Made available in DSpace on 2016-12-08T16:24:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGCA13MA113.pdf: 865063 bytes, checksum: 41861f94a8b447b6d17dbc06ba954319 (MD5) Previous issue date: 2013-08-23 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Bovine leukemia virus (BLV) is a member of the family Retroviridae, genus Deltaretrovirus and it is an important agent, being primarily responsible for economic losses in dairy herds, causing losses of around 10% in production. The infection of BLV, can manifest itself in two ways, benign one, which reaches approximately 30% of the animals infected with concomitant persistent lymphocytosis and malignant condition, often fatal, affecting approximately 5% of animals with tumor appearance lymphoid (lymphosarcomas).Currently, several studies have been made about of BLV genotypes, finding at least seven genotypes, in samples of different parts of the world. The aim of this study was the molecular characterization of samples of BLV from seropositive dairy cattle in Santa Catarina State. Were collected 454 blood samples of dairy cattle of the 31 properties and four buffaloes, being initially performed serology using agar gel immunodiffusion test (IDGA). Also collected tumor samples with different locations: lymph node, heart, intestine and muscle near the coxal, from three cattle. After serology 191 samples were found to be seropositive then submitted to DNA extraction and in 62 samples were performed the polymerase chain reaction (PCR) for amplification of a 440 bp fragment of the env gene, as well as the tumor samples. Nineteen samples extracted from blood and tumors samples were submitted to restriction fragment lenght polymorphism analysis (RFLP) by digestion of the PCR fragment for five restriction endonucleases, BamHI, HaeIII, Tru9I, TaqI and MwoI. The results obtained in serology demonstrated 42% seropositive animals (191/454) and 68% positives properties 7 (21/31), buffaloes no positive and tumor samples were positive in its entirety in PCR. In RFLP analysis identified five different profiles corresponding to five genotypes circulating in the State. Among the genotypes found in this study, the highest prevalence was observed genotype X (47.4%). This study allows us to know some the viral genotypes present in cattle in the Santa Catarina state and these results useful for future epidemiological studies, as well as identify the existence of new variants and their current prevalence / O vírus da Leucose Bovina (BLV) membro da família Retroviridae, gênero Deltaretrovirus, é um agente importante em bovinos, sendo responsável por perdas econômicas principalmente em rebanhos leiteiros, podendo causar prejuízos em torno de 10% na produção. A infecção pelo BLV, pode manifestar-se de duas formas, uma benigna, que atinge aproximadamente 30% dos animais infectados, cursando com linfocitose persistente, e a forma maligna, muitas vezes fatal, que atinge aproximadamente 5% dos animais, com surgimento de tumores linfóides (linfossarcomas). Atualmente, vários estudos têm sido realizados a cerca dos genótipos do BLV, encontrando-se pelo menos sete genótipos, em amostras de diferentes locais do mundo. O presente estudo teve como objetivo, a genotipagem do BLV, em rebanhos leiteiros do estado de Santa Catarina. Foram coletadas 454 amostras de sangue de bovinos leiteiros de 31 propriedades e quatro búfalos sendo realizada inicialmente a sorologia pelo teste de imunodifusão em gel de ágar (IDGA). Coletaram-se também amostras de tumores com diferentes localizações: linfonodo, coração, intestino e musculatura próximo ao coxal, de três bovinos. Após a sorologia 191 amostras foram constatadas como soropositivas sendo submetidas então à extração de DNA e em 62 amostras realizou-se a reação da polimerase em cadeia (PCR), visando a amplificação de um fragmento 440 pb do gene env, assim como nas amostras de tumores. Dezenove amostras extraídas de sangue e dos tumores foram submetidas à análise de polimorfismo dos fragmentos de restrição (RFLP), através da digestão do fragmento da PCR por 5 cinco endonucleases de restrição, BamHI, HaeIII, Tru9I, TaqI e MwoI. Os resultados obtidos na sorologia demonstraram 42% dos soros dos bovinos analisados positivos (191/454), 68% de propriedades positivas (21/31), nenhum soro bubalino positivo e as amostras de tumores foram positivas em sua totalidade na PCR. Nas análises por RFLP identificamos cinco perfis diferentes correspondendo a cinco genótipos circulantes no Estado. Dentre os genótipos encontrados neste trabalho, o mais prevalente foi o genótipo X (47,4%). Este estudo permitiu conhecer alguns dos genótipos virais presentes em bovinos no Estado de Santa Catarina sendo estes resultados úteis para futuros estudos epidemiológicos, assim como identificar a existência de novas variantes circulantes e sua prevalência

Made available in DSpace on 2015-03-03T14:03:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 CynthiaHKC_DISSERT.pdf: 2413327 bytes, checksum: 062d4378968e15e34eed7123a46717b9 (MD5) Previous issue date: 2010-05-11 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico / Haplotypes linked to the ?S gene represent patterns of DNA polymorphisms along chromosome 11 of individuals bearing the ?S gene. Analysis of haplotypes, in addition to serving as an important source for anthropological studies about the ethnic origin of a population, contributes to a better understanding of the variations in clinical severity of sickle cell anemia. The aim of the present study was to determine ?S gene haplotypes in a group of patients with sickle cell anemia treated at the Dalton Barbosa Cunha Hematology Center (Hemonorte) in Natal, Brazil and the Oncology and Hematology Center in Mossor?, Brazil. Blood samples were obtained from 53 non-related patients (27 males and 26 females), aged between 3 months and 61 years (mean age: 16.9 ? 