Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The chemotherapeutic busulfan is widely used in studies of spermatogonial stem cells kinetics and studies of male infertility. However it effects on male germ cells in different animal lineages or species are unclear. The objective of this study was to assess the damage caused by busulfan in male mice spermatogenesis of two distinct lineages. The analyzed parameters were the mRNA pattern expression profile of spermatogonial stem cells (SSC) markers, analysis of spermatozoa motility, vigor and morphology, germinal epithelium histology and fertility recovery analysis. The animals received a single dose of 40 mg kg-1 of busulfan or vehicle. Past 30 days of the drug injection, the mice were weighted and anesthetized and had one of the testes and epididymis surgically removed. This procedure did not cause any damage to the other testis, once mice that had one of the testes removed were capable to generate offspring. From these testes, were evaluated the tissue histology and mRNA gene expression of spermatogonial stem cell (SSC) markers. The motility, vigor and spermatozoa morphology were analyzed from cauda epididymal spermatozoa. After 90 days of the drug injection, the mice were weighted, anesthetized and had the other testis removed for the same analyzes procedure. The analysis at 30 and 90 days after drug injection were from the same animals, minimizing the variation in individual response between periods. It was observed that, for Balb/C lineage, independent of the analyzed period, the busulfan treated animals showed a severe testicular degeneration, with loss of SSC, decreased motility and spermatozoa vigor and increased number of defective spermatozoa. In mRNA expression it was observed a marked reduction in Nanos2 expression, and an increase in Gdnf and Plzf gene expression. For animals of Swiss lineage, it was observed that at 30 days after the busulfan injection, the results obtained were similar to that obtained for Balb/C lineage, except in gene expression, which remained unchanged. However, 90 days after the drug injection, these animals show germinal epithelium almost normal, with spermatogenic lineage. They also show an increase in testicular and epididymal mass, spermatozoa motility and vigor and an increase in number of normal spermatozoa, did not differing from the control group. Moreover, this recovery was confirmed by the offspring obtained after matting with virgin females. The male mice utilized in these tests were not submitted to testes removal. These results shows the variation of busulfan effects in two distinct mice lineages, being the drug effective to cause a severe testicular degeneration for more than 90 days in Balb/C lineage, but not in Swiss lineage, due to genetic variations. / Apesar de amplamente utilizado em estudos de cinética das células-tronco espermatogoniais ou em estudos de infertilidade masculina, não se sabe ao certo quais efeitos o quimioterápico busulfan exerce, de fato, sobre as células germinativas masculinas e em diferentes linhagens e espécies animais. Sendo assim, o objetivo deste estudo foi analisar os danos causados pelo busulfan na espermatogênese de camundongos machos de duas linhagens distintas, através do perfil de expressão de RNAm dos marcadores moleculares espermatogoniais, análises de motilidade, vigor e morfologia espermática, histopatologia do epitélio germinativo e teste de recuperação de fertilidade. Os animais receberam uma única dose de 40 mg/kg de busulfan ou do veículo. Após 30 dias da aplicação do fármaco, os camundongos foram pesados, anestesiados e tiveram um dos testículos e epidídimo cirurgicamente removidos. Este procedimento não acarretou dano algum ao outro testículo, uma vez que camundongos que tiveram um testículo e epidídimo removidos foram capazes de gerar prole após o período de recuperação cirúrgica. A partir destes testículos, foram avaliadas tanto características histológicas quanto a expressão de RNA mensageiro de marcadores de células-tronco espermatogoniais (SSC). Outros parâmetros avaliados foram a motilidade, vigor e morfologia espermática, a partir da recuperação dos espermatozoides da cauda do epidídimo. Passados 90 dias da aplicação inicial do fármaco, os camundongos foram novamente pesados e anestesiados, e tiveram o outro testículo removido para as mesmas análises. Sendo assim, as análises referentes aos 30 e aos 90 dias pertencem aos mesmos animais, minimizando a variação da resposta individual entre os períodos analisados. Foi observado que para a linhagem Balb/C, independente do período analisado, os animais tratados com busulfan apresentaram uma severa degeneração testicular, com perda de célulastronco espermatogoniais, diminuição de motilidade e vigor espermáticos e aumento no número de espermatozoides defeituosos. Com relação à expressão gênica, foi observada uma marcada redução na expressão do gene Nanos2, e aumento da expressão dos genes Gdnf e Plzf. Para os animais da linhagem Swiss, foi observado que aos 30 dias após a aplicação do fármaco, os resultados foram semelhantes aos obtidos para a linhagem Balb/C, com exceção da expressão gênica, a qual não apresentou variação. Porém, noventa dias após a administração do fármaco, esses animais apresentaram epitélio germinativo quase normal, com linhagem espermatogênica, aumento na massa testicular e epididimal, aumento na motilidade e vigor espermáticos e aumento na quantidade de espermatozoides normais, não diferindo dos animais do grupo controle. Além disso, essa melhora foi comprovada através da obtenção de prole após o acasalamento com fêmeas virgens, sendo que os machos utilizados neste teste não foram submetidos ao processo de remoção dos testículos. Esses resultados demonstram a variação do efeito do busulfan em duas linhagens distintas de camundongos, sendo o fármaco eficiente para causar degeneração testicular severa por mais de 90 dias na linhagem Balb/C, porém não na linhagem Swiss, provavelmente devido as variações genéticas entre as duas linhagens.

