Mon projet de thèse a porté sur les mécanismes neurodégénératifs dans le contexte de la maladie de Parkinson (MP). Cette maladie est caractérisée notamment par la présence d’inclusions intracytoplasmiques appelées corps de Lewy, dont le composant protéique principal est l’α-synucléine. L’absence de traitements curatifs à ce jour renforce la nécessité de comprendre les processus neurodégénératifs. L’objectif de mon travail de thèse fut de proposer une approche multifactorielle, translationnelle, basée sur trois axes complémentaires: modélisation, thérapeutique et mécanistique. Premièrement, nous nous sommes intéressés à la modélisation de la MP par l’utilisation de vecteurs viraux. Cette première partie nous a permis de conclure que le vieillissement ne constitue pas un facteur de risque pour les trois espèces étudiées. Ensuite, nous avons étudié deux stratégies pour combattre la dysfonction lysosomale existant chez les patients, premièrement par une approche biotechnologique avec des nanoparticules permettant de restaurer le pH des lysosomes dysfonctionnels, et une stratégie de thérapie génique par surexpression d’un régulateur de la biogénèse lysosomale. Grâce à ce travail, nous avons démontré l’intérêt du lysosome comme cible thérapeutique. Enfin, nous nous sommes focalisés sur l’hypothèse « prion » pour les synucléinopathies. Dans ce projet, nous avons mis en œuvre une approche de modélisation chez le primate non-humain ainsi qu’une une approche thérapeutique anti-agrégative chez le rongeur. Ces travaux mettent en évidence le rôle clé de l’α-synucléine dans l’étiologie de la MP et proposent des pistes d’améliorations des modèles animaux actuels ainsi que des approches thérapeutiques innovantes / The aim of this work was to focus on neurodegenerative mechanisms in the context of synucleinopathies, especially on Parkinson’s disease (PD). PD is characterized by the loss of dopaminergic neurons and the presence of intracytoplasmic proteinaceous inclusions named Lewy Bodies of which α-synuclein (α-syn) is the main protein component. To date, there are no curative treatments. Elucidating mechanisms underlying neurodegeneration in PD will allow the identification of new molecular targets for therapeutic intervention. My Ph.D. work intends multifactorial and translational approaches based on modelling, therapeutic intervention and mechanistic studies. We first focused on the development of new animal models of PD based on the use of viral vector-mediated overexpression of α-syn. This word allowed us to conclude on the absence of additive effect of ageing in α-syn-related toxicity, at least in the three investigated species. Then, we worked on two therapeutic strategies to overcome the lysosomal dysfunction occurring in PD. To do so, we first developed a biotechnological approach based on the use of acidic nanoparticles restoring acidic pH of sick lysosomes, and then we used a gene therapy approach based on the overexpression on a central modulator lysosomal biogenesis. We here demonstrated the interest of restoration of lysosomal physiology. Finally, we tested the “prion-like” hypothesis in a cohort of nonhuman primates and assessed the efficacy of a therapeutic approach using an oligomer modulator in mice. This work highlights the central role of α-syn in PD etiology and offers innovative strategies for both modelling and therapeutic intervention.