12.1 years). Laboratory analyses consisted of the following: erythrogram, reticulocyte count, hemoglobin electrophoresis at alkaline pH, measurement of hemoglobin A2 and Fetal hemoglobin, solubility test and molecular analysis to determine ?S gene haplotypes. DNA samples were extracted by illustra blood genomicPrep Mini Spin kit and ?S gene haplotypes were determined by PCR-RFLP, using Xmn I, Hind III, Hinc II and Hinf I restriction enzymes for analysis of six polymorphic restriction sites in the beta cluster. Of 106 ?S chromosomes studied, 75.5% were Central African Republic (CAR) haplotype, 11.3% Benin (BEN) and 6.6% Cameroon (CAM). The atypical haplotypes had a frequency of 6.6%. More than half the patients (58.5%) were identified as CAR/CAR genotype carriers, 16.9% heterozygous CAR/BEN, 13.2% CAR/CAM and 1.9% BEN/BEN. Patients with atypical haplotype in one or two chromosomes accounted for 9.5% (CAR/Atp, BEN/Atp and Atp/Atp). The genotype groups showed no statistically significant difference (p < 0.05) in their laboratory parameters. This is the first study related to ?S haplotypes conducted in state of Rio Grande do Norte and the higher frequency of Cameroon halotype found, compared to other Brazilian states, suggests the existence of a peculiarity of African origin / Os hapl?tipos do gene ?s representam padr?es de polimorfismos do DNA ao longo do cromossomo 11 de indiv?duos portadores do gene ?s. A an?lise dos hapl?tipos, al?m de servir como uma fonte importante para estudos antropol?gicos acerca da origem ?tnica de uma popula??o, colabora para uma melhor compreens?o da varia??o de gravidade cl?nica da anemia falciforme. O presente estudo teve como objetivo determinar os hapl?tipos do gene ?s em um grupo de pacientes portadores de anemia falciforme atendidos no Ambulat?rio de Hematologia do Hemocentro Dalton Barbosa Cunha (Hemonorte) - Natal/RN e no Centro de Oncologia e Hematologia de Mossor?/RN. Foram obtidas amostras sang??neas de 53 pacientes n?o aparentados (27 do sexo masculino e 26 do sexo feminino), com idade variando entre 3 meses e 61 anos (m?dia de idade: 16,9 ? 12,1 anos). As an?lises laboratoriais consistiram em: eritrograma, contagem de reticul?citos, eletroforese de hemoglobina em pH alcalino, dosagem de hemoglobinas A2 e Fetal, teste de solubilidade e an?lise molecular para determin??o dos hapl?tipos ?s. O DNA foi extra?do pelo kit illustra blood genomicPrep Mini Spin e a determina??o dos hapl?tipos do gene S foi realizada por PCR-RFLP, utilizando as endonucleases de restri??o Xmn I, Hind III, Hinc II e Hinf I para an?lise de 6 s?tios polim?rficos do cluster ?. Os resultados observados mostraram, em rela??o ao n?mero de cromossomos, o predom?nio do hapl?tipo CAR (75,5%), frente aos hapl?tipos Benin (11,3%), e Camar?es (6,6%). Os hapl?tipos at?picos tiveram freq??ncia de 6,6%. Com rela??o aos gen?tipos, mais da metade dos pacientes (58,5%) foram identificados como portadores do gen?tipo CAR/CAR. O segundo mais freq?ente foi o CAR/BEN (16,9%), seguido de CAR/CAM (13,2%) e BEN/BEN (1,9%). Os pacientes com hapl?tipo at?pico em um ou nos dois cromossomos representaram 9,5% (CAR/Atp, BEN/Atp e Atp/Atp). N?o houve diferen?a estatisticamente significativa das m?dias dos par?metros laboratoriais entre os diferentes grupos de gen?tipos comparados. O presente trabalho ? o primeiro estudo relacionado aos hapl?tipos ?s realizado no estado do Rio Grande do Norte e o encontro de uma maior freq??ncia do hapl?tipo Camar?es, em rela??o a outros estados do Brasil, sugere a exist?ncia de uma peculiaridade da origem africana no estado

A epidemia da Síndrome de Imunodeficiência Adquirida (AIDS) fez aumentar a incidência de sarcoma de Kaposi (SK) em todos os países e o SK passou a ser considerado doença definidora de AIDS. Desde a descoberta de seu agente etiológico, o herpesvírus humano tipo 8 (HHV-8), vários estudos vêm sendo realizados com o objetivo de caracterizar subtipos virais presentes em todas as formas de SK: clássica, endêmica, iatrogênica e epidêmica. Os sistemas rotineiramente usados na subtipagem do HHV-8 têm usado o seqüenciamento de um gene que contém regiões hipervariáveis e que codifica uma glicoproteína de membrana viral (ORF K1). O presente trabalho apresenta um sistema de subtipagem alternativo que se baseia na presença de sítios de restrição enzimática em um pequeno segmento do gene ORF K1, região hipervariável 1 (VR1) e que permite discriminar subtipos virais. A análise de 68 seqüências; 50 que pertenciam a 36 pacientes com sarcoma de Kaposi infectados e não infectados pelo HIV-1 de São Paulo e 18 a protótipos dos subtipos A a E, mostraram mapas de restrição enzimática característicos dos principais subtipos virais descritos até o momento. Tomando como base apenas as enzimas disponíveis comercialmente, foram selecionadas cinco que se mostraram úteis para a subtipagem de HHV-8: Taq I, Nsi I, Hinf I, Hae III e Mse I. Os resultados obtidos com a técnica de PCR-RFLP (reação em cadeia de polimerase associada à análise do polimorfismo de fragmentos de restrição enzimática) mostraram que de 48 espécimes brasileiros previamente classificados como sendo dos subtipos A, B e C por seqüenciamento gênico, todos foram corretamente subtipados pela técnica de PCR-RFLP. Três amostras (duas do subtipo A e uma do B) apresentaram mais um sítio de restrição enzimática além dos descritos como sendo os predominantes. Mais recentemente, outras 27 amostras de 18 casos de infecção por HHV-8 foram subtipadas pela PCR-RFLP. Houve detecção de oito isolados do subtipo A, sendo seis de variante predominante, um de variante minoritária conhecida e um de nova variante viral. Dois casos de infecção por HHV-8 do subtipo B e sete do subtipo C também foram identificados. Finalmente, um provável caso de infecção pelo subtipo E foi encontrado em paciente com SK-AIDS disseminado, resistente à quimioterapia. Na avaliação global, houve maior número de casos de infecção por HHV-8 dos subtipos A e C. Concluindo, devido à alta sensibilidade e especificidade, baixo custo, rapidez e facilidade de execução, a técnica de PCR-RFLP pode ser usada em larga escala para estudos de epidemiologia molecular, principalmente em países em desenvolvimento. / AIDS epidemic has increased the incidence rates of Kaposi’ s sarcoma (KS) in all countries, and