Orientador: Elenice Deffune / Banca: Marjorie de Assis Golim / Banca: Natalia Mayumi Inada / Resumo: A produção de anticorpos monoclonais (mAbs) é de extrema importância na área médica, sendo considerada a grande inovação da indústria biotecnológica. O método descrito por Köhler e Milstein exige a seleção celular por vias bioquímicas através do meio HAT (meio com hipoxantina, aminopterina e timidina). Com o crescente emprego da luz na área médica este trabalho buscou avaliar o emprego do LED (abreviação de Light Emitting Diode) com comprimento de onda de 475nm na seleção das células envolvidas na produção de anticorpos monoclonais com vistas a oferecer uma nova opção na seleção de hibridomas. Culturas celulares de Mieloma Murino (NS1) e MRSA 3-75 e 4-27 em meio completo 10% SFB foram segregadas em seis grupos para cada tipo celular (12 amostras), sendo: G1: controle (não irradiado); G2: 1 J/cm2; G3: 3 J/cm2; G4: 5 J/cm2; G5: 10 J/cm2; G6: 20 J/cm2. Com vistas a determinar o comportamento das células frente ao efeito da luz, foram avaliadas a taxas de viabilidades das células por Citometria de fluxo e MTT (3-(4,5-dimethyl thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide), perfil secretor dos hibridomas por ELISA e nanodrop e taxa crescimento celular pela coloração de Azul de Tripan. Os resultados mostraram que houve bioinibição de NS1 e MRSA 3-75 e 4-27 em doses superiores a 5 J/cm2 promoveram aumento da morte por necrose e apoptose tardia com supressão da produção de anticorpos (hibridomas) em todos os grupos experimentais. Os Hibridomas MRSA 4-27 apresentaram bioestimulação quanto a produção de anticorpos em 31% na dose de 1 J/cm2 porém, o MRSA 3-75 não apresentou alteração no perfil secretor. O LED no comprimento de onda de 475nm não promoveu fotoseleção de mielomas e hibridomas após exposição à luz. Mas, bioestimulou o crescimento celular (NS1) e promoveu aumento da secreção de imunoglobulinas (MRSA 4-27), principal interesse dos laboratórios de bioengenharia que utilizam esta tecnologia / Abstract: The production of monoclonal antibodies (mAbs) for medicine is highly important, being considered the greatest innovation of the biotechnologic industry over the years. The method described by Köhler e Milstein demands cellular selection through biochemistry ways using HAT (culture medium with hypoxanthine, aminopterin and tymidhine). By the increasing use of lights in the medical areas, this paper searches to evaluate the application of LED (Light Emitting Diode) - wave length of 475nm - in the selection of cells involved on monoclonal antibodies production, in order to offer a new option for hybridoma selection. Cell culture of Murine Myeloma (NS1) and MRSA 3-75 and 4-27 in complete culture medium with 10% of fetal bovine serum (FBS) were separated in six groups for each cellular type (12 samples), being: G1: control group (not irradiated), G2: 1 J/cm2; G3: 3 J/cm2; G4: 5 J/cm2; G5: 10 J/cm2; G6: 20 J/cm2. To determine the behavior of cells, the following tests were made: viability tests by Flow Cytometry and MTT (3-(4,5-dimethyl thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide), ELISA and Emission Spectrometry to check hydridomas' secretory profile and Tripan blue stain to determine cellular growth rate. The results show that there were bioinstimualtion of NS1 and MRSA 3-75 and 4-27 in doses above of 5 J/cm2, which promoted the increase of death by necrosis and late apoptosis with the reduction of monoclonal antibodies production (hybridoma) in all experimental groups. The MRSA 4-27 hybridomas presented biostimulation as for the anitbodies production in 31% at the dose of 1 J/cm2, although the MRSA 3-75 didn't present any alteration of secretory profile. The LED with wave length of 475nm didn't promoted photoselection of hybridomas and myelomas after the exposure to light. However, it biostimulated the cellular growth (NS1) and the increased the secretion of immunoglobulins (MRSA 4-27), which is the main interest of ... / Mestre