Les synucléionopathies représentent un groupe de maladies neuro-dégénératives incurables du système nerveux central. Elles regroupent entre autres la maladie de Parkinson, l’atrophie multi-systématisée et la maladie à corps de Lewy. Toutes ces maladies se caractérisent par un déclin progressif des fonctions motrices, cognitives, comportementales et autonomiques. La mal-conformation et l’agrégation de la protéine α-synuclein qui forme des inclusions intraneuronales sont des éléments communs à toutes les synucleinopathies. Ces inclusions portent le nom de corps de Lewy et se forment dans des neurones ou cellules gliales appartenant à des régions cérébrales spécifiques. Elles sont vraisemblablement à l’origine de la perte progressive de neurones dans certaines parties du cerveau. Dans le cas de la maladie de Parkinson et dans d’autres maladies neuro-dégénératives, il a été démontré que la pathologie se propage anatomiquement d’une manière spécifique et prévisible au niveau cérébrale. Ceci suggère donc que la progression de la maladie est étroitement liée au transfert des agrégats d’α-synucléine. Ce procédé est très similaire à celui impliqué dans la maladie du prion qui elle en revanche est infectieuse. Par ailleurs, des inclusions neuronales d’α-synucléine ont été identifiées dans des neurones dopaminergiques d’origine fœtaux qui avaient été transplanté dans des cerveaux de patients parkinsoniens. Cette étude a permis d’envisager pour la première fois la possibilité de la transmission d’inclusions d’α-synucléine entre les neurones. Bien que de nombreuses études aient démontré la propagation d’α-synucléine in vitro et in vivo, le mécanisme permettant ce transfert n’est pas clairement établi. Par conséquent, ma thèse s’attache à étudier le mécanisme de transfert d’assemblages d’α-synucléine (i.e., oligomères et fibrilles). Dans un premier temps, j’ai apporté la preuve que les assemblages d’α-synucléine transfèrent de manière efficace entre les cellules neuronales via les Tunneling nanotubes (TNT). Les TNT sont définis comme étant des ponts membranaires riches en F-actine et permettant de connecter physiquement le cytoplasme de cellules éloignées. Au niveau subcellulaire, j’ai démontré que les assemblages d’α-synucléine qui transfèrent se trouvent dans des lysosomes. En revanche, après le transfert, ces assemblages se retrouvent libres dans le cytoplasme. J’ai également mis en évidence qu’à la suite du transfert, permis par les TNT, les fibrilles d’α-synucléine sont capables de recruter et d’induire l’agrégation de l’α-synucléine soluble afin de perpétuer le processus d’agrégation à l’infinie. Ces résultats indiquent que les TNT peuvent représenter un moyen efficace permettant le transfert d’assemblages d’α-synucléine. Cette découverte offre de nouvelles opportunités pour le développement de nouveaux agents neuro-protectifs contre la propagation des synucléinopathies. / Synucleinopathies are a group of fatal neurodegenerative diseases including Parkinson's disease, dementia with Lewy bodies, and multiple system atrophy, characterized by a chronic and progressive decline in motor, cognitive, behavioral, and autonomic functions. The hallmark of these diseases is the misfolding and aggregation of α-synuclein protein accumulating into intracellular inclusions Lewy bodies in neurons and glial cells which leads to the loss of neurons in specific brain regions. In the case of Parkinson’s disease and other neurodegenerative diseases, the pathology was shown to progress throughout the brain in a specific and predictable manner suggesting that the progression of the diseases is linked to the transfer of aggregated α-synuclein that is reminiscent of prion diseases that are infectious. Importantly, upon transplantation of fetal dopaminergic neurons in the brain of Parkinson’s patients, neuronal inclusions were found in the grafted neurons strongly suggesting that α-synuclein inclusions could transmit between neurons. While several studies showed α-synuclein propagation in vitro and in vivo the mechanism of intercellular transfer remains elusive. The aim of my thesis was to study the mechanism of transfer of α-synuclein assemblies (i.e., oligomers and fibrils) involved in Parkinson’s pathogenesis. I evidenced that α-synuclein assemblies transferred efficiently via tunneling nanotubes (TNT), F-actin based membranous bridges connecting the cytoplasm of remote cells. I demonstrated that, at the sub-cellular level, the transferred α-synuclein assemblies were specifically confined in lysosomes and that upon transfer a large amount of α-synuclein was found free in the cytosol of acceptor cells. Finally, I showed that after TNT-mediated transfer α-synuclein fibrils recruited and seeded the aggregation of the soluble α-synuclein protein in order to perpetuate aggregation. The identification of TNT as an efficient means of α-synuclein transfer opens new avenues to the development of novel therapies targeting the spreading into the brain of amyloidogenic proteins involved in neurodegenerative diseases.

