importância para ativação, regulação e controle de diversas funções biológicas a elas relacionadas fica evidente a relevância da identificação e caracterização das interações participantes desse processo para uma melhor compreensão da patogênese e para o desenho racional de drogas contra a febre amarela. Material e Método. O gene NS5 de YFV foi dividido em seus dois domínios, os quais foram clonados independentemente no plasmídeo com DNA-BD de GAL4, gerando as iscas metiltransferase e RNA polimerase. Em seguida, foi realizado um screening em sistema duplo-híbrido com a isca RNApol contra biblioteca de cDNA de células Hela clonada em vetor com AD de GAL4, uma vez que MT mostrou-se tóxica para a levedura hospedeira do experimento Saccharomyces cerevisiae, linhagem AH109. Resultados. Os 204 transformantes obtidos foram testados quanto à capacidade de ativação dos genes repórteres HIS3, ADE2 e lacZ de AH109 quando, então, apenas 35 amostras mostraram-se positivas para pelo menos dois dos repórteres testados. Após o seqüenciamento nucleotídico desses clones e comparação das seqüências com o GenBank, os resultados indicaram seqüências nucleotídicas codificadoras para 33 proteínas celulares diferentes como parceiras interativas de RNApol NS5, dentre as quais foram eleitas as proteínas Snf5, p54NRB, HMG20B, U1A, eIF3S6IP, GIPC PDZ e MIF para o prosseguimento dos experimentos. Para excluir a possibilidade de pertencerem a uma classe de clones falso-positivos e confirmar as interações proteína-proteína identificadas na triagem inicial, foi efetuado o plasmid linkage. Após tal confirmação, foram mapeadas as regiões em RNApol responsáveis pelas interações com Snf5 e eIF3S6IP, tendo sido descoberta uma mesma região de aproximadamente 80 resíduos aminoácidos como o domínio mínimo requerido para tais interações, a qual foi denominada fragmento A. Conclusões. A relevância do fragmento A de YFV como determinante das interações protéicas tornou-se mais evidente quando sua seqüência foi comparada à de outros Flavivirus, mostrando a presença de uma homologia principalmente entre os aminoácidos 20 a 80, demonstrando que esse fragmento se comporta como uma região conservada entre os Flavivirus considerados. Além disso, a geração de um modelo de similaridade do domínio RNA polimerase da proteína NS5 de YFV, a partir de NS5 de DENV, demonstrou que a região de interação está exposta ao solvente, sendo, portanto, potencialmente capaz de formar interações.

Facteur clé du développement des nations, la médecine et son organisation se trouvèrent au centre des préoccupations des autorités politiques qui se sont succédées en Argentine et en Uruguay dès que ces territoires ont été conquis par l’Espagne. Pourtant, une fois l'indépendance acquise, des crises économiques répétées et une situation politique chaotique ont fait que, dans les deux rives de la Plata, la médecine a peiné à s’éveiller et à se consolider. Tandis qu’en Uruguay l’érection de la faculté de médecine ne fût possible qu’en 1875, celle de Buenos Aires, érigée en 1821, fonctionna de manière chancelante jusqu’en 1852, à cause de la situation politique troublée que connut le pays avec la dictature de Juan Manuel de Rosas. De ce fait, bon nombre d'Uruguayens et Argentins sont partis entamer ou parfaire leur formation médicale à la Faculté de Paris. En même temps, et en dépit des agitations politiques et de l’instabilité économique de la région, de nombreux médecins français ont, dès la première moitié du 19ème siècle, décidé de s’établir dans les rives de la Plata. Ce travail se penche sur les liens que les médecins séjournant de part et d’autre de l’Atlantique entre 1828 et 1886 ont noués, entretenus et renforcés au fil du siècle. Cette dynamique circulatoire des savoirs, des pratiques et des techniques médicaux, énergique et permanente, bénéficia à la médecine de part et d’autre de l’Atlantique. Cette circulation est abordée, en particulier, par l’analyse de la gestion effectuée, par le corps médical de Montevideo et Buenos Aires, des épidémies de choléra et de fièvre jaune lorsqu’elles firent irruption dans ces villes et des connaissances qui, à leur sujet, ont circulé dans la région avant et après leur apparition. Nous étudions également l’accueil accordé par les membres des sphères médicales française et rioplatense aux discours liés à la crémation des cadavres - système qui provoqua l’engouement du corps médical européen au tournant des années 1860 - et à sa mise en place. Nous montrons que la médecine de part et d’autre de l’Atlantique s’est vue enrichie par le contact et les échanges réciproques que ces médecins ont entretenus. En effet, si la médecine de la Plata a connu dans une grande mesure son éveil par la contribution des acteurs médicaux français qui ont amené dans la région leurs connaissances et leur savoir-faire, la médecine française a été, à son tour, alimentée par le séjour des médecins de l’Hexagone dans les rives de la Plata. Indépendamment de la durée de leurs séjours dans la région, les diverses explorations qu’ils ont effectuées et leur confrontation directe à la pathologie locale ont permis aux médecins français d'accroître leurs connaissances et d’acquérir une expérience singulière. Cette expérience a eu un impact significatif, non seulement dans leur pratique quotidienne, mais aussi dans l’adoption de pratiques innovantes indispensables au progrès médical français dans le dernier quart du 19ème siècle. / As a key factor in the development of nations, medicine and its organization were at the center of the preoccupations of the political authorities who succeeded one another in Argentina and Uruguay as soon as these territories were conquered by Spain. Yet, once