A malária é uma das prioridades da pesquisa mundial na área de desenvolvimento de vacinas. Apesar da contínua e crescente atividade de pesquisa nessa área, ainda não existe uma vacina capaz de impedir a infecção pelo Plasmodium spp. Devido ao complexo ciclo de vida deste agente, uma formulação vacinal eficaz para a indução de uma resposta imune protetora deverá conter uma combinação de regiões imunodominantes de antígenos do parasita. Portanto, este trabalho visou caracterizar a resposta imune humoral induzida pela imunização experimental de camundongos com o Antígeno 1 de Membrana Apical (AMA-1), região C-terminal da Proteína 1 da Superfície do Merozoíto e a Proteína 3β da Superfície do Merozoíto de P. vivax, administradas isoladamente ou em combinação. As proteínas recombinantes foram purificadas por cromatografia de afinidade e por cromatografia de troca iônica, posteriormente foram analisadas por RP-HPLC confirmando o elevado nível de pureza das amostras. A imunogenicidade dessas formulações foi avaliada em duas linhagens de camundongos BALB/c e C57BL/6, e na presença de dois adjuvantes Quil A e Poly I:C. Os títulos de anticorpos IgG foram determinados por ELISA. Os camundongos C57BL/6 imunizados com a combinação dos antígenos, emulsificados em Quil A ou Poly I:C apresentaram altos títulos de anticorpos (log10>4), assim como os camundongos imunizados com os antígenos administrados individualmente. Em contraste, os camundongos BALB/c imunizados com a combinação dos antígenos apresentaram títulos de anticorpos mais baixos contra a proteína MSP119 ou contra as proteínas MSP119 e AMA-1 quando administradas na presença dos adjuvantes Quil A e Poly I:C, respectivamente. Interessantemente, observamos um aumento significativo nos títulos de anticorpos dos camundongos C57BL/6 imunizados com a combinação dos antígenos emulsificados em Poly I:C contra a proteína MSP3β. A razão entre as subclasses de IgG mostraram um perfil de reposta mista Th1/Th2, em todos os grupos testados. Os anticorpos específicos mantiveram-se elevados por 6 meses após a última imunização, mostrando que a resposta imune induzida pelas imunizações experimentais foi duradoura. Nossos dados, em conjunto, demonstram que a combinação de antígenos pode ser uma estratégia promissora de vacinação contra a malária. / Malaria is one of the priorities of global research in the area of vaccine development. In spite of the continuing and growing research activity in this area, there is still no vaccine to prevent infection by Plasmodium spp. Due to the complex life cycle of this agent, an effective vaccine formulation to elicit protective immune responses should contain a combination of immunodominant regions of parasite antigens. Therefore, this study aimed at characterizing the humoral immune response induced by experimental immunization of mice with Apical Membrane Antigen 1 (AMA-1), C-terminal region of the Merozoite Surface Protein 1 and Merozoite Surface Protein 3β of P. vivax, provided either alone or as a combination. The recombinant proteins were purified by affinity and ion exchange chromatography, subsequently were analyzed by RP-HPLC to confirm the high purity of the samples. The immunogenicity of these formulations was evaluated in BALB/c and C57BL/6 mice, administered in the presence of two different adjuvants, Quil A or Poly I:C. The humoral immune response was measured by IgG antibody titers using ELISA. C57BL/6 mice immunized with the recombinant antigen combination in the presence of Quil A or Poly I:C adjuvants showed high antibody titers (log10>4) similar to mice inject with a single antigen alone. In contrast, BALB/c mice immunized with the recombinant antigen combination had lower antibody titers to MSP119 or to MSP119 and AMA-1 when administered in the presence of Quil A or Poly I:C adjuvants, respectively. Interestingly, we observed a significant increased in the antibody titers of the C57BL/6 mice receiving the combination of antigens against MSP3β protein in Poly I:C. The ratio between the IgG subclasses profile showed a mixed Th1/Th2 response in all groups tested. Specific antibodies were still high six months after the last immunizing dose indicating a long lived immune response. Together, our data show that the combination of antigens may be an effective strategy for immunization against malaria.

