Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000396843-Texto+Completo-0.pdf: 208677 bytes, checksum: 50ebe2518a717c97f6596659cfc38e2f (MD5) Previous issue date: 2006 / Background: obstructive sleep apnea-hypopnea syndrome (OSAHS) is considered a comorbity associated to morbid obesity mainly due to the large neck circumference. Depending on its severity, OSAHS can interfere in many systems homeostasis as, for example, central nervous system (CNS). Neuron Specific enolase (NSE) and S100B protein provenient from astrocytes, are considered sensible cerebral injury biochemical markers. We evaluated in this study, serum S100B and NSE levels, with the objective to mark possible cerebral injuries of OSAHS over CNS. Methods: this is a transversal study with data provenient from 25 OSAHS morbid obese patients. Blood samples were collected before and after polisomnographic exam for S100B and NSE protein dosage. We also analyzed data provenient from depression and excessive daytime sleepiness. Results: S100B levels were higher after [0,029 (0,010-0,199) than before [0,010 (0,010-0,025) ] PSG (P=0,002). S100B levels are expressed in median and IQ25-IQ75. NSE levels did not show significative diferences between after and before PSG. Conclusions: Study shows significative S100B level variations when compared after and before PSG. This suggests that there is a CNS astrocyte reaction because of possible cerebral hypoxemy in OSAHS morbidly obese patients. / Embasamento teórico e objetivos: a síndrome das apnéias-hiponéias obstrutivas do sono (SAHOS) é uma comorbidade associada à obesidade mórbida principalmente em função da grande circunferência do pescoço. Dependendo da sua gravidade, a SAHOS pode interferir na homeostasia de inúmeros sistemas, como por exemplo o sistema nervoso central (SNC). A enolase neurônio-especifica (NSE) e a proteína S100B, proveniente do astrócito, são considerados marcadores sensíveis para lesão cerebral. Nesse estudo avaliamos os níveis séricos de S100B e NSE com o intuito de marcar possíveis injúrias causadas pela SAHOS ao SNC. Pacientes e métodos: nós estudamos dados provenientes de 25 pacientes obesos mórbidos portadores de SAHOS e realizamos a coleta de sangue antes e após o exame polissonográfico (PSG) para a dosagem das proteínas S100B e NSE. Também foram analisados dados relativos a depressão e sonolência diurna excessiva. Resultados: Os valores de S100B foram maiores após [0,029 (0,010-0,199)] em comparação com antes [0,010 (0,010-0,025)] µg/l da PSG (P=0,002). Os valores são expressos em mediana e IQ25-IQ75. Os valores de NSE não mostraram diferenças significativas entre antes e depois do sono. Conclusões: o estudo mostra variações significativas em níveis de S100B quando comparados antes e depois exame polissonográfico.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000401022-Texto+Completo-0.pdf: 970049 bytes, checksum: 1fc17227f3815a94113f9cadc1efc0e4 (MD5) Previous issue date: 2008 / Phosphodiesterases (PDEs) are a super family of enzymes which degrade the intracellular second messengers cyclic guanosine monophosphate (cGMP) and cyclic adenosine monophosphate (cAMP). As essential regulators in cyclic nucleotide signaling with diverse physiological functions, PDEs are drug targets for the treatment of various diseases including heart failure, depression, asthma, inflammation, and erectile dysfunction. Among the eleven PDE gene families, the cGMP-specific PDE5 is the principal cGMP-hydrolyzing activity in the human corpus cavernosum tissue. It is well known as the target of many drugs used in the treatment of erectile dysfunction, like sildenafil. This work aims the synthesis of the coding region, cloning, expression and purification of the catalytic domain of human PDE5 gene which encodes the phosphodiesterase 5. The synthesis of the coding region of the target polypeptide was accomplished by using 24 primers, which were ligated by overlap extension using the polymerase chain reaction. The construction was cloned into pCRBlunt® vector and sequenced to confirm its identity and the absence of mutations. The fragment was subcloned into pET23a(+) expression vector with NdeI and BamHI restriction sites. Escherichia coli Rosetta (DE3) electrocompetent cells were transformed with the recombinant plasmid and the coding region of the catalytic domain of the PDE5 was expressed in its soluble form with 0. 1mM of IPTG induction. The purification yielded 2. 39 mg. mL-1 through 3 steps of purification. The pure catalytic domain of PDE5 will allow screening for the discovery of new natural inhibitors from the brazilian biodiversity that could be used in the treatment of erectile dysfunction. / Fosfodiesterase (PDE) é uma super família de enzimas responsáveis pela degradação dos segundos mensageiros intracelulares adenosina monofosfato cíclico (AMPc) e guanosina monofosfato cíclico (GMPc). Como reguladoras essenciais na sinalização de segundos mensageiros cíclicos com diversas funções fisiológicas as PDEs são alvo de drogas para o tratamento de diversas doenças. Dentre estas estão insuficiência cardíaca, depressão, asma, inflamação e disfunção erétil. Dentre as 11 famílias de genes de PDE, a fosfodiesterase 5 (PDE5) é específica para GMPc, sendo responsável pela atividade de hidrólise que sofre o GMPc dentro dos tecidos dos corpos cavernosos penianos dos homens. A PDE5 é amplamente conhecida por ser alvo de diversas drogas utilizadas no tratamento da disfunção erétil, como por exemplo, o sildenafil (Viagra®). Este trabalho tem por objetivo a síntese da região codificante, clonagem, expressão e purificação do domínio catalítico da PDE5 humana. A síntese da região codificante do polipeptídeo alvo foi realizada através da técnica de overlap, utilizando 24 oligonucleotídeos que foram unidos através da reação em cadeia da polimerase (PCR). A construção foi clonada em vetor pCRBlunt® e sequenciada para confirmar sua identidade e a ausência de mutações. O fragmento foi subclonado em vetor de expressão pET23a(+) com sítios de restrição NdeI e BamHI, para o N terminal e C terminal, respectivamente. Células eletrocompetentes de E. coli Rosetta (DE3) foram transformadas com o plasmídeo recombinante, a região que codifica para o domínio catalítico da PDE5 foi expressa em sua forma solúvel e ativa na presença de 0,1 mM do indutor IPTG. Quando o domínio catalítico da PDE5 foi isolado, um rendimento de 2,39 mg. mL-1 foi obtido através de 3 passos de purificação.O domínio catalítico da PDE5 puro permitirá a realização de uma triagem de extratos vegetais oriundos da biodiversidade brasileira. Com o intuito de buscar novos compostos que possam se tornar possíveis inibidores de PDE5, e assim serem utilizados no tratamento da disfunção erétil.