Orientador: Elenice Deffune / Banca: Maria de Lourdes Ribeiro da Cunha / Banca: Fábio Bernardi Dalpino / Resumo: S. aureus é, sem duvida, o patógeno humano mais importante entre os estafilococos. O surgimento e a disseminação progressiva da resistência a meticilina tiveram grande impacto na terapia das infecções estafilocócicas. O mecanismo de resistência a meticilina desenvolvido por S. aureus está relacionado com a alteração das proteínas ligadoras de penicilinas, as PBPs. Os Staphylococcus. aureus produzem 5 tipos de PBPs: 1,2,3,3', e 4. As cepas de S. aureus resistentes a meticilina produzem uma nova PBP, a PBP2a, adquirida de outras cepas de estafilococos. Diversos métodos são utilizados para detecção da resistência a meticilina no S. aureus. Dentre eles, a detecção da PBP2a por meio de métodos de aglutinação em látex utilizando anticorpo monoclonal específico dirigido para o antígeno PBP2a. Na presente pesquisa, anticorpos monoclonais murinos dirigidos contra a PP2a do S. aureus resistente a meticilina foram produzidos através de fusão celular utilizando-se células de baço de camundongos BALB/c imunizados.Cinco fusões MRSA foram realizadas e os sobrenadantes de cultura foram triados por testes Elisa indireto . Foram construídos e testados 1236 híbridos e nove híbridos se mostraram reativos após o 4º. teste de Elisa indireto. Os nove híbridos foram testados frente a diferentes bactérias para observar inibição do crescimento. Este trabalho teve como foco, a produção de anticorpo monoclonal murino para uso em testes de detecção rápida / Abstract: S. aureus is, without doubt, the most important human pathogen among staphylococci. The emergence and dissemination of progressive resistance to methicillin had great impact on therapy of staphylococcal infections. The mechanism of resistance to methicillin developed by S. aureus is related to the alteration of penicillin binding proteins, the PBPs. Staphylococcus. aureus produces five types of PBPs: 1,2,3,3 ', and 4. Strains of S. aureus resistant to methicillin produce a new PBP, PBP2a the acquired from other strains of staphylococci. Several methods are used for detection of methicillin resistance in S. aureus. Among them, the detection of PBP2a by latex agglutination methods using monoclonal antibody specific for the antigen directed PBP2a. In the present study, murine monoclonal antibodies directed against the PP2A methicillin resistant S. aureus were produced by cell fusion using spleen cells from immunized BALB / c mice. Five MRSA fusions were performed and the culture supernatants were screened by testing indirect ELISA. Were built and tested in 1236 hybrids and nine of them were reactive after the 4th indirect ELISA test. The nine hybrids were tested against different bacteria to observe inhibition of growth. This work focused on the production of murine monoclonal antibody for use in rapid detection tests / Mestre

Orientador: Chung Man Chin / Banca: Chung Man Chin / Banca: Regina Maria Barreto Cicarelli / Banca: Veni Maria Andres Felli / Banca: Adélia Emilia de Almeida / Banca: Carlota de Oliveira Rangel Yagui / Resumo: A doença de Chagas ou Tripanossomíase americana é ainda um dos maiores problemas endêmicos na América Latina desde sua descoberta 100 anos atrás. Em 2006, havia aproximadamente 7,6 milhões de casos de infecção por Trypanosoma cruzi nos 21 países latino americanos. Cerca de 90 milhões de pessoas estão sobre o risco de contrair a infecção. O número de mortes e novos casos atribuídos a essa doença são respectivamente 21.000 e 200.000 no ano de 2000. Dois fármacos são usados particularmente para tratar esta doença, nifurtimox e benznidazol que são ativos somente na fase aguda da doença. No Brasil, somente benznidazol é disponível no mercado, por causa da resistência do nifurtimox às cepas de T. cruzi. Ambos os fármacos causam efeitos adversos graves que incluem polineuropatia periférica, agranulocitose e trombocitopenia púrpura. Embora o papel exato do sistema imune na patogenia não é totalmente entendido, é aceito que o sistema imune tenha um papel importante na proteção da infecção parasitária. Antígenos produzidos por T. cruzi afetam a função celular e induzem uma resposta caótica no hospedeiro, como a transialidase (TS) que é essencial para sobrevivência do parasita. TS é uma enzima envolvida na invasão de células hospedeiras mamíferas, na proteção contra componentes do sistema complemento e induz apoptose severa nas células do sistema imune, e que a administração de anticorpos é capaz de neutralizar esta enzima. Outro antígeno, J-18, um derivado recombinante da glicoproteína gp82, é capaz de se ligar à mucosa gástrica e isto é crucial para o estabelecimento da infecção oral. Então, um anticorpo contra esta glicoproteína poderia ser útil para inibir a invasão na mucosa gástrica. Cruzipaína é outra enzima importante do T. cruzi e suas funções parecem ser participar da nutrição, mecanismos de defesa e replicação do parasita... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Chagas disease or American trypanosomiasis is still one of the major endemic problems in Latin America since its discovery 100 years ago. In 2006, there were approximately 7.6 million cases of Trypanosoma cruzi infection in 21 Latin American countries. Around 90 million people are at risk of contracting the infection. The number of deaths and new cases attributed to this disease are respectively 21,000 and 200,000 in the year 2000. Two drugs are particularly used to treat this disease; nifurtimox and benznidazol are active only in its acute phase. In Brazil, just benznidazol is available in the market, because nifurtimox resistant to T. cruzi strains. Both drugs cause severe side-effects including peripheral sensitive polyneuropathy, agranulocytosis and thrombocytopenic purpura. Although the exact role of the host immune system in the pathogenesis is not still fully understood, it is accepted that the immune system plays an important role in protection from parasitic infection. Antigen derivatives from T. cruzi affect cellular function and induce chaotic immune system host response, like trans-sialidase (TS) being essential for the parasite survival. TS is an enzyme involved in the invasion of mammalian host cells, in the protection against components of complement system and induces severe apoptose in cells of the immune system, and that antibodies administration is able to neutralize this enzyme. Another antigen, J-18, a recombinant glyprotein gp82 derivative, is able to bind to gastric mucin and this is crucial for the establishment of T. cruzi infection by oral route. Then, an antibody against this glycoprotein could be useful to inhibit the gastric mucin invasion. Cruzain is another important enzyme of T. cruzi and its functions seem to participate in nutrition, defense host mechanisms and replication of intracellular parasite. While there are no strong inhibitors against TS... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Ramon Kaneno / Resumo: O câncer colorretal (CCR) é o terceiro tipo mais prevalente de câncer no mundo, com frequentes complicações metastáticas muitas vezes associadas ao desenvolvimento de resistência adquirida aos fármacos. Uma das estratégias terapêuticas utilizadas no tratamento de pacientes que não respondem bem à quimioterapia convencional é a imunoterapia baseada na aplicação de anticorpos monoclonais cetuximab ou panitumumab, ambos dirigidos ao receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR). Em alguns casos observa-se associação da resistência aos anticorpos com a superexpressão de HER2, outro membro da família do EGFR. Assim, esta dissertação foi elaborada para testar a hipótese de que o uso conjunto de anticorpos anti-EGFR e anti-HER será capaz de reduzir o escape das células tumorais e que a associação com fármacos antitumorais tornará mais efetiva sua eliminação. Com esse propósito, nosso objetivo foi utilizar nanopartículas ouro (AuNP) para o transporte de 5-fluorouracil (5FU), endereçando esses nanocarreadores para as células de câncer colorretal recobrindo-os com anticorpos contra os receptores para fator de crescimento epidérmico EGFR (ErbB-1) e HER2 (ErbB-2). Os nanocarreadores foram testados in vitro quanto a sua interação por células de câncer colorretal HCT-116 e Caco-2 por citometria de fluxo, sua capacidade de induzir apoptose/necrose e seu efeito sobre a atividade proliferativa das células testadas. Nossos dados indicam que as AuNP produzidas e funcionalizadas com as molé... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Colorectal cancer (CRC) is the third most prevalent type of cancer in worldwide and is frequently associated with metastatic complications. Therapeutic strategies to treat those patients who do not respond to conventional chemotherapy is based on the application of monoclonal antibodies cetuximab or panitumumab, both directed targeting the epidermal growth factor receptor (EGFR). However, in some cases resistance is associated with an overexpression of HER2, another receptor belonging to the EGFR family. Therefore, this dissertation was designed to test the hypothesis that the combination of anti-EGFR and anti-HER antibodies will be able to reduce the escape of tumor cells, and that their association with antitumor drugs could improve the elimination of tumor cells. Then, our goal was to use gold nanoparticles (AuNP) for transporting 5-fluorouracil (5FU), addressing them to colorectal cancer cells by coating them with antibodies against the receptors of epidermal growth factor EGFR (ErbB-1) and HER2 (ErbB-2). Nanocarriers were tested in vitro by flow cytometry for their interaction and internalization by the colorectal cancer cell line HCT-116 and Caco-2, their ability to induce apoptosis/necrosis and stop cell proliferation. Our results show that AuNP produced and functionalized with the molecules of interest have spherical structure, however, some formulations showed agglomeration due to the incorporation of organic molecules. Biological assays showed that AuNP 5FU EGFR had... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