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L'α-synucléine est reconnue comme une protéine clé dans la physiopathologie de la maladie de Parkinson ainsi que d'autres troubles neurodégénératifs appelés synucléinopathies. Dans ces maladies, la surexpression de l’α-synucléine entraîne la formation d'agrégats toxiques dans les neurones dopaminergiques (DA). Dans cette thèse, nous avons exploré l’effet de la régulation de microARN (miARN) sur l’expression de l’α-synucléine. Pour se faire, des études ont été menées avec la lignée cellulaire humaine SH-SY5Y qui peut être différenciée pour créer un modèle de neurones DA et ensuite traitée avec une neurotoxine pour induire des caractéristiques cellulaires de la maladie de Parkinson. Des observations importantes ont été supportées dans des modèles cellulaires plus avancés, notamment les neurones induits par reprogrammation directe de fibroblastes humains (iNs) et les neurones DA primaires de souris purifiés. Le premier objectif était de mieux comprendre comment la surexpression aberrante de l'α synucléine dans les synucléinopathies pourrait être due à une dérégulation de la maturation des miARN qui ciblent son ARN messager. Tout d’abord, nous avons sélectionné les miARN les plus susceptibles d'avoir un effet régulateur sur l’expression de l’α-synucléine à partir de recherche de la littérature et d’analyse de bases de données spécialisées. Nous avons observé que l’augmentation de l'expression de l'α-synucléine associée à l’ajout de neurotoxine est accompagnée d’une diminution concomitante de l'expression de plusieurs miARN sélectionnés. Sur la base de ces résultats, l'impact de ces miARN sur l'expression de l'α-synucléine a été évalué dans plusieurs types de cellules humaines, notamment les HEK 293T, les SH-SY5Y différenciées et les iNs. À cette fin, nous avons utilisé des cibles de miARN exogènes pour réprimer l'activité régulatrice des miARN et avons mesuré leur effet sur l'expression de l'α synucléine. Ainsi, nous avons démontré que la répression de miR-7, miR-93, miR-140, miR 153 et miR 214 mène systématiquement à la surexpression de l’α-synucléine dans les différents types de cellules. De plus, nous avons démontré que certains miARN sont régulés de manière post-transcriptionnelle en mesurant les niveaux des formes immatures et matures des miARN dans différents contextes cellulaires. Le deuxième objectif était d’identifier des protéines potentiellement aptes à réguler la maturation post-transcriptionnelle de miARN. Des études de purification par affinité et de spectrométrie de masse ont permis d'identifier les protéines qui s’associent avec la tige-boucle des formes immatures des miARN et régulent potentiellement leur maturation. Quelques protéines candidates ont été sélectionnées sur la base d’analyse informatique pour examiner l’effet de leur surexpression dans différents essais cellulaires. À ce jour, nous avons identifié quatre protéines (MIF, PCBP2, Prohibitin-2, and Tfr1) qui, en plus de répondre à certains critères de bases (lient l’ARN, sont présentes dans le cerveau et impliquées dans des maladies associées au système nerveux), ont un effet sur l’activité et l’expression de miR-153 ainsi que sur l’expression de l’α-synucléine. Ces travaux ont permis d’établir de solides bases dans notre compréhension de la régulation de l'α-synucléine par les miARN et d’ouvrir la voie à des études plus élaborées qui permettront d’établir les mécanismes de régulation des niveaux de miARN qui ciblent l’α-synucléine. À plus long terme, cet axe de recherche pourrait fournir des pistes pour le développement d'outils diagnostiques et thérapeutiques pour les synucléinopathies. / Alpha-synuclein is a key protein in the pathophysiology of Parkinson's disease and other neurodegenerative disorders called synucleinopathies. In these diseases, overexpression of α-synuclein leads to the formation of toxic aggregates in dopaminergic (DA) neurons. In this thesis, we explored the effect of microRNA (miRNA) regulation on α-synuclein expression. To do so, studies were conducted with the human SH-SY5Y cell line, which can be differentiated to create a model of DA neurons and then treated with a neurotoxin to induce cellular features of Parkinson's disease. Important observations were supported in more advanced cell models, including neurons induced by direct reprogramming of human fibroblasts (iNs) and purified primary mouse DA neurons. The first objective was to better understand how aberrant overexpression of α-synuclein in synucleinopathies results in the deregulation of the maturation of miRNAs that target its messenger RNA. First, we selected the miRNAs most likely to have a regulatory effect on α-synuclein expression based on literature searches and specialized database analyses. We observed that the increase in α-synuclein expression associated with neurotoxin addition is accompanied by a concomitant decrease in the expression level of several selected miRNAs. Based on these results, the impact of these miRNAs on αsynuclein expression was evaluated