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000431857-Texto+Completo-0.pdf: 2482469 bytes, checksum: b7a25df1538a26027ad365149defa70e (MD5) Previous issue date: 2011 / Critical condition is caused by interactions between genetic and environmental factors. Although each risk factor itself is partially under genetic control, studies propose the existence of additional effects caused by susceptibility genes; these studies begin suggesting isolated genetic variants that was increasing the risk of the critically ill patient. This proposition is now becoming evident. In parallel, there is growing evidence that inflammation plays also a central role in patients with critical health conditions and in their outcome. During the critical condition, the conventional clinic and biochemical risk factors are very important, the inflammatory status can modulates the severity of the pathological process. Inflammation may be involved in all stages of critical ill development and compliances, and the inflammatory process a central agent of morbidity and mortality of critically ill patient. So, controlling inflammatory status may enhance individual chance of to acquire a better/worse outcome. The CD14 (cluster of differentiation 14) receptor is a pattern of recognition molecules involved in the innate immune response against exogenous and endogenous stress factors. The most important CD14 signaling co receptors are the toll-like receptor 2 and 4 (TLR2, TLR4), which are transmembrane receptors that mediate inflammatory responses by endotoxins, and activate the nuclear factor kappaB (NF-kappaB) pathway. Tumor necrosis factor (TNF-α) is another relevant cytokine in the course of the inflammation process. But, besides its protector role in innate immunity, these pro-inflammatory cytokines may exert also pathogenic effects. In 2006, it was evaluated the influence of the -260C>T CD14 single nucleotide polymorphism (SNP) in a sample of 85 critically ill patients. With random genotype distribution for clinical characteristics at Intensive Care Unit (ICU) patient admission, age, and length of hospital stay, we found that -260TT CD14 patients presented higher survivor rates when compared to the -260C CD14 carriers. In 2009 it was tested in a sample of 514 critically ill subjects whether the -260TT CD14 genotype would occur more commonly among ICU survivors than among decease patients. This published study showed that previous 2006 results were robustly confirmed. The -260C>T CD14 SNP was a protective factor towards survival in critically ill patients; there was higher frequency of survivors in -260TT CD14 homozygote. These results emerge with the hypothesis suggested that the higher -260TT CD14 genotype frequency in ICU survivor patients was possibly explained by an effect on innate immunity signaling. In that moment (2009), the current literature was suggesting that the analysis of a lot of polymorphic genetic markers could be more informative than the analysis of a single polymorphism. Aware of this information it was analyzed differential SNPs in other genes that encode CD14 synergic proteins to examine if they could also be informative in patients with critical health conditions. We verified whether the shared inheritance of TLR2, TLR4, and TNF-α variants might act in synergy with -260C>T CD14 SNP on the outcome from critical condition. The results for 2029C>T and 2258G>A of TLR2, 896A>G and 1196C>T of TLR4 and the - 308G>A of TNF-α SNPs alone did show a significantly remarkable role in the outcome not from critical illness. However, when performed a combined analysis with the CD14 inheritance, it was detected a significant higher survivor rate in -260TT CD14/-308GG TNF-α doublehomozygote group. In the adjusted analysis with double-genotype variable and the main clinical predictors to mortality, showing that the -260TT CD14/-308GG TNF-α doublegenotype was a significant protective factor towards survival. Connected to the beneficial effect of -260TT CD14, the -308GG TNF-α genotype was protector against the reported overexpression of TNF-α caused by -308A rare allele. In conclusion, this results supported the hypothesis that the interaction between -260TT CD14 and -308GG TNF-α functional SNPs may be influencing the outcome of critically ill patients. / A condição crítica de saúde é causada pela interação de fatores genéticos e ambientais. Embora cada fator de risco em si já esteja parcialmente sob controle genético, estudos propõem a existência de efeitos adicionais causados por genes de susceptibilidade; estes estudos iniciaram sugerindo variantes genéticas isoladas que poderiam aumentar o risco do paciente criticamente enfermo. Paralelamente, há evidências crescentes de que a inflamação desempenha também um papel central nos pacientes com condições críticas de saúde. Durante a situação crítica, os fatores de risco clínicos e bioquímicos convencionais são muito importantes, mas o estado inflamatório do paciente pode modular a gravidade do processo patológico. A inflamação pode estar envolvida em todas as fases do desenvolvimento e das conseqüências da doença crítica, sendo o processo inflamatório um agente central da morbi-mortandade do paciente criticamente doente. Assim, controlando o estado inflamatório pode-se aumentar a chance do indivíduo ter um melhor / pior desfecho.O CD14 (cluster of diferenciation 14) é um receptor padrão de reconhecimento de moléculas envolvidas na resposta imune inata contra fatores exógenos e endógenos de estresse. Os co-receptoes do CD14 mais importantes são TLR2, TLR4 (Toll-like Receptors), que são receptores transmembrana que mediam a resposta inflamatória por endotoxinas, e ativam a via do fator nuclear kappa B (NF-kappa B). O fator de necrose tumoral (TNF-α) é outra citocina relevante no âmbito do processo de inflamação. Mas, além de seu papel protetor na imunidade inata, essas citocinas pró-inflamatórias podem exercer também efeitos patogênicos. Em 