As cepas vacinais rotavírus reassortants G1, G2, G3, G4 e G9 foram obtidas de um rearranjo genético entre cepas humanas de rotavírus do grupo A do sorotipo G (D, DS-1, P, ST-3 e AU32) e a cepa bovina UK-Bovine. Neste estudo, a cepa reassortant de rotavírus IB-BRV-4-G4 foi formulada, em duas condições, sem adjuvante (Esquema 1) e com adjuvante (Esquema 2) para imunização de camundongos Balb/c. Três AcMos da classe IgM foram obtidos da fusão utilizando animais do Esquema 1 e com o esquema 2 foram obtidos 3 AcMos, dois da classe IgA e um da subclasse IgG1. Destes últimos, dois AcMo (IgA) reconheceram somente epitopos conformacionais em teste de Dot-blot. Entretanto, o AcMo 3 (IgG1) foi reativo a proteínas virais também por Western Blotting, em uma região de perfil eletroforético coincidente com a glicoproteína VP7 de rotavírus. Os resultados mostram que o esquema II de imunização resultou em AcMo específicos para o sorotipo G4, sendo o AcMo IgG1 um forte candidato a ser utilizado nos testes de potência da vacina pentavalente de rotavírus do Instituto Butantan. / The rotavirus strain (G1, G2, G3, G4 and G9) were obtained of reassortants between human rotavirus of the group A and G serotypes (D, DS-1, P, ST-3 and AU32) and a strain from bovine (UK-Bovine).In this study, IB-BRV-4-G4 reassortant rotavirus strain was used to immunize Balb/c mice. Two schedules of immunization were used in the animals, one with IB-BRV-4-G4 (E1) and other with rotavirus antigen and adjuvant (E2). Three monoclonal antibodies of IgM class were obtained of cells from mice immunized only with rotavirus antigen (E1) and with (E2) was obtained three monoclonal antibodies, two producers the IgA class and one the IgG1 subclass. The IgA clones were reactive to G4 serotype rotavirus antigen only in the Dot-blot test. The mAb IgG1 was also reactive to viral proteins in a region of electrophoresis profile in the Western blotting test that coincided with the glycoprotein VP7 of rotavirus. The results indicate that the IgG1 obtained is specific to G4 serotype of rotavirus. It is candidate to be for use in the potency test of pentavalent vaccine.

No semi-árido paraibano há poucos relatos de ocorrência da raiva, há quem afirme que os caprinos, ovinos e asininos são resistentes à doença e a prática de vacinação é incomum. Este trabalho visou estudar a situação da raiva na região semi-árida de Patos-PB, estabelecendo o diagnóstico desta enfermidade em diferentes espécies de animais domésticos e silvestres. Foram capturados 12 exemplares de raposas (Dusicyon vetulus), por meio de armadilha; 192 morcegos insetívoros (Molossus molossus), capturados no Centro de Saúde e Tecnologia Rural - CSTR, Universidade Federal de Campina Grande - UFCG, em Patos, e oito morcegos insetívoros (M. molossus) encaminhados por moradores desta cidade. As raposas capturadas foram submetidas à colheita de sangue e em seguida sacrificadas com uso de Ketamina e T-61. Outras 287 raposas e oito guaxinins (Procyon cancrivorous) atropelados e mortos nas rodovias que servem o município de Patos foram examinados, além de 74 amostras de diferentes espécies de animais domésticos, enviados pelo setor de Patologia do Hospital Veterinário do CSTR-UFCG. Os animais silvestres, uma vez transportados ao Laboratório de Virologia do CSTR-UFCG, foram necrópsiados e os fragmentos do cérebro, submetidos à prova de imunofluorescência direta (IFD) e inoculação intracerebral em camundongos (ICC) para o diagnóstico da raiva. Dos 581 materiais examinados, 50 (8,60%) foram positivos à IFD, dos quais 47 (8,09%) se confirmaram à ICC. Relativamente às espécies, 19/41 amostras de bovinos; 12/299 de raposas; 1/5 de ovinos e 2/6 de caninos apresentaram resultados positivos para ambas as provas. Amostras procedentes de caprinos, eqüinos e morcegos apresentaram resultados discrepantes entre as provas de IFD e ICC, de 2/6 e 1/6; 3/11 e 2/11; e 9/200 e 8/200, respectivamente. As amostras de vírus foram enviadas ao Laboratório de Raiva da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo, para extração do material nucléico, tipificação antigênica e genética. A tipificação antigênica e