Genomas bacterianos são extremamente dinâmicos e boa parte dessa dinâmica ocorre devido a transferência horizontal e aquisição de DNA exógeno, um processo natural e fundamental para a evolução, adaptação e diversificação dos microrganismos. Ilhas genômicas são grandes regiões do cromossomo bacteriano adquiridas por transferência horizontal e estão presentes em apenas algumas linhagens, podendo conferir alguma vantagem adaptativa. Em Pseudomonas aeruginosa, até o momento foram caracterizadas pelo menos dezesseis ilhas genômicas e cada uma delas confere características diferentes a seus hospedeiros. Em P. aeruginosa UCBPP-PA14 (ou simplesmente PA14), encontram-se duas ilhas de patogenicidade denominadas PAPI-1 e PAPI-2, sendo a primeira a maior e a mais estudada, contendo 115 ORFs (“Open Reading Frame”, ou quadros abertos de leitura). Dentre estes, o gene int codifica uma integrase essencial para a excisão e integração de PAPI-1, e o gene soj é necessário para a manutenção da ilha na célula e é expresso apenas quando esta se encontra na forma epissomal. PAPI-1 codifica um provável sistema de secreção tipo IV (T4SS), similar ao do elemento móvel ICEHin1056, responsável pela transferência deste para outras bactérias. O objetivo deste trabalho foi identificar fatores genéticos e ambientais que contribuem para a transferência de PAPI-1 entre linhagens de P. aeruginosa. Foi observado que os mutantes por transposon nos genes PAPI-1 PA14_59860, PA14_59880, PA14_59920 e PA14_59940 têm a frequência de transferência de PAPI-1 diminuída, mas os genes interrompidos nesses mutantes não são essenciais para a excisão da ilha. Também foi mostrado que os reguladores percepção de quorum RhlR e MvfR têm influência na expressão do gene int, mas não de soj. O terceiro regulador de percepção de quorum, LasR, assim como a proteína H-NS MvaT, não tem influência na expressão de int e de soj. Ensaios de RT-PCR quantitativos mostraram que o choque térmico aumentou os níveis do mRNA de soj, mas não de int, corroborando dados previamente sugeridos pela literatura, que mostram uma maior freqüência de transferência de PAPI-1 nessas condições. Também foi analisado se o segundo mensageiro celular em bactérias, c-di-GMP, poderia contribuir para a excisão/manutenção de PAPI-1. Alterações nas concentrações deste segundo mensageiro pela superexpressão de proteínas responsáveis por sua síntese ou degradação não foram capazes de afetar a excisão/manutenção de PAPI-1. Houve diminuição na frequência de transferência de PAPI-1 a partir de linhagens doadoras superexpressando uma diguanilato ciclase ou uma fosfodiesterase de c-di-GMP, mas provavelmente este efeito não se deve aos níveis alterados desse segundo mensageiro. Em Xanthomonas axonopodis pv. citri 306 (XAC), uma região de 86 kb possui uma grande semelhança com PAPI-1 na organização dos genes. Além disso, possui uma série de ORFs relacionados aos genes “core” que definem uma família de ilhas genômicas sintênicas das quais PAPI-1 faz parte. Entretanto, os genes acessórios encontrados entre os blocos de genes conservados varia muito entre PAPI-1 e a região de XAC. Foi determinado que esta região de XAC não pode se excisar do cromossomo nas condições analisadas. Por fim, com o intuito de verificar as possíveis interações entre os produtos dos genes conservados em PAPI-1 e XAC, ensaios de duplo-híbrido foram realizados, porém não foi possível determiná-las, visto que apenas resultados falsos positivos foram obtidos. Este trabalho mostrou pela primeira vez que a percepção de quorum está envolvida com a expressão de soj e determinou uma extensa similaridade entre essa ilha e uma região do genoma de XAC / Bacterial genomes are extremely dynamic mostly because of horizontal gene transfer, a natural and fundamental process for evolution, adaptation and diversification of microorganisms. Genomic islands are large DNA segments acquired by horizontal gene transfer which are present only in a few strains and may confer some adaptative advantage. At least sixteen genomic islands have been characterized in Pseudomonas aeruginosa to date and each confers different characteristics to its host strain. P. aeruginosa UCBPP-PA14 (PA14) harbors two pathogenicity islands named PAPI-1 and PAPI-2. PAPI-1 is the largest one, carrying 115 open reading frames (ORFs). Among these, int codes for an integrase essential for PAPI-1 excision and integration, and soj is required for maintaining PAPI-1 in the cells, being expressed only when this island is in an episomal, circular form. PAPI-1 also harbors genes coding for a type four secretion system (T4SS) similar to the mobile element ICEHin1056, which is responsible for transferring this element to other bacteria. In this work, we show that transposon insertion in PAPI-1 genes PA14_59860, PA14_59880, PA14_59920 and PA14_59940 lowered the frequency of conjugation of PAPI-1 from PA14 to other bacteria, but those genes were not essential for PAPI-1 excision. Quorum sensing regulators RhlR and MvfR had a role in int expression, but did not alter soj transcription. The third quorum sensing regulator LasR, as well as the H-NS protein MvaT, did not alter both int and soj expression. Quantitative RT-PCR assays showed that cells incubated at heat shock conditions present higher levels of soj, mRNA, confirming published data that showed an increase in PAPI-1 transfer in these conditions. It was also analyzed whether the second messenger c-di-GMP would contribute to PAPI-1 excision/maintenance. Changes in the levels of this second messenger in cells overexpressing proteins responsible for its synthesis or degradation did