O sorodiagnóstico da toxocaríase humana é geralmente baseado na detecção de anticorpos IgG anti-Toxocara spp. em amostras de soro pelo teste ELISA utilizando os antígenos de excreção-secreção de larvas de T. canis (TES). No entanto, observa-se uma ocorrência de reatividade cruzada com outras helmintíases nas áreas endémicas de poliparasitismo. Vários estudos têm mostrado que as glicanas presentes nos antígenos dos helmintos podem ser as responsáveis pela reatividade cruzada. Neste estudo, avaliamos o efeito da deglicosilação dos antígenos TES na sensibilidade e especificidade dos testes de ELISA e Western-blotting para detecção de anticorpos IgG, IgM e IgE. Para a deglicosilação dos antígenos TES, estes foram tratados com diferentes concentrações de hidróxido de sódio (NaOH) ou metaperiodato de sódio (NaIO4) e foram testados 58 amostras de soro de pacientes com toxocaríase visceral, 75 amostras de soros de pacientes com outras helmintíases, e 95 amostras de soro de indivíduos saudáveis. Nossos resultados mostraram que os antígenos TES foram totalmente deglicosilados com NaOH 100mM por 4 horas a 37°C (dTES), enquanto que o tratamento com NaIO4 não gerou bons resultados. A sensibilidade e especificidade dos antígenos TES e dTES na detecção de anticorpos IgG pelo teste de ELISA foi de 100%, com menor reatividade cruzada (5,3%) para os antígenos dTES, se comparada com os antígenos TES (13,3%). Todos os pacientes com toxocaríase mostraram anticorpos IgG contra as cinco frações dos antígenos TES (32, 45, 55, 70 e 120 kDa) e contra a única fração de 26kDa dos antígenos dTES, com sensibilidades e especificidades de 100% para ambos os antígenos. A reatividade cruzada, observada com as frações de 70 kDa, 55 kDa e 32 kDa dos antígenos TES, foi eliminada totalmente quando utilizaram-se os antígenos dTES. A detecção de anticorpos IgM pelo teste de ELISA mostrou reatividade inespecífica nos três grupos estudados, com sensibilidades de 39,7% e 34,5% e especificidades de 95,8% e 96,8%, para os antígenos TES e dTES, respectivamente, porém com ocorrência de reatividade cruzada de 24% e 28% para ambos os antígenos. Os três grupos estudados apresentaram reatividade contra quase todas as frações dos antígenos TES e dTES. A detecção de anticorpos IgE apresentou sensibilidades de 63,79% e 62,07% e uma especificidade de 100%, e uma reatividade cruzada de 26,6% e 53,3% para ambos os antígenos. A maioria dos pacientes com toxocaríase (74,1%) mostraram anticorpos contra as frações de 32, 55 e 70 kDa, em quanto que não houve reatividade nos pacientes com outras helmintíases ou nos indivíduos saudáveis. Estes resultados mostraram que a deglicosilação dos antígenos TES permite reduzir a ocorrência de reatividade cruzada nos pacientes com outras helmintíases, elevando o valor diagnóstico da detecção de anticorpos IgG. No entanto, este procedimento não permite melhorar a sensibilidade e especificidade na detecção de anticorpos IgM e não permite elevar a sensibilidade na detecção de anticorpos IgE pelo teste de ELISA. Por outro lado, os resultados discordantes na especificidade do Western-blotting para a detecção de anticorpos IgG, IgM e IgE sugerem a presença de epítopos conformacionais presentes no estado nativo dos antígenos TES que estariam implicados na reação cruzada observada no teste de ELISA / Serodiagnosis of human toxocariasis is usually based on the detection of anti-Toxocara spp. IgG antibodies in serum samples by ELISA test using T.canis larvae excretory-secretory (TES) antigens. However, a cross-reactivity occurrence is observed in endemic areas of polyparasitism. Many studies have shown that the glycan structures, present in helminth antigens, can be the responsible for the cross-reactivity. In this study, we evaluated the deglycosylation of the TES antigens on the sensitivity and specificity of both the ELISA and Western-blotting for the detection of IgG, IgM, and IgE antibodies. For the deglycosylation of the TES antigens, they were treated with different concentrations of sodium hydroxide (NaOH) or sodium metaperiodate (NaIO4), and 58 serum samples of 58 patients with visceral toxocariasis, 75 serum samples of patients with other helminth infections, and 95 serum samples of healthy individuals. Our results show that the TES antigens were totally deglycosylated with 100 mM NaOH for 4 hours at 37°C (dTES), whereas not good results were obtained with sodium metaperiodate. The sensitivity and specificity of both TES and dTES antigens were 100% in detecting IgG antibodies by ELISA; the cross-reactivity observed with TES antigens (13.3%) was reduced (5.3%) when dTES antigens were used. All toxocariasis patients showed IgG antibodies against the five fractions of TES antigens (32, 45, 55, 70, and 120 kDa), but also with the 26-kDa single fraction of dTES antigens, with sensitivities and specificities of 100% for both antigens. The occurrence of cross-reactivity, observed mainly with the 32-, 55-, and 70 kDa fractions of the TES antigens, was totally eliminated when the dTES antigens were used. The detection of IgM antibodies by ELISA test showed unspecific reactivity in all studied groups, with sensitivities of 39.7% and 34.5%, and specificities