genética com base no gene M1 foi realizada no "Canadian Food and Inspection Agency", Fallowfield, Otawa, Canadá, patrocinado pela IICA – "Inter-American Institutes for Cooperation on Agriculture". A caracterização genética do gene N e o estudo filogenético foram realizados no laboratório do "National Institute of Infectious Diseases", Toyama, Tóquio, pelos pesquisadores do "College of Bioresources Sciences" da Nihon University, Kanagawa, Japão. O estudo do comportamento biológico das amostras foi realizado em camundongos, pela inoculação por via intracerebral, avaliando-se os períodos de incubação e clínico, no seu primo-isolamento. O comportamento biológico de um isolado de raposa foi estudado em caprinos e ovinos inoculados experimentalmente por via intramuscular. A mesma amostra foi utilizada para o desafio de asininos e eqüinos vacinados com uma vacina comercial de vírus inativado. Estes animais apresentaram níveis mensuráveis de anticorpos anti-rábicos neutralizantes e os resultados do desafio indicaram a eficácia da vacina contra o isolado de raposa. Os resultados da tipificação antigênica e genética permitem concluir que: na região estudada a epidemiologia da raiva é complexa, revelando existir variantes distintas, mantidas em cães domésticos, raposas, morcegos insetívoros e morcegos hematófagos. / In the semiarid of the State of Paraíba there are few reports of rabies occurrence, and it is said that caprines, ovines and asinines are resistant to rabies and the use of vaccines in these species is uncommon. This work aimed to study the situation of rabies in the semiarid of Patos-PB, establishing the diagnosis in domestic and wild animals. For the study, 12 foxes (Dusicyon vetulus) were captured alive; 192 insectivorous bats (Molossus molossus), captured at the "Centro de Saúde e Tecnologia Rural-CSTR", of the "Universidade Federal de Campina Grande-UFCG", Patos-PB; and 8 bats (M. molossus) sent by residents of the city of Patos. Captured foxes were submitted to blood collection and then sacrificed using ketamine and T-61. Other 287 foxes and 8 raccoons (Procyon cancrivorus) road-kills collected from the roads serving the Patos municipality were examined. Other 74 samples from different domestic animals sent by the Pathology section of the Veterinary Hospital of the CSTR-UFCG were also included. The wild animals, once shipped to the Virology Laboratory of the CSTR-UFCG, were necropsied and brain fragments were submitted to the fluorescent antibody test (FAT) and mouse inoculation test (MIT) for rabies diagnosis. Among the 581 materials, 50 (8.60%) were positive by FAT, and 47 (8.09%), confirmed by MIT. Concerned to animal species, 19/41 bovines; 12/299 foxes; 1/5 ovines; and 2/6 canines were positive for both FAT and MIT. Caprine, equine and bat samples presented discrepant results between the FAT and MIT, from 2/6 to 1/6; 3/11 to 2/11; 9/200 to 8/200, respectively. All the isolates were sent to the Rabies Laboratory of the "Departamento de Medicina Veterinária Preventiva e Saúde Animal", "Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia", "Universidade de São Paulo-FMVZ-USP", for extraction of nucleic materials, to perform the antigenic and genetic typing. Antigenic and genetic typing based on M1 gene was conducted at the Canadian Food and Inspection Agency, Fallowfield, Otawa, Canada, sponsored by the IICA – Inter-American Institutes for Cooperation on Agriculture. The genetic characterization of the N gene and the phylogenetic analyses were made at the National Institute of Infectious Diseases, Toyama, Tokyo, by the researchers of the College of Bioresources Sciences, Nihon University, Kanagawa, Japan. The biologic behavior of the isolates was studied in mice through intracerebral inoculation by registering the incubation and the clinical periods at its first passage. The biologic behavior of a fox isolate was assessed in caprines and ovines, by experimental inoculation through intramuscular route. The same isolate was used for the challenge of asinines and equines that had been vaccinated with a commercially available inactivated virus vaccine. The vaccinated animals showed measurable levels of neutralizing antirabies antibodies and the results of challenge indicated the efficacy of this vaccine against the fox isolate. According to the results of antigenic and genetic typing, it can be concluded that in the region, the epidemiology of rabies is complex, revealing the existence of virus variants maintained in populations of domestic dogs, foxes and hematophagous and insectivorous bats.

