Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento, Florianópolis, 2017. / Made available in DSpace on 2017-06-27T04:16:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 345842.pdf: 20355711 bytes, checksum: db706dc03a3229b07a3809663bfa6843 (MD5) Previous issue date: 2017 / Salinidade é um importante componente do meio ambiente que pode influenciar a estrutura e a função das comunidades de gramas marinhas. Especialmente quando expostas a mudanças de salinidade, tais comunidades sofrem estresse osmótico, traduzindo-se em alterações morfológicas e fisiológicas. Halodule wrightii Ascherson é uma grama marinha de grande relevância ecológica e com ampla distribuição na zona costeira tropical e subtropical, sendo encontrada também em ambientes estuarinos. A espécie prefere áreas com salinidades próximas a 35, no entanto, esta consegue suportar condições de salinidade adversas. Dessa forma, H. wrightii constitui um excelente material para identificação de mecanismos celulares e fisiológicos envolvidos com a resistência a esse estresse abiótico. Utilizando a espécie H. wrightii como modelo, a presente pesquisa tem como objetivo principal determinar os efeitos de diferentes salinidades sobre os mecanismos adaptativos e efeitos biológicos na organização celular, parâmetros bioquímicos e morfometria das estruturas vegetativas (raiz, rizoma e lâmina foliar) desta grama marinha. Para isso, as plantas foram cultivadas por 21 dias nas salinidades 25, 35 e 45. A espécie apresentou diversas alterações celulares e bioquímicas sob estresse hipo e hipersalino. Estas alterações ocorreram em todos os órgãos vegetativos da planta, mas principalmente na lâmina foliar. Na raiz, a salinidade 45 levou a um aumento na sua espessura e na quantidade de pelos radiculares, os quais também devem aumentar a barreira ao fluxo radial de íons. Na lâmina foliar observou-se mais hidropótios em amostras expostas à salinidade 45 com aumento das invaginações da membrana plasmática e parede celular, que aumentam a área superficial, facilitando as trocas com o ambiente. Estas invaginações também foram observadas nas outras células epidérmicas da lâmina foliar de todas as amostras, em menores proporções, foram observadas nas amostras da salinidade 25. Em particular, observou-se uma retração significativa da membrana plasmática em amostras expostas à salinidade 45, com possível deposição de compostos entre a membrana e a parede celular. O estresse osmótico em amostras expostas à salinidade 45 diminuiu a quantidade de proteínas totais, bem como o número de cloroplastos epidérmicos, além de afetar a organização interna destas organelas com o aumento de plastoglóbulos e tilacoides por granum. A condição hipersalina levou a um aumento na concentração de açúcares na raiz e no rizoma. Na lâmina foliar, ocorreu aumento na concentração destes açucares nas amostras sob estresse hipo e hipersalino. Compostos fenólicos foram encontrados nas células epidérmicas foliares das amostras das salinidades 25 e 45. Estes compostos foram também detectados nas paredes celulares epidérmicas do rizoma e lâmina foliar, em menor proporção na salinidade de 25. As amostras que apresentaram os valores mais baixos de concentração de compostos fenólicos na raiz (salinidades 25 e 45) alcançaram os valores mais altos na lâmina foliar. Maiores concentrações de flavonólicos foram encontradas na lâmina foliar, na condição hiposalina. As arabinogalactana-proteínas foram visualizadas de forma intensa no citoplasma e na membrana plasmática das células epidérmicas foliares das amostras sob condição hipersalina, servindo, assim, como mecanismo de estabilização de membrana. Este estudo mostrou que a H. wrightii consegue sobreviver à variação de salinidade de 25 a 45, num período de 21 dias, sem alterar sua taxa de crescimento, entretanto na salinidade 35 a planta possui maior viabilidade celular. O estresse salino, tanto hipo quanto hipersalino, diminuiu a viabilidade celular na espécie estudada. Modificações ultraestruturais permitiram à H. wrightii suportar salinidades 45; no entanto, as alterações no aparato fotossintetizante demonstraram que esta espécie tolera melhor salinidades abaixo deste valor.