KS has been considered an AIDS-defining illness. Since the discovery of the human herpesvirus 8 (HHV-8), the etiological agent of KS, several studies have been conducted in order to characterize HHV-8 in all forms of KS: classic, endemic, iatrogenic, and epidemic. The HHV-8 genome presents a hypervariable region termed ORF K1 useful for virus subtyping. The objectives of the present study were to describe an alternative method for subtyping HHV-8, to compare this new method with DNA sequencing, and to use this method for HHV-8 subtyping. After cloning and sequencing a segment of the ORF K1 (VR1) in 50 HHV-8/DNA isolates from 36 Brazilian KS-AIDS patients, we searched for restriction enzymatic sites in this segment of DNA, and compared them with 18 sequences reported in the literature. Then we constructed the enzymatic restriction maps useful for discriminating all HHV-8 subtypes described up to now, and standardized a PCR-RFLP (restriction fragment length polymorphism analysis) using five commercial enzymes: Taq I, Nsi I, Hinf I, Hae III e Mse I. After comparing the results obtained by the two methods, we used PCR-RFLP for HHV-8 subtyping in 27 new HHV-8/DNA isolates. The results obtained by DNA sequencing and PCR-RFLP showed 100% of concordance, and allowed the use of PCR-RFLP for HHV-8 subtyping. Indeed, we disclosed that among KS-AIDS patients from São Paulo, subtypes A and C are more prevalent than subtype B. Although additional restriction sites were detected in some Brazilian HHV-8 isolates, the majority of them belonged to the predominant strains described in the literature. Interestingly, one probable case of HHV-8 subtype E was detected in a patient who presented disseminated KS and resistance to chemotherapy. Because of its high sensitivity, specificity, low cost, and rapid execution, PCR-RFLP could be used on a large scale, mostly in countries with poor resources and where KS is endemic.

Neospora caninum é um parasito intracelular obrigatório, formador de cistos, que acomete vários animais domésticos e silvestres, tendo maior importância nas espécies canina e bovina, nas quais causa problemas nervosos e reprodutivos. Os canídeos do gênero Canis são os únicos reconhecidos como hospedeiros definitivos do N. caninum até o momento, nos quais ocorre a fase sexuada de multiplicação, resultando na eliminação de oocistos pelas fezes. Toxoplasma gondii também é um coccídio responsável por uma das zoonoses de maior importância e ocorrência em todo o mundo. A fase assexuada de desenvolvimento do T. gondii ocorre nos mamíferos e aves (hospedeiros intermediários) com formação de cistos teciduais e a fase sexuada de desenvolvimento ocorre no intestino delgado dos hospedeiros definitivos, que são os membros da família Felidae. Este estudo teve por objetivo determinar a soroprevalência de anticorpos contra Neospora spp. e T. gondii em equídeos de diferentes regiões do Brasil e o isolamento e caracterização genética destes coccídios em amostras de tecidos de equídeos. A sorologia para T. gondii e Neospora spp. foi realizada em 453 amostras de soros por meio da Reação de Imunofluorescência Indireta com ponto de corte de 50 para Neospora spp e 64 para T. gondii. Deste total, oito (1,75%) amostras (sete de jumentos e um de cavalo) foram positivas para Neospora spp. e 129 (28,47%) amostras (82 jumentos, 32 cavalos e 15 mulas) para T. gondii. Para o isolamento do T. gondii foram realizados 29 bioensaios em camundongos, sendo 19 de animais soropositivos e 10 de pools de tecidos de cavalos soronegativos. Por meio dessa prova biológica, foi possível o isolamento em uma amostra de jumento (Equus asinus) de Mossoró, RN, ocorrendo a morte dos dois únicos camundongos infectados, no 16o e 17o dia pós-inoculação. A caracterização genotípica do isolado foi realizada pela PCR-RFLP utilizando 12 marcadores genotípicos. A genotipagem dessa amostra evidenciou o genótipo #60 TgCkBr220, já isolado em galinha do Arquipélago de Fernando de Noronha, PE, Brasil. O isolamento de Neospora spp em gerbilos não pode ser feito uma vez que não foi possível a obtenção de tecidos dos equídeos soropositivos. / Neospora caninum is an obligate intracellular parasite, forming cysts that affect many domestic and wild animals, having greater importance in canine and bovine species due neurological and reproductive problems. Canids of the genus Canis are recognized as the only definitive hosts of N. caninum until the moment in which sexual phase occurs multiplication, resulting in the elimination of oocysts in the feces. Toxoplasma gondii is also a coccidian parasite responsible for a zoonotic disease of great importance and occurrence around the world. The asexual developmental stage of T. gondii occurs in mammals and birds, the intermediate hosts, resulting in the formation of cysts and the sexual stage occurs in the small intestine of definitive hosts, which are the felids, occurring oocysts formation. This study aimed to determine the seroprevalence of antibodies against Neospora spp. and Toxoplasma gondii in equids from different regions of Brazil and the isolation and genetic characterization of these parasites from equids tissue. Serology for T. gondii and Neospora spp. was performed in 453 serum samples by Immunofluorescence Antibody Test (IFAT). Of this total, eight (1.75%) samples (seven of donkeys and one of horse) were positive to Neospora spp. antibodies and 129 (28.47%) samples (82 donkeys, 32 horses, 15 mules) were T. gondii seropositive. For the isolation of T. gondii, bioassay was performed in mice. A sample of one donkey (Equus asinus) from Mossoró, RN, was obtained with two of the 20 inoculated mouse infected. The mouse died at day 16th and 17th post inoculation. The genotypic characterization of the isolate was performed by PCR-RFLP using 12 genotypic markers. Genotyping showed the genotype #60 TgCkBr220, already described in chickens from Fernando de Noronha, PE, Brazil. Due the impossibility of acquisition of tissue from Neospora spp seropositive equids, isolation of this coccidian by gerbil bioassay was not possible to be done.