Orientador: Wirla Maria da Silva Cunha Tamashiro / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-05T10:09:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Scuro_LorenSemionatto_M.pdf: 980651 bytes, checksum: f54e323b2050cb528e7e829af26086ad (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: O objetivo do presente trabalho foi a obtenção e caracterização de anticorpos monoclonais contra a IL6 humana recombinante (hr) para serem empregados em ensaios imunoenzimáticos do tipo ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay) de detecção da IL6 humana nativa, presente em fluídos biológicos de pacientes portadores de quadros onde os níveis de IL6 encontram-se elevados, ou então produzida por monócitos humanos e murinos ativados in vitro. Dois grupos de hibridomas (1A6 e 3B1) secretores de anticorpos monoclonais anti-IL6 foram obtidos pela fusão de células de mieloma da linhagem SP2 Ag14/0 com esplenócitos de camundongos BALB/c, previamente imunizados com a IL6 humana recombinante. Esses hibridomas foram selecionados com base em sua reatividade com a hrIL6, através de ensaios do tipo ELISA indireto. As imunoglobulinas (Igs) monoclonais produzidas pelos hibridomas dos dois grupos são do isotipo IgG1 Kappa e foram purificadas de líquidos ascíticos e dos sobrenadantes de cultura por cromatografia de afinidade. As proteínas purificadas foram conjugadas com biotina para uso em ensaios de ELISA de captura da hrIL6, de modo a se identificar um ou mais pares de anticorpos adequados a esse tipo de teste, bem como para definir a sensibilidade de detecção da citocina. O par de anticorpos monoclonais 3B1E4 x 1A6F10-biotinilado se mostrou mais promissor nos ensaios de ELISA, detectando a citocina recombinante entre 8 e 512 ng/mL, liberando densidades óticas mais elevadas. Todos os anticorpos monoclonais (AcMos) anti IL6 estudados foram capazes de neutralizar a atividade biológica da citocina em ensaios empregando o hibridoma B13.9, uma célula dependente de IL-6 para seu crescimento. Finalmente, o par de hibridomas anti IL6 3B1E4 e 1A6F10 foi estudado quanto às suas principais características de cultivo: crescimento, produção in vitro dos anticorpos, consumo de glicose e produção de lactato e amônia. O seqüênciamento da porção N-terminal do par 3B1E4 e 1A6F10 revelou que as cadeias leves dos dois anticorpos apresentam seqüência idêntica de aminoácidos. Porém, a análise dos dez resíduos de aminoácidos presentes na região variável das cadeias pesadas resultou em seqüências completamente distintas nos dois monoclonais, sendo um forte indício de diferença nos sítios de ligação ao antígeno dos anticorpos estudados / Abstract: In the present study we have developed monoclonal antibodies against human recombinant (hr) IL6, for the use in ELISA assays to detect the human native IL6 present in biological fluid of patients or in supernatant of activated human and rodent monocytes. Two families of hibridomas (1A6 and 3B1) secreting MAb against-IL6 were obtained from the fusion of mieloma cells from SP2 Ag14/0 lineage with spleen cells from BALB/c mice, previously immunized with human recombinant IL6. Those hibridomas were selected on the basis of their reactivity with the hrIL6, through an ELISA indirect assay. The monoclonal immunoglobulins (Igs) produced by these hibridomas are from IgG1 Kappa isotype and were purified from ascitic fluid and culture supernatant by affinity chromatography. The purified proteins from the ascitic fluid were conjugated with biotin for the use in ELISA hrIL6 capture assay, to identify one or more pairs of antibodies appropriated to this kind of test, as well to define the sensibility of cytokine detection. The pair of MAbs 3B1E4 x 1A6F10-biotinilates was shown promising in ELISA assays, detecting the recombinant cytokine between 8 and 512 ng/mL, liberating elevated optical densities. All of the a-IL6 MAbs studied were capable to neutralize the biological activity of the cytokine in attempt employing the hibridoma B13.9 IL-6 dependent. Finally, the pair of hibridomas a-IL6 3B1E4 and 1A6F10 was studied as regards his main cultivation characteristics: growth, MAb production in vitro, lactate and ammonia production and glucose consumption. The N-Terminal portion sequence of 3B1E4 and 1A6F10 revealed that