2006, foi avaliada a influência do polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) -260C>T CD14 em uma amostra de 85 pacientes criticamente enfermos. Com uma distribuição aleatória de genótipos para as características clínicas, como tempo de internação do paciente na Unidade de Terapia Intensiva (UTI), idade e tempo de permanência hospitalar, foi observado que os pacientes -260TT CD14 apresentaram maiores índices de sobrevivência quando comparados com os portadores do alelo -260C CD14. Em 2009 foi testado uma amostra de 514 pacientes em estado crítico se o genótipo -260TT CD14 ocorreria mais frequentemente entre os sobreviventes do que entre os pacientes falecidos. Este estudo publicado mostrou que os resultados de 2006 se confirmaram com uma maior robustez. O SNP -260C>T CD14 foi um fator protetor para a sobrevivência em pacientes gravemente doentes: houve uma frequência superior de sobreviventes homozigotos -260TT CD14. Estes resultados surgiram com a hipótese de a maior frequência do genótipo -260TT CD14 em pacientes de UTI sobreviventes seria, possivelmente, explicada por um efeito de sinalização na imunidade inata. Naquele momento (2009), a literatura atual estava sugerindo que a análise de uma série de marcadores genéticos polimórficos poderia ser mais informativa do que a análise de um único polimorfismo. Ciente destas informações buscou-se a analisar SNPs em outros genes que codificam proteínas com ações sinérgicas com o CD14 para verificar se eles também poderiam ser informativos no desfecho dos pacientes com condições críticas de saúde. Verificou-se a herança de variantes nos genes TLR2, TLR4, e TNF-α, os quais poderiam atuar em sinergia com o SNP -260C>T CD14 durante a condição crítica. Foram obtidos resultados que mostraram que SNPs 2029C>T e 2258G>A do TLR2, 896A>G e 1196C>T do TLR4 e o - 308G>A do TNF-α, isoladamente, não desempenham um papel significantemente notável no desfecho da doença crítica. No entanto, ao se realizar uma análise combinada com a herança do -260C>T CD14, foi detectado uma taxa de sobrevivência significativamente maior no grupo de pacientes duplo homozigoto -260TT CD14/-308GG TNF-α. Na análise ajustada com o duplo genótipo as principais variáveis clínicas preditoras de mortalidade, foram observadas que o duplo genótipo -260TT CD14/-308GG TNF-α foi um fator importante de proteção para a sobrevivência. Conectado ao efeito benéfico do -260TT CD14, o genótipo -308GG TNF-α foi protetor contra a relatada superexpressão de TNF-α causada por alelo -308A TNF-α. Em conclusão, os resultados apóiam a hipótese de que a interação entre os SNPs funcionais - 260TT CD14 e -308GG TNF-α pode estar influenciando o desfecho de pacientes criticamente enfermos.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000434361-Texto+Completo-0.pdf: 871387 bytes, checksum: 61b94d1dabcbd610bd45519b7f1bd74a (MD5) Previous issue date: 2011 / INTRODUCTION: We have previously shown that pharmacological blockade of the gastrin-releasing peptide receptor (GRPR) during the neonatal period in rats produces behavioral features of developmental neuropsychiatric disorders of the autism spectrum, including deficits in social interaction and cognition. OBJECTIVES: Assess the effects of the antagonism of bombesin-like peptides, the GRPR and NMBR, during development in rats, in two related studies. Thus, in the first study we analyzed the expression of GRPR, NR1, and EGFR, three neuronal receptors potentially involved in the etiology of autism, in cerebral cortex and hippocampus of rats submitted to neonatal GRPR blockade by RC-3095. In addition, our second goal was to verify whether clozapine could rescue social behavior impairment in this potential novel animal model of ASD. In the second study, we aimed to investigate the effects of the blockade of two bombesin-like petides; the GRPR and NMBR in aggregative behavior at postnatal day 12 and in social interaction at PN 30 of males and females rats neonatally treated with selective antagonists, RC-3095 and PD 176252.METHODS: Study 1: Rats were injected with the GRPR antagonist RC-3095 or vehicle from postnatal days 1 to 10, and tested for social behavior and recognition memory in the adulthood. One hour prior to the behavioral testing, rats were given a systemic injection of clozapine or saline. The mRNA expression of the NR1 subunit of the N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor, the epidermal growth factor receptor (EGFR), and GRPR was measured in the hippocampus and cortex of a separate set of rats given neonatal RC-3095 or vehicle. Study 2: Male and female Wistar rats were injected with the GRPR antagonist RC-3095 or NMB antagonist PD 176252 or vehicle from PN 1 to 10, and tested for aggregative behavior at PN 12 and social interaction in the young phase (at PN 30).RESULTS: Study 1: Rats given neonatal RC-3095 showed decreased social interaction and impaired object recognition memory. Clozapine rescued the social interaction impairment. Treatment with RC-3095 resulted in parallel decreases in the expression of GRPR, NR1, and EGFR in the cortex, and increased expression in the hippocampus. Study 2: Males and females rats given neonatal RC-3095 showed decreased in the maintenance of aggregation behavior during the developmental phase (PN 12) and in different analyses of social interaction when tested at PN 30.CONCLUSION: The results further validate the novel rat model of autism induced by neonatal GRPR blockade, and show for the first time in this model alterations in the expression of neuronal receptors associated with the pathogenesis of autism. In addition, for the first time we showed that the GRPR neonatal blockade, in male and female animals, is associated with impairments observed in aggregation, an important pattern of sociability, and in social interaction, which corresponds to an important behavioral feature of rodent models of autism spectrum disorders. / INTRODUÇÃO: Estudos anteriores de nosso grupo de pesquisa demonstraram que o bloqueio do receptor do peptídeo liberador de gastrina (GRPR) em ratos, durante o período neonatal, produz padrões comportamentais característicos de desordens neuropsiquiátricas do espectro do autismo, incluindo déficits em interação social e cognição. OBJETIVOS: O presente trabalho teve como objetivos avaliar os efeitos do antagonismo dos receptores