not affect PAPI-1 excision and maintenance. A decrease in PAPI-1 transfer frequency was detected when those cells were used as donors in conjugation, but this effect cannot be attributed to the altered c-di-GMP levels. In Xanthomonas axonopodis pv. citri 306 (XAC), an 86 kb genome region shares similarity with PAPI-1 regarding gene homology and organization. It also carries ORFs related to the core genes that define a syntenic family of genomic islands that includes PAPI-1. Nevertheless, the accessory genes dispersed among the clusters of conserved genes are not related, when comparing PAPI-1 and this region in XAC. An epissomal form of this putative XAC island could not be detected in the conditions tested in this work. Finally, in order to verify interactions involving the conserved proteins in PAPI-1 and XAC, two hybrid assays were carried out, but only false positives results were obtained

Les pompes d'efflux sont des complexes macromoléculaires qui permettent l'efflux des antibiotiques à travers les deux membranes (interne et externe). Ces pompes, spécifiques des bactéries Gram négatif, constituent l'un des acteurs majeurs du phénomène de résistance aux antibiotiques, en contribuant ainsi à la résistance intrinsèque et acquise de ces bactéries à de nombreuses molécules utilisées en antibiothérapie. Chez P. aeruginosa, ces pompes appartiennent pour la plupart à la famille des transporteurs RND. Ce sont des complexes tripartites constitués d'un transporteur de la membrane interne (RND), d'un adaptateur périplasmique (MFP) et d'un canal de la membrane externe (OMF). Ces composants ont été caractérisés individuellement chez de nombreuses bactéries. Cependant, les mécanismes qui régissent l'assemblage et la dissociation de la pompe, essentiels pour son fonctionnement, demeurent mal compris. Nous nous sommes donc intéressés au cours de ce travail aux pompes à efflux de Pseudomonas aeruginosa. Nous avons notamment procédé à la caractérisation structurale du canal OprN de la pompe MexEF-OprN impliquée dans la résistance aux fluoroquinolones et à la caractérisation biophysique du transporteur RND MexY de la pompe MexXY-OprM, spécifique des aminoglycosides. Nous avons étudié en parallèle le mécanisme d'ouverture du canal OprM seul in vitro (aspects structuraux) et in vivo (aspects fonctionnels) au sein de la pompe assemblée. Nos résultats montrent que les OMFs de P. aeruginosa présentent des similitudes avec les OMFs d'autres bactéries Gram négatif, mais également des différences, notamment pour OprN et OprM au niveau de l'interaction avec leurs partenaires ou encore pour OprM concernant l'ouverture du canal. Nous avons par ailleurs participé à l'étude in vitro de l'assemblage et du transport à travers la pompe MexAB-OprM, reconstituée au sein de protéoliposomes, confirmant l'importance de l'acylation de la MFP dans la formation du complexe et montrant l'importance de la force proto-motrice dans l'assemblage de la pompe mais pas dans sa dissociation. En parallèle de l'étude des pompes à efflux, nous nous sommes intéressés à un autre système de résistance, impliqué dans la dégradation des antibiotiques. Nous avons donc réalisé, en collaboration avec le Pr Patrick Plésiat (laboratoire de Bactériologie de Besançon), la modélisation de mutants de la beta-lactamase AmpC de P. aeruginosa, permettant de lier les effets fonctionnels observés à des hypothèses de modifications conformationnelles. / Multidrug efflux systems are membrane transport proteins that are used to translocate a wide variety of drugs across the inner and the outer membranes of Gram-negative bacteria, leading to natural and acquired antimicrobial resistances.Most of the multidrug transporters of P. aeruginosa belong to the resistance-nodulation-cell division (RND) superfamily.They function as three-component assemblies made of an inner membrane transporter (RND), a periplasmic membrane fusion protein (MFP) and an outer membrane factor channel (OMF). Along with functional studies, many crystal structures of the individual components of the pump have been solved but the interactions underlying the complex assembly and the opening mechanism of the outer channel remain unclear. In this study, we investigated structural and functional insights of P. aeruginosa efflux pumps. We solved the crystal structure of the MexEF-OprN efflux pump outer membrane channel OprN mainly involved in fluoroquinolones resistance. Our new structure highlights the differences between P. aeruginosa and other Gram-negative bacteria OMFs that could explain their specific interaction with the cognate MFP partners. We also purified and characterized the inner membrane transporter MexY from the MexXY-OprM efflux pump, which is the major determinant of aminoglycosides resistance in P. aeruginosa. Besides, we solved the crystal structure of a mutatedform of the outer membrane channel OprM in order to understand its opening mechanism. We also investigated in vivo effect of the OprM mutants in antibiotics resistance by MIC measurements and tried to correlate with the observed structural modifications leading to the open state. Moreover, we set up a new in vitro test allowing the investigation of the assembly of the MexAB-OprM efflux pump. Our results showed the importance of MexA and its lipid anchor in promoting and stabilizing the complex assembly. In addition, as a side project with the group of Pr Plésiat (laboratoire de Bactériologie de Besançon), we built different structural models of AmpC mutants from overproducing clinical isolates,showing the possible conformational changes that lead to the resistance increase.