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2012-07-18T21:46:22Z No. of bitstreams: 1 Fernanda Oliveira Novais Avaliacao do papel....pdf: 2271339 bytes, checksum: eee5aa084065678cf55651296f356919 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-07-18T21:46:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fernanda Oliveira Novais Avaliacao do papel....pdf: 2271339 bytes, checksum: eee5aa084065678cf55651296f356919 (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, Bahia, Brasil / Linfócitos T CD8+ são células do sistema imune adaptativo capazes de induzir a morte de células infectadas através de mecanismos citotóxicos. No modelo de infecção intradérmica por Leishmania revelou-se que os linfócitos T CD8+ são responsáveis tanto pela indução de patogênese bem como pela imunidade contra a infecção primária por L. major. Até o momento, o papel dos linfócitos T CD8+ não foi estudado na infecção experimental por L. braziliensis. Neste estudo, investigamos o recrutamento dos linfócitos T CD8+ para o sítio de infecção e determinamos a sua função. Cinco semanas após a infecção intradérmica por L. braziliensis, camundongos BALB/c apresentaram um aumento na porcentagem de linfócitos T CD8+ presentes na orelha infectada e estes produziram, principalmente, IFN-g e Granzima B. Já no linfonodo de drenagem, estas células não produzem granzima mas, sim, IFN-g e TNF-a. Utilizando o mesmo modelo de infecção, camundongos BALB/c ou C57BL/6 depletados de linfócitos T CD8+ ou camundongos deficientes em b2-microglobulina ou em CD8 apresentaram redução no tamanho da lesão ao longo da infecção e menor carga parasitária cinco semanas após a infecção. A depleção de linfócitos T CD8+ não induziu qualquer alteração no recrutamento e produção de IFN-g, TNF-a e IL-10 pelos linfócitos T CD4+ no sítio de infecção ou no linfonodo de drenagem. Além disso, a capacidade proliferativa ou a produção de citocinas específicas in vitro após estímulo com células dendríticas infectadas por L. braziliensis não sofreram alteração. A ausência de linfócitos T CD8+ após a 8 infecção por L. braziliensis também não alterou o recrutamento de monócitos inflamatórios nem a sua diferenciação em células dendríticas. Por último, a análise histológica e de citometria de fluxo mostrou aumento no recrutamento de neutrófilos para o sítio de infecção e este resultado pode ser correlacionado com o controle da doença. Para confirmar o envolvimento dos linfócitos T CD8+ no desenvolvimento de lesão por L. braziliensis, transferimos linfócitos T CD8+ de camundongos naïve ou imunes, bem como linfócitos T CD4+ somente ou linfócitos T CD8+ e T CD4+ para camundongos RAG-/-. Neste contexto, a transferência de linfócitos T CD8+ naïve ou imunes induziu uma intensa patologia no sítio de infecção bem como a disseminação de parasitas para outros sítios, como a orelha não infectada, pata e nariz. Camundongos RAG-/- controle e aqueles que receberam linfócitos T CD8+ naïve ou imunes apresentam a mesma quantidade de parasitas no sítio de infecção, embora o aspecto da lesão tenha sido muito diferente. A transferência de linfócitos T CD4+ foi capaz de controlar a carga parasitária nestes animais e o mesmo foi observado após transferência de linfócitos T CD4+ e T CD8+ em conjunto. Nestes animais não observamos lesões em outros sítios, indicando que os linfócitos T CD8+ contribuem para a disseminação dos parasitas. Por último, transferimos linfócitos T CD8+ provenientes de camundongos selvagens ou deficientes de IFN-g e perforina e observamos que, na ausência de perforina, a patologia e a disseminação parasitária são controladas. Portanto, este estudo sugere envolvimento dos linfócitos T CD8+ na patogênese induzida por L. braziliensis devido ao seu potencial citotóxico e, em paralelo, inibindo o recrutamento de neutrófilos para o sítio de infecção. / CD8+ T lymphocytes are part of the adaptive immune system and are considered cytotoxic because of their ability to induce death in infected cells. Using the intradermal model of Leishmania infection, it has been shown that CD8+ T cells play an essential role in both pathogenesis and immunity to primary infection with L. major in the skin. So far, the role of these lymphocytes in the experimental model of infection using L. braziliensis has not been evaluated. In this study we determined the recruitment and function of these cells upon infection with L. braziliensis. Five weeks after infection, the frequency of CD8+ T cells was increased in the dermal site and these cells produced mainly IFN-g and granzyme B in infected mice. In the draining lymph nodes, these cells produced high levels of IFN-g and TNF-a, but not granzyme B. Using the same intradermal model of infection, we analysed the outcome of infection in the absence of CD8+ T lymphocytes using both antibody depletion in BALB/c and C57BL/6 mice and mice deficient in b2- microglobulin and CD8. In all groups, the absence of CD8+ T cells was correlated with better control of lesion development and parasite load in both depleted BALB/c and in b2-microglobulin deficient mice. In the absence of CD8+ T cells, CD4+ T lymphocytes were recruited to the same extension and produced same levels of IFN-g, TNF-a and IL-10 both in the infected ear and in draining lymph nodes when compared to infected mice that were not depleted. Also, there was no change in the proliferative potential and in IFN-g production by these cells after re-stimulation with infected dendritic cells. Analysis of inflammatory monocyte recruitment and differentiation of these cells into dendritic cells were similar in both depleted and non-depleted mice. On the other hand, histological and flow cytometric analyses showed increased neutrophil recruitment to the site of infection and this can be correlated with disease control. To confirm the role of CD8+ T cells in the lesion development of L. braziliensis infected mice, we then transferred CD8+ T cells from naïve or immune mice, as well as CD4+ T cells alone or together with T CD8+ to RAG deficient mice. The transfer of CD8+ T cells from immune or naïve mice into RAG recipients induced an intense pathology upon infection with L. braziliensis in the infection site, but also in uninfected tissues such as the uninfected ear, nose and footpad. Evaluation of parasite numbers in the infected ear showed that RAG deficient mice without T cells and those transferred with CD8+ T cells from naïve or immune mice had similar number of parasites although the pathology was very different. The transfer of CD4+ T cells alone or in association with CD8+ T cells induced parasite control in the infection site. In these mice, we could not detect lesions in other sites and we concluded that the transfer of CD8+ T cells alone induces parasite dissemination in RAG deficient mice. Finally, the transfer of CD8+ T cells from perforin deficient mice led to control in lesion development and in parasite dissemination. In this study we can conclude that CD8+ T cells are involved in the pathogenesis of L. braziliensis due to their cytotoxic potential and by inhibiting neutrophil recruitment to the infection site.