both light-chains present identical amino acid sequence. However, the analysis of the ten amino acid residues present in variable region of heavy-chains resulted in completely distinct sequences in both antibodies, being a strong indication of difference in their ability to recognize the antigen / Mestrado / Imunologia / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Orientadores: Clarice Weis Arns, Dagmar Ruth Stach-Machado / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-11T14:40:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Coswig_LiaTreptow_D.pdf: 19863975 bytes, checksum: 7e0e923baa4947ed3f77ff3ca34747e9 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: o Metapneumovírus Aviário (AMPV), também denominado vírus da rinotraqueíte dos perus (TRT), é um vírus que acomete e causa infecção no trato aéreo superior das galinhas e perus. Além da infecção respiratória, em poedeiras e matrizes está associado com uma queda significativa na produção de ovos. Em galinhas o vírus está relacionado com a Síndrome da Cabeça Inchada (SCI), uma enfermidade multifatorial, e por este motivo é importante o diagnóstico diferencial. Testes realizados com anticorpos monoclonais (Mabs) e técnicas moleculares são capazes de detectar diferenças entre os subtipos do vírus. Os métodos de diagnóstico incluem isolamento ou detecção da partícula viral ou testes sorológicos. O isolamento das amostras virais SHS-BR-121 (subtipo A) e STG-SHS-1439 (subtipo B) foi realizado em cultura de anel de traquéia, em fibroblasto de embrião de galinha (FEG) e em células chicken embryo related (CER). A comparação das médias dos títulos obtidos para as duas amostras virais, em célula CER, apresentou diferença estatisticamente significativa (P=0,014) com p< 0,05. Neste projeto foi avaliada a suscetibilidades de seis sistemas celulares (CER, Vero, BHK-21, HEp-2, MDBK e ED) para a multiplicação das duas amostras virais (subtipos A e B). Destes sistemas as células CER, Vero e BHK-21 demonstraram ser apropriadas para a replicação vira!. Os títulos nestas células variaram de 105.5 a 107,o/mL DICC50 , para o vírus SHS-BR-121, e 105,5 a 106.0/mL DICC50 para o vírus STG-SHS-1439. As diferenças entre as médias dos títulos nos diferentes sistemas celulares foi estatisticamente significativa para a amostra SHS-BR-121 inoculada em CER em relação as células Vero e BHK-21 (P= 0,01 e P=0,004, respectivamente) com p< 0,05. Para a amostra STG-SHS-1439 não houve diferença estatística significativa, com p<0,05. A curva da cinética viral foi realizada para as duas amostras virais, em três sistemas celulares, CER, Vero e BHK-21, demonstrando estas diferenças. Foram produzidos anticorpos monoclonais contra o AMPV isolado no Brasil, sendo obtidos cinco anticorpos monoclonais para o antígeno viral através da fusão celular que apresentaram os isotipos IgG1, IgG2a e IgG2b quando da isotipagem. Dos cinco anticorpos monoclonais, três possuíam atividade neutralizante e quatro deles inibiram a fusão invitro. No teste de soroneutralização cruzada foram utilizadas três amostras virais para a análise, sendo elas SHS-Br-121, STG 854/88 e TRT-SHS-1439. Todos os anticorpos monoclonais apresentaram resultado positivo em relação à amostra homóloga, sendo que três apresentaram resultados positivos também para as amostras heterólogas. Os resultados confirmam que os dois anticorpos monoclonais descritos podem ser utilizados com importante ferramenta nos estudos epizootiológicos e para o diagnóstico específico dos subtipos na infecção pelo Metapneumovírus Aviário / Abstract: Avian Metapneumovirus (AM PV) , also denominated virus of the rhinotracheitis of the turkeys, it is a virus that attacks and it causes infection in the upper respirator) tract of chickens and turkeys. Besides the respiratory infection, in breeders and layers is associated with a significant fall in the production of eggs. In chickens the virus is related with the Swollen Head Syndrome (SHS), an illness multifactorial and for this reason it is very important the differential diagnosis. Tests accomplished with monoclonal antibodies (Mabs) and molecular techniques are capable to detect differences among the subtypes of the virus. Methods for the diagnosis of AMPV infections include detection or isolation of the virus