Introdução: Gestações múltiplas apresentam alta morbidade relacionada a fatores como prematuridade, baixo peso ao nascer e sepse. Em gemelares, a aquisição de imunidade passiva por meio do cordão umbilical e do colostro ainda não é bem conhecida. O objetivo geral do estudo foi descrever a concentração de IgG total e específico anti-Streptococcus B, antilipopolissacarídeos de Klebsiella pneumoniae e antilipopolissacarídeos de Pseudomonas aeruginosa no cordão umbilical de recém-nascidos gemelares e a concentração de IgA secretora total e específica destes anticorpos no colostro. O objetivo específico foi analisar a associação entre infecção neonatal e concentração dos anticorpos no sangue de cordão umbilical e no colostro. Métodos: estudo prospectivo transversal de uma coorte de recémnascidos gemelares internados no Centro Neonatal do Instituto da Criança do Hospital das Clínicas da FMUSP no período de 20 meses. Foram excluídos: recém-nascidos com malformação; mães com infecção ou imunodeficiência. Variáveis analisadas: idade gestacional; peso de nascimento; classificação gestacional; concentrações de IgG total e específicos e IgA total e específicas anti-Streptococcus B, antilipopolissacarídeos de Klebsiella pneumoniae e antilipopolissacarídeos de Pseudomonas aeruginosa no sangue de cordão umbilical e no colostro; nutrição enteral; episódios de infecção; desfecho. As dosagens de IgG total foram realizadas por nefelometria e dos demais anticorpos através de ensaio imunoenzimático. Os testes t-Student pareado ou teste de Wilcoxon pareado, teste de Mann-Whitney e teste de Kruskal-Wallis, foram utilizados, considerando-se significante p< 0,005. Resultados: Foram incluídos 57 pares de gêmeos, compondo a casuística de 114 recém-nascidos. A idade gestacional foi 36±1,65 semanas (média±DP) e o peso de nascimento foi 2.304,8 ± 460g (média±DP). As concentrações de anticorpos encontradas foram (média±DP): IgG total 835,71 ± 190,73 mg/dL, IgG anti-Streptococcus B 295,1 ± 250,66 UA/mL, IgG antilipopolissacarídeos de Pseudomonas aeruginosa 280,04 ± 498,66 UA/mL e IgG antilipopolissacarídeos de Klebsiella pneumoniae 504,75 ± 933,93 UA/mL; IgA total 210,2 ± 285,3 g/L, IgA anti-Streptococcus B 6640 ± 9526,8 UA/mL, IgA antilipopolissacarídeos de Pseudomonas aeruginosa 3231,0 ± 2935,2 UA/mL, IgA antilipopolissacarídeos de Klebsiella pneumoniae 3070,1±2886,6 UA/mL. A concentração de IgG total foi menor nos recém-nascidos prematuros (p < 0,001). Em gemelares com idade gestacional < 34 semanas a concentração de IgG total (p=0,013) e IgG antilipopolissacarídeos de Pseudomonas aeruginosa (p=0,032) foi menor. A concentração de anticorpos IgG antilipopolissacarídeos de Klebsiella pneumoniae foi menor nos recém-nascidos pequenos para a idade gestacional (p=0,013). No colostro, houve detecção de IgA total, IgA anti-Streptococcus B, IgA antilipopolissacarídeos de Klebsiella pneumoniae e antilipopolissacarídeos de Pseudomonas aeruginosa em 98,1% das mães. A concentração de IgA antilipopolissacarídeos de Pseudomonas aeruginosa foi menor no colostro das mães de recém-nascidos prematuros (p=0,013). A concentração de IgA antilipopolissacarídeos de Klebsiella pneumoniae foi menor no colostro das mães com parto antes de 34 semanas (p=0,001). Houve infecção em cinco recém-nascidos, cuja concentração de IgG total foi menor (p<0,05). Os neonatos que receberam colostro apresentaram menor incidência de infecção (p < 0,001). Conclusões: Os anticorpos IgG total e específicos foram detectados no sangue do cordão umbilical em todos os gemelares, comprovando sua passagem transplacentária. Houve diminuição significativa na concentração de anticorpos IgG total nos gemelares prematuros e de IgG total e IgG antilipopolissacarídeos de Pseudomonas aeruginosa nos gemelares com idade gestacional inferior a 34 semanas. No colostro houve detecção de IgA total e específica em 98,1% das mães. A concentração de IgA anti-lipopolissacarídeos de Pseudomonas aeruginosa foi menor no colostro das mães de gemelares prematuros. Nas mães com parto antes de 34 semanas houve diminuição da concentração de IgA antilipopolissacarídeos de Klebsiella pneumoniae, sugerindo que a prematuridade possa ter influenciado a transferência de anticorpos maternos pelo colostro. A maior incidência de infecção no grupo de recém-nascidos, que não receberam colostro e naqueles que apresentavam concentração sérica de IgG total significativamente menor, reforça a importância da proteção anti-infecciosa conferida pela imunidade passiva transferida da mãe / Introduction: Multiple pregnancies have high morbidity related to factors such as prematurity, low birth weight and sepsis. In twins, acquisition of passive immunity through the umbilical cord and colostrum is not yet known. The overall aim of the study was to describe the concentration of total and specific IgG antibodies anti-Streptococcus B, anti-lipopolysaccharide of Klebsiella pneumoniae and anti-lipopolysaccharide of Pseudomonas aeruginosa in the umbilical cord of newborn twins and the concentration of total and specific secretory IgA antibodies in the colostrum. The specific aim was to analyze the association between neonatal infection and antibody concentration in the umbilical cord blood and colostrum. Methods: A prospective cross-sectional study of a cohort of newborn twins admitted to the Neonatal Center of Children\'s