A cana-de-açúcar constitui uma das principais fontes de alimento e de energia renovável no mundo. Entre os fatores bióticos que reduzem sua produtividade, destaca-se o carvão, doença causada pelo fungo biotrófico Sporisorium scitamineum, cujos danos à cultura podem ultrapassar 80%. No entanto, poucos estudos foram desenvolvidos sobre a genética desse patógeno. Assim, o presente trabalho estudou a dinâmica de marcas RFLP associados à região subtelomérica (tel-RFLP) e marcas GFP em três populações do patógeno (a, b e c) obtidas em ciclos sucessivos da doença. A população a inicialmente foi formada pela inoculação com teliósporos F1 oriundos do isolado 39 produzido em trabalho anterior (REIS, 2012). As populações b e c foram produzidas inicialmente por cruzamentos controlados. Estes envolveram como parentais esporídios haploides de tipos de reação sexual compatíveis e perfis tel-RFLP conhecidos. Na população b os esporídios parentais (18A e 39B) foram isolados de teliósporos distintos, apresentaram perfis tel-RFLP mais contrastantes e simularam fecundação cruzada. Na população c, os esporídios parentais 39Agfp e 39Bgfp apresentaram perfis tel- RFLP mais semelhantes. Esses mutantes foram obtidos pela inserção heteróloga do gene gfp em esporídios obtidos de um único teliósporo simulando autofecundação (reação sexual intra-tétrade). A comparação entre os perfis de tel-RFLP dos esporídios selvagens e mutantes GFP detectou a inserção do gene gfp possivelmente na região subtelomérica do individuo 39Agfp (parental). A cada ciclo da doença teliósporos selvagens e mutantes GFP foram obtidos, sendo isolados dois esporídios para os cruzamentos controlados que levaram à produção do ciclo seguinte de doença. O uso de cruzamentos controlados possibilitou a produção de teliósporos idênticos geneticamente, permitindo inferir sobre eventos meióticos ocorrentes numa mesma progênie. A fenotipagem sexual dos esporídios que tiveram os perfis de tel-RFLP analisados reduziu o viés advindo do desvio da segregação esperada de 1:1 entre os tipos sexuais de esporídios pertencentes à mesma divisão meiótica. Além disso, auxiliou na detecção de recombinantes, visto que os loci de reação sexual segregam na meiose I. A análise das marcas tel-RFLP das progênies mutantes GFP e selvagens, obtida respectivamente em 1 e 2 ciclos da doença, evidenciou eventos de recombinação na segregação de cromossomos homólogos e eventos de recombinação homóloga. Mesmo apresentando número elevado, as marcas tel-RFLP foram capazes de rastrear indivíduos pertencentes a uma mesma população, o que poderá auxiliar em futuras avaliações epidemiológicas do carvão da cana-de-açúcar. Por fim, a expressão do gene gfp em células de pró-basídios mutantes possibilitou a detecção de recombinação homóloga associada a essa marca e a observação inédita de tétrades lineares de quatro células para essa espécie. Observou-se elevado potencial de utilização do gene gfp em estudos genéticos aplicados a esse patossistema. A recombinação sugerida na região subtelomérica mostrou frequência de recombinação ainda não descrita para essa espécie a ser estudada posteriormente. / Sugarcane is a major source of food and renewable energy in the world. Among the biotic factors that reduce its productivity we highlight the sugarcane smut disease, caused by the biotrophic fungus Sporisorium scitamineum, whose damages to the crop can overpass 80%. However, few genetic studies have targeted this pathogen. Thus, the present work studied the dynamics of RFLP marks associated to the subtelomeric region (tel-RFLP) and GFP marks of three populations of the pathogen (a, b and c) obtained from consecutive disease cycles. Population a was initially formed with inoculation using teliospores F1 from the whip 39 obtained in previous work (REIS, 2012). Populations b and c were initially produced by controlled crosses of sexual compatible haploid sporidia with known tel-RFLP profiles as parents. In population b the parent sporidia (18A and 39B) were isolated from distinct teliospores, had more different tel-RFLP profiles (7 polymorphic marks) and simulated outcrossing. In population c, the parental sporidia 39Agfp and 39Bgfp had more similar tel-RFLP profiles. These mutants were obtained by heterologous insertion of gfp gene in sporidia obtained from single teliospore, simulating selfing (intra-tetrad mating type). The comparison between wild-type and GFP mutant sporidia tel-RFLP profiles had detected the gfp gene insertion in the subtelomeric region of the individual 39Agfp (parent). For each disease cycle wild-type and GFP mutant teliospores were obtained and two sporidia were isolated to perform controlled crosses that lead to the next disease cycle. The use of controlled crosses resulted in the production of genetically identical teliospores, which allowed inferring about same progeny meiotic occurring events. The sexual phenotyping of the sporidia that had their tel-RFLP analyzed reduced the bias resulted from deviation of expected 1:1 ratio segregation among the mating types of same meiotic division progeny. Besides, it helped in the recombinants detection, due to mating type loci segregation in meiosis I. The analysis of wild-type and GFP mutant progenies tel- RFLP marks, obtained for 2 and 1 disease cycles, has pointed out events of homologous chromosomes recombination and crossing-over events. Despite of the high amount of marks obtained, the tel-RFLP marks allowed the tracking of individuals from the same population, which can benefit future sugarcane smut disease epidemiologic evaluations. Moreover, the gfp gene expression of mutant probasidium cells led to the detection of crossing-over involving the GFP mark and the first observation of linear four-cells tetrads to this species. A high potential use of gfp gene in genetic studies applied to this pathosystem was observed. The recombination suggested for the subtelomeric region showed a recombination frequency haven\'t described for this species that needs to be further studied.