of 95.8% and 96.8% for both antigens; the occurrence of cross-reactivity for both antigens were 24% and 28%, respectively. All studied groups have IgM antibodies against almost all fractions of TES antigens and the single fraction of dTES. The detection of IgE antibodies by ELISA test showed sensitivities of 63.8% and 62%, specificities of 100%, and occurrence of reactivity of 26.6% and 53.3% for TES and dTES antigens, respectively. The majority of the toxocariasis patients (74.1%) showed IgE antibodies against the 32-, 55-, and 70 kDa fractions of the TES antigens, whereas there was not reactivity in sera from patients with other helminth infections or healthy individuals. These results showed that the deglycosylation of the TES antigens reduces the occurrence of cross-reactivity in patients with other helminth infections, increasing the diagnostic value for the detection of IgG antibodies. However, this procedure does not improve the sensitivity nor reduces the occurrence of cross-reactivity in the detection of IgM antibodies. Likewise, this procedure does not improve the sensitivity in the detection of IgE antibodies by the ELISA test. On the other hand, the high specificity obtained in the detection of IgG, IgM, and IgE by Western-blotting suggest that conformational epitopes of the TES antigens may also be the responsible for the cross-reactivity in the ELISA test

As células dendríticas (DCs) expressam receptores que reconhecem padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs), sendo capazes de capturar, processar e apresentar antígenos para os linfócitos. O contato com PAMPs induz a maturação das DCs e, consequentemente, a ativação dos linfócitos. Nossa estratégia para desenvolver vacinas é empregar anticorpos monoclonais contra os receptores endocíticos DEC205 e DCIR2, presentes nas subpopulações de DCs, em fusão com o antígeno de interesse. E estimular a maturação delas utilizando os adjuvantes poly I:C, CpG ODN 1826 e flagelina de S. Typhimurium . Imunizamos camundongos selvagens ou knockouts para os receptores TLR 3, 5 e 9 com adjuvantes e anticorpos quiméricos anti-DEC205, anti-DCIR2 ou isotipo controle (Iso) fundidos a proteína MSP119 de Plasmodium vivax. Avaliamos as repostas humoral e celular no grupos imunizados. Os resultados indicam que, seja qual for o adjuvante usado, a maioria dos parâmetros analisados aponta para a superioridade do direcionamento do antígeno para o receptor DEC205. / Dendritic cells (DCs) express receptors that recognize pathogen-associated molecular patterns (PAMPs), and are able to capture, process and present antigens to lymphocytes. In recent years, a immunization strategy that directs antigens to DCs in vivo has been developing. This consists in the use of monoclonal antibodies fused with the antigen of interest. However, effective immune activation occurs mainly when the chimeric antibodies anti-DEC or anti-DCIR2 are administered in the presence of a DC maturation stimulus. We immunized wild type and knockout mice for TLR3, 5 and 9 with adjuvants (poly I:C, CpG ODN 1826 and flagellin from S. typhimurium) and chimeric anti-DEC205, anti-DCIR2 or isotype control fused to the Plasmodium vivax MSP119 protein. After the administration of two doses, we evaluated the humoral and cellular immune responses in the different groups. Our results indicate that, irrespectively of the adjuvant, the majority of parameters analyzed points out to the superiority of antigen targeting to the DEC205 receptor.

Uma biblioteca genômica de T. cruzi, construída no vetor λgt11, foi selecionada com um soro anti-tripomastigota. Dois clones, denominados B12 e B13, foram isolados, verificando-se que expressam proteínas que contém repetições seriadas de 20 aminoácidos (B12) e 12 aminoácidos (B13). Os insertos respectivos foram subclonados e expressos em fusão com β-galactosidase no vetor pMSgt11. A caracterização dos antígenos em T. cruzi foi feita por Western blot, utilizando soros de coelho contra as proteínas de fusão ou anticorpos imuno-selecionados de soros de pacientes chagásicos. Concluiu-se que B12 corresponde a antígenos de 230 kDa e 200 kDa expressos em tripomastigotas e epimastigotas, respectivamente. Anticorpos contra B13 reconheceram antígenos de 140 kDa e 116 kDa nas duas formas evolutivas. A imunoprecipitação de parasitas radioiodados indicou que o antígeno de 140 kDa está localizado na superfície de tripomastigotas, enquanto os demais polipeptídios correspondem a antígenos internos em ambos os estágios evolutivos. As proteínas recombinantes B12 e B13 foram avaliadas no diagnóstico sorológico da doença de Chagas por radioimunoensaio. Foi feito um levantamento com 128 soros, sendo 70 de pacientes chagásicos, 38 de pacientes com outras parasitoses e 20 de indivíduos normais. B12 e B13 obtiveram índices Kappa, que estimam a proporção de acertos verdadeiros, de 0,94 e 0,61, respectivamente. Esses resultados indicam que o antígeno B13 é um candidato potencial para ser empregado no diagnóstico sorológico da doença de Chagas. Os insertos dos clones B12 e B13 foram usados como sondas para o isolamento de clones genômicos de uma biblioteca em λEMBL3.O mapa de restrição de uma região de 32 