Institute, University of São Paulo during the period of 20 months. Patients with malformations and mothers with infection or immunodeficiency were excluded from our analysis. Variables analyzed: gestational age; birth weight; sex; gestational classification; antibody concentrations of total and specific IgG and IgA anti-Streptococcus B, anti-lipopolysaccharide of Klebsiella pneumoniae and antilipopolysaccharide of Pseudomonas aeruginosa in umbilical cord blood and colostrum; enteral nutrition; infection episodes; outcome. Total IgG measurements were performed using nephelometry and the specific antibodies were evaluated by enzyme immunoassay. We used paired Student t test or Wilcoxon test, Mann-Whitney test and Kruskal-Wallis test considering significant p < 0.005. Results: During the study period a total of 57 pairs of twins were included, making the sample of 114 newborns. Gestational age was 36 ± 1.65 weeks (mean±SD) and birth weight was 2304.8 ± 460g (mean±SD). We found the following antibody concentrations (mean±SD): total IgG 835.71 ± 190.73 mg/dL, anti-Streptococcus B IgG 250.66 ± 295.1 AU/mL, anti-lipopolysaccharide of Pseudomonas aeruginosa IgG 280.04 ± 498.66 AU/mL and anti-lipopolysaccharide of Klebsiella pneumoniae IgG 504.75±933.93 AU/mL; total IgA 210.2 ± 285.3 g/L, anti- Streptococcus B IgA 6640±9526.8 AU/mL, anti-lipopolysaccharide of Pseudomonas aeruginosa IgA 3231.0±2935.2 AU/mL, antilipopolysaccharide Klebsiella pneumoniae IgA 3070.1±2886.6 AU/mL. The concentration of total IgG was lower in preterm infants (p < 0.001). In twins with gestational age < 34 weeks both total IgG concentration (p = 0.013) and anti-lipopolysaccharide of Pseudomonas aeruginosa IgG concentration (p = 0.032) were lower. The concentration of anti-lipopolysaccharide of Klebsiella pneumoniae IgG was lower in small for gestational age newborns (p=0,013). There was detection of total IgA and specific antibodies in the colostrum of 98.1% mothers. The concentration of anti-lipopolysaccharide of Pseudomonas aeruginosa IgA was lower in the colostrum of premature\'s mothers (p = 0.013). The concentration of anti-lipopolysaccharide of Klebsiella pneumoniae IgA was lower in the colostrum of mothers with delivery before 34 weeks (p = 0.001). Five newborns were diagnosed with sepsis and in this group the concentration of total IgG was lower (p < 0.05). Neonates receiving colostrum had a lower incidence of infection (p < 0.001). Conclusion: This study showed detection of total and specific IgG antibodies in umbilical cord blood for all twin newborn, proving its transplacental passage. There was a significant decrease in the concentration of total IgG antibodies in premature twins and antilipopolysaccharide of Pseudomonas aeruginosa IgG in twins with gestational age less than 34 weeks. There was detection of total and specific IgA in the colostrum of 98.1% mothers. The concentration of anti-lipopolysaccharide of Pseudomonas aeruginosa IgA was lower in mothers of premature twins. Among the newborns with gestational age less than 34 weeks there was a decrease in the concentration of anti-lipopolysaccharide Klebsiella pneumoniae IgA, suggesting that prematurity may have influenced the transfer of maternal antibodies through colostrum. The highest incidence of infection in the newborn group who did not receive colostrum and in those who had significantly lower total IgG serum antibodies reinforces the importance of anti-infectious protection afforded by passive immunity transferred from the mother

Genomas bacterianos são extremamente dinâmicos e boa parte dessa dinâmica ocorre devido a transferência horizontal e aquisição de DNA exógeno, um processo natural e fundamental para a evolução, adaptação e diversificação dos microrganismos. Ilhas genômicas são grandes regiões do cromossomo bacteriano adquiridas por transferência horizontal e estão presentes em apenas algumas linhagens, podendo conferir alguma vantagem adaptativa. Em Pseudomonas aeruginosa, até o momento foram caracterizadas pelo menos dezesseis ilhas genômicas e cada uma delas confere características diferentes a seus hospedeiros. Em P. aeruginosa UCBPP-PA14 (ou simplesmente PA14), encontram-se duas ilhas de patogenicidade denominadas PAPI-1 e PAPI-2, sendo a primeira a maior e a mais estudada, contendo 115 ORFs (&#8220;Open Reading Frame&#8221;, ou quadros abertos de leitura). Dentre estes, o gene int codifica uma integrase essencial para a excisão e integração de PAPI-1, e o gene soj é necessário para a manutenção da ilha na célula e é expresso apenas quando esta se encontra na forma epissomal. PAPI-1 codifica um provável sistema de secreção tipo IV (T4SS), similar ao do elemento móvel ICEHin1056, responsável pela transferência deste para outras bactérias. O objetivo deste trabalho foi identificar fatores genéticos e ambientais que contribuem para a transferência de PAPI-1 entre linhagens de P. aeruginosa. Foi observado que os mutantes por transposon nos genes PAPI-1 PA14_59860, PA14_59880, PA14_59920 e PA14_59940 têm a frequência de transferência de PAPI-1 diminuída, mas os genes interrompidos nesses mutantes não são essenciais para a excisão da ilha. Também foi mostrado que os reguladores percepção de quorum RhlR e MvfR têm influência na expressão do gene int, mas não de soj. O terceiro regulador de percepção de quorum, LasR, assim como a proteína H-NS MvaT, não