<br> / Abstract : Salinity is an important environmental component that can influence the structure and function of seagrasses communities. In particular, when exposed to salinity changes conditions, seagrasses undergo osmotic stress that are, in turn, reflected in morphological and physiological changes. The ecologically important seagrass Halodule wrightii Ascherson is widely distributed in the coastal tropical and subtropical zone, as well as estuarine environments. This species prefers areas with approximate salinities 35, but it can also tolerate adverse salt conditions, making this species an excellent model for the identification of cellular and physiological mechanisms involved in the resistance to this abiotic stress. Accordingly, we used H. wrightii as a model seagrass to determine the effect of different salinities on adaptive mechanisms and biological effects on cell organization, biochemical parameters and morphometry of its vegetative structures, including root, rhizome and leaf blade. To accomplish this, plants were cultivated for 21 days at salinities 25, 35 and 45. The species presented several cellular and Biochemical alterations under hypo and hypersaline stress. These changes occurred in all vegetative organs of the plant, but mainly in the leaf blade. At the root, the salinity 45 led to an increase of your thickness and quantity of root hairs, which, in turn, results in an increasing barrier to the radial flow of ions. In the leaf blade, more hydropotens were observed in samples exposed to salinity 45 with increased invaginations of the plasma membrane and cell wall. This increases the surface area of the leaf, facilitating exchanges with the environment. These invaginations were also observed in other epidermal cells of the leaf blade in all the samples, albeit in smaller proportions in samples treated in salinity 25. In particular, a significant retraction of the plasma membrane was observed in samples exposed to salinity 45, with possible deposition of compounds between the membrane and the cell wall. Osmotic stress in samples exposed to salinity 45 decreased the amount of total proteins, as well as the number of epidermal chloroplasts, in addition to affecting the internal organization of these organelles with the increase of plastoglobules and thylakoids by granum. Hypersaline condition led to an increase in the concentration of total sugars in the root and rhizome. In the leaf blade, increased concentration of these sugars occurred in the samples under both hypo- and hypersaline stress. Phenolic compounds were found in leaf epidermal cells of samples treated with salinities 25 and 45. They were also detected in the epidermal cell walls of the rhizome and leaf blade, albeit in lower proportion in samples treated with salinity 25. Samples that presented the lowest values of phenolic compounds in the root (salinity 25 and 45) reached the highest values in the leaf blade. Higher concentrations of flavonoids were found in the leaf blade in hyposaline condition. The arabinogalactan-proteins were intensely visualized in the cytoplasm and plasma membrane of the epidermal cells of the samples under hypersaline conditions, serving as membrane stabilization mechanism. These findings led us to conclude that H. wrightii can survive salinity variations from 25 to 45 for a period of 21 days without altering its growth rate. In salinity 35, the plant has greater cellular viability. Nevertheless, salt stress, both hypo and hypersaline, did decrease cell viability in this species. While ultrastructural modifications allowed H. wrightii to withstand salinity 45, changes in the photosynthetic apparatus showed that this species best tolerates salinities below this value.

A identificação de novos alvos terapêuticos no tratamento de glioblastomas multiformes (GBMs) se faz necessária devido ao mau prognóstico e ineficiência das terapias associadas a esses tumores. Nesta dissertação, avaliamos o envolvimento do Fator Nuclear kappaB (NFkappaB) e da via da PI3K/Akt no crescimento in vitro de glioblastomas, e o potencial uso dos inibidores de NFkappaB e de PI3K/Akt como possíveis agentes antitumorais. Com esta finalidade foram utilizados os inibidores farmacológicos de NFkappaB (partenolide), e de PI3K/Akt (quercetina e Ly294002), e o inibidor misto de NFkappaB/Akt (curcumina). Os inibidores de NFkappaB causaram uma significativa diminuição na viabilidade dos GBMs quando comparado com os inibidores de outras vias de sinalização (MAPK, MEK/ERK1/2, EGFr e JNK1/2), a qual foi tipo dose resposta. Além disso, os inibidores de NFkappaB apresentaram extravasamento de LDH no meio de cultura e perda de integridade da membrana plasmática que foi vista através da técnica do Iodeto de Propideo (PI). Já os inibidores de PI3K/Akt apresentaram um menor efeito do que o apresentado pelos inibidores de NFkappaB, não demonstrando uma curva do tipo dose resposta, ainda assim, diminuíram a viabilidade dos GBMs. Entretanto, não apresentaram extravasamento de LDH no meio de cultura, e não houve incorporação de PI, mostrando que, diferentemente do que ocorre com os inibidores de NFkappaB, a perda de viabilidade vista nas células tratadas com os inibidores de PI3K/Akt está preponderavelmente relacionada com uma diminuição