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Neospora caninum and Toxoplasma gondii are two obligate intracellular protozoa and can infect a wide variety of hosts, including birds. Domestic chickens can be considered as sentinels of infection, since they have potential exposure to oocysts in the soil, serving as indicators of environmental contamination, also acting as an efficient source of T. gondii infection. In addition, chickens infected with T. gondii oocysts may contain virulent strains of this parasite in different tissues, without any clinical signs. Therefore, the objectives of this study were (1) to determine the presence of anti-T. gondii and anti-N. caninum in domestic chickens raised extensively in rural areas, (2) evaluate the association of risk factors for infection by T. gondii present in properties in one of the study regions (3) isolating of the parasite T. gondii from tissues of chickens antibody positive (4) genotypically characterize the T. gondii from rural area of the municipality of Santa Maria, Rio Grande do Sul State, Brazil. Firstly, in May 2011 were collected 137 blood samples in some farms in the state and were tested by indirect immunofluorescence (IFA) for antibodies anti-T. gondii and anti-N. caninum and were detected in 74.4% (102/137) and 36.5% (50/137) of chickens, respectively. Later in the period from March 2013 to February 2014 were collected 597 blood samples from 74 properties in the rural area of Santa Maria, RS. The samples were tested by IFA, where 49.2% (294/597) were positive for antibodies anti-T. gondii infection, with titers ranging from 16 to 4096. From bioassay of 12 positive tissues chickens were obtained nine isolates of the parasite. Genotypic characterization of isolates was performed by PCR-RFLP, using 12 genetic markers, SAG1, 5'-3'SAG2, alt. SAG2, SAG3, BTUB, GRA6, c22-8, c29-2, L358, PK1, apical. The result of analysis of the genotype of individual of this study revealed the presence of five genotypes according to ToxoDB (# 11, # 55, # 64, # 140 and # 163) plus two new ones, not previously described in literature. The high prevalence of antibodies found in this study suggests a major environmental contamination, and thus a potential risk to human and animal health .From the results in genotypic characterization, it can be observed that there is a wide genetic diversity of T. gondii in the study region, which confirms previous studies in Brazil. / Toxoplasma gondii e Neospora caninum são dois protozoários intracelulares obrigatórios e podem infectar uma grande variedade de hospedeiros, incluindo aves. Galinhas domésticas podem ser consideradas sentinelas da infecção, já que as mesmas têm potencial à exposição aos oocistos presente no solo, servindo como indicadores de contaminação ambiental, atuando também como eficiente fonte de infecção do T. gondii. Além disso, galinhas infectadas com oocistos de T. gondii podem albergar cepas virulentas deste parasito em diferentes tecidos, sem apresentar sinais clínicos. Diante disso, os objetivos deste estudo foram (1) determinar a presença de anticorpos anti-T. gondii e anti-Neospora caninum em galinhas domésticas criadas extensivamente em zona rural, (2) avaliar a associação dos fatores de risco para infecção por T. gondii presentes nas propriedades em uma das regiões de estudo (3) isolar o protozoário T. gondii a partir de tecidos de galinhas anticorpo positivas e (4) caracterizar genotipicamente os isolados de T. gondii de galinhas em área rural do município de Santa Maria, Rio Grande do Sul, Brasil. Primeiramente, em Maio de 2011 foram coletadas 137 amostras de sangue de galinhas em algumas propriedades rurais do estado e foram testadas por Imunofluorescência indireta (RIFI) para anticorpos anti-T. gondii e anti-N. caninum, sendo detectados 74.4% (102/137) e 36.5% (50/137) das galinhas, respetivamente. Posteriormente, no período de março de 2013 a fevereiro 2014 foram coletadas 597 amostras de sangue de galinhas em 74 propriedades da zona rural de Santa Maria, RS.. As amostras foram testadas por RIFI, onde 49,2% (294/597) foram positivas para anticorpos anti-T. gondii, com títulos variando de 16 a 4096. A partir do bioensaio de tecidos de 12 galinhas positivas, obteve-se nove isolados do protozoário. A caracterização genotípica dos isolados foi realizada através da técnica de PCR-RFLP, utilizando os 11 marcadores genéticos, SAG1, 5 -3 SAG2, alt. SAG2, SAG3, BTUB, GRA6, c22-8, c29-2, L358, PK1, Apico. O resultado da análise genotípica dos isolados de galinhas do presente estudo revelou a presença de cinco genótipos de acordo com o ToxoDB (#11, #55, #64, #140 e #163), além de dois outros novos, não descritos anteriormente na literatura. A elevada prevalência de anticorpos encontrada neste estudo, sugere uma grande contaminação ambiental, sendo assim um risco potencial para a saúde humana e animal. A partir dos resultados obtidos na caracterização genotípica, pode-se observar que há uma ampla diversidade genética do T. gondii na região de estudo, o que confirma os estudos já realizados no Brasil.