in several human cell types, including HEK 293T, differentiated SHSY5Y, and iNs. To this end, we used exogenous miRNA targets to repress miRNA regulatory activity and measured their effect on α-synuclein expression. Thus, we demonstrated that repression of miR-7, miR-93, miR-140, miR-153, and miR-214 consistently leads to overexpression of α-synuclein in different cell types. In addition, we demonstrated that some miRNAs are regulated in a posttranscriptional manner by measuring the levels of immature and mature forms of miRNAs in different cellular contexts. The second objective was to identify proteins potentially able to regulate the post-transcriptional maturation of miRNAs. Affinity purification and mass spectrometry studies were used to identify proteins that associate with the stem-loop of immature forms of miRNAs and potentially regulate their maturation. A few candidate proteins were selected based on computational analysis to examine the effect of their overexpression in different cell-based assays. To date, we have identified four proteins (MIF, PCBP2, Prohibitin-2, and Tfr1) that, in addition, to fitting basic criteria (known to bind RNA, are present in the brain and associated with nervous system-related diseases) affect miR-153 activity and expression as well as α-synuclein expression. This work has established a solid foundation in our understanding of the regulation of α-synuclein by miRNAs and has paved the way for more elaborate studies that will establish the mechanisms of regulation of miRNA levels that target α-synuclein. In the longer term, this line of research could provide avenues for the development of diagnostic and therapeutic tools for synucleinopathies.

Les maladies neurodégénératives liées à l’âge, telle celle de Parkinson, sont un problème majeur de santé publique. Cependant, la maladie de Parkinson reste incurable et les traitements sont très limités. En effet, les causes de la maladie restent encore mal comprises et la recherche se concentre sur ses mécanismes moléculaires. Dans cette étude, nous nous sommes intéressés à deux phénomènes anormaux se produisant dans la maladie de Parkinson : l’agrégation de l’α-synucléine et l’activation des cellules microgliales. Pour étudier la polymérisation de l’α-synucléine, nous avons établi de nouvelles méthodes permettant la production in vitro de différents types d’oligomères d’α-synucléine. Grâce à des méthodes biophysiques de pointe, nous avons caractérisé ces différents oligomères à l’échelle moléculaire. Puis nous avons étudié leurs effets toxiques sur les neurones. Ensuite, nous nous sommes intéressés à l’activation des microglies et en particulier à leurs canaux potassiques et aux changements liés au vieillissement. Nous avons identifié les canaux Kv1.3 et Kir2.1 et montré qu’ils étaient impliqués dans l’activation des microglies. En parallèle, nous avons établi une méthode originale qui permet l’isolation et la culture de microglies primaires issues de cerveaux adultes. En comparaison à celles de nouveaux-nés, les microglies adultes montrent des différences subtiles mais cruciales qui soutiennent l’hypothèse de changements liés au vieillissement. Globalement, nos résultats suggèrent qu’il est possible de développer de nouvelles approches thérapeutiques contre la maladie de Parkinson en modulant l’action des microglies ou en bloquant l’oligomérisation de l’ α-synucléine. / Age-related neurodegenerative disorders like Parkinson’s disease take an enormous toll on individuals and on society. Despite extensive efforts, Parkinson’s disease remains incurable and only very limited treatments exist. Indeed, Parkinson’s pathogenesis is still not clear and research on its molecular mechanisms is ongoing. In this study, we focused our interest on two abnormal events occurring in Parkinson’s patients, namely α-synuclein aggregation and microglial activation. We first investigated α-synuclein and its abnormal polymerisation. For this purpose, we developed novel methods, which allowed the in vitro production of different types of α-synuclein oligomers. Using highly sensitive biophysical methods, we characterised these different oligomers at a single-particle level. Then, we tested their biological effects on neurons. Afterwards, we studied microglial activation. We concentrated our efforts on two axes, namely age-related changes in microglial function and K+ channels in microglia. We showed that Kv1.3 and Kir2.1 K+ channels are involved in microglial activation. In parallel, we developed a new approach, which allows the effective isolation and culture of primary microglia from adult mouse brains. Adult primary microglia presented subtle but crucial differences in comparison to microglia from neo-natal mice, confirming the hypothesis of age-related changes of microglia. Taken together, our results support the hypotheses that microglial modulation or inhibition of α-synuclein oligomerisation are possible therapeutic strategies against Parkinson's disease.

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