kb do genoma de T. cruzi indicou que os genes B12 e B13 são contíguos. Em ensaios de Northern blot B12 hibridizou com transcritos de 7,2 e 8,8 kb e B13 com mRNAs de 3,5 e 4,2 kb. O arranjo genômico de B12 e B13, deduzido de Southern blots de DNA e de cromossomos separados por eletroforese de campo pulsado, é compatível com genes de cópia única. A seqüência completa de um gene homólogo a B13 foi previamente descrita por Buschiazzo e cols. (Mol. Biochem. Parasitol, 54: 125-128, 1992), indicando que 75 repetições seriadas de 36 pb estão presentes em um único bloco. A seqüência completa do gene B12 e da região intergênica entre B12 e B13 foi determinada. B12 codifica uma proteína de 223 kDa contendo um domínio de 173 aminoácidos repetido 3 vezes ao longo da proteína e intercalado por blocos contendo um número variável de repetições seriadas de 20 aminoácidos. A estrutura de B12 é peculiar, uma vez que em outros antígenos de T. cruzi clonados as repetições seriadas estão contidas em um único bloco. Uma busca no banco de dados GenBank demonstrou homologia com proteínas ricas em prolina, incluindo a subunidade pesada da proteína triplet de neurofilamento (NF-H)de mamíferos. Um terceiro gene, denominado B11, e que hibridiza com um transcrito de 5,5 kb, foi localizado a cerca de 9,5 kb a montante de B12. Análises de Southem blot, feitas a partir de DNA de T. cruzi digerido com enzimas de restrição ou de cromossomos, demonstrou que B11 apresenta múltiplas cópias dispersas no genoma do parasita. A seqüência nucleotídica de um fragmento de 0,7 kb de B11 revelou homologia, a nível protéico, com o produto de TRS-1, um elemento semelhante a retrotransposon, isolado de T. brucei (Murphy et al.: J. Mol. Biol. , 195: 855-871, 1987). / Characterization of two contiguous antigen genes of Trypanosoma cruzi presenting immunodominant repetitive epitopes A genomic library of T. cruzi in the vector λgt11 was screened with antitrypomastigote serum. Two clones, named B12 and B13, were isolated and shown to express proteins which contain tandemly repeated units of 20 amino acids (B12) and 12 amino acids (B13). lnserts from clones B12 and B13 were subcloned in the vector pMSgt11 and expressed as β-galactosidase fusion proteins. The characterization of T. cruzi antigens coded by recombinants B12 and B13 was performed by Western blot, using either rabbit antisera to the fusion proteins or immunoselected antibodies from chagasic patients. It was concluded that B12 corresponds to antigens of 230 kDa and 200 kDa found, respectively, both in trypomastigotes and epimastigotes, whereas B13 corresponds to polypeptides of 140 kDa and 116 kDa expressed in both evolutive stages. Immunoprecipitation of radioiodinated parasites indicates that the 140 kDa antigen is located on the surface of trypomastigotes, whereas the other polypeptides correspond to internal antigens. B12 and B13 recombinant proteins were evaluated by radioimmunoassay in the serological diagnosis of Chagas\' disease. Analysis of 128 sera from 20 normal individuals, 70 chagasic patients and 38 patients with other parasitoses indicated kappa indexes of 0.94 and 0.61, respectively, for the B12 and B13 proteins. These data indicate that B13 polypeptide is a potential candidate for the diagnosis of Chagas\' disease. The inserts of B12 and B13 were used to isolate genomic clones from a λEMBL3 library. The restriction map of a region of 32 kb from T. cruzi genome indicated that B12 and B13 genes are contiguous. Northern blots showed that B12 corresponds to 7.2 and 8.8 kb mRNAs, whereas B13 hybridizes to transcripts of 3.5 and 4.2 kb. Southern blot analysis of total digested T. cruzi DNA and pulse field-separated chromosomes lead to the conclusion that B12 and B13 correspond to single copy genes. The entire sequence of a gene homologous to B13 was previously reported (Buschinazzo et aI.: MoI. Biochem. Parasitol. , 54: 125-128, 1992), indicating that ca. 75 units of the 36 bp repeat motif are organized in a single cluster. The complete sequence of B12 gene and the intergenic region between B12 and B13 genes were determined. B12 encodes a 223 kDa protein bearing a 173 amino acids motif repeated 3 times along the sequence and intercalated by clusters containing a variable number of tandemly repeated 20 amino acids units. The sequence of B12 gene is peculiar since in other cloned antigen genes of T. cruzi the repeat units are generally located in a single cluster. A search for homology, with the BLAST program, revealed some homology to proline-rich proteins, like mammalian heavy neurofilament subunit (NF-H). A third gene, denominated B11 and hybridizing to a 5.5 mRNA species, was identified 9.5 kb upstream from the 5\' end of B12 gene. Southern blots of digested DNA and pulse field-separated chromosomes hybridized with the B11 probe, indicating that B11 is a multicopy gene distributed in many chromosomes. The nucleotide sequence of a 0.7 kb fragment from B11 was determined and a search in GenBank database, performed with BLAST program, revealed a significant homology at the protein leveI to the product of TRS-l element, a retrotransposon-like sequence of T. brucei (Murphy et aI.:J MoI. Biol., 195:855-871).