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The study concerning the lifelong dynamic of undifferentiated cell populations present in the organism expanded the therapeutics frontiers aiming to healing several kinds of wounds and diseases. Different cell populations have been used for this purpose, as those derived from pre-implantation embryos, called embryonic stem cells (ESC); those derived from pluripotent somatic cells niches, responsible for organic regeneration throughout life, named adult stem cells (ASC); and cells derived from the bone marrow mononuclear fraction (BMNC), which has ASC and hematopoietic lineage cells at different stages of differentiation. Important barriers have been overcome aiming to elucidate benefits and risks inherent to cell therapy. However, the knowledge derives from an evolution process fraught with doubts, and there are many things to be unveiled for safe exploration of different kinds of cell therapy, mainly when allogeneic cells are used. Toxoplasmosis is an opportunistic zoonosis caused by the protozoan Toxoplasma gondii, which has a worldwide distribution and affects about a third of the human population. In the acute infection, T. gondii tachyzoites spread up and multiply themselves into host cells. Immune response leads to evasion of the protozoan in tissue cysts of (semi-latent) bradyzoites, mantaining the chronic infection of the host. Immunosuppression, as used in conditioning for allogeneic cells transplantation, is a risk factor for toxoplasmosis reactivation in chronically infected hosts. The studies presented in this thesis were performed aiming to contribute with: a. methods used for molecular detection of allogeneic cells after systemic transplantation by endovenous injection, allowing to mapping the organic distribution and the fate of these cells in recipient body; and b. understanding about interrelationships among conditioning (pharmacological immunosuppression) for transplantation, allogeneic cell therapy with BMNC and toxoplasmosis reactivation in chronically infected hosts. The study described in the Chapter 1 shows a nested-PCR test with increased sensitivity and assurance for molecular diagnosis of presence or absence of male mice cells in body fluids and tissues of female recipients after intravenous transplantation. This method, based on detection of specific DNA fragment from the Y chromosome, was effective for cells from two distinct populations: BMNC and in vitro cultured cells derived from adipose tissue. Therefore, this method can be suitable for other cell types. The study presented in the Chapter 2 shows the effects caused by an immunosuppressive pharmacological regimen with high doses of busulfan and cyclophosphamide (PCT), followed by allogeneic BMNC transplantation in a model of chronic toxoplasmosis in mice. This study was divided in three subsequent steps: I. experimental infection with type II cystogenic strain of T. gondii (ME-49) and characterization of acute and chronic toxoplasmosis; II. evaluation of the pharmacological immunosuppression effects in female Balb/c; and III. evaluation of the effects resulting from transplantation of male mice BMNC to recipient females. The pharmacological immunosuppression caused worsening of the general clinical condition of the animals and high mortality rates. This effect occurred remarkably earlier in animals chronically infected with T. gondii, showing the high risk of the combination between persistent toxoplasmosis and pharmacological immunosuppression in conditioning for allogeneic transplantation. This study showed the safety of the allogeneic BMNC transplantation in female Balb/c independently of the infection by T. gondii, provided that they have not been subjected to conditioning regimen before transplantation. In the Chapter 3, a pharmacological immunosuppressive regimen, with reduced doses of busulfan and cyclophosphamide (PCTrd), was tested as an alternative to minimize conditioning regimen inherent risks in mice chronically infected with T. gondii and submitted to allogeneic transplantation of BMNC. This study was also divided in three sequential steps: I. oral infection of female Balb/c with tissue cysts of T. gondii (cystogenic VEG strain) and monitoring over a 120 days period (chronic toxoplasmosis); II. evaluation of conditioning regimen effects using reduced doses of busulfan and cyclophosphamide (PCTrd); III. endovenous transplantation of allogeneic BMNC from male donors to the female Balb/c. The results showed the safety of the PCTrd for use in female Balb/c chronically infected with T. gondii. Reduced doses of busulfan and cyclophosphamide (PCTrd) resulted in lower incidence and intensity of clinical signs and absence of mortality, in contrast to results that were observed with high doses (PCT) recommended for myeloablation. Transplantation of allogeneic bone marrow-derived mononuclear cells from male donors was safe in the short term for female Balb/c mice submitted to PCTrd regardless of persistent infection by T. gondii. / O estudo da dinâmica das populações celulares indiferenciadas, presentes no organismo ao longo da vida, ampliou a fronteira de alternativas para o tratamento de vários tipos de lesões e de doenças. Diversas populações celulares têm sido usadas para isso, como as derivadas de embriões em fase de pré-implantação, denominadas células-tronco embrionárias (CTE); as derivadas de nichos de células somáticas pluripotentes, responsáveis pela regeneração dos tecidos orgânicos ao longo da vida, chamadas de células-tronco adultas (CTA); e as células da fração mononuclear da medula óssea (CFMO), que conta com CTA e células da linhagem hematopoiética em variados estágios de diferenciação. Importantes obstáculos têm sido superados no que se refere ao conhecimento de benefícios e de riscos inerentes à terapia celular. Contudo, a construção do conhecimento é permeada de dúvidas e há muito a ser desvendado para que se possam explorar com segurança as potencialidades das terapias celulares, especialmente usando células alogênicas. A toxoplasmose é uma zoonose oportunista causada pelo protozoário Toxoplasma gondii, que apresenta distribuição mundial e acomete cerca de um terço da população humana. Na fase aguda da infecção, taquizoítos de T. gondii disseminam-se e multiplicam-se nas células hospedeiras. A resposta imune induz a evasão do protozoário em cistos teciduais de bradizoítos (forma de semilatência), mantendo o hospedeiro cronicamente infectado. A imunossupressão, como a utilizada no pré-condicionamento para transplante de células alogênicas, é um fator de risco de reativação da toxoplasmose em portadores crônicos. Na presente tese, são apresentados estudos realizados com objetivo de contribuir com: a. métodos de detecção molecular de células alogênicas após o transplante sistêmico pela via endovenosa, permitindo o mapeamento da distribuição e do destino destas células no organismo receptor; e b. compreensão das inter-relações envolvendo pré-condicionamento (imunossupressão farmacológica) para o transplante, terapia celular alogênica com CFMO e reativação da toxoplasmose em portadores crônicos. No Capítulo 1 demonstra-se uma nested-PCR que aumenta a sensibilidade e a segurança do diagnóstico molecular de presença ou ausência de células de camundongos machos em fluidos e tecidos de receptoras fêmeas após transplante endovenoso. O método, que envolve a detecção de fragmento de DNA específico do cromossomo Y, foi eficaz para células de duas populações distintas: CFMO e células cultivadas in vitro derivadas do tecido adiposo. Portanto, o método pode ser útil para outros tipos celulares. O estudo apresentado no Capítulo 2 demonstra os efeitos de um protocolo de imunossupressão farmacológica com altas doses de busulfan e ciclofosfamida (PCT), seguido do transplante alogênico de CFMO em um modelo de toxoplasmose crônica em camundongos. Esse estudo foi dividido em três etapas subsequentes: I. infecção experimental com cepa cistogênica do tipo II de T. gondii (ME-49) e caracterização da toxoplasmose aguda e crônica; II. avaliação dos efeitos da imunossupressão farmacológica nas fêmeas Balb/c; e III. avaliação dos efeitos do transplante de CFMO de camundongos machos para as fêmeas receptoras. A imunossupressão farmacológica provocou agravamento do quadro clínico geral dos animais e altas taxas de mortalidade. Esse efeito foi notavelmente precoce nos animais cronicamente infectados por T. gondii, demonstrando o alto risco da combinação entre toxoplasmose persistente e imunossupressão farmacológica na preparação para o transplante alogênico. Demonstrou-se a segurança do transplante alogênico de CFMO em fêmeas Balb/c infectadas ou livres de infecção por T. gondii, desde que não tenham sido submetidas ao protocolo de pré-condicionamento para o transplante. No Capítulo 3, um regime de imunossupressão farmacológica com doses reduzidas de busulfan e ciclofosfamida (PCTdr) foi testado como alternativa para minimizar os riscos inerentes ao pré-condicionamento em camundongos cronicamente infectados com T. gondii e submetidos ao transplante alogênico de CFMO. Esse estudo também foi dividido em três etapas sequenciais: I. infecção oral de fêmeas Balb/c com cistos teciduais de T. gondii (cepa VEG, cistogênica) e monitoramento durante um período de 120 dias (toxoplasmose crônica); II. avaliação dos efeitos do regime de pré-condicionamento, com doses reduzidas de busulfan e ciclofosfamida (PCTdr); III. transplante alogênico endovenoso de CFMO de doadores machos para as fêmeas Balb/c. Os resultados demonstraram a segurança do PCTdr para uso em Balb/c fêmeas cronicamente infectadas com T. gondii. Doses reduzidas de busulfan e ciclofosfamida (PCTdr) resultaram em menor incidência e intensidade de sinais clínicos e ausência de mortalidade, em oposição ao ocorrido com as altas doses (PCT) recomendadas para mieloablação. O transplante alogênico de células mononucleares da medula óssea de doadores machos foi seguro no curto prazo em fêmeas Balb/c submetidas ao PCTdr, independentemente de infecção persistente pelo T. gondii.

A pandemia de AIDS é um dos principais problemas de saúde pública no mundo e demanda o desenvolvimento de uma vacina eficaz. Uma abordagem vacinal ideal, baseada em resposta celular contra o HIV-1, deveria induzir uma resposta imune mediada tanto por células T CD4+ quanto CD8+. A diversidade genética do HIV-1 é uma grande preocupação para o desenvolvimento de uma vacina e sequências consenso têm sido utilizadas a fim de contornar a barreira imposta por essa diversidade. A escolha apropriada dos antígenos a comporem as construções vacinas também é relevante, visto que proteínas como Gag e Vif têm se mostrado bastante imunogênicas, enquanto alguns trabalhos têm demonstrado que Env possui características imunossupressoras e que respostas celulares contra esse antígeno podem ser danosas aos indivíduos vacinados. Nosso grupo demonstrou que uma vacina de DNA (HIVBr18) codificando 18 peptídeos para linfócitos T CD4+, promíscuos (capazes de se ligarem a múltiplas moléculas HLA-DR) e conservados na sequência consenso do subtipo B do HIV-1 foi capaz de induzir uma resposta celular ampla, polifuncional e de longa duração em camundongos BALB/c e transgênicos para moléculas HLA. Neste trabalho identificamos 34 peptídeos potencialmente reconhecidos por linfócitos T CD4+, promíscuos e conservados na sequência consenso dos consensos do grupo M do HIV-1. Uma vacina de DNA (HIVBr27) codificando 27 dos 34 peptídeos (exceto os 7 peptídeos de Env identificados) induziu uma resposta mais ampla e de maior magnitude que a vacina HIVBr18 em camundongos BALB/c. Além disso, a vacina HIVBr27 induziu maior frequência de linfócitos T CD4+ e CD8+ polifuncionais, capazes de proliferar e produzir as citocinas IFN-gama e TNF-alfa. Desenvolvemos também uma vacina de DNA (HIVenv7) codificando os 7 peptídeos de Env do HIV-1 identificados. A co-imunização de HIVenv7+HIVBr27 reduziu a amplitude da resposta celular contra peptídeos codificados pela vacina HIVBr27. Além disso, a co-imunização reduziu a magnitude da resposta e a frequência de linfócitos T CD4+ e CD8+ polifuncionais contra o pool de 27 peptídeos codificados por essa vacina. A vacina HIVBr27, desenhada para induzir uma resposta de linfócitos T CD4+ ampla e intensa contra peptídeos promíscuos e conservados da sequência consenso dos consensos do grupo M do HIV-1, é mais imunogênica e mais completa que a vacina HIVBr18, tendo potencial de conferir, em grande cobertura populacional, imunidade contra os diversos subtipos circulantes do vírus. O fenômeno observado na co-imunização com HIVenv7 sugere que a inclusão do envelope em imunógenos contra o HIV-1 possa ser prejudicial. Por outro lado, isto faz desse plasmídeo um alvo promissor para terapias imunológicas que visem indução de imunossupressão / The AIDS pandemic is a worldwide major public health problem and requires the development of an effective vaccine. An ideal vaccine approach based on cellular immune responses against HIV-1 should induce an immune response mediated by both CD4+ and CD8+ T cells. HIV-1 genetic diversity is a major concern for developing a vaccine and consensus