na proliferação, e não com morte celular. Vimos também que os inibidores foram capazes de alterar o imunoconteúdo de fatores relacionados com morte e sobrevivência celular, tais como caspase 3, LC3 A/B, PARP e Hsp70, assim como o ciclo celular. Portanto, nossos resultados demonstram que a via da PI3K/Akt parece estar preferencialmente relacionada com a proliferação celular, enquanto a via do NFkappaB preferencialmente com sobrevivência. / The identification of new therapeutic targets for treatment of glioblastoma multiforme (GBMs) is necessary due to poor prognosis and ineffective therapies associated with these tumors. In this study we have assessed the role of Nuclear Factor-kappaB (NFkappaB) and the PI3K/Akt pathway in glioblastomas in vitro growth, and their inhibitors as potential antitumor agents. For this we used the pharmacological inhibitors of NFkappaB (Parthenolide), and PI3K/Akt (LY294002 and quercetin), and mixed inhibitor of NFkB / Akt (curcumin). NFkappaB inhibitors yielded a significant decrease in viability of GBMs compared to inhibitors of other signaling pathways (MAPK, MEK/ERK1/2, EGFr and JNK1 / 2), which was dose-dependent. Furthermore, inhibitors of NFkappaB showed LDH releasing in culture medium and membrane integrity losing, evaluated through the Propidium Iodide (PI)-based method. The PI3K/Akt inhibitors showed a smaller effect than NFkappaB inhibitors, also decreasing GBMs viability but playing no dose-dependence response. Despite there was not LDH releasing in culture medium and PI incorporation, showing that the loss of viability observed in cells treated with inhibitors of PI3K/Akt is associated with a decrease in the proliferation, unlike what happens with inhibitors of NFkappaB, no cell death was observed. We have also seen that the inhibitors were able to alter the contents of immune-related factors death and cell survival, such as caspase-3, LC3 A / B, PARP and Hsp70, as well as the cell cycle. Therefore, our results demonstrate that the PI3K/Akt pathway seems to be related to cell proliferation, while the NFkappaB pathway to survival.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A junção aderente (JA) é um dos principais componentes do complexo juncional apical. Esta juncão é um complexo multiprotéico em que a E-caderina, uma glicoproteína transmembrana, atua como principal mediadora da adesão célula-célula. Sua ancoragem ao citoesqueleto de actina ocorre via proteínas da família das cateninas. Modificações pós-traducionais da E-caderina, como fosforilação e glicosilação, podem modular a estabilidade e organização das JAs. Muitos estudos têm sugerido que no câncer a invasão e a metástase podem estar associadas a arranjos de glicanos na superfície celular. Em câncer colo-retal, o papel de alterações na expressão de glicanos sobre a estabilidade da adesão mediada por Ecaderina ainda não está claro. Neste estudo, investigamos a relação entre estas alterações e a estabilidade das JAs em células de câncer colo-retal. Nós utilizamos duas linhagens celulares com diferentes potenciais metastáticos, Caco-2 and HCT- 116, que constituem dois modelos de JAs: estáveis e instáveis, respectivamente. Ensaios de precipitação de lectinas e immunoblotting demonstraram que em HCT- 116, a linhagem mais invasiva, a E-caderina apresenta uma diminuição de glicanos reconhecidos pelas lectinas HPA e WGA, que reconhecem resíduos de Nacetilgalactosamina e, _-N-acetilhexosaminas e ácido siálico, respectivamente. Concomitantemente, em HCT-116 também foi observado um aumento de glicanos reconhecidos pelas lectinas L-PHA e E-PHA, que reconhecem respectivamente: acetilglicosamina_1,6-ligada formando N-glicanos tri- e tetraantenados e, Nacetilglicosamina bisectante _1,4-ligada formando N-glicanos biantenados. Ensaios de imunofluorescência mostraram que a presença desses glicanos reconhecidos por L-PHA, em HCT-116, é intensa na região de contato célula-célula quando comparada com células Caco-2, em que a marcação foi observada, predominantemente, na região apical. Além disso, a inibição completa da Nglicosilação por tunicamicina ou a inibição da síntese de N-glicanos complexos por swainsonina, aumentou a associação da E-caderina com o citoesquleto de actina em células HCT-116, mas não em Caco-2. Em células HCT-116, a inibição de Nglicosilação por tunicamicina produziu uma diminuição da atividade de ERK1/2 e a formação de adesão célula-célula foi mais evidente. Estes dados sugerem que alterações na expressão e localização subcelular de diferentes glicanos podem ser importantes eventos associados à perda da estabilidade das JAs em câncer coloretal. / The adherent junction (AJ) is one of the main components of the apical junctional complex. It is a multiprotein