A demanda por transfusões sanguíneas tem aumentado no Brasil e o número de doações de sangue permanecem insuficientes. Há escassez de componentes de sangue para transfusão, principalmente de concentrados de células vermelhas do sangue. As células-tronco pluripotentes induzidas humanas (hiPSCs) possuem um grande potencial para se tornar uma fonte de CÉLULAS VERMELHAS DO SANGUE, pois podem se diferenciar em qualquer tipo celular, incluindo CÉLULAS VERMELHAS DO SANGUE de fenótipo específico. O objetivo deste trabalho é a geração de hiPSCs para partir de células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) de candidatos a doação de sangue que possuem fenótipo eritrocitário de baixa imunogenicidade, bem como a diferenciação eritroide das hiPSCs geradas. As amostras de sangue periférico (PB) de 11 indivíduos foram coletadas e caracterizadas quanto ao genótipo para os seguintes antígenos eritrocitários: Sistema Rh (RHCE*01/RHCE*02/RHCE*03/RHCE*04/RHCE*05), Kell (KEL*01/KEL*02), Duffy (FY*01/FY*02 and FY*02N.01), Kidd (JK*01/JK*02) e MNS (GYPB*03/GYPB*04). Outros antígenos de grupos sanguíneos distintos foram determinados por meio de fenotipagem. Duas amostras (PBMCs PB02 e PB12) foram selecionadas para a reprogramação devido ausência de múltiplos antígenos eritrocitários e, portanto, considerados de baixa imunogenicidade. Os PBMCs foram enriquecidos em eritroblastos e em seguida, as células foram transfectadas com os vetores episomais pEB-C5 e pEB-Tg e então, co-cultivados sobre fibroblastos de embriões murinos (MEFs) até o surgimento de colônias semelhantes a hiPSCs (hiPSC PB02 e hiPSC PB12). Estas colônias foram transferidas para condições de cultivo próprias e posteriormente caracterizadas quanto à sua pluripotência. A expressão dos genes de pluripotência OCT4, SOX2 e NANOG demonstrou níveis de expressão maior em comparação às linhagens não pluripotentes. As análises de imunofenotipagem por citometria de fluxo revelaram que em torno de 86% das células expressaram Nanog, 88% Oct4 e 88% Sox2. Os níveis de expressão de genes de pluripotência e marcadores foram consistentes com o estado indiferenciado encontrado em células pluripotentes conhecidas. A análise funcional para avaliação da pluripotência foi realizado pela injeção das hiPScs em camundongos imunodeficientes, demonstrando a formação de teratoma nas linhagens geradas. A metodologia para diferenciação hematopoética das hiPSCs geradas a partir dos corpos embrioides estão em progresso. O potencial de diferenciação foi confirmado durante a padronização deste processo, utilizando ensaio de formação de colônias em metilcelulose. Uma média de 10,5 colônias de precursores eritroide foram obtidas a partir de 50x103 hiPSC PB02 em diferenciação e uma colônia mista (mieloide e linfoide) a partir de 15x103 hiPSC PB12 foram obtidas. Neste trabalho foi possível gerar duas linhagens de hiPSCs com fenótipos de antígenos eritrocitários de interesse que podem ser mantidas em cultura por um longo período (26 passagens) e demonstram um potencial de diferenciação hematopoética. / The demand for blood transfusion has increased in Brazil and the number of blood donations remains insufficient. Therefore, there is a shortage of blood components for transfusion, mainly concentrates of red blood cells (RBCs). Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) have great potential to become a source of RBCs, because they can differentiate into every cellular type, including RBCs of a particular phenotype. The objective of this work was to generate hiPSC from mononuclear cells of peripheral blood (PBMCs) from blood donors who presented low immunogenic phenotype for transfusion, and erythroid differentiation of the generated hiPSCs. Peripheral blood samples from 11 individuals were collected and characterized for the following erythrocyte antigens: Rh system (RHCE*01/RHCE*02/RHCE*03/RHCE*04/RHCE*05), Kell (KEL*01/KEL*02), Duffy (FY*01/FY*02 and FY*02N.01), Kidd (JK*01/JK*02), MNS (GYPB*03/GYPB*04). Additionally, other antigens of different blood groups were determined by phenotyping. The samples PBMC PB02 and PBMC PB12 were chosen for iPS generation due to their multiple negative erythrocyte antigens. They were isolated, expanded into erythroblasts, and transfected using the reprogramming episomal vectors PEB-C5 and PEB-Tg. This population was co-cultured on mouse embryonic fibroblasts (MEFs) until the appearance of hiPSC like colonies (hiPSC PB02 and hiPSC PB12). These colonies were transferred to human embryonic stem cells (hESCs) culture conditions and characterized regarding their pluripotency. The expression of OCT4, SOX2 and NANOG pluripotency genes demonstrated that the expression of both lineages was higher in comparison with non-pluripotent lineages. Immunophenotyping performed by flow cytometry revealed that 86% of cells expressed Nanog, 88% Oct4 and 88% Sox2. Expression levels of pluripotency genes and markers were consistent with undifferentiated state found in known pluripotent cells. Functional analysis for pluripotency was achieved by the hiPSC injection in immunodeficient mice showing that both hiPSC cell lines were able to induce teratoma tumor. The hematopoietic differentiation potential was confirmed using methylcellulose assay, with an average of 10.5 erythroid colonies from 50x103 single cells and a mixed colonies of myeloid and lymphoid cells) and finally a colony composed of white cells from 15x103 PB12 hiPSC. In conclusion, it was possible to generate a hiPSC from a red blood cell phenotype that are negative for multiple antigens, and this cell line can be maintained for a long period in culture (26 passages) and show potential for hematopoietic differentiation.