de peptídeos semelhantes à bombesina, o GRPR e o NMBR, durante o desenvolvimento em ratos, em dois estudos relacionados. Sendo assim, no primeiro estudo, avaliamos a expressão de GRPR, NR1 e EGFR, três receptores neuronais potencialmente envolvidos na etiologia do Autismo, em córtex cerebral e hipocampo de ratos submetidos ao bloqueio neonatal do GRPR, pelo RC-3095. Adicionalmente, nosso segundo objetivo foi verificar se a Clozapina® seria capaz de reverter os prejuízos em comportamento social neste potencial modelo animal da síndrome do autismo. No segundo estudo, investigamos os efeitos do bloqueio de dois receptores de peptídeos semelhantes a bombesina, o GRPR e NMBR em comportamento de agregação e em interação social em ratos machos e fêmeas tratados no período neonatal com antagonistas seletivos RC-3095 e PD 176252.MÉTODOS: Estudo 1: os ratos receberam injeções de RC-3095 (antagonista do GRPR) ou de veículo do 1º ao 10º dias de vida pós natal, e foram testados em tarefas de comportamento social e memória de reconhecimento na fase adulta. Uma hora antes da realização da tarefa comportamental, os animais receberam injeções sistêmicas de Clozapina® ou salina. As expressões de mRNA da subunidade NR1 do receptor NMDA, do EGFR e GRPR foram medidas em hipocampo e córtex de um outro grupo de animais que receberam veículo ou RC-3095 no período neonatal. Estudo 2: Ratos Wistar machos e fêmeas receberam injeções do antagonista de GRPR, o RC-3095, ou antagonista do NMBR, o PD 176252, ou veículo do 1º ao 10º dias de vida pós natal, e foram testados em comportamento de agregação no 12° dia de vida pós-natal (PN 12) e na tarefa de interação social na fase jovem (PN 30).RESULTADOS: Estudo 1: Ratos tratados com RC-3095 na fase neonatal apresentaram decréscimos em interação social e prejuízos em tarefa de memória de reconhecimento. A Clozapina® reverteu os prejuízos em interação social. O tratamento com RC-3095 resultou em decréscimos paralelos na expressão de GRPR, NR1 e EGFR em córtex e aumento de suas expressões em hipocampo. Estudo 2: ratos machos e fêmeas tratados com RC-3095 apresentaram decréscimo na manutenção do comportamento de agregação durante o período de desenvolvimento e em diferentes análises de interação social quando testados aos 30 dias de período pós-natal. CONCLUSÃO: Os resultados apresentados validam o modelo de autismo original, induzido pelo bloqueio neonatal de GRPR e demonstram pela primeira vez neste modelo, alterações na expressão de receptores neuronais associados a patogênese do autismo. Além disso, pela primeira vez demonstramos que o bloqueio neonatal do GRPR, em animais machos e fêmeas, está associado a prejuízos observados na agregação, um importante parâmetro de sociabilidade, e em interação social, que corresponde a um parâmetro importante na caracterização comportamental de modelos de roedores de autismo.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000408010-Texto+Completo-0.pdf: 324019 bytes, checksum: a134e04c894f3ac9eaae510c195117e6 (MD5) Previous issue date: 2008 / In order to analyze the effect of the two different versions of the manganese superoxide dismutase gene (SOD2) on sepsis, we determined the 47C>T single nucleotide polymorphism (SNP) frequencies in critically ill patients with (n=356) and without sepsis (n=173), and also investigated the genotype frequencies in adverse outcomes in the septic patient's subgroup. We compared the 47C allele carriers (47CC+47CT genotypes) with 47TT homozygotes and we demonstrated a significant association between 47C allele carriers and septic shock in septic patients (p=0. 025). With an adjusted binary logistic regression, incorporating 47C>T SNP and the main clinical predictors, we showed that only SOFA score [p<0. 001, OR=9. 107 (95%CI=5. 319-15. 592)] and 47C allele [p=0. 011, OR=2. 125 (95%CI=1. 190-3. 794)] were significantly associated with septic shock outcome. Our results and our hypothesis suggest that the higher 47C allele carrier frequency in septic patients with negative outcome is possibly explained by an effect on cellular stress. / Para avaliar as duas versões do gene SOD2 que codifica para a proteína superóxido dismutase dependente de manganês na sepse, nós determinamos a freqüência do polimorfismo de nucleotídeo simples (SNP) 47C>T em pacientes criticamente doentes com sepse (n=356) e sem sepse (n=173), e também investigamos as freqüências genotípicas nos desfechos adversos à sepse (choque séptico e mortalidade) no grupo de pacientes sépticos. Nós comparamos os portadores do alelo 47C (genótipos 47CC+47CT) com homozigotos 47TT e demonstramos uma associação estatisticamente significativa entre os portadores do alelo 47C e a ocorrência de choque séptico no subgrupo de pacientes sépticos (p=0. 025). Na análise ajustada de regressão logística binária, incorporando o SNP 47C>T e os principais preditores clínicos, nós mostramos que somente o escore SOFA [p<0. 001, OR=9. 107 (95%CI=5. 319-15. 592)] e o alelo 47C [p=0. 011, OR=2. 125 (95%CI=1. 190-3. 794)] foram significativamente associados com o desfecho de choque séptico. Nossos resultados e nossa hipótese sugerem que a mais alta freqüência de portadores do alelo 47C em pacientes sépticos com desfecho desfavorável é provavelmente explicada por um efeito no estresse celular.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000385077-Texto+Completo-0.pdf: 420922 bytes, checksum: 0e0a5b00bb03f3c41dbc7f262cf35a36 (MD5) Previous issue date: 2006 / Introduction: Venous thromboembolism (VTE) is a multigenic and multifactor disease and main clinical presentations include deep venous thrombosis and pulmonary thromboembolism. More than 60% of VTE cases are related to genetic predisposition and hyperhomocysteinemia is an established risk factor for VTE. Methilenetetrahydrofolate redutase (MTHFR) is a key enzyme in the homocysteine (Hcy) and folate metabolism. It catalyses the reduction of 5,10-metilenethetrahydrofolate to 5-metilthetrahydrofolate, a derivative form of folate which acts as a co-factor for remethylation of homocysteine to methyonine. A C ! T base transition at the nucleotide 677 of the MTHFR gene results in an alanine to valine substitution, generating a thermolabile variant of MTHFR. This thermolabile variant presents a decreased enzymatic activity, resulting in elevated plasma homocysteine levels. Materials and Methods: We studied 70 patients with thromboembolic disease (case group) and 74 individuals with no history of thromboembolism (control group). C677T MTHFR polymorphism was analyzed by polymerase chain reaction, followed by HinfI restriction enzyme digestion (PCR-RFLP).Results: T allele frequency was 46. 