complex where E-cadherin, a transmembrane glycoprotein, acts as the main mediator of cell-cell adhesion in epithelium. This protein is anchored to the actin cytoskeleton via proteins of the catenin family. Posttranslational modifications of E-cadherin, such as phosphorylation and glycosylation, can modulate the assembly of AJs. Various studies have suggested that invasion and metastasis is associated to glycan patterns on the cell surface of tumor cells. In colorectal cancer the role of altered glycans expression and stability of E-cadherin-mediated adhesion is not clear. In this study we investigated the relation between changes of the glycans expression and AJs stability in colorectal cancer cells. We used two colon adenocarcinoma cell lines with different metastatic potential, Caco-2 and HCT-116, both models of stable and unstable AJs, respectively. Lectin binding assays demonstrated that in HCT-116, the more invasive cell line, E-cadherin presents a decrease of the glycans recognized by HPA and WGA lectins, which recognize N-acetylgalactosamine and, _-N-acetylhexosamines and sialic acid, respectively. Conversely, in HCT-116, there was an increase of glycans recognized by E-PHA and L-PHA lectins, which recognize bisecting _1,4- branched and _1,6-branched N-acetylglucosamine, respectively. Immunofluorescence assays showed a stronger L-PHA binding on cell-cell contact regions of HCT-116 cells when compared with Caco-2. Furthermore, in HCT-116 cells a complete inhibition of N-glycosylation by tunicamycin or inhibition of complex N-glycans synthesis by swainsonine increased the association of E-cadherin with the actin cytoskeleton. Finally, it was possible to observe that the inhibition of N-linked glycosylation by tunicamycin, leaded to a decreasing of ERK1/2 phosphorylation concomitantly with the formation of more intimate cell-cell contacts. These findings suggest that altered expression and subcellular localization of different glycans can be important events associated to loss of AJs stability in colorectal cancer.

Os fibrócitos foram inicialmente identificados pelo seu recrutamento rápido para os tecidos lesionados e por atuar diretamente na resposta imune através do reconhecimento, apresentação antigênica e produção de citocinas e quimiocinas. Segundo Grab (2004) fibrócitos podem participar da resposta imune na leishmaniaose e por isso no presente estudo propomos analisar a resposta celular e apresentação antigênica dos fibrócitos na infecção por L. (L.) amazonensis. Para os experimentos in vivo camundongos C57BL/6 e knockout para o receptor TLR-2 foram inoculados na derme auricular com 105 formas promastigotas de L. (L.) amazonensis e 1, 7, 15 dias após a infecção as regiões de inóculo e os linfonodos foram retirados e processados para citometria de fluxo. Para os experimentos in vitro fibrócitos foram obtidos de mononucleares do sangue periférico de camundongos C57BL/6. Os fibrócitos foram avaliados quanto às suas características morfológicas e fenotípicas, infecção, expressão de MHC-II/B7-1/B7-2 e ativação de linfócitos T CD4+. As análises na região de inóculo mostraram o aumento no percentual de fibrócito na derme de camundongos após 15 dias de infecção tanto em animais C57BL/6 quanto em animais KO TLR-2. Neste sítio, os fibrócitos produziram citocinas e expressaram MHC-II, B7-1 e B7-2 podendo participar da resposta imune. As análises no linfonodo mostraram a existência de um alto percentual de fibrócitos nos animais controle, contudo, após infecção este percentual foi reduzido. Após infecção verificamos que os fibrócitos de animais WT C57BL/6 foram capazes de produzir as citocinas IL-4, IL-10 e IFN-&#61543; durante o primeiro dia. Entretanto, na ausência de TLR-2 os fibrócitos presentes no linfonodo produziram TNF-&#945; e IFN-&#61543; que podem estar relacionadas com a ativação celular e aumento da capacidade de apresentação antigênica destas células durante a infecção. No linfonodo verificamos que os fibrócitos podem participar da apresentação antigênica após a infecção por L. (L.) amazonensis. Contudo, nos linfonodos de animais WT C57BL/6 observamos a redução significativa no percentual destas células expressando MHC-II e B7-1, o que pode estar relacionada a presença do TLR-2. Nos ensaios in vitro fibrócitos de camundongos C57BL/6 apresentaram alta capacidade endocítica, eliminaram os parasitas nas primeiras 24 horas de infecção, expressaram MHC-II/B7-1/B7-2 e foram capazes de ativar linfócitos T CD4+. Com isso, nossos resultados sugerem que os fibrócitos podem atuar na resposta celular e na apresentação antigênica durante a infecção por L. (L.) amazonensis, contudo estas funções podem ser moduladas pela participação do TLR-2 e pelo microambiente