Apesar de mais de 20 anos de esforço, o design de uma vacina anti-HIV eficaz ainda constitui um enorme desafio. Neste cenário, novas abordagens imunológicas devem ser consideradas. Monócitos de pares discordantes e de indivíduos sadios não expostos ao HIV foram diferenciados in vitro em células dendríticas (DCs), pulsadas com diferentes antígenos do HIV e co-cultivadas com linfócitos autólogos. A resposta imunológica desenvolvida pelos linfócitos T e o perfil fenotípico e funcional das DCs foram avaliados. Todas as DCs utilizadas no co cultivo apresentavam-se maduras e ativadas. Linfócitos estimulados por DC pulsadas com HIV inativado ou proteína p55Gag apresentaram maior ativação, proliferação e produção de IFN<font face=\"Symbol\">&#947 em comparação a linfócitos estimulados por DCs não pulsadas. Entretanto, as células T do grupo controle apresentaram o mesmo padrão de resposta imunológica, com exceção da produção de IFN<font face=\"Symbol\">&#947. Este modelo vacinal pode representar uma alternativa viável e promissora de vacinação terapêutica contra o HIV. / Despite more than 20 years of effort, the design of an effective HIV-1 vaccine remains an enormous challenge. In this scenario, new immunological approaches must be considered. Monocytes from HIV-serodiscordant couples and non HIV exposed controls were differentiated in vitro into dendritic cells (MoDC), pulsed with different virus antigens and cultured with autologous lymphocytes. The T lymphocyte immunological response and the MoDC phenotype and function were determined. MoDCs were shown to be fully matured and activated in all antigen-pulsing protocols. Lymphocytes stimulated by DC pulsed with inactivated HIV or p55Gag protein showed greater activation, proliferation and IFN<font face=\"Symbol\">&#947 production in comparison to those stimulated by non pulsed MoDC. Nonetheless, T cells from non-exposed controls elicited the same response, except for the IFN<font face=\"Symbol\">&#947 production. This MoDC vaccine model may represent a viable and promising alternative of therapeutic vaccination against HIV.

O Monometoxi-polietilenoglicol succinimidil ácido propiônico (mPEG-SPA 5 e 20 kDa) foi analisado como adjuvante e inibidor da atividade neurotóxica da toxina tetânica (TxT) adsorvida ou não em Al(OH)3, à qual o polímero foi conjugado. Avaliou-se a toxicidade das amostras por DL50, demonstrando que a atividade neurotóxica da TxT foi inibida. A via subcutânea foi mais efetiva na indução de resposta à TxT tratada pelo mPEG-SPA e o efeito adjuvante do Al(OH)3 se deu pela intramuscular. Trinta cavalos foram submetidos a esquema de imunização seletiva, dividindo-se os dezoito escolhidos em grupos para imunização com TxT conjugada ao mPEG-SPA 5.000 e 5.000(2X) e TxT adsorvida ou não. Os soros dos cavalos foram analisados por ToBI Teste, que avaliou a evolução da resposta imune. Os soros também foram analisados por imunodifusão, eletroforese e immunoblotting, tendo este indicado uma provável superioridade antigênica da TxT Fluida relativamente aos adjuvantes. A conjugação mPEG-SPA provou ser efetiva na produção do soro antitetânico terapêutico para uso humano. / Monometoxypolyethylene glycol succinimidyl propionic acid (SPA-mPEG 5 and 20 kDa) was analyzed as adjuvant and inhibitor of tetanus toxin neurotoxic activity (TxT) adsorbed or not by Al(OH)3, to which the polymer was conjugated. The samples toxicity was evaluated by DL50, disclosing that TxT neurotoxic activity was inhibited. The subcutaneous inoculation was more effective in induction of response to TxT treated with SPA-mPEG and the adjuvant effect of Al(OH)3 was evidenced by the intramuscular. Thirty horses were submitted to a selective scheme of immunization and eighteen were divided in groups to be immunized with TxT conjugated to SPA-mPEG 5,000 and 5,000(2X) and TxT adsorbed or not. The horses sera were analysed by ToBI Test, which evaluated the immune response development. The sera were also analysed through immunodifusion, electrophoresis and immunoblotting and the last one indicates a probable antigenic superiority of TxT fluid relatively to the adjuvants. The SPA-mPEG conjugation proved to be effective for anti-tetanus human therapeutic serum production.