sequences have been used to circumvent the barrier posed by this diversity. The appropriate choice of antigens to compose the vaccines is also relevant, since proteins such as Gag and Vif have been shown to be immunogenic, while some studies have shown that Env has immunosuppressive characteristics and cellular responses against this antigen can be harmful to vaccinated individuals. Our group has demonstrated that a DNA vaccine (HIVBr18) encoding promiscuous multiple HLA-DR binding, conserved B-subtype HIV-1 CD4+ T cell epitopes was able to induce a broad, polyfunctional and long lasting T cell response in BALB/c and HLA transgenic mice. In this work we identified 34 promiscuous and conserved sequences within the group M HIV-1 consensus of the consensus sequence, potentially recognized by CD4+ T cells. A DNA vaccine (HIVBr27) encoding 27 of the 34 peptides (except the 7 Env identified peptides) induced a broader and higher magnitude T cell response than HIVBr18 vaccine in BALB/c mice. Moreover, the vaccine HIVBr27 induced a higher frequency of polyfunctional CD4+ and CD8+ T cells, able to proliferate and produce the cytokines IFN-gama and TNF-alfa. We also developed a DNA vaccine (HIVenv7) encoding the 7 HIV-1 Env identified peptides. Co-immunization with HIVenv7+HIVBr27 reduced the breadth of the cellular immune response against the HIVBr27 encoded peptides. Besides, co-imunization reduced the magnitude of the response and the frequency of polyfunctional CD4+ and CD8+ T cells against the pool of 27 peptides encoded by this vaccine. The HIVBr27 vaccine, designed to induce a broad and intense CD4+ T cell response against promiscuous and conserved peptides within the group M HIV-1 consensus of the consensus sequence, is more immunogenic and more complete than the vaccine HIVBr18, having the potential to provide, with wide population coverage, immunity against various circulating subtypes of the virus. The phenomenon observed in the co-immunization with HIVenv7 suggests that the inclusion of the envelope in immunogens against HIV-1 may be harmful. On the other hand, these results suggest that HIVenv7 is a promising target for immune therapies aimed at inducing immunosuppression

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:13:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Debora_G_Melo.pdf: 804977 bytes, checksum: 2854d8486722eba4b2703a8a3bd9eab0 (MD5) Previous issue date: 2008-08-14 / The objective of this work was to obtain new isolates of N. caninum and characterize the same pathogenically. In Nerópolis (Goiás, Brazil), two Holstein-Friesian male calves, aged four months, positive for indirect immunoflourescence for Neospora with a titre of 1:400 and 1:800 were utilized for the isolation. Two new isolates, NC- Goiás 1 and NC-Goiás 2, were obtained. NC-Goiás 2 was discarded, however, due to fungal contamination. In addition to characterization of isolate NC-Goiás 1, pathogenic characterizations were done for six Spanish isolates in female mice of the lineage Balb/c. Symptomatology and mortality caused by the isolates, parasitaemia, detection of parasite DNA in the brain and lungs were verified, as well as parasite load in the brain throughout the experiment. Further, the development of humoral immune response of the animals was verified. Statistical analysis was carried analysing the effect of isolate and the infection phase. Differences between percentages encountered through nested-PCR were analysed using the Chi-square test. When significant differences were observed (P<0,05), the groups were compared two by two. The difference between parasite loads, optical density values for IgG1, IgG2a and the relation IgG1/IgG2a between the isolates were analysed by the Kruskal-Wallis test. When statistically significant differences were observed (P<0,05), the groups were compared two by two using the Mann-Whitney U test. In blood and lungs, the parasite was detected mainly in the acute phase (P<0,05). The DNA of N. caninum was also detected in the brain mainly in the chronic phase (P<0,05). On comparing parasite loads between isolates, statistically significant differences were observed between them in the chronic phase (P< 0,05). Antibodies of class IgG1 and IgG2a were detected starting from day 16 P.I. and 4 P.I. respectively, increasing gradually and remaining high until day 64 P.I. An analysis of the relation IgG1/IgG2a demonstrated predominance of IgG2a on day 8 e 16 P.I. and highest levels of IgG1 were detected on day 32 and 64 P.I. The isolate NC-Goiás 1 is the first isolate obtained in Goiás and the first obtained from an infected calf, though clinically healthy, reported from South América. These results are the first of a study of the diversity of the protozoon, N. caninum, and indicate that these isolates are of low pathogenicity in mice as compared with other known isolates / A neosporose bovina foi reconhecida inicialmente em 1989 e a partir de seu reconhecimento e descrição da nova espécie Neospora caninum, a neosporose emergiu como uma séria enfermidade de bovinos e cães. Este trabalho teve como objetivo obter novos isolados de N. caninum e realizar a caracterização patogênica dos mesmos. Em Nerópolis (Goiás, Brasil) dois bezerros machos de quatro meses de idade, da raça Holandês, positivos por Imunofluorescência indireta para Neospora com título de 1:400 e 1:800, foram utilizados para isolamento. Dois novos isolados denominados NC-Goiás 1 e NC-Goiás 2 foram obtidos porém, o isolado NC-Goiás 2 foi perdido devido a contaminação por fungos. Além da caracterização do isolado NC-Goiás 1 foram feitas caracterizações biológicas de seis isolados espanhóis em camundongos fêmeas, da linhagem BALB/c. Foi verificada a sintomatologia e mortalidade provocada pelos isolados, a parasitemia, detecção de DNA do parasito no cérebro e pulmão e determinada a carga parasitária no cérebro ao longo do experimento. Além disso, também se verificou o desenvolvimento da resposta imune humoral dos animais. A análise estatística foi realizada para verificar a influência do isolado e a fase da infecção. As diferenças entre as porcentagens encontradas pela nested-PCR foram analisadas aplicando o teste de Qui-quadrado. Quando observadas diferenças estatisticamente significativas (P<0,05), os grupos foram comparados dois a dois. A diferença entre as cargas parasitárias, valores de densidade óptica para IgG1, IgG2a e a razão IgG1/IgG2a entre os isolados foram analisadas pela prova de Kruskal-Wallis. Quando observadas diferenças estatisticamente significativas (P<0,05), os grupos foram comparados dois a dois pelo teste de U de Mann-Whitney. No sangue e pulmão o parasito foi detectado principalmente na fase aguda (P<0,05). Quanto ao cérebro, foi detectado DNA de N. caninum principalmente na fase crônica (P<0,05). Ao comparar as cargas parasitárias entre os isolados, foram observadas diferenças estatisticamente significativas na fase crônica (P< 0,005). Anticorpos da classe IgG1 e IgG2a foram detectados a partir do dia 16 P.I. e 4 P.I. respectivamente, aumentando gradualmente e se mantendo elevados até o dia 64 P.I. A análise da relação de IgG1/IgG2a mostrou predominância de IgG2a nos dias 8 e 16 P.I. e os níveis de IgG1 mais elevados foram detectados nos dias 32 e 64 P.I. O isolado NC-Goiás 1 é o primeiro isolado de N. caninum obtido em Goiás e o primeiro isolado obtido de um bezerro infectado porém clinicamente saudável relatado na América do Sul. Esses resultados são o início do estudo da diversidade do protozoário N. caninum e indicam que esses isolados são de baixa patogenicidade em camundongos quando comparados com outros isolados conhecidos