onde estes se encontram. / Fibrocytes were initially identified by their fast recruitment to the injured tissues and by acting directly on the immune response through recognition, antigen presentation and production of cytokines and chemokines. According to Grab et al., 2004 fibrocytes may participate in the immune response to leishmaniasis and therefore, in this study we propose to examine the cellular response and antigen presentation of fibrocytes in infection by L. (L.) amazonensis. In vivo experiments C57BL/6 and knockout receptor TLR-2 animals were inoculated in the ear dermis with 105 promastigotes of L. (L.) amazonensis and 1,7, 15 days after infection ears and lymph nodes were removed and processed for flow cytometry. For in vitro experiments peripheral blood fibrocytes from C57BL/6 mice were evaluated for their morphological and phenotypic, MHC-II/B7-1/B7-2 expression and ability to activate CD4+ T cells. The analyses in the inoculum region showed significant increase in the percentage of fibrocyte in the C57BL/6 and TLR-2 knockout mice after 15 days of infection. At this site fibrocytes part of the immune response by cytokines production and MHC-II, B7-1 and B7-2 expression. The analyses in the lymph node showed the existence of a high percentage of fibrocytes in the control animals, however, after infection, this percentage was reduced. After infection it was verified that the fibrocytes of C57BL/6 were able to produce cytokines IL-4, IL-10 and IFN-&#61543; during the first days. However, in the absence of TLR-2 fibrocytes in the lymph produced TNF-&#945; and IFN-&#61543; that may be related to cell activation and increased antigen presentation capacity of these cells during infection. In the lymph node it was found that fibrocytes may participate in antigen presentation after infection with L. (L.) amazonensis. However, in lymph nodes of mice C57BL/6 it was observed the significant reduction in the percentage of those cells expressing MHC-II, B7-1, which can be related to the presence of the TLR-2. In vitro fibrocytes of C57BL/6 showed high endocytic capacity, eliminating the parasites within the first 24 hours after infection, and expressed MHC-II/B7-1/B7-2 being were able to activate CD4 + T cells. Thus, our results suggest that fibrocytes may act in cellular response and antigen presentation during infection by L. (L.) amazonensis, however these functions can be modulated by the involvement of TLR-2 and the in microenvironment.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento, Florianópolis, 2015. / Made available in DSpace on 2016-05-24T17:29:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 337729.pdf: 1221821 bytes, checksum: 7c57ec1110e16404029739f864df5aae (MD5) Previous issue date: 2015 / O fenômeno conhecido como Tolerância à primeira exposição, do inglês "One Trial Tolerance (OTT)", vem sendo estudado durante os últimos 25 anos. Porém, os seus mecanismos subjacentes (neurobiológicos, moleculares, genéticos), ainda não foram totalmente desvendados. No OTT, uma simples experiência no labirinto em cruz elevado (LCE) reduz significativamente a ação das drogas, que exercem um efeito ansiolítico em roedores, quando estes são reexpostos ao teste. O estado farmacológico dos roedores durante a primeira exposição ao teste não influencia no desenvolvimento da tolerância criada por esta primeira passagem pelo LCE, e o fenômeno, parece persistir mesmo com um intervalo de duas semanas entre o teste e o reteste. No presente trabalho, nós investigamos o OTT em ratos machos e fêmeas, adultos, de duas linhagens diferentes, SLA16 (SHR.LEW-Anxrr16) e seu controle isogênico SHR (Spontaneously Hypertensive Rats). Inicialmente foi realizada uma caracterização comportamental de todos os grupos experimentais, sendo expostos durante cinco dias repetidos ao Teste Triplo (TT) (experimento 1) ou ao LCE (experimento 2), em um estado sem droga. Após, nós avaliamos o OTT no TT, utilizando novamente ratos machos e fêmeas adultos das linhagens SLA16 e SHR, utilizando doses baixas de midazolam (MDZ), (experimento 3). Nossos resultados para o experimento 1 sugeriram a ausência de OTT em todos os grupos. No experimento 2, os resultados sugerem que ao menos as fêmeas SLA16 apresentam total ausência de OTT em um estado sem droga quando testada também no LCE. Por fim, no experimento 3, foi observado que em machos, não ocorreu o OTT e em fêmeas a ausência do OTT foi verificada nos dias 3 e 4. Portanto, o TT demonstrou ser um teste comportamental útil para pesquisa de novos fármacos podendo ser utilizado para triagem de drogas ansiolíticas. Além disso, a linhagem SLA16, especialmente as fêmeas, parece ser uma ferramenta genética promissora para a pesquisa de novos fármacos, ou dos mecanismos biológicos subjacentes ao OTT.