independence has been achieved, repeated economic crises and a chaotic political situation have meant that medicine on both sides of the Plata has struggled to awaken and consolidate. While in Uruguay the erection of a faculty of medicine was not possible until 1875, that of Buenos Aires, erected in 1821, functioned in an intermittent manner until 1852, because of the troubled political situation in the country with the Juan Manuel de Rosas's dictatorship. As a result, many Uruguayans and Argentines have gone to begin or perfect their medical training at the Faculty of Paris. At the same time, in spite of the political unrest and the economic instability of the region, many French doctors decided to establish themselves on the banks of the Plata in the first half of the 19th century.This work examines the links that physicians living on both sides of the Atlantic between 1828 and 1886 developed, maintained and strengthened over the course of the century. This dynamic circulation of knowledge and medical techniques, energetic and permanent, benefited the medicine on both sides of the Atlantic. More specifically, we approach these exchanges by an analysis of the management carried out by the medical corps of Montevideo and Buenos Aires of the epidemics of cholera and yellow fever when they broke out in these towns and of the knowledge that circulated in the area before and after their appearance. We also study the reception given by the members of the French and Rioplatense medical spheres to the speeches related to the crematist system and its establishment, a system that excited the European medical profession at the turn of the 1860s. We show that medicine on both sides of the Atlantic has been enriched by the contact and reciprocal exchanges that these doctors have maintained. Indeed, while Plata's medicine has to a large extent been awakened by the contribution of the French medical actors who brought their knowledge and know-how to the region, French medicine was in turn fueled by the stay of doctors of the Hexagon in the banks of the Plata. Regardless of the length of their stay in the region, the various explorations they have carried out and their direct confrontation with the local pathology have allowed French physicians to increase their knowledge and acquire a singular experience. This experience had a significant impact, not only in their daily practice, but also in the adoption of innovative practices essential to French medical progress in the last quarter of the 19th century. / Factor esencial para el desarrollo de las naciones, la medicina y su organización se encontraron en el centro de las preocupaciones de las autoridades políticas del Río de la Plata (Argentina y Uruguay) desde el momento mismo de la conquista española. Sin embargo, una vez adquirida la Independencia, las crisis éconómicas y la inestabilidad política fueron permanentes en los dos países, En consecuencia, el despliegue y la consolidación de la medicina de parte y parte de la Plata se vieron fuertemente comprometidos. Mientras que en Uruguay la facultad de medicina fue creada apenas en 1875, la facultad de Buenos Aires, instalada desde 1821, funcionó de manera irregular hasta 1852, puesto que el régimen dictatorial de Juan Manuel de Rosas entorpeció la enseñanza y puso freno al movimiento científico establecido desde principios de siglo 19. Fue por eso que, con el objetivo de formarse o especializarse en la facultad de medicina de París, numerosos uruguayos y argentinos viajaron a Francia. Paralelamente, y a pesar de las múltiples agitaciones políticas y de la economía vacilante de la Plata, varios médicos franceses decidieron establecerse en la región desde la primera mitad del siglo. Este trabajo explora las relaciones establecidas y consolidadas con el paso del tiempo entre los médicos y estudiantes en medicina rioplatenses y franceses que viajaban entre el viejo continente y la Plata, y que dieron paso a la instauración de una circulación énergica y permanente de saberes, de prácticas y de técnicas médicas, que benefició tanto a la medicina rioplatense como a la medicina francesa. Dicha circulación es ejemplificada a través de la actuación concreta de los cuerpos médicos de Buenos Aires y Montevideo en los momentos en que el cólera y la fiebre amarilla irrumpieron en estas ciudades de forma epidémica, asi como también de la circulación de saberes que, sobre estas enfermedades exóticas, tuvo lugar en la región antes y después de su aparición en la Plata. Asimismo, se analiza la recepción de los discursos y la puesta en práctica de la cremación de cadáveres – sistema que provocó el entusiasmo del cuerpo médico europeo desde finales de los años 1860 – en las esferas médicas francesa y rioplatense. Se espera así recalcar que la medicina de parte y parte del Atlántico se vió enriquecida por el contacto y los intercambios científicos enfectuados entre los médicos franceses y rioplatenses. En efecto, si los médicos franceses, llevando sus conocimientos y su experiencia a la Plata, jugaron un rol clave y estimularon el desarrollo de la medicina rioplatense, la medicina francesa fue, a su turno, alimentada por la estadía de los médicos franceses en la región. En efecto, sin importar el tiempo pasado en la Plata, las múltiples exploraciones geográficas y la confrontación directa avec la patología local enriquecieron los conocimentos de esos médicos y les aportaron una experiencia singular cuyo impacto, altamente significativo en el ejercicio cotidiano de su profesión, repercutió igualmente en el desarrollo de la médicina nacional, estimulando la adopción de prácticas innovantes indispensables al progreso médico francés en el último cuarto del siglo 19.