A paracoccidioidomicose (PCM) é uma doença sistêmica de caráter granulomatoso, causada pelo fungo termodimórfico Paracoccidioides spp. A PCM é endêmica na America Latina e aproximadamente 80% do pacientes vivem no território brasileiro. O tratamento medicamentoso é eficiente, entretanto, é longo e vários pacientes acabam abandonando e recidivas são comuns neste grupo. A utilização de uma vacina terapêutica poderia resultar na redução do tempo de tratamento assim como, recuperar a resposta imune do hospedeiro frente ao fungo. As vacinas de DNA são uma abordagem promissora na imunoterapia e podem ser injetadas por via intramuscular, intradérmica ou via mucosa. As proteínas de choque térmico (HSPs) são proteínas que estão ligadas a homeostase celular e também possuem efeitos imunológicos em diversos casos como doenças infecciosas e autoimunes. No presente trabalho, analisamos o esquema vacinal terapêutico em camundongos BALB/c previamente infectados intratraquealmente com 3x105 leveduras de P. brasiliensis Pb18, 60 dias depois, submetidos a imunização com pcDNA3 contendo sequências codificadoras de PbHSP60 e/ou IL-12 murina e/ou vetor vazio. Foi observada redução significativa no número de unidades formadoras de colônia (UFCs) nos pulmões de camundongos imunizados com PbHSP60. Os grupos que receberam PbHSP60+pcDNA3 vazio ou PbHSP60x2 apresentaram os maiores índices de redução da cargas fúngicas. A inclusão do plasmídeo contendo o inserto de mIL-12, resultou em um efeito deletério. A análise dos cortes histológicos indicou que os animais vacinados apresentavam áreas bem preservadas e com poucos ou nenhum foco de granuloma. Detectamos um perfil de citocinas típico Th1/Th2. Nossos resultados sugerem que a imunização utilizando plasmídeo contendo o inserto HSP60, tem grande potencial vacinal / The paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic granulomatous disease of character, caused by the thermally dimorphic fungus Paracoccidioides spp. The PCM is endemic in Latin America and approximately 80% of patients are living in Brazil. The medical treatment is effective, however, is long and many patients end up abandoning and relapses are common in this group.The use of a therapeutic vaccine could result in the reducing time of treatment as well as recover the host immune response against the fungus. DNA vaccines are a promising approach for immunotherapy and can be injected by intramuscular, intradermal, or mucosal route. The heat shock proteins (HSPs) are proteins that are linked to cellular homeostasis and also have immunological effects in many cases as infectious and autoimmune diseases. In the present study, we analyzed the therapeutic vaccine schedule in BALB/c mice previously infected intratracheally with 3x105 yeast of P. brasiliensis strain 18, and 60 days after, undergoing immunization with pcDNA3 containing coding sequences PbHSP60 and / or murine IL-12 and / or empty vector. Significant reduction was observed in the number of colony forming units (CFU) in the lungs of mice immunized with PbHSP60. The groups that received empty pcDNA3 and PbHSP60 or PbHSP60x2 have higher rates of reduced fungal loads. The inclusion of the plasmid containing the insert mIL-12 resulted in a deleterious effect. The analysis of histological sections indicated that vaccinated animals had wellpreserved, with few or no focus of granuloma areas. It was detected a profile typical Th1/Th2 cytokines. Our results suggest that immunization using plasmid containing the insert HSP60 vaccine has great potential

Estudamos o efeito do tratamento com salbutamol em dois regimes: diário (DS) e administrado a intervalos de 96 horas (IS) em camundongos balb/c sensibilizados com injeções intraperitoneais de uma solução de ovoalbumina (OVA) adsorvida em hidróxido de alumínio, e desafiada com inalações de ovoalbumina a 1%. O grupo controle SAL recebeu injeções i.p. de salina e desafios inalatórios de sallina. A partir do 34o dia, os animais OVA foram tratados com salbutamol via inalatória 10 mg/ml durante 15 minutos nos dois regimes descritos. Os animais foram sacrificados no 60o dia, que corresponde a 48 horas após o último desafio antigênico. Após os camundongos serem anestesiados com pentobarbital sódico via i.p., eles foram traqueostomizados e entubados e sacrificados com secção da Aorta abdominal. Então, procedeu-se com a coleta do lavado broncoalveolar para a quantificação de leucócitos. Coletamos os tecidos pulmonares para a avaliação do processo inflamatório por quantificação de células linfomononucleares (LMN) e eosinófilos EPO+, essa última com marcação citoquímica. Além disso, estudamos a influência do tratamento adrenérgico sobre o IgE anafilático. O modelo de inflamação (grupo OVA) produziu significativo aumento do número de células totais, de eosinófilos e de neutrófilos observados na avaliação de lavado broncoalveolar. Além disso, houve nesse grupo processo inflamatório na parede de vias aéreas, caracterizada por um infiltrado linfomononuclear e com presença de eosinófilos. O nosso processo de indução de inflamação também recrutou eosinófilos para o septo alveolar. O tratamento com salbutamol diário produziu uma queda significativa do processo inflamatório no BAL, principalmente de neutrófilos e eosinófilos, enquanto que o tratamento intermitente produziu redução significativa apenas de neutrófilos. O tratamento com salbutamol a cada 96 horas (IS) promoveu uma queda significativa de células LMN quantificadas no septo alveolar, mas não atingindo valores do grupo salina (NS). Ambos os tratamentos com salbutamol produziu redução significativa de células EPO+ no parênquima pulmonar (P < 0,05). Apesar das alterações no processo celular, o salbutamol não influenciou na expressão de anticorpos IgE anafiláticos a OVA. Assim, podemos concluir que o salbutamol apresenta atividade imunomoduladora, observada por redução de eosinófilos no