0% in patients and 38. 0% in controls (P=0. 92; OR 0. 72; 95%CI=0. 45-1. 15). MTHFR genotypes distribution for case and control groups, respectively, was: 40. 0% and 41. 9% normal homozygous (CC) (P=0. 87; OR 0. 92; 95% CI=0. 47-1. 79); 28. 3% and 40. 5% heterozygous (CT) (P=0. 16; OR 0. 58; 95%CI=0. 29-1. 17); 31. 4% and 17. 6% mutant homozygous (TT) (P=0. 08; OR 2. 15; 95% CI=0. 98-4. 70). Discussion and Conclusions: frequencies of C and T alleles were similar in both groups; presence of T allele did not represent a higher risk for TVE. The higher prevalence of the TT genotype in case group, although not statistically significant, suggests an association between the MTHFR C677T polymorphism and a higher risk for thromboembolic disease. The results presented herein represent the first report on the frequency of this polymorphism in the study population, since no data was available in the literature. These results are also a contribution for the understanding of the relationship between the MTHFR C677T polymorphism and VTE. / Introdução: O tromboembolismo venoso (TEV) tem como manifestações clínicas a trombose venosa profunda e o tromboembolismo pulmonar. Trata-se de uma doença multigênica e multifatorial. Mais de 60% dos casos estão relacionados com predisposição genética e a hiperhomocisteinemia é considerada um fator de risco estabelecido. A enzima metilenotetraidrofolato redutase (MTHFR) está envolvida no metabolismo da homocisteína (Hcy) e do ácido fólico. Esta enzima catalisa a redução do 5,10-metilenotetraidrofolato em 5-metiltetraidrofolato, derivado do ácido fólico que atua como co-fator para remetilação da homocisteína em metionina. A transição de uma citosina para uma timina no nucleotídeo 677 do gene da MTHFR resulta na substituição de uma alanina por uma valina, gerando uma variante termolábil da MTHFR. Esta variante termolábil apresenta uma atividade enzimática diminuída, o que resulta em um aumento nos níveis plasmáticos de Hcy. Materiais e Métodos: Foram avaliados 70 indivíduos com episódio de tromboembolismo venoso (grupo caso) e 74 indivíduos sem histórico de doença tromboembólica (grupo controle). O genótipo da MTHFR foi determinado por reação em cadeia da polimerase, seguida de digestão enzimática com a enzima HinfI (PCR-RFLP).Resultados: A freqüência do alelo T foi 46,0% entre os pacientes e 38,0% entre os controles (P=0,92; OR 0,72; 95%CI=0,45-1,15). O genótipo CC (homozigoto normal) foi encontrado em 40,0% dos pacientes e 41,9% dos controles (P=0,87; OR 0,92; 95%CI=0,47-1,79). O genótipo CT estava presente em 28,3% dos casos e 40,5% dos controles (P=0,16; OR 0,58; 95%CI=0,29-1,17). Os homozigotos para a variante termolábil da enzima (genótipo TT) representaram 31,4% dos indivíduos do grupo caso e 17,6% dos indivíduos do grupo controle (P=0,08; OR 2,15; 95%CI=0,98-4,70). Discussão e Conclusões: A freqüência dos alelos C e T foi semelhante entre os grupos estudados e a presença do alelo T não representou aumento no risco para TEV. Entre os genótipos, não houve diferença estatisticamente significativa entre os indivíduos com e sem histórico de trombose. No entanto, o genótipo TT foi mais freqüente no grupo caso que no grupo controle, indicando uma tendência de associação entre o genótipo TT da MTHFR e o desenvolvimento de doenças tromboembólicas. Estes resultados representam o primeiro relato indicativo da freqüência deste polimorfismo na população da região estudada, uma vez que não foram encontrados dados na literatura sobre estas freqüências, contribuindo para a pesquisa da relação entre este polimorfismo e o TEV.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000431137-Texto+Completo-0.pdf: 15580738 bytes, checksum: 8de463b0a32f5623e6e47a0d1d0edad2 (MD5) Previous issue date: 2011 / Epilepsy is a neurological disorder characterized by the occurrence of spontaneous and recurrent seizures. This disease and its treatment influence diverse neurological pathways. The purinergic system is an essential route for cell-to-cell communication and employs extracellular nucleotides and nucleosides as signaling molecules. The neurotransmitter ATP mediates synaptic currents through activation of G-proteincoupled P2Y receptors and P2X ionotropic receptors. The ATP degradation and consequent production of adenosine is promoted by a family of enzymes named ectonucleotidases, which includes NTPDases (nucleoside triphosphate diphosphohydrolases) and ecto-5´-nucleotidase. Adenosine is a neuromodulator that acts through the activation of P1 metabotropic receptors (A1, A2A, A2B, and A3). Adenosine can acts as an endogenous anticonvulsant, mainly by A1 receptors. The NTPDases hydrolyze both tri- and diphosphonucleosides whereas ecto-5’- nucleotidase hydrolyzes nucleoside monophosphates producing the nucleoside adenosine, that is hydrolyzed by adenosine deaminase (ADA). Therefore, NTPDases, ecto-5’-nucleotidase, and ADA control nucleotide and nucleoside levels, modulating the purinergic signaling. In the cholinergic system, acetylcholine (ACh) acts through muscarinic (metabotropic) and nicotinic (ionotropic) receptors. ACh is inactivated by its hydrolysis, that is catalyzed by acetylcholinesterase (AChE). Zebrafish is a small freshwater teleost which is becoming widely used as an experimental organism. Studies have demonstrated that zebrafish could be an important model to study seizures and to screen antiepileptic drugs. Considering that the purinergic and cholinergic systems exert an important role in the nervous system and that these neurotransmitter pathways have been already described in zebrafish, the aim of this study was to evaluate in this teleost the effect of pentylenetetrazole (PTZ)-induced seizures and antiepileptic drugs on the ectonucleotidases, ADA, and AChE activities. We have tested the in vitro effects of carbamazepine, phenytoin, and gabapentine at different concentrations on ectonucleotidase and AChE activities. Our results have shown that carbamazepine reduced ATP and ACh hydrolysis whereas phenytoin enhanced AMP hydrolysis. Gabapentin