tem influência na expressão de int e de soj. Ensaios de RT-PCR quantitativos mostraram que o choque térmico aumentou os níveis do mRNA de soj, mas não de int, corroborando dados previamente sugeridos pela literatura, que mostram uma maior freqüência de transferência de PAPI-1 nessas condições. Também foi analisado se o segundo mensageiro celular em bactérias, c-di-GMP, poderia contribuir para a excisão/manutenção de PAPI-1. Alterações nas concentrações deste segundo mensageiro pela superexpressão de proteínas responsáveis por sua síntese ou degradação não foram capazes de afetar a excisão/manutenção de PAPI-1. Houve diminuição na frequência de transferência de PAPI-1 a partir de linhagens doadoras superexpressando uma diguanilato ciclase ou uma fosfodiesterase de c-di-GMP, mas provavelmente este efeito não se deve aos níveis alterados desse segundo mensageiro. Em Xanthomonas axonopodis pv. citri 306 (XAC), uma região de 86 kb possui uma grande semelhança com PAPI-1 na organização dos genes. Além disso, possui uma série de ORFs relacionados aos genes &#8220;core&#8221; que definem uma família de ilhas genômicas sintênicas das quais PAPI-1 faz parte. Entretanto, os genes acessórios encontrados entre os blocos de genes conservados varia muito entre PAPI-1 e a região de XAC. Foi determinado que esta região de XAC não pode se excisar do cromossomo nas condições analisadas. Por fim, com o intuito de verificar as possíveis interações entre os produtos dos genes conservados em PAPI-1 e XAC, ensaios de duplo-híbrido foram realizados, porém não foi possível determiná-las, visto que apenas resultados falsos positivos foram obtidos. Este trabalho mostrou pela primeira vez que a percepção de quorum está envolvida com a expressão de soj e determinou uma extensa similaridade entre essa ilha e uma região do genoma de XAC / Bacterial genomes are extremely dynamic mostly because of horizontal gene transfer, a natural and fundamental process for evolution, adaptation and diversification of microorganisms. Genomic islands are large DNA segments acquired by horizontal gene transfer which are present only in a few strains and may confer some adaptative advantage. At least sixteen genomic islands have been characterized in Pseudomonas aeruginosa to date and each confers different characteristics to its host strain. P. aeruginosa UCBPP-PA14 (PA14) harbors two pathogenicity islands named PAPI-1 and PAPI-2. PAPI-1 is the largest one, carrying 115 open reading frames (ORFs). Among these, int codes for an integrase essential for PAPI-1 excision and integration, and soj is required for maintaining PAPI-1 in the cells, being expressed only when this island is in an episomal, circular form. PAPI-1 also harbors genes coding for a type four secretion system (T4SS) similar to the mobile element ICEHin1056, which is responsible for transferring this element to other bacteria. In this work, we show that transposon insertion in PAPI-1 genes PA14_59860, PA14_59880, PA14_59920 and PA14_59940 lowered the frequency of conjugation of PAPI-1 from PA14 to other bacteria, but those genes were not essential for PAPI-1 excision. Quorum sensing regulators RhlR and MvfR had a role in int expression, but did not alter soj transcription. The third quorum sensing regulator LasR, as well as the H-NS protein MvaT, did not alter both int and soj expression. Quantitative RT-PCR assays showed that cells incubated at heat shock conditions present higher levels of soj, mRNA, confirming published data that showed an increase in PAPI-1 transfer in these conditions. It was also analyzed whether the second messenger c-di-GMP would contribute to PAPI-1 excision/maintenance. Changes in the levels of this second messenger in cells overexpressing proteins responsible for its synthesis or degradation did not affect PAPI-1 excision and maintenance. A decrease in PAPI-1 transfer frequency was detected when those cells were used as donors in conjugation, but this effect cannot be attributed to the altered c-di-GMP levels. In Xanthomonas axonopodis pv. citri 306 (XAC), an 86 kb genome region shares similarity with PAPI-1 regarding gene homology and organization. It also carries ORFs related to the core genes that define a syntenic family of genomic islands that includes PAPI-1. Nevertheless, the accessory genes dispersed among the clusters of conserved genes are not related, when comparing PAPI-1 and this region in XAC. An epissomal form of this putative XAC island could not be detected in the conditions tested in this work. Finally, in order to verify interactions involving the conserved proteins in PAPI-1 and XAC, two hybrid assays were carried out, but only false positives results were obtained