<br> / Abstract : The phenomenon known as "One Trial Tolerance" (OTT) has been studied for the past 25 years. However, its underlying mechanisms (neurobiological, molecular, genetic), have not been fully unraveled. In OTT, a trial in elevated plus maze (EPM) significantly reduces the action of drugs that exert anxiolytic effects in rodents, when they are re-exposed into this test. The rodents pharmacological state during the first test exposure does not influence the development of tolerance created by this first trial in the EPM, and the phenomenon seems to persist even with an interval of two weeks between the test and the retest. In this study, we investigated the OTT in males and females, adults, of two rat strains, SLA16 (SHR.LEW-Anxrr16) and its inbred control SHR (spontaneously hypertensive rats). Initially, we performed a behavioral characterization of all experimental groups exposed them for five repeated days into Triple Test (TT) (experiment 1) or EPM (experiment 2) in a drug-free state. After we evaluated the OTT in TT, again using adult male and female SLA16 and SHR strains , using low doses of midazolam (MDZ) (experiment 3). Our results for the first experiment suggested the absence of OTT in all groups. In the experiment 2, the results suggested that at least the SLA16 females have total absence of OTT in a drug-free state, also when tested in the EPM. Finally, in the experiment 3, males didn?t exhibited OTT what occurred on days 3 and 4 in females. Therefore, the TT proved a useful behavioral assay for screening of new anxiolytic drugs. Furthermore, SLA16 strain, especially females, appears to be a promising tool for genetic research on new drugs or biological mechanisms underlying the OTT.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento, Florianópolis, 2015. / Made available in DSpace on 2016-05-24T17:30:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 337730.pdf: 3042114 bytes, checksum: b1db87538875d11b0c2804170ae64711 (MD5) Previous issue date: 2015 / Elevados níveis do aminoácido homocisteína (Hcy) são caracterizados como uma desordem metabólica denominada - hiperhomocisteinemia, a qual está envolvida com a ocorrência de anomalias congênitas. No sistema nervoso central (SNC) especificamente, esta condição está associada ao dano ao DNA, citotoxicidade neuronal, estresse oxidativo e prejuízo na síntese de neurotransmissores. Neste estudo, foi avaliado o efeito da dose alta de Hcy sobre a expressão das proteínas do ciclo celular, diferenciação e sobrevivência neural. Adicionalmente, investigamos o efeito da Hcy sobre a ultraestrutura das células do mesencéfalo em embriões de Gallus domesticus. Para tal, os embriões foram tratados com 48 horas de incubação (E2) onde foram organizados dois grupos experimentais: controle - 50 µl salina e Hcy - 20 µmol Hcy/50 µl salina. Os embriões foram analisados em duas idades - E6 e E10. Através da técnica de imuno-histoquímica, verificou-se uma redução significativa da proliferação celular na camada ependimária do mesencéfalo nos embriões em E6. A avaliação da expressão das demais proteínas envolvidas no ciclo celular como p53, p21, ciclina E e PCNA foi realizada pela combinação das técnicas de citometria de fluxo e imuno-histoquímica. O tratamento com Hcy induziu um aumento na expressão da proteína p53, e uma diminuição na expressão das proteínas p21 e ciclina E. Para as proteínas envolvidas no processo apoptótico, como BCL2 e BAK, não foram encontradas diferenças significativas nas duas idades analisadas. Na análise da diferenciação neural encontramos um aumento significativo na expressão da proteína GFAP em E6, o que caracterizamos como um processo de resposta celular denominado gliose reativa. Porém, esta resposta foi normalizada nos embriões na idade E10. Para a análise de sobrevivência neural, houve uma redução na expressão de BDNF e GDNF nos embriões expostos à Hcy na idade de E6. Por fim, através da técnica de microscopia eletrônica de transmissão, a análise ultraestrutural das células revelou alterações relacionadas ao espaço perinuclear e a formação anômala de membrana nos embriões expostos à Hcy nas idades de E6 e E10. Os resultados demonstram que, embora a Hcy não tenha induzido anomalias congênitas aparentes no SNC, o tratamento comprometeu os processos de proliferação celular, diferenciação glial e sobrevivência neural em G. domesticus.