did not promote any changes on enzymatic activities. In addition, we tested the effect of PTZ-induced seizures on ectonucleotidases and ADA activities in adult zebrafish brain. Our results have demonstrated that PTZ treatments did not alter ectonucleotidase and ADA activities in membranes and soluble fraction, respectively. However, ecto-ADA activity was significantly decreased in brain membranes of animals exposed to PTZ treatments. These results have shown that antiepileptic drugs can influence the enzyme activities involved in the degradation of ACh and extracellular nucleotides. Furthermore, the decreased adenosine deamination observed in our study suggests the ADA participation on the modulation of extracellular adenosine levels during PTZinduced seizures in zebrafish. / A epilepsia é uma desordem neuronal caracterizada pela ocorrência de convulsões espontâneas e recorrentes. Essa patologia e seu tratamento interferem em diversos mecanismos neurológicos. O sistema purinérgico é uma importante rota de sinalização celular que emprega nucleotídeos e nucleosídeos extracelulares como moléculas sinalizadoras. O neurotransmissor ATP atua através de receptores do tipo P2Y, acoplados à proteína G e receptores P2X, que são ionotrópicos. A degradação do ATP extracelular e a conseqüente produção de adenosina é realizada por uma família de enzimas de superfície celular conhecidas como ectonucleotidases, que inclui as NTPDases (nucleosídeo trifosfato difosfoidrolases) e a ecto-5´-nucleotidase. A adenosina é um neuromodulador que atua através da ativação de receptores metabotrópicos do tipo P1 (A1, A2A, A2B, A3). Esse nucleosídeo pode agir como um anticonvulsivante endógeno, principalmente via receptores A1. As NTPDases hidrolisam nucleotídeos tri- e difosfatados originando a adenosina, que é hidrolisada pela adenosina deaminase (ADA). Assim, as NTPDases, ecto-5’-nucleotidase e ADA controlam os níveis de nucleotídeos e nucleosídeos, modulando o sistema purinérgico. No sistema colinérgico, a acetilcolina (ACh) atua através de receptores muscarínicos (metabotrópicos) e nicotínicos (ionotrópicos). Sua ação é encerrada através de sua hidrólise catalisada pela acetilcolinesterase (AChE). O peixe zebra é um pequeno teleósteo de água doce que vem sendo amplamente utilizado como modelo experimental em pesquisa. Estudos mostram que o peixe zebra pode ser uma ferramenta importante para o entendimento da epilepsia, bem como para o screening de fármacos antiepilépticos. Considerando que as sinalizações purinérgica e colinérgica têm importante participação no sistema nervoso e que essas vias de neurotransmissão estão identificadas e caracterizadas em peixe zebra, o objetivo desse estudo foi avaliar nesse teleósteo o efeito de convulsões induzidas por pentilenotetrazol (PTZ), bem como de fármacos antiepilépticos na atividade das ectonucleotidases, ADA e AChE, enzimas essenciais na modulação destas vias de sinalização. Foram avaliados os efeitos in vitro da carbamazepina, fenitoína e gabapentina na atividade das ectonucleotidases e AChE. A carbamazepina diminuiu a hidrólise de ATP e também de ACh. A fenitoína aumentou a hidrólise de AMP e a gabapentina não provocou alterações enzimáticas. Foi analisado também o efeito de crises convulsivas induzidas por PTZ na atividade das ectonucleotidases e da ADA. Os resultados não mostraram alterações nas ectonucleotidases e ADA nas frações extracelular e intracelular, respectivamente. No entanto, a atividade extracelular da ADA foi inibida em animais expostos ao PTZ. As análises mostraram que os fármacos antiepilépticos podem influenciar a atividade das enzimas envolvidas na degradação extracelular de nucleotídeos, bem como na hidrólise de ACh. Além disso, a diminuição na degradação de adenosina observada em nosso modelo de estudo pode sugerir a participação da ADA na modulação nos níveis de adenosina durante as crises convulsivas em peixe zebra.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000431795-Texto+Completo-0.pdf: 275377 bytes, checksum: fa4bd9a0279d69728af19923528ef71f (MD5) Previous issue date: 2011 / Extra-pyramidal symptoms (EPS), such as akinesia, dystonia, gait alterations, and tremors, are observed when dopamine D2 receptors are pharmacologically blocked by agents such as haloperidol, a widely used clinical drug. These EPS produce a Parkinson´s Disease (PD)-like state, known as a parkinsonism. It is widely accepted that physical exercise is capable to improve gait and locomotor deficits caused by PD, however studies are scarce when comparing physical exercise with dopamine D2 receptor blockers. The objective of this study was to understand the possible benefits of physical exercise in Wistar rats with chronic haloperidol-induced parkinsonism. To this end, 48 Wistar rats were allocated into four groups (n = 12 per group): 1- Control + sedentary, 2- Control + exercise, 3- Haloperidol + sedentary, 4- Haloperidol + exercise. The animals received daily doses of either haloperidol or saline (0. 3 mg/kg/day, i. p. ). Furthermore, groups 2 and 4 underwent a physical exercise protocol which consisted of a light-intensity walk at a speed of 4 m/min for the first five minutes, and then 6 m/min for 25 minutes. The animals were subjected to different tests to evaluate locomotor activity and behavioral parameters: the ink-paw test for a gait analysis, the bar test to measure akinesia, and the open-field test to measure bradykinesia. The gait analysis showed a shorter stride length and a wider stance width with the use of haloperidol when compared to the control group (p<0. 05), these alterations were reverted with physical exercise. The time on bar, used as a measure of akinesia, increase significantly during the haloperidol treatment (p<0. 001), however physical exercise was capable to attenuate this increment (p<0. 