Introdução: Gestações múltiplas apresentam alta morbidade relacionada a fatores como prematuridade, baixo peso ao nascer e sepse. Em gemelares, a aquisição de imunidade passiva por meio do cordão umbilical e do colostro ainda não é bem conhecida. O objetivo geral do estudo foi descrever a concentração de IgG total e específico anti-Streptococcus B, antilipopolissacarídeos de Klebsiella pneumoniae e antilipopolissacarídeos de Pseudomonas aeruginosa no cordão umbilical de recém-nascidos gemelares e a concentração de IgA secretora total e específica destes anticorpos no colostro. O objetivo específico foi analisar a associação entre infecção neonatal e concentração dos anticorpos no sangue de cordão umbilical e no colostro. Métodos: estudo prospectivo transversal de uma coorte de recémnascidos gemelares internados no Centro Neonatal do Instituto da Criança do Hospital das Clínicas da FMUSP no período de 20 meses. Foram excluídos: recém-nascidos com malformação; mães com infecção ou imunodeficiência. Variáveis analisadas: idade gestacional; peso de nascimento; classificação gestacional; concentrações de IgG total e específicos e IgA total e específicas anti-Streptococcus B, antilipopolissacarídeos de Klebsiella pneumoniae e antilipopolissacarídeos de Pseudomonas aeruginosa no sangue de cordão umbilical e no colostro; nutrição enteral; episódios de infecção; desfecho. As dosagens de IgG total foram realizadas por nefelometria e dos demais anticorpos através de ensaio imunoenzimático. Os testes t-Student pareado ou teste de Wilcoxon pareado, teste de Mann-Whitney e teste de Kruskal-Wallis, foram utilizados, considerando-se significante p< 0,005. Resultados: Foram incluídos 57 pares de gêmeos, compondo a casuística de 114 recém-nascidos. A idade gestacional foi 36±1,65 semanas (média±DP) e o peso de nascimento foi 2.304,8 ± 460g (média±DP). As concentrações de anticorpos encontradas foram (média±DP): IgG total 835,71 ± 190,73 mg/dL, IgG anti-Streptococcus B 295,1 ± 250,66 UA/mL, IgG antilipopolissacarídeos de Pseudomonas aeruginosa 280,04 ± 498,66 UA/mL e IgG antilipopolissacarídeos de Klebsiella pneumoniae 504,75 ± 933,93 UA/mL; IgA total 210,2 ± 285,3 g/L, IgA anti-Streptococcus B 6640 ± 9526,8 UA/mL, IgA antilipopolissacarídeos de Pseudomonas aeruginosa 3231,0 ± 2935,2 UA/mL, IgA antilipopolissacarídeos de Klebsiella pneumoniae 3070,1±2886,6 UA/mL. A concentração de IgG total foi menor nos recém-nascidos prematuros (p < 0,001). Em gemelares com idade gestacional < 34 semanas a concentração de IgG total (p=0,013) e IgG antilipopolissacarídeos de Pseudomonas aeruginosa (p=0,032) foi menor. A concentração de anticorpos IgG antilipopolissacarídeos de Klebsiella pneumoniae foi menor nos recém-nascidos pequenos para a idade gestacional (p=0,013). No colostro, houve detecção de IgA total, IgA anti-Streptococcus B, IgA antilipopolissacarídeos de Klebsiella pneumoniae e antilipopolissacarídeos de Pseudomonas aeruginosa em 98,1% das mães. A concentração de IgA antilipopolissacarídeos de Pseudomonas aeruginosa foi menor no colostro das mães de recém-nascidos prematuros (p=0,013). A concentração de IgA antilipopolissacarídeos de Klebsiella pneumoniae foi menor no colostro das mães com parto antes de 34 semanas (p=0,001). Houve infecção em cinco recém-nascidos, cuja concentração de IgG total foi menor (p<0,05). Os neonatos que receberam colostro apresentaram menor incidência de infecção (p < 0,001). Conclusões: Os anticorpos IgG total e específicos foram detectados no sangue do cordão umbilical em todos os gemelares, comprovando sua passagem transplacentária. Houve diminuição significativa na concentração de anticorpos IgG total nos gemelares prematuros e de IgG total e IgG antilipopolissacarídeos de Pseudomonas aeruginosa nos gemelares com idade gestacional inferior a 34 semanas. No colostro houve detecção de IgA total e específica em 98,1% das mães. A concentração de IgA anti-lipopolissacarídeos de Pseudomonas aeruginosa foi menor no colostro das mães de gemelares prematuros. Nas mães com parto antes de 34 semanas houve diminuição da concentração de IgA antilipopolissacarídeos de Klebsiella pneumoniae, sugerindo que a prematuridade possa ter influenciado a transferência de anticorpos maternos pelo colostro. A maior incidência de infecção no grupo de recém-nascidos, que não receberam colostro e naqueles que apresentavam concentração sérica de IgG total significativamente menor, reforça a importância da proteção anti-infecciosa conferida pela imunidade passiva transferida da mãe / Introduction: Multiple pregnancies have high morbidity related to factors such as prematurity, low birth weight and sepsis. In twins, acquisition of passive immunity through the umbilical cord and colostrum is not yet known. The overall aim of the study was to describe the concentration of total and specific IgG antibodies anti-Streptococcus B, anti-lipopolysaccharide of Klebsiella pneumoniae and anti-lipopolysaccharide of Pseudomonas aeruginosa in the umbilical cord of newborn twins and the concentration of total and specific secretory IgA antibodies in the colostrum. The specific aim was to analyze the association between neonatal infection and antibody concentration in the umbilical cord blood and colostrum. Methods: A prospective cross-sectional study of a cohort of newborn twins admitted to the Neonatal Center of Children\'s Institute, University of São Paulo during the period of 20 months. Patients with malformations and mothers with infection or immunodeficiency were excluded from our analysis. Variables analyzed: gestational age; birth weight; sex; gestational classification; antibody concentrations of total and specific IgG and IgA anti-Streptococcus B, anti-lipopolysaccharide of Klebsiella pneumoniae and antilipopolysaccharide of Pseudomonas aeruginosa in umbilical cord blood and colostrum; enteral nutrition; infection episodes; outcome. Total IgG measurements were performed using nephelometry and the specific antibodies were evaluated by enzyme immunoassay. We used paired Student t test