Nos últimos anos, diversos protocolos e tecnologias têm sido propostos a fim de viabilizar ou otimizar a micropropagação de diversas culturas, bem como reduzir custos de produção. Dentre eles, tem ganhado destaque, o uso do meio de cultura líquido e do sistema de biorreator de imersão temporária (BIT). No entanto, observam-se diferenças de resposta entre espécies e metodologias, sendo necessários maiores estudos para um melhor conhecimento dos fatores que afetam os sistemas de micropropagação. Estudos recentes, baseados em técnicas moleculares, têm revelado que as culturas in vitro não são axênicas, como se acreditava, apresentando comunidades endofíticas onipresentes. Sabendo-se da importância desses microrganismos em plantas a campo, passou-se a questionar o papel destes no desenvolvimento e multiplicação de plantas in vitro. Diante deste cenário, este trabalho se propôs a comparar o desempenho de culturas in vitro em diferentes condições de cultivo: meio semissólido, meios líquido estático, sob agitação e, avaliando-se o crescimento/ multiplicação das plântulas e, naqueles onde houve diferença no desempenho, foram realizadas análises moleculares para a caracterização da comunidade microbiana presente na parte aérea das plantas. Foram utilizadas culturas de bromeliáceas e cana-de-açúcar, buscando sistemas que permitissem as avaliações pretendidas. Para isto foram instalados experimentos com Ananas comosus var. comosus (\'Imperial\' e \'Pérola\') e Aechmea nudicaulis, sob cultivo em meio líquido estático e sob agitação; e com Vriesea hieroglyphica E. Morren, sob cultivo em meio líquido estático, sob agitação e em BIT. Para a gramínea, cana-de-acúcar (Saccharum spp., variedade SP80-3280), foram avaliados o cultivo em meio líquido estático e em BIT. Foram também realizadas análises moleculares de plântulas de Dyckia distachya, que haviam sido cultivadas em meios de culturas semissólido, líquido sob agitação e estático. As culturas que apresentaram diferenças de desempenho entre os sistemas avaliados foram D. distachya, (sendo o melhor tratamento o meio líquido sob agitação) e cana-de-açúcar (melhor tratamento foi BIT) e estas foram consideradas como sistemas adequados para o estudo de como diferentes sistemas de cultivo in vitro podem influenciar na comunidade bacteriana das plantas. A caracterização da comunidade bacteriana de D. distachya foi realizada por T-RFLP (Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism) e mostrou que o tratamento meio líquido sob agitação, o qual teve a maior produção de brotos em relação aos demais, diferiu quanto à abundância relativa das unidades taxonômicas operacionais (UTOs) encontradas. Para cana-de-açúcar foram realizadas a construção de bibliotecas de clones do gene 16S rRNA e PCR quantitativo em tempo real (qPCR). Estas análises mostraram não haver diferença significativa entre as bibliotecas dos tratamentos avaliados, no entanto, BIT apresentou 3,54 vezes mais cópias do gene 16S rRNA em relação ao tratamento meio líquido estático, nos permitindo inferir que também possui uma maior número de bactérias. Este estudo apresenta fortes indícios de que o sistema de cultivo in vitro utilizado influencia a comunidade microbiana presente nas plantas / In recent years, several protocols and technologies have been proposed for feasibility and optimization of micropropagation of different cultures as well as to reduce production costs. Among these, the use of liquid culture medium and the temporary immersion bioreactor system (TIB) have gained special attention. However, differences are observed among species and methodologies, being necessary more detailed studies for a better knowledge of the factors that affect the micropropagatiion systems. Recent studies, based on molecular techniques, have revealed that in vitro cultures are not axenic, as thought, presenting ubiquitous endophytic community. Knowing the importance of these microorganisms to field plants we would like to know more about their role in in vitro plants. In this scenario, this work proposes to compare the performance of in vitro cultures under different culture conditions: semisolid medium culture, liquid static and liquid medium under agitation, and where differences in in vitro performance were observed comparative molecular analysis of microbial community in the plantlets was performed. Bromeliads and sugarcane cultures were used seeking for model systems for these analyses. These experiments were conducted with Ananas comosus var. comosus (\'Imperial\' and \'Pérola\') and Aechmea nudicaulis cultured under liquid static medium and liquid under agitation, and with Vriesea hieroglyphica, we compared liquid static medium, liquid medium under agitation and TIB. For sugarcane (Saccharum spp. variety SP80-3280), liquid static medium and TIB was compared. Molecular analyses of Dyckia distachya plantlets, which had been grown in semisolid medium liquid static and liquid medium under agitation, were also carried out. Cultures that showed differences in performance among the systems evaluated were D. distachya, (with liquid medium under agitation as the best condition) and sugarcane (best treatment was BIT) and these were considered adequate to study the differences in the bacterial comunity of plants when grown in different in vitro conditions. The characterization of the microbial community of D. distachya was performed by T-RFLP (Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism) and showed that the liquid medium under agitation, which had the highest number of shoots compare to the other culture conditions, also differed as to the relative abundance of Operational Taxonomic Units (OTUs). For sugarcane 16S rRNA gene clone libraries, as well as real-time PCR (qPCR) were performed. These analyses showed no significant differences between the libraries of the two treatments, however, BIT showed 3.54 times more copies of the 16S rRNA gene compared to cultures from static liquid medium, allowing us to infer a higher number of bacteria. This study provides strong evidence that the in vitro system used influences the microbial community present in plants