05). The open-field test presented an increase of the parameters of bradykinesia when comparing pre- and post-exercise time frame, but with no differentiation between groups. These results indicate that physical exercise can be used as an efficient approach as an adjuvant treatment to haloperidol induced EPS. / Sintomas extrapiramidais (extra-pyramidal symptoms) (EPS), como acinesia, distonia, alterações de marcha e tremores, são observados quando receptores D2 de dopamina são bloqueados farmacologicamente por agentes comumente utilizados na clínica como o haloperidol. Os EPS combinados criam um estado que se assemelha a Doença de Parkinson (Parkinson´s Disease) (PD), conhecido como parkinsonismo. É amplamente conhecido que o exercício físico é capaz de melhorar a marcha e os sintomas locomotores da PD, contudo são escassos os estudos relativos a prática de exercício concomitantemente com o uso de bloqueadores de receptores D2. O objetivo deste trabalho foi compreender os possíveis efeitos benéficos do exercícios em ratos Wistar com parkinsonismo induzido pela administração crônica de haloperidol. Para isso, 48 ratos Wistar foram distribuidos em quatro grupos (n = 12 por grupo): 1- Controle + sedentário, 2- Controle + exercício, 3- Haloperidol + sedentário e 4- Haloperidol + exercício. Os animais receberam doses diárias de haloperidol ou salina (0,3 mg/kg/dia, i. p. ), os animais dos grupos 2 e 4 foram submetidos a um protocolo de exercício que consistia de caminhada leve em esteira rolante a uma velocidade de 4 m/min nos primeiros 5 minutos, seguido de uma velocidade de 6 m/min por 25 minutos. Os animais foram pesados e submetidos a diferentes testes para avaliação da atividade locomotora e de parâmetros comportamentais: o teste da pata-impresssa para análise de marcha, o teste da barra horizontal para avaliar acinesia e o teste de campo aberto para mensurar bradicinesia.A análise da marcha mostrou uma diminuição do passo e um alargamento da base com o uso de haloperidol em relação ao grupo controle (p<0. 05), estas alterações foram revertidos pelo exercício. O tempo dispendido na barra, utilizado como medida do grau de acinesia, aumentou significativamente durante o tratamento com haloperidol (p<0. 001), contudo o exercício foi capaz de atenuar este aumento (p<0. 05). O teste de campo aberto apresentou um aumento nos parametros de bradicinesia quando comparados pré- e pós-exercício, mas sem diferenciação entre os grupos. Estes resultados indicam que exercício físico pode se constituir como um coadjuvante terapêutico eficiente para o tratamento dos EPS causado pelo uso de haloperidol.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000438527-Texto+Completo-0.pdf: 10657738 bytes, checksum: caad3abdc5d9b9863dbe5c3d7120700f (MD5) Previous issue date: 2012 / Transplantation of solid organs has emerged as a viable therapeutic modality for the treatment of a variety of disorders. Rejection of solid organ allografts is the result of a complex range of interactions involving coordination between both the innate and adaptive immune system. Therewith, a major goal of clinical organ transplantation is to induce a donor-specific unresponsive state in a mature immune system that is free from long-term immunosuppression and chronic rejection. The limitations in the establishment of immunossupressive stratagies led us to search new methods to the modulation of the homeostatic mechanisms that limit and prevent inflammatory responses in allograft tissue. The heat shock protein 70 (Hsp70) has a protective and antiinflamatory role in several animals models like arthritis, colitis, pulmonary fibrosis and brain injury. This protein can modulates both the innate and adaptative immune system. Our group demonstrated that Mycobacterium tuberculosis Hsp70 (Mt Hsp70) can inhibit bone marrow dendritic cells (BMDCs) maturation; however the mechanisms involved in this process has not been completely elucidated. In the present work, we demonstrated that Mt Hsp70 inhibited the acute rejection in two allograft models (a tumor model and a skin allograft model).In both models, we observed an involvement of Tregs. In addition, s. c. Mt Hsp70 injection leds to an increase in Treg population and IL-10 production in the draining lymph node. We also observed that the inhibition of acute rejection induced by Mt Hsp70 was dependent on the presence of toll-like receptor (TLR) 2 in the allograft, and not in the host. In BMDCs, we demonstrated that IL-10 production induced by Mt Hsp70 is dependent on TLR2. Also, we analyzed the phosphorylation of ERK, p38 and Akt after Mt Hsp70 stimulus. We observed an increase in p-ERK expression, but no difference in p-38 and p-Akt levels. The inhibition of ERK abolished the IL-10 production induced by Mt Hsp70. We propose that Mt Hsp70 effect on DCs can be used as a therapeutic approach in transplantation models. / O transplante de órgãos sólidos emergiu como uma terapia viável para o tratamento de uma variedade de patologias. A rejeição dos enxertos é resultado de uma série complexa e coordenada de interações envolvendo o sistema imune inato e adaptativo. Com isso, o maior desafio no transplante de órgãos sólidos é induzir um estado irresponsivo e específico ao doador em um sistema imune maduro sem que haja uma imunossupressão sistêmica e de longo prazo, tudo isso livre de rejeição crônica. As limitações no estabelecimento de estratégias imunossupressoras nos levaram a buscar novos métodos para a modulação dos mecanismos homeostáticos que previnem e limitam as respostas inflamatórias nos tecidos enxertados. A proteína de choque térmico (Heat shock protein – Hsp) 70 tem um papel antiinflamatório e protetor em modelos animais experimentais como artrite, colite, fibrose pulmonar e danos cerebrais. Essa protéina pode modular tanto o sistema imune inato quanto o adaptativo. Nosso grupo demonstrou que a Hsp70 de Mycobacterium tuberculosis (Mt Hsp70) pode inibir a maturação de células dendríticas diferenciadas da medula óssea (bone marrow dendritic cells – BMDCs), porém o mecanismo envolvido nesse processo ainda não foi totalmente esclarecido. Nesse trabalho, demonstramos que a Mt Hsp70 foi capaz de aumentar a sobrevida do enxerto em dois modelos murinos de transplantes (um modelo tumoral e um modelo de aloenxerto cutâneo).Em ambos os modelos, observamos o envolvimento de Tregs. Demonstramos que a administração s. c. da Mt Hsp70 levou a um aumento dessas células nos linfonodos drenantes, além de um aumento na produção de IL-10. Também observamos que a inibição da rejeição aguda induzida pela Mt Hsp70 no modelo de aloenxerto cutâneo é dependente da presença do receptor do tipo toll (toll like receptor – TLR) 2 no enxerto, e não no receptor. Nas BMDCs, vimos que a indução da IL-10 induzida pela Mt Hsp70 é dependente de TLR2. Ainda nessas células, analisamos a fosforilação de moléculas como a ERK, p38 e Akt após o estímulo com a Mt Hsp70. Observamos um aumento na expressão de p-ERK e nenhuma alteração nos níveis de p-p38 e p-Akt. A inibição da ERK aboliu a produção de IL-10 induzida pela Mt Hsp70. Propomos que esse efeito da Mt Hsp70 sobre as DCs pode servir como intervenção terapêutica em modelos de transplantes.