or Wilcoxon test, Mann-Whitney test and Kruskal-Wallis test considering significant p < 0.005. Results: During the study period a total of 57 pairs of twins were included, making the sample of 114 newborns. Gestational age was 36 ± 1.65 weeks (mean±SD) and birth weight was 2304.8 ± 460g (mean±SD). We found the following antibody concentrations (mean±SD): total IgG 835.71 ± 190.73 mg/dL, anti-Streptococcus B IgG 250.66 ± 295.1 AU/mL, anti-lipopolysaccharide of Pseudomonas aeruginosa IgG 280.04 ± 498.66 AU/mL and anti-lipopolysaccharide of Klebsiella pneumoniae IgG 504.75±933.93 AU/mL; total IgA 210.2 ± 285.3 g/L, anti- Streptococcus B IgA 6640±9526.8 AU/mL, anti-lipopolysaccharide of Pseudomonas aeruginosa IgA 3231.0±2935.2 AU/mL, antilipopolysaccharide Klebsiella pneumoniae IgA 3070.1±2886.6 AU/mL. The concentration of total IgG was lower in preterm infants (p < 0.001). In twins with gestational age < 34 weeks both total IgG concentration (p = 0.013) and anti-lipopolysaccharide of Pseudomonas aeruginosa IgG concentration (p = 0.032) were lower. The concentration of anti-lipopolysaccharide of Klebsiella pneumoniae IgG was lower in small for gestational age newborns (p=0,013). There was detection of total IgA and specific antibodies in the colostrum of 98.1% mothers. The concentration of anti-lipopolysaccharide of Pseudomonas aeruginosa IgA was lower in the colostrum of premature\'s mothers (p = 0.013). The concentration of anti-lipopolysaccharide of Klebsiella pneumoniae IgA was lower in the colostrum of mothers with delivery before 34 weeks (p = 0.001). Five newborns were diagnosed with sepsis and in this group the concentration of total IgG was lower (p < 0.05). Neonates receiving colostrum had a lower incidence of infection (p < 0.001). Conclusion: This study showed detection of total and specific IgG antibodies in umbilical cord blood for all twin newborn, proving its transplacental passage. There was a significant decrease in the concentration of total IgG antibodies in premature twins and antilipopolysaccharide of Pseudomonas aeruginosa IgG in twins with gestational age less than 34 weeks. There was detection of total and specific IgA in the colostrum of 98.1% mothers. The concentration of anti-lipopolysaccharide of Pseudomonas aeruginosa IgA was lower in mothers of premature twins. Among the newborns with gestational age less than 34 weeks there was a decrease in the concentration of anti-lipopolysaccharide Klebsiella pneumoniae IgA, suggesting that prematurity may have influenced the transfer of maternal antibodies through colostrum. The highest incidence of infection in the newborn group who did not receive colostrum and in those who had significantly lower total IgG serum antibodies reinforces the importance of anti-infectious protection afforded by passive immunity transferred from the mother

O operon pst de P. aeruginosa codifica um transportador de fosfato de alta afinida-de e também a proteína PhoU que, em conjunto, atuam como repressores da ex-pressão do regulon Pho dessa espécie. A atividade de PhoU está também associada ao metabolismo de polifosfato (poliP), dado que mutantes phoU nulos apresentam um vasto acúmulo do biopolímero. Ensaios de &beta;-galactosidase mostraram uma alteração na expressão dos genes ppk e ppx, envolvidos no metabolismo de poliP, no mutante phoU. Observou-se que na cepa selvagem, a transcrição de ppk e de ppx não responde às limitações de Pi ou de nitrogênio, sendo esses genes altamente expressos em condições normais de crescimento. Além disso, determinou-se que ppk é co-transcrito com o gene hemB, os quais formam, portanto, um operon. O operon pst também foi analisado. Foi identificado por ensaios de northern blot o transcrito do primeiro gene do operon, pstS, que codifica uma proteína periplasmática. Também, foi identificado um promotor imediatamente a montante de phoU, o gene mais distal do operon, que permitiria sua expressão em condições normais do crescimento bacteriano. Por fim, determinou-se por ensaios de EMSA que as duas sequências consenso Pho box presentes no operon pst são completamente funcionais. / The pst operon in P. aeruginosa encodes a high-affinity phosphate transporter and the PhoU protein, which together act as repressors of Pho regulon of this species. The PhoU activity is also related with polyphosphate (polyP) metabolism, since phoU null mutants have a large accumulation of the biopolymer. &beta;-galactosidase assays allowed to confirm a change in the expression of ppk and ppx genes, in-volved in PolyP metabolism, in the phoU mutant. It was also evidenced that in the wild type strain, the ppk and ppx transcription does not respond to Pi or nitrogen starvation, and that these genes are highly expressed under conditions of normal growth. In addition, it was determined that ppk is co-transcribed with hemB, a gene involved in the synthesis of porphyrins, and they constitute therefore an operon. The pst operon was also examined. Was identified by northern blot the transcript of the first gene in the operon, pstS, which encodes a periplasmic protein. Also, a promoter was identified immediately upstream of phoU, the most distal gene in the operon, allowing its expression in normal conditions of bacterial growth. Finally, it was determined by EMSA that the two consensus sequences Pho box present in the pst operon are fully functional.