<br> / Abstract : High levels of amino acid homocysteine (Hcy) are characterized as a metabolic disorder named hyperhomocysteinemia, which is related to the occurrence of congenital anomalies. Specifically in the nervous system (CNS), this condition is associated with DNA damage, neuronal cytotoxicity, oxidative stress and impaired neurotransmitter synthesis. This study evaluated the effect of Hcy on the expression of cell cycle proteins, neuronal differentiation and survival. Additionally we investigated the effect of Hcy on the ultrastructure of midbrain in embryos aged E6 and E10. Thus, fertilized eggs of Gallus domesticus were treated at 48 hours of incubation (E2). Two experimental groups were organized: Control - 50 µl saline and Hcy - 20 µmol Hcy/50 µl saline. Embryos were analyzed at two embryonic ages - E6 and E10. Immunohistochemistry showed a significant reduction in expression cell proliferation in the ependymal layer of the midbrain at E6. Evaluation of expression of the other proteins involved in cell cycle such as p53, p21, cyclin E and PCNA were performed by the combination of flow cytometry and immunohistochemistry Hcy treatment induced an increase in p53 expression, and a decrease in the expression of the proteins p21 and cyclin E. Proteins involved in apoptosis, as BCL2 and BAK, not showed significant differences in both ages examined. The analysis of neural differentiation found a significant increase in protein expression GFAP at E6, which characterized as a process of cellular response termed reactive gliosis, but this response was standardized at E10. The quantification of the proteins neuronal survival BDNF and GDNF were quantified by flow cytometry and a significant reduction was found in embryos exposed to Hcy at E6, and this pattern is reversed at E10. Finally, by technique of transmission electron microscopy, the ultrastructural analysis of the cells showed changes related to the perinuclear space and the anomalous formation of membrane in embryos exposed to Hcy at E6 and E10. The results demonstrated that although Hcy did not induce congenital anomalies in the CNS, the treatment impaired the cellular processes of proliferation, differentiation glial and neuronal survival in G. domesticus.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento / Made available in DSpace on 2013-03-04T20:27:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 313801.pdf: 974036 bytes, checksum: 530e234617767e1e4ae8abcb35e16ff5 (MD5) / O câncer de mama é o segundo tipo de câncer mais frequente no mundo e de maior prevalência entre as mulheres. Sabe-se que células tumorais alteram o microambiente para facilitar o escape do sistema de imunovigilância, sendo que, dentre as alterações está a alta expressão de HLA-G. O HLA-G possui na sua 3'UTR sítios polimórficos dentre eles um 14pb*InDel e um SNP +3142 C/G, ambos relacionados com a estabilidade e expressão do gene. Objetivou-se genotipar esses 2 polimorfismos, em 203 pacientes e 211 controles (pareados por idade) e verificar a influência desses polimorfismos na patogênese da doença. Realizou-se um levantamento de dados epidemiológicos relacionados ao desenvolvimento da doença (menarca precoce, menopausa tardia, utilização de contraceptivo oral, gestações, amamentação, histórico familial para o câncer de mama e hábito tabagista) e estes foram testados como fatores de risco. O DNA foi extraído de sangue total e a genotipagem feita por SSP e visualizada em PAGE 7% corado com nitrato de prata. Após as análises foram encontradas associações dos polimorfismos e o risco de desenvolver câncer de mama para o alelos 14pb*In OR=1,404 (p=0,019), 14pb*In*In OR=2,218 (p=0,004). Também se encontrou proteção ao desenvolvimento da patologia 14pb*DelDel+14pb*InDel OR=0,451 (p=0,004). Para os fatores de risco obteve-se associação com histórico familial OR=2,676 (p=0), hábito tabagista OR=2,624 (p=0) e utilização de contraceptivo oral por mais de cinco anos OR=1,668 (p=0,014). Para haplótipos *In/G (01) e *In/G*In/G (0101), OR=1,926, (p=0,001) e OR=5,380, (p=0). Para haplótipos e fatores de risco: utilização de contraceptivo oral *In/G (01) OR=3,667 (p=0,021) e proteção para *Del/G (03) OR=0,160 (p=0); amamentar por menos de seis meses aos alelos *In/G (01) OR=2,692 (p=0,002) e com o haplótipo *In/G*In/G (0101) OR= 15,961 (p=0,002). Em conclusão, os polimorfismos da 3'UTR do HLA-G são associados à doença bem como aos dados epidemiológicos analisados neste trabalho.