As Terras Pretas de Índio (TPIs) na Amazônia Brasileira são altamente férteis e o seu conteúdo químico parece não exaurir mesmo em condições de floresta tropical. Por essa razão, são frequentemente procuradas pelas populações locais para o cultivo de subsistência. A importância das comunidades microbianas tem aumentado o interesse em compreender a relação entre o uso da terra, as comunidades de plantas, os micro-organismos e os processos do ecossistema. Portanto, o objetivo principal desta pesquisa foi investigar as comunidades bacterianas sob a influência da cobertura vegetal em sistemas de uso da terra (floresta secundária e plantio de mandioca) e na rizosfera de plantas leguminonas nativas em comunidades de bactéria das TPIs. Além disso, investigou-se também as bactérias desnitrificantes nesses solos. A área de estudo está localizada na Estação Experimental do Caldeirão, pertencente à Embrapa Amazônia Ocidental, no município de Iranduba-AM. A funcionalidade da comunidade bacteriana foi determinada pela Análise de Perfil Fisiológico da Comunidade Microbiana (CLPP), a estrutura da comunidade bacteriana foi acessada por Polimorfismo do Tamanho do Fragmento de Restrição Terminal (T-RFLP), a composição e distribuição das comunidades bacterianas foram determinadas por sequenciamento em larga escala (pirosequenciamento), e para quantificar as bactérias desnitrificantes foi utilizada a técnica de PCR quantitativa (qPCR). Os estudos foram realizados no laboratório de Biologia Celular e Molecular (CENA / USP) e no departamento de Biogeoquímica (Max Planck Institute for Terrestrial Microbiology). A análise de T-RFLP mostrou que o uso da terra e a sazonalidade afetaram as comunidades bacterianas na TPI, e mostrou também um claro efeito da rizosfera nas comunidades bacterianas. CLPP demonstrou que a atividade funcional da TPI não foi afetada pela sazonalidade. Além disso, a tecnologia de pirosequenciamento foi uma ferramenta importante para diferenciar filotipos raros. Diferenças distintas de alguns filos bacterianos da rizosfera foram observadas, indicando que a zona de raiz contribui para moldar essas comunidades. A abundância relativa do gene nirK não foi afetada pelo uso da terra nos dois tipos de solos. Alterações na estrutura das comunidades dos genes nirK e nosZ foram observadas em ambos os tipos de solos. As comunidades desnitrificantes na TPI pareceram ser mais influenciadas pelo uso da terra do que pela sazonalidade, e ACH foi mais influenciada pelas variações de sazonalidade. / Amazonian Dark Earths (ADEs) in the Brazilian Amazon are highly fertile and its chemical content seems not to get depleted even under tropical humid conditions. For this reason, these soils are frequently searched by local population for subsistence farming. The importance of microbial communities has grown the interest in understanding the relationship between land use, plant communities, microorganisms, and ecosystem processes. Therefore, the main objective of this research was to investigate the effect of vegetation cover in land use systems (secondary forest and cassava plantation) and rhizosphere of native leguminous plants on bacterial communities of ADEs. Furthermore, it was also aimed to investigate denitrifying bacteria in these soils. The study area is located at the Experimental Station of Caldeirão, belonging to Embrapa Amazônia Ocidental, Iranduba, AM. The bacterial community function was determined by Community Level Physiological Profile (CLPP), the bacterial community structure was assessed by Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism (T-RFLP), the bacterial community composition and distribution by high-throughput sequencing (pyrosequencing), and the quantification of denitrifier bacteria by Quantitative PCR (qPCR). The studies were performed in the Laboratory of Cell and Molecular Biology (CENA/USP) and the Deparment of Biogeochemistry (Max Planck Institute for Terrestrial Microbiology). T-RFLP analysis showed that land use and seasonality affected bacterial communities in ADE, and also showed a clear rhizosphere effect on bacterial communities. CLPP have shown that ADE functional activity was not affected by seasonality. Furthermore, pyrosequencing technology was an important tool to differentiate rare phylotypes. Distinct differences of some rhizosphere bacterial phyla were also observed, indicating that the root zone contributed to shape these communities. The relative abundance of nirK gene was not affected by land use in both studied soils. Alterations in the community structure of nirK and nosZ genes were observed for both soils. ADE denitrifying communities seemed to be more affected by land use than seasonality, and ACH was more influenced by seasonal variations.