BAL e no parênquima pulmonar, apesar de não atingir valores semelhantes aos animais do grupo salina / We studied the effects of salbutamol treatment in two regimen: diary (DS) and at interval of 96 hours (IS) in ovalbumin sensitized (OVA) balb/c mice. The control group (NS) received i.p. injections and aerosol challenge with normal saline. Starting at day 34 the OVA animals were treated with 10mg/ml salbutamol by inhalation during 15 minutes per day in both regimen: DS and IS. The mice were sacrificed at day 60 that corresponded the fourthly eight hours after last OVA and/or salbutamol exposure. At experimental day, mice were anesthetized with i.p. injection of sodium pentobarbital, tracheostomized, entubed and the abdominal aorta sectioned. We followed with collecting of bronchoalveolar lavage (BAL) and lungs to histopathology studies. In the BAL, total cells and differential leukocytes were quantified, while in the lung sections, the EPO+ and LMN in airways wall and parenchyma septa were evaluated. Also, we sampled the blood to evaluate the effects of salbutamol on anaphylactic IgE antibodies expression. The inflammatory model (OVA animals) produced a significant increase of BAL total cells, BAL eosinophils and neutrophils, and LMN cells and EPO+ eosinophils in the airways and in the parenchyma. Diary salbutamol treatment decrease significantly BAL eosinophils and neutrophils, while the IS group showed a diminution of BAL neutrophils and LMN cells in the alveolar septum. Both salbutamol treatments produced significant decline of EPO+ cells in the lung parenchyma. Despite the changes in the cellular patterns, the salbutamol did not affect the IgE antibodies expression. So, we can concluded that salbutamol present an immunomodulatory activity observed by reduction of eosinophils in the BAL and lung parenchyma, but did not achieve the values of saline control group

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2016-05-05T17:26:06Z No. of bitstreams: 1 akinoricardozonagato.pdf: 3623412 bytes, checksum: 052499ef93e153d7b083782377a73cd1 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2016-06-07T15:40:58Z (GMT) No. of bitstreams: 1 akinoricardozonagato.pdf: 3623412 bytes, checksum: 052499ef93e153d7b083782377a73cd1 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-07T15:40:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 akinoricardozonagato.pdf: 3623412 bytes, checksum: 052499ef93e153d7b083782377a73cd1 (MD5) Previous issue date: 2016-03-23 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Estudos prévios têm demonstrado que o dano e estresse oxidativo induzido pela hiperóxia levam ao aumento de interleucina-6 (IL6), fator de necrose tumoral-alfa (TNFα) e fator de crescimento transformador beta (TGFβ) em pulmões de camundongos. Juntos, a IL6 e TGFβ têm sido conhecidos por direcionar a diferenciação do fenótipo para as células T-helper 17 (Th17). No estudo corrente nós testamos a hipótese que a hiperóxia promove a polarização de células T para o fenótipo Th17 na resposta inflamatória aguda das vias aéreas induzida por ovalbumina (OVA). A inflamação das vias aéreas foi induzida em camundongos BALB/c, fêmeas, através da sensibilização intraperitonial e instilação intranasal de OVA, acompanhado de metacolina (MetCo). Depois do ataque com MetCo, os animais foram expostos a condições de hiperóxia em uma câmara de inalação durante 24h. Os animais do grupo controle permaneceram em normóxia ou receberam hidróxido de alumínio em salina tamponada. Depois de 24h de hiperóxia, o número de macrófagos (Mᶲ) e linfócitos diminuiu nos animais com inflamação induzida por OVA, enquanto o número de neutrófilos (PMN) aumentou. Os resultados mostraram que a expressão de Fator de transcrição nuclear derivado de eritróide 2 (Nrf2), óxido nítrico sintase induzida (iNOS), Fator de transcrição Tbet (Tbet) e interleucina-17 (IL17) aumentou depois de 24h de hiperóxia tanto em Mᶲ alveolares quanto em células epiteliais pulmonares, comparados com os animais que permaneceram em ar ambiente e com inflamação induzido por OVA. A hiperóxia, isoladamente, levou ao aumento dos níveis de Fator de necrose tumoral (TNFα) e Quimiocina ligante CC5 (CCL5), enquanto a hiperóxia depois da inflamação por OVA levou a diminuição dos níveis de CCL2. O extravasamento de células inflamatórias peribronquiolar e perivascular foi observado após a inflamação pulmonar e hiperóxia. A hiperóxia promoveu a polarização da resposta imune em direção ao fenótipo Th17, resultando em estresse oxidativo e dano tecidual, e migração de PMN e Mᶲ para os pulmões e vias aéreas. Esses achados sugerem que controlar o estresse oxidativo induzido pela hiperóxia pode contribuir importantemente no controle da inflamação aguda das vias aéreas induzida por OVA. / Previous studies have demonstrated that hyperoxia-induced stress and oxidative damage to the lungs of mice lead to an increase in IL6, TNFα and TGFβ expression. Together, IL6 and TGFβ have been known to direct T cell differentiation towards the TH17 phenotype.In the current study, we tested the hypothesis that hyperoxia promotes the polarization of T cells to the TH17 cell phenotype in response to ovalbumin-induced acute airway inflammation. Airway inflammation was induced in female BALB/c mice by intraperitoneal sensitization and intranasal introduction of ovalbumin, followed by challenge methacholine. After the methacholine challenge, animals were exposed to hyperoxic conditions in an inhalation chamber for 24 h. The controls were subjected to normoxia or aluminum hydroxide dissolved in phosphate buffered saline. After 24 h of hyperoxia, the number of macrophages and lymphocytes decreased in animals with ovalbumin-induced airway inflammation, whereas the number of neutrophils increased after ovalbumin-induced airway inflammation. The results showed that expression of Nrf2, iNOS, Tbet and IL17 increased after 24 of hyperoxia in both alveolar macrophages and in lung epithelial cells, compared with both animals that remained in room air, and animals with ovalbumin-induced airway inflammation. Hyperoxia alone without the induction of airway inflammation lead to increased levels of TNFα and CCL5, whereas hyperoxia after inflammation lead to decreased CCL2 levels. Histological evidence of extravasation of inflammatory cells into the perivascular and peribronchial regions of the lungs was observed after pulmonary inflammation and hyperoxia. Hyperoxia promotes polarization of the immune response towards the TH17 phenotype, resulting in tissue damage associated with oxidative stress, and the migration of neutrophils to the lung and airways. Elucidating the effect of hyperoxia-induced oxidative stress is relevant to preventing or treating ovalbumin-induced acute airway inflammation.