INTRODUÇÃO: As moléculas HLA são os principais alvos da rejeição nos transplantes de órgãos sólidos. A influência dos anticorpos anti-HLA pré-formados e da compatibilidade HLA no transplante de fígado ainda não está bem definida. A maioria dos transplantes é realizada sem a pesquisa de anticorpos anti-HLA pré-formados e sem pareamento HLA. OBJETIVOS: Avaliar as associações dos anticorpos anti-HLA pré-formados e da compatibilidade HLA à rejeição celular aguda (RCA) em até 90 dias após o transplante. MÉTODOS: Coorte prospectiva de transplantes de fígado ABO compatíveis/idênticos realizados entre janeiro de 2012 e dezembro de 2013. Enxertos que sobreviveram além de 4 dias foram incluídos. A pesquisa de anticorpos anti-HLA classes I e II foram realizadas por meio de ensaios de fase sólida (LABScreen® Mixed e LABScreen® Single Antigen). MFI (Mean Fluorescence Intensity) >= 1.000 foi onsiderado omo positi o para anticorpos anti-HLA. Tipificação HLA-A, B e DR, de receptores e doadores foi feita por meio de PCR (Polymerase Chain Reaction). Conforme o número de alelos HLA incompatíveis, os transplantes foram classificados em compatíveis (0-3 incompatibilidades) e incompatíveis (4-6 incompatibilidades). Apenas episódios de RCA comprovados por biópsia, associados a alterações das provas hepáticas, foram considerados. O critério Banff foi utilizado para diagnóstico e os episódios foram estratificados em leves, moderados e graves. Modelos de regressão de Cox foram realizados e as razões de risco (RR) associadas foram determinadas. Sobrevidas livres de RCA foram obtidas por meio do estimador de Kaplan Meier e comparadas entre os grupos pelo teste log-rank. RESULTADOS: Cento e vinte e nove transplantes foram analisados. Incidência global de RCA em 90 dias foi de 14,7%. A pesquisa de anticorpos anti-HLA pré-formados foi considerada positiva em 35,6% dos transplantes. Em relação à compatibilidade HLA, 91,5% dos transplantes foram classificados como incompatíveis. A sensibilização para anticorpos anti-HLA foi associada a um risco aumentado de RCA (RR=4,3; IC 95%=1,3 - 13,5; p=0,012). De acordo com a classe do anticorpo, observamos que a classe II foi associada a um risco aumentado de RCA (RR=56,4; IC 95%= 4,5 - 709,6; p=0,002). Para anticorpos classe I, foi observada associação marginalmente significante (RR=2,77; IC 95%=0,8 - 8,8; p= 0,08). Uma melhor compatibilidade HLA não foi associada a um risco reduzido de RCA (RR= 0,9; IC 95%=0,2-4; p=0,89). CONCLUSÕES: O presente estudo mostrou que a sensibilização para anticorpos anti-HLA pré-formados om I >= 1.000 está asso iada a um risco aumentado de rejeição celular aguda precoce no transplante de fígado. Anticorpos classe II foram também associados a um risco aumentado de RCA e anticorpos classe I foram tendência. A melhor compatibilidade HLA não foi associada a um risco reduzido de RCA neste estudo. A presença de sensibilização para anticorpos anti-HLA pré-formados poderia servir como marcador de imunorreatividade aumentada contra os enxertos. Isso permitiria ajustes individualizados de imunossupressão / INTRODUCTION: Human leucocyte antigens (HLA) molecules are the main targets of rejection in solid organ transplantation. Significance of anti-HLA preformed antibodies and HLA compatibility remains unclear in liver transplantation. Majority of liver transplants are performed without assessment of preformed anti-HLA antibodies and HLA-matching. OBJECTIVES: Evaluate associations of preformed anti-HLA antibodies and HLA compatibility with acute cellular rejection (ACR) in the first 90 days after transplantation. METHODS: Prospective cohort of ABO-identical/compatible liver transplants between January 2012 and December 2013. Grafts that survived more than 4 days were included. Anti-HLA class I and II antibodies were determined by solid phase assays (LABScreen® Mixed and LABScreen® ingle Antigen). A mean fluores en e intensity ( I) >= 1.000 was considered as positive for anti-HLA antibodies. Recipients and donors HLA typing for HLA-A, B and DR were performed using polymerase chain reaction (PCR) assays. According to HLA mismatches (MM), transplants were divided in compatible (0-3 MM) and incompatible (4-6 MM). Only biopsy proven ACR episodes, associated with abnormal liver tests, were considered. Banff criteria was used for diagnosis of ACR and episodes were graded as mild, moderate and severe. Cox proportional hazards models were performed and associated hazard ratios (HR) were determined. Free ACR rates were estimated with Kaplan-Meier analysis and were compared between groups with the log-tank test. RESULTS: One hundred twenty nine transplants were analyzed. Overall incidence of ACR was 14.7% in 90 days. Assessment of anti-HLA pre-formed antibodies was considered positive in 35.6% of transplants. Regarding HLA compatibility, 91.5% were considered incompatible. Anti-HLA antibodies sensitization was associated with an increased risk of ACR (HR= 4.3; CI 95%=1,3 - 13,5; p=0.012). According to class of antibody, we could observe that class II was associated with an increased risk of ACR (HR=56.4; CI 95%= 4.5 - 709.6; p=0.002). Class I antibodies were considered tendency to increased risk of ACR (HR=2.7; CI 95%= 0.8 - 8.8; p=0,08). A better HLA compatibility was not associated with a lower risk of ACR (HR=0.9; CI 95%=0.2-3.8 p=0.89). CONCLUSIONS: The present study indicates that preformed anti-HLA antibodies with I >= 1.000 are associated with an increased risk of early ACR rejection in liver transplantation. Class II antibodies were also associated with an increased risk of ACR. Class I antibodies were considered tendency. HLA matching had no influence on early acute cellular rejection on this study. Anti-HLA antibodies sensitization could serve as a marker of increased immunoreactivity to the graft. It would serve for tailored immunosuppression