A classificação de fungos microscópicos é limitada pela escassez de detalhes morfológicos e incertezas na caracterização bioquímica. Nesse trabalho desenvolvemos um método simples, baseado na amplificação de um segmento de cerca de 2.800 bares de bases seguida de digestão com DdeI e análise do padrão após eletroforese em agarose. Demonstramos que o método discrimina tão bem quanto a sequência de DNA do segmento após analisar mais de 400 amostras que foram classificadas em 33 espécies. Essa tecnologia facilita a busca por novos representantes da imensa diversidade existente, espécies que podem ser exploradas quanto ao seu valor potencial para a medicina e a indústria. Outras metodologias moleculares foram desenvolvidas para discriminar entre espécies próximas e na identificação de novas espécies. Em seguida, o trabalho esteve voltado para o desenvolvimento de um ensaio laboratorial que nos permitisse estudar a transição dimórfica em Candida albicans. Desenvolvemos dois novos ensaios, um biológico e outro sobre membrana artificial, para estudar a indução ou inibição da produção de hifas. A expressão de genes associados ao processo foi acompanhada de maneira quantitativa. Fracionando cromatograficamente o soro fetal bovino, obtivemos resultados indicativos de frações estimuladoras e inibidoras da transição morfológica. / Fungal identification is limited by few morphological details and uncertainty in the biochemical tests. In the present work we developed a simple procedure, based upon DNA amplification of a 2,800 base pairs region followed by the amplicon digestion with DdeI and electrophoretic analyzes in agarose gels. After analyzing more than 400 samples encompassing 33 species, we demonstrate that this method discriminates as well as DNA sequencing of the region. This technology simplifies the search for new representatives among the great diversity of fungi of medical and industrial interest. We devised also molecular methods to discriminate between closely related species and described a new putative species. Next our work was dedicated to develop an in vitro assay for the study of the dimorphic transition in Candida albicans. We devised two biological assays and one that used an artificial membrane to investigate the induction and inhibition of hyphal production. The expression of genes associated with the morphological transition was examined in a quantitative way. We fractionated bovine fetal serum by column chromatography and obtained results pointing to fractions that stimulate or inhibit hyphal production.

Este estudo teve como objetivo detectar e caracterizar molecularmente isolados de campo do vírus da laringotraqueíte infecciosa (VLTI) detectados de aves comerciais com e sem sintomatologia da doença de diferentes regiões do Estado de São Paulo. O estudo incluiu amostras coletadas durante e após o primeiro surto epidêmico da laringotraqueíte infecciosa (LTI) no Brasil, região de Bastos, e de outras localidades durante o período de 2002-2008. A caracterização molecular foi realizada através da técnica de polimorfismo do comprimento de fragmentos de restrição (RFLP) de produtos da reação em cadeia pela polimerase (PCR) dos genes da glicoproteína E, G, proteína quinase (TK) e da proteína reguladora da transcrição (ICP4), assim como pela análise de seqüências dos genes TK e ICP4. Para seqüenciamento do gene ICP4 foram desenvolvidas duas reações de PCR que amplificam dois diferentes fragmentos do gene ICP4. As técnicas de PCR-RFLP e seqüenciamento de DNA mostraram resultados idênticos, diferenciando os isolados de campo das cepas vacinais de origem de cultivo celular (TCO) e de embrião de galinha (CEO). Os resultados mostraram que o surto clínico na região de Bastos foi causado por uma cepa não vacinal e de alta virulência (cepa Bastos), embora também tenha sido possível detectar dois isolados relacionados à cepa CEO circulando durante o surto. Verificou-se que a cepa causadora do surto severo na região de Bastos continua circulando na região apesar do uso de vacinas atenuadas. Além disso, foram isoladas amostras relacionadas às cepas CEO e à cepa Bastos apartir de granjas comerciais de poedeiras localizadas fora da região de Bastos e que estão envolvidas em quadros clínicos da doença. Este estudo mostra (1): a persistência do vírus selvagem de campo na região de Bastos (cepa Bastos) apesar das medidas de controle e do uso de vacinas atenuadas, (2): a disseminação da cepa Bastos e das cepas vacinais CEO para outras regiões, e (3): a eficacia da estratégia padronizada neste estudo para a caracterização e diferenciação de isolados de campo e de cepas vacinais. / The objective of this study was the molecular detection and characterization of field isolates of infectious laryngotracheitis virus (ILTV) detected from commercial chickens with and without clinical signs of the disease from regions of the São Paulo state. The study included samples collected during and after of the first epidemic infectious laryngotracheitis (ILT) outbreak in Brazil, Bastos region, and from other regions during 2002-2008. The molecular characterization was developed by restriction fragment length polymorphic analysis (RFLP) of polymerase chain reaction (PCR) products of glycoprotein E, G, thymidine kinase (TK) and regulatory protein of transcription (ICP4) gene, and by sequence analysis of TK and ICP4 gene. For ICP4 gene sequencing, two PCR assays have been developed for amplification of two different fragments of ICP4 gene. The PCR-RFLP and DNA sequencing techniques showed identical results, they could differentiate the field isolates from vaccine strains, tissue culture origin (TCO) and chicken embryo origin (CEO). The results showed that the severe outbreak in Bastos region was caused by a non-vaccine and virulent strain (Bastos strain); however it was possible to detect two isolates closely related to the CEO vaccine strain circulating during the outbreak. This study showed that the strain, which it caused the severe outbreak in Bastos region continue circulating in these region despite of the use of attenuate vaccines. In addition, the present research showed that isolates related to CEO and Bastos strains are circulating in commercial layer flocks located outside the Bastos region, and were involving in clinical cases of the disease. This study shows (1) the persistence of the wild field strain in Bastos region (Bastos strain) despite of the control measures and the use of attenuate vaccines, (2) the dissemination of the Bastos and CEO strains to other regions, and (3) the efficacy of the strategy standardized in this study to characterization and differentiation of field isolates and vaccine strain.