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2017-02-03T13:11:46Z No. of bitstreams: 1 caiocesardesouzaalves.pdf: 1872262 bytes, checksum: f03fadd9407262d508f6744a7f73820f (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2017-02-03T13:14:01Z (GMT) No. of bitstreams: 1 caiocesardesouzaalves.pdf: 1872262 bytes, checksum: f03fadd9407262d508f6744a7f73820f (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-03T13:14:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 caiocesardesouzaalves.pdf: 1872262 bytes, checksum: f03fadd9407262d508f6744a7f73820f (MD5) Previous issue date: 2007-08-30 / A Paracoccidioidomicose é uma micose sistêmica humana causada pelo fungo dimórfico, Paracoccidioides brasiliensis, que acomete, principalmente, indivíduos adultos do sexo masculino. O presente estudo propôs a padronização do modelo de infecção com P. brasiliensis pela via intratorácica em camundongos BALB/c. Este estudo foi monitorado pela detecção do P. brasiliensis através da contagem de unidades formadoras de colônia e pela presença de DNA do fungo nos pulmões dos animais infectados em diferentes pontos pósinfecção (2o, 7o, 15o, 30o, 45o, 60o e 90o dias) e a taxa de sobrevida dos camundongos. Além disto, foram avaliados alguns parâmetros imunológicos como a produção de óxido nítrico, TNF-alpha, IFN-gama, e IL-10 por células presentes no lavado intratorácico, contagem total e diferencial do número de células do lavado intratorácico, o estudo histopatológico dos pulmões e a detecção de anticorpos específicos anti-P. brasiliensis nos pulmões e no soro. Os resultados mostram um aumento gradual do número de colônias e de DNA de P. brasiliensis nos pulmões. Até o 15o dia após a infecção pode ser observado um aumento na produção de óxido nítrico e IFN-gama pelas células do lavado intratorácico, bem como um aumento do número total de células e da porcentagem de leucócitos mononucleares. A partir do 30o dia após a infecção observa-se um aumento de anticorpos específicos (IgG1) no soro e no pulmão, um aumento da produção de IL-10 e TNF-alpha pelas células do lavado intratorácico e conseqüente diminuição da produção de IFN-gama e óxido nítrico. Além disso, observa-se um aumento da porcentagem de células polimorfonucleares no lavado. No estudo histopatológico pode ser constatado um aumento gradual no tamanho e complexidade dos granulomas presentes nos cortes histológicos. Os camundongos utilizados no estudo de sobrevida começaram a morrer no 60o dia após a infecção. Os resultados mostram uma resposta inicial do hospedeiro com um perfil Th1 mudando durante a infecção para uma resposta Th2 que leva ao óbito dos camundongos BALB/c. / Paracoccidioidomycosis or South American blastomycosis, is a chronic granulomatous human male infection caused by the Paracoccidioides brasiliensis. The present study it considered the standardization of the model of infection with P. brasiliensis for the intrathoracic route in BALB/c mice. This study was monitored by the detection of the P. brasiliensis through the counting of colony forming units and by the presence of DNA of fungi in the lungs of the infected animals in different points (2, 7, 15, 30, 45, 60 and 90 days) and the survival rate of the mice. Moreover, some immune parameters had been evaluated as the nitric oxide production, TNF-alpha, IFN-gamma, and IL-10 for cells in the intrathoracic washed, total and distinguishing counting of cells of the intrathoracic washed, the lung histopathology and the detection of specific antibodies anti-P. brasiliensis in the lungs and serum. The results show a gradual increase of the number of colonies and P. brasiliensis DNA in the lungs. Until 15 day after the infection can be observed an increase in the nitric oxide production and IFN-gamma for the cells of the washed, as well as an increase of the total number of cells and the percentage of mononuclear. From 30 day after the infection observes an increase of specific antibodies (IgG1) in the serum and the lung, an increase of the production of IL-10 and TNF-alpha for the cells of the washed and consequent reduction of the IFN-gamma production and nitric oxide. Moreover, observed an increase of the percentage of cells polimorphonuclear in the washed. In the histopathology it can be evidenced a gradual increase in the size and complexity of granulomas in the cuts. The mice used in the survival study had started to die in 60 day after the infection. The results show an initial reply of the host with a Th1 profile moving during the infection for a Th2 reply that leads to the death of the BALB/c mice.

A mutagênese química utilizando o agente mutagênico N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) seguida da observação do fenótipo deu origem a um mutante Anêmico. O tipo de herança é autossômica dominante, com morte intra útero dos mutantes homozigotos. O mapeamento genético foi feito utilizando-se marcadores microssatélites, sendo selecionados marcadores polimórficos entre as linhagens BALB/c e C57BL/6 envolvidas no mapeamento. Estabeleceu-se um painel de microssatélites distribuídos por todo o genoma do camundongo, que permitisse a localização do cromossomo portador da mutação. O gene mutante foi localizado no cromossomo 7 entre os marcadores D7Mit301 e D7Mit131 delimitando um intervalo entre 46,5cM e 51cM de 4,5cM. Através das análises fenotípicas do mutante Anêmico e estudo dos genes candidatos neste intervalo, foi selecionado o gene Hbb responsável pela síntese das globinas b-major e b-minor , sendo o gene que mais se identifica com as características do mutante, localizado a 50cM. A deficiência deste gene leva a uma das mais severas anemias humana, a b-Talassemia major. / Chemical mutagenesis, using the mutagenic agent N-ethyl-N-nitrosourea (ENU), and followed by observation of the phenotype, originated in an Anaemic mutant. The inheritance-type is dominant auto-somic, with intra-uterus death of the homozygotic mutants. Genetic mapping was undertaken by means of micro-satellite markers, polymorphic markers being selected from among the BALB/c and C57BL/6 lineages involved in the mapping itself. A panel was established of the micro-satellites distributed throughout the whole mouse genome, thereby permitting localization of the mutation bearing chromosome. The mutant gene was located in chromosome 7 between markers D7Mit301 and D7Mit131, these delimiting an interval between 46,5cM and 51cM of 4,5cM. Selection of the Hbb gene responsible for synthesis of the b-major and b-minor globins came about through phenotypic analysis of the Anaemic mutant and a study of candidate genes within this interval, the selected gene being that which was most identified with the mutants characteristics and located at 50cM. A deficiency in this gene leads to one of the most severe forms of human anaemia, b-Talhassemia major.