No presente estudo, avaliamos a resposta de anticorpos, por ELISA, contra um recombinante bacteriano baseado no domínio 11 da Proteína Ligação ao Duffy (DBP-RII) em indivíduos naturalmente expostos Plasmodium vivax. Amostras de soro de 160 pacientes com malária vivax, procedentes de duas áreas endêmicas do Estado do Pará (Belém e São Jorge), foram utilizadas neste estudo. Estes soros foram também testados contra outras duas proteínas recombinantes derivadas de merozoítas de P. vívax, para efeito de comparação da resposta de anticorpos: AMA-1 (Antígeno 1 Membrana Apical) e MSP119 (região C-terminal de 19 kDa da Proteína 1 Superfície do Merozoíta). A freqüência de indivíduos que apresentaram anticorpos IgG específicos contra as proteínas recombinantes DBP-RII, AMA-1 e MSP119 foi de 15,6% 50% e 93,1%, respectivamente. Observamos que a proporção de indivíduos que apresentaram anticorpos contra DBP-RII e AMA-1 aumentou de acordo com o maior número de exposições prévias ao P. vivax, enquanto que resposta de anticorpos contra a MSP119 desenvolveu-se rapidamente após uma única exposição ao parasita. A persistência da resposta de anticorpos contra DBP-RII, AMA-1 MSP119 foi avaliada em amostras de soro coletadas durante a infecção patente e dois ou nove meses após o tratamento. Observamos que, durante este período, não houve uma diminuição significativa das freqüências respondedores contra DBP-RII e AMA-1. Por outro lado, a freqüência respondedores contra a MSP119, diminuiu significativamente nove meses após o tratamento. Não observamos diferença significativa entre os títulos anticorpos obtidos contra DBP-RII e AMA-1, durante a infecção e dois ou nove meses após o tratamento, indicando que a resposta de anticorpos se manteve. Por outro lado, os títulos de anticorpos para MSP119 foram significativamente maiores durante a infecção patente do que nove meses após o tratamento. / In the present study, we evaluated by ELISA the antibody immune response to a recombinant protein based on the domain II of the Duffy Binding Protein (DBP-RII) in individuals naturally exposed to Plasmodium vivax. Serum samples from 160 patients with vivax malaria were collected in two endemic areas of State of Pará (Belém and São Jorge). For purposes of comparison, ELISA were also performed using two other recombinant proteins representing antigens derived from P. vivax merozoites: AMA-1 (Apical Membrane Antigen-1) and MSP119 (19kDa C-terminal region of Merozoite Surface Protein-1). The frequency of individuals who presented IgG antibodies specific to the recombinant proteins DBP-RII, AMA-1 or MSP119 were 15.6%, 50% or 93.1 respectively. We observed that the proportions of individuals who presented antibodies against DBP-RII or AMA-1 increased according to the number malaria episodes, while the antibodies response to MSP1 19 developed quickly after a single contact with the parasite. The persistence of antibodies response to DBP-RII, AMA-1 or MSP119 was compared in serum samples during patent infection or two and nine months following treatment. We observed that during this period the frequency responders to DBP-RII and AMA-1 remained similar. In contrast, the frequency of responders to MSP119 dropped significantly nine months after treatment. No difference was observed when we compared the antibody titers obtained DBP-RII or AMA-1 during the infection or after treatment. These results established that the antibodies response to DBP-RII or AMA-1 remained similar two or nine months after treatment. In contrast, the antibody titers to MSP119 were significantly lower nine months after treatment when compared to patent infection.

A agalaxia contagiosa é uma doença de notificação obrigatória que causa severas perdas econômicas para produção de ovinos e caprinos mundialmente. Apesar de seu impacto na produção animal, pouco se sabe sobre os fatores de virulência e patogenicidade do M. agalactiae (principal agente etiológico). Desta maneira, o presente estudo possuiu como objetivo a identificação, purificação e caracterização de proteínas antigênicas de M. agalactiae. Para tanto, quatro proteínas de superfície com potencial antigênico (WP_011949419.1, WP_011949418.1 (P40), WP_011949336.1, WP_011949770.1) foram selecionadas. Essas proteínas foram expressas em Escherichia coli e purificadas em coluna de níquel. As proteínas purificadas foram avaliadas quanto a antigenicidade em Western blotting utilizando soros de caprinos naturalmente infectados com M. agalactiae. Todas as proteínas expressas foram imunorreativas aos soros de caprinos naturalmente infectados, demonstrando que as proteínas utilizadas nesse estudo são possivelmente antigênicas e possuem epítopos acessíveis. / The Contagious agalactia is a notifiable disease that causes severe economic losses to sheep and goats worldwide. Despite its impact on animal production, little is known about the virulence factors and pathogenicity of M. agalactiae (main etiological agent). Thus, the present study identified, purified and characterized antigenic proteins of M. agalactiae. Therefore, four surface proteins with antigenic potential (WP_011949419.1, WP_011949418.1 (P40), WP_011949336.1, WP_011949770.1) were selected. These proteins were expressed in Escherichia coli and purified on nickel column. The purified proteins were assayed for antigenicity by Western blotting using goat sera naturally infected with M. agalactiae. All expressed proteins were immunoreactive with sera from naturally infected goats, demonstrating that the proteins used in this study are possibly antigenics and it have acessible epitopes.