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000419691-Texto+Completo-0.pdf: 1447789 bytes, checksum: 5ccd4a3822fedcf2320dfa685397b746 (MD5) Previous issue date: 2008 / The interaction between a B cell and a primed T cell, in the T-B border, leads to a germinal center reaction, where an antigen specific B cell increases the affinity and specificity for the antigen. After the generation of the high affinity and specificity, some clones differentiate into antibody producing cells. The antibody is the effector molecule of the B cell, and has major functions such as opsonization, neutralization, fixing complement and immunomodulation. In most individuals, the antibody mediated immune response is exclusively specific to non-self antigens, but for reasons not well understood, some individuals develop autoimmune responses. Little is known about the mechanisms behind the generation and survival of autoreactive cells. One of the models of how B cells are recruited in autoimmune responses, like Systemic Lupus Erythemathosus, predicts that B cells are driven into an autoimmune reaction through the presentation of peptides derived from the B cell receptor. The B lymphocytes can randomly combine several gene segments, generating a single cell receptor. Because the frequency of a B cell expressing a particular V gene is low, it was originally postulated that T cells were not rendered tolerant to immunoglobulin derived peptides. Since autoimmunity is the exception, not the rule, mechanisms that suppress the T cell responses against immunoglobulin derived peptides are required. The goal of my Thesis is to test two hypotheses. The first is how immunoglobulin specific T cells are rendered tolerant. The second is to test if a B cell can be recruited in an autoimmune response, through the presentation of immunoglobulin derived peptides. In this model only the sequences of the immunoglobulin that have somatic hypermutated have the potential to generate a T cell epitope. In the first chapter, using a combination of two transgenes and the mixed bone marrow technique, a third animal was generated. In this model the frequency of a B cell expressing a particular V gene (3671-κTg B cells) is similar to the B cell repertory diversity, and the T cells (CA30), are specific to peptides derived from the κ-chain of 3671-κTg B cells. The results demonstrated that the majority of the CA30 T cells were deleted in the thymus; however some T cells were able to reach the periphery. The escapees expressed an endogenous α-chain, were antigen experienced, but did not proliferate to peptide stimulation in vitro. The second chapter’s objective was to test the receptor presentation hypothesis, as an avenue for T cell help to autoreactive B cells, using a partial transgene animal to the B cell receptor. Even with autoimmunity being spontaneously induced, no autoreactive B cell carrying the transgene autoreactive receptor was found in the periphery. / A interação de uma célula B com uma célula T ativada na borda T-B leva a formação de um centro germinativo que tem como resultado o aumento da especificidade e afinidade da célula B pelo antígeno. Após a formação de uma célula B de alta especificidade e afinidade, alguns clones diferenciam-se em células produtoras de anticorpos. O anticorpo é a molécula efetora da célula B e tem como principais finalidades a opsonização, a neutralização, a fixação de complemento e a imunomodulação. Na maioria dos indivíduos, a resposta imune mediada por anticorpo é direcionada apenas contra antígenos não-próprios, porém, devido a fatores até hoje não compreendidos, alguns indivíduos montam respostas auto-imunes. Pouco se sabe quais os mecanismos que estão por trás da formação e manutenção das células auto-reativas. Em um dos modelos que propõe como as células B são recrutadas em resposta auto-imunes, como no Lupus Eritematoso Sistêmico, as células B recebem auxílio via apresentação de peptídeos derivados do receptor de célula B. Os linfócitos B podem aleatoriamente combinar diversos segmentos gênicos para criar um único receptor na superfície da célula. Devido à baixa freqüência de uma célula B expressar um gene V em particular, originalmente foi proposto que as células T não eram tolerantes aos peptídeos derivados da imunoglobulina. Em virtude que a auto-imunidade não é a regra, mecanismos que controlam a resposta de células T a peptídeos derivados da imunoglobulina se fazem necessários. Este trabalho tem como objetivo testar estas duas hipóteses. A primeira questão é a de como as células T imunoglobulinas específicas são tornadas tolerantes. A segunda questão é a de que uma célula B auto-reativa pode ser conduzida a uma resposta auto-imune pela apresentação de peptídeos derivados da imunoglobulina. Neste modelo, apenas as seqüências da imunoglobulina que sofressem hipermutações somáticas teriam o potencial de gerar um epitopo de célula T. No segundo capítulo, usando uma combinação de dois animais transgênicos e a técnica de transplante de medula óssea, um terceiro animal transgênico foi gerado. Neste modelo, a freqüência de uma célula B expressando um gene V em particular (células B 3671-κTg) é semelhante à diversidade do repertório de células B, e as células T(CA30) são, na grande maioria, específicas para um peptídeo derivado da cadeia κ das células B 3671-κTg. Os resultados demonstraram que as células T são, na grande maioria, eliminadas no timo destes animais, porém algumas células são capazes de alcançar a periferia. As células que escapam o timo aparentemente expressam uma cadeia α endógena, são antígenos experientes, porém não respondem à estimulação in vitro com o peptídeo. O terceiro capítulo teve como objetivo testar a apresentação do receptor como via para as células B auto-reativas, usando um animal transgênico parcial para o receptor de célula B. Apesar de a auto-imunidade ter sido induzida de forma espontânea nesses animais, nenhuma célula B auto-reativa encontrada na periferia expressava o receptor transgênico.