itself, demonstration of a specific antibody response to the virus. For the primary isolation of the two samples of AMPV SHS-BR-121 (subtype A) and STG-SHS-1439 (subtype B) was it accomplished ir chicken embryo tracheal" organ culture (TOC), in chicken embryo fibroblast cell culture (CEF) and was it accomplished in cell line chicken embryo related (CER). Done the comparison of the averages of the titers obtain for the two strains, in cellline CER, did present statistically significant difference (P=0,014) with p< 0,05. The growth of SHS121-BR and STG-SHS-1439 was evaluated in six different celllines (CER, Vero, BHK21, HEp-2, MDBK and ED). CER, Vero and BHK-21 showed to be the most appropriate for virus multiplication. The titers in these cells varied from 105.5 to 107,o/mL !CID50, for the virus SHS-BR-121, and 105,5 to 106,o/mL TCID50 for the virus STG-SHS71439. The differences among the averages of the titers in the different cell lines was statistically significant differences (P=0,01) with p<0,05 for the strain SHS-BR-121 in CER cellline. One-step growth curves of the strains SHS-BR-121 and STG-SHS-1439 in CER, Vero and BHK-21 showed that there was not statistically significant difference in the infectious virus titers from 0 to 60 hours after infection. Five monoclonal antibodies were obtained for the viral antigen through the cell fusion that showed the isotypes IgG1, IgG2a and IgG2b, when of the characterization of Mabs. Three of them showed neutralizing activity and four inhibited the fusion in vitro. These MAbs were used to investigate antigenic relationship among three strains (SHS-BR-121, STG 854/8o/and TRT1439/91) of a MPV subtypes A and B using cross-neutralization test. When the five hybridomas were analyzed showed result positive for the homologus virus. In relation t4 two samples of heterologus AMPV three Mabs were positive to heterologus AMPV. Th4 results confirm that the two monoclonal antibodies described can be used as a valuable tool in the epizootiological and serological studies, and also for the specific diagnosis o the subtypes in the infection for Avian Metapneumovirus / Doutorado / Microbiologia / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

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Apesar da forte ativação do sistema imune que ocorre durante a infecção pelo Plasmodium, a memória imunológica à infecção é restrita a pacientes residentes em áreas endêmicas. Dessa forma é importante a geração de métodos capazes de induzir uma resposta imune eficaz e duradoura contra o parasito. Nesse contexto o direcionamento de antígenos para células centrais do sistema imune tem se apresentado como uma alternativa promissora. Produzimos e caracterizamos um anticorpo híbrido específico para a molécula DEC205, um receptor endocítico presente nas células dendríticas, acoplado à proteína MSP-1(19) de P. chabaudi, para fins de imunização e análise da resposta imune celular e humoral. Ensaios de imunização mostraram a indução de resposta humoral em camundongos imunizados com anticorpo híbrido e seu controle isotípico, caracterizada pela produção de IgM. Nossos resultados prévios indicam que o direcionamento de antígenos aliado a outras estratégias de imunizações podem resultar na ativação da resposta imune específica ao parasita. / Despite the strong activation of the immune system that occurs during infection by Plasmodium, the immunological memory to infection is restricted to patients residing in endemic areas. Thus it is important to the generation of methods to induce an effective immune response against the parasite. In this context, the targeting of antigens to the central cells of the immune system has emerged as a promising alternative. We produce and characterize a hybrid antibody molecule specific for DEC205, an endocytic receptor present on dendritic cells, coupled to protein MSP-1(19) of P. chabaudi, for immunization and analysis of cellular and humoral immune response. Immunization tests showed the induction of humoral response in mice immunized with hybrid antibody and isotype control, characterized by production of IgM. Our previous results indicate that targeting antigens combined with other strategies for immunization may result in the activation of specific immune response to the parasite.