Les espèces bactériennes exhibent plusieurs états de structure de populations pouvant varier de clonale à panmictique selon l'importance des transferts horizontaux et la nature de leur écosystème. Dans mon travail de thèse, je me suis intéressé à trois espèces bactériennes, Staphylococcus aureus, Legionella pneumophila et Pseudomonas aeruginosa qui reflètent trois situations différentes. Afin de pouvoir décrire de façon rapide de grandes collections de souches, j'ai utilisé comme marqueurs de diversité le polymorphisme de séquences répétées en tandem appelées VNTRs, pour Variable Number Tandem Repeat. La méthode MLVA, ou Multiple Loci VNTR Analysis, est une méthode de typage moléculaire qui s’appuie sur l’étude concomitante du polymorphisme de plusieurs loci VNTRs. Dans un premier temps, j'ai conçu des protocoles de typage automatisés pour les trois espèces considérées, puis j'ai appliqué ces outils pour traiter de questions d'épidémiologie. S. aureus, espèce à structure clonale, est un pathogène majeur responsable notamment de toxi-infections alimentaires collectives (TIAC). Les travaux réalisés ont permis de démontrer la spécificité d’hôte de certains complexes clonaux et l’origine humaine des cas de TIAC. L. pneumophila est un pathogène de l’environnement dont la structure de population est atypique : présumée panmictique dans la nature, la bactérie semble connaitre une évolution clonale lorsque son écosystème est restreint, dans un milieu anthropique par exemple. L’étude épidémiologique menée sur la population de L. pneumophila dans la ville de Rennes a mis en évidence la présence d’un écotype, non impliqué dans les cas cliniques épidémiques, particulièrement adapté aux réseaux d’eau. P. aeruginosa, modèle de bactérie panmictique, colonise les bronches de patients atteints de mucoviscidose. Le suivi longitudinal de patients indique que les souches installées sont persistantes et quasi-exclusive de la niche qu’elles occupent. L’exploration de cette diversité du monde bactérien est un préalable à l’investigation épidémiologique des maladies infectieuses. Avec un même outil moléculaire de première intention, cette thèse retrace l’épidémiologie et la structure de trois espèces bactériennes très différentes. L’adaptation à un nouvel environnement (hôte animal, niche écologique, organe) est l'occasion d'expansions clonales. / Bacterial species exhibit diversity in their population structure varying from clonal to panmictic according to the abundance of horizontal transfer and the nature of their ecosystem. During my PhD, I focused on three bacterial species, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa and Legionella pneumophila, which reflect three different situations. To perform the characterisation of large strain collections, I studied the polymorphism of molecular markers called VNTRs for Variable Number Tandem Repeat. MLVA (Multiple Loci VNTR Analysis) is a PCR based typing method that relies on the concomitant analysis of several VNTRs loci. Initially, I designed automated typing protocols for the three species, then I applied these tools to address issues of epidemiology. S. aureus, a clonal species, is a major cause of food poisoning. The present work confirmed the existence of host-specific clonal complexes and demonstrated the predominantly human origin of foodborne disease cases. L. pneumophila is an environmental pathogen whose population structure is atypical: it is presumed panmictic in the environment but the bacterium expands clonally when the ecosystem is restricted, in an anthropogenic habitat for instance. A long-term epidemiological monitoring of L. pneumophila populations in the city of Rennes highlighted the presence of an ecotype, not involved in epidemic cases, particularly adapted to hot water supply systems. P. aeruginosa, a well-described panmictic bacterium, colonizes CF patients’ airways. The longitudinal monitoring of patients provided evidence that the settled strains were persistent and exhibited strong exclusivity for the occupied niche. Exploring the bacterial world diversity is a prerequisite for epidemiological investigation of infectious diseases. Using a first-line molecular tool, these works trace the epidemiology and the population structure of three bacterial species. The adaptation to a new environment (animal host, ecological niche, organ) generally results in clonal expansions.

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[Truncated abstract] Pseudomonas aeruginosa, an important opportunistic pathogen, is resistant to a wide array of functionally and structurally diverse antimicrobial agents including antibiotics, disinfectants and biocides. P. aeruginosa is more resistant than other Gram negative bacteria to tea tree oil (TTO), the essential oil steam distilled from the leaves of Melaleuca alternifolia and comprised of over 100 terpene hydrocarbon components and their oxygenated derivatives. TTO is an established topical antimicrobial agent, with antibacterial, antiviral and antifungal properties. Intrinsic antimicrobial resistance mechanisms in P. aeruginosa include the low permeability of the outer membrane and expression of multi-drug efflux pumps. A series of multi-drug efflux mutants from the resistance-nodulation-cell division family was obtained and their susceptibility to TTO and several components examined. This demonstrated that TTO and the components terpinen-4-ol, 1,8-cineole and a-terpineol were substrates of MexAB-OprM, using both pump deletion mutants and the pump inhibitor Phe-arg ß-naphthylamide dihydrochloride. In complementation studies, the addition of mexAB-oprM to deletion mutants restored susceptibility to these agents to that of the wild-type, confirming the role of MexAB-OprM in tolerance to TTO and these three components. ... An increase in susceptibility to ticarcillin and Timentin occurred in PAO1 following serial subculture in terpinen-4-ol. Susceptibility to ticarcillin has been associated with expression of the MexCD-OprJ system in P. aeruginosa. A library of transposon mutants was created to find additional mechanisms by which P. aeruginosa could tolerate TTO. The library yielded a total of 20 mutants that were more susceptible than parental strains to TTO and/or terpinen-4-ol. The insertion site of the transposon was identified in 14 mutants and, in four mutants, this was a gene related to flagellar biosynthesis. Flagella deficient mutants have previously demonstrated enhanced susceptibility to the membrane-disrupting surfactant sodium dodecyl sulfate and this echoes the increased susceptibility to TTO and terpinen-4-ol observed. Three non-sibling surA mutants were also identified. SurA is involved in the correct folding of outer membrane proteins, including porins, in Gram negative bacteria: surA mutants of Escherichia coli have phenotypes that are characteristic of a defective cell envelope, including an increased susceptibility to hydrophobic agents. The increase in susceptibility to hydrophobic TTO and terpinen-4-ol in the surA mutants is consistent with this and represents the first report linking SurA function to antimicrobial resistance in P. aeruginosa. In conclusion, several Mex efflux systems of P. aeruginosa including MexAB-OprM, MexCD-OprJ and MexEF-OprN, as well as the LPS core, outer membrane integrity and a functioning flagella biosynthetic pathway contribute to the tolerance of this organism to TTO and/or several components.