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento, Florianópolis, 2013 / Made available in DSpace on 2013-12-06T00:10:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 318121.pdf: 4575817 bytes, checksum: 020cbc46c65eab385604a74862c369a2 (MD5) Previous issue date: 2013 / O desequilíbrio no metabolismo do ácido fólico (AF) e da homocisteína (Hcy) está relacionado à ocorrência de defeitos do tubo neural (DTN). Os aspectos morfológicos e os mecanismos celulares envolvidos na gênese dos DTN provocados pelos elevados níveis de Hcy, ainda não foram adequadamente elucidados. O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos da Hcy sobre os mecanismos celulares envolvidos na morfogênese do tubo neural, com ênfase no desenvolvimento da medula espinhal e do esqueleto axial, utilizando embriões de Gallus domesticus como modelo experimental. Os embriões foram incubados (38ºC), pré-tratados com 26 h e tratados com 48 h de incubação. Foram organizados quatro grupos experimentais: AF - pré-tratado com 50 µl de salina e tratado com 0,5 ?g de AF / 50 µl de salina; Hcy - pré-tratado com 50 ?l de salina e tratado com 20 ?mol D,L-Hcy / 50 ?l salina; AF+Hcy - pré-tratado com 0,5 ?g AF / 50 ?l salina e tratado com 20 ?mol D,L-Hcy/50 ?l salina; controle - pré-tratado e tratado com 50 ?l de salina. Os embriões foram analisados em duas idades - E4 e E6. Foram encontradas diferentes categorias de DTN, acompanhadas de alterações na morfologia da medula espinhal e do esqueleto axial. A Hcy gerou estresse celular e oxidativo, reconhecidos pelo aumento da expressão da proteína de estresse HSP 70 induzível e da proteína anti-apoptótica Bcl 2, respectivamente. Além disso, houve aumento da carbonilação de proteínas e diminuição dos níveis de tióis não-proteicos (NPSH), indicando aumento da produção de espécies reativas de oxigênio (ERO) e redução das defesas antioxidantes. Alterações nos mecanismos de proliferação e diferenciação celulares nos tecidos neurais e mesenquimais foram evidenciadas por técnicas de imuno-histoquímica e RT-qPCR. A Hcy reduziu o número de células em proliferação e gerou danos ao DNA nas células dos tecidos neural e mesenquimal. A diferenciação neural foi comprometida pela Hcy, efeito evidenciado pela diminuição da expressão das proteínas p53 e ?-tubulina III na medula espinhal. A Hcy levou à redução da expressão de Pax 1/9 e Sox 9 no mesênquima. Os resultados demonstraram importantes efeitos da Hcy sobre mecanismos celulares e moleculares envolvidos no desenvolvimento da medula espinhal e do esqueleto axial e a provável relação destes efeitos com a gênese dos DTN na medula espinhal.<br>

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de ciências Biológica, Programa de Pós-graduação em em Biologia de Fungos, Algas e Plantas, Florianópolis, 2013. / Made available in DSpace on 2013-12-06T00:34:28Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento, Florianópolis, 2015. / Made available in DSpace on 2016-10-19T12:51:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 337730.pdf: 3042114 bytes, checksum: b1db87538875d11b0c2804170ae64711 (MD5) Previous issue date: 2015 / Elevados níveis do aminoácido homocisteína (Hcy) são caracterizados como uma desordem metabólica denominada - hiperhomocisteinemia, a qual está envolvida com a ocorrência de anomalias congênitas. No sistema nervoso central (SNC) especificamente, esta condição está associada ao dano ao DNA, citotoxicidade neuronal, estresse oxidativo e prejuízo na síntese de neurotransmissores. Neste estudo, foi avaliado o efeito da dose alta de Hcy sobre a expressão das proteínas do ciclo celular, diferenciação e sobrevivência neural. Adicionalmente, investigamos o efeito da Hcy sobre a ultraestrutura das células do mesencéfalo em embriões de Gallus domesticus. Para tal, os embriões foram tratados com 48 horas de incubação (E2) onde foram organizados dois grupos experimentais: controle - 50 µl salina e Hcy - 20 µmol Hcy/50 µl salina. Os embriões foram analisados em duas idades - E6 e E10. Através da técnica de imuno-histoquímica, verificou-se uma redução significativa da proliferação celular na camada ependimária do mesencéfalo nos embriões em E6. A avaliação da expressão das demais proteínas envolvidas no ciclo celular como p53, p21, ciclina E e PCNA foi realizada pela combinação das técnicas de citometria de fluxo e imuno-histoquímica. O tratamento com Hcy induziu um aumento na expressão da proteína p53, e uma diminuição na expressão das proteínas p21 e ciclina E. Para as proteínas envolvidas no processo apoptótico, como BCL2 e BAK, não foram encontradas diferenças significativas nas duas idades analisadas. Na análise da diferenciação neural encontramos um aumento significativo na expressão da proteína GFAP em E6, o que caracterizamos como um processo de resposta celular denominado gliose reativa. Porém, esta resposta foi normalizada nos embriões na idade E10. Para a análise de sobrevivência neural, houve uma redução na expressão de BDNF e GDNF nos embriões expostos à Hcy na idade de E6. Por fim, através da técnica de microscopia eletrônica de transmissão, a análise ultraestrutural das células revelou alterações relacionadas ao espaço perinuclear e a formação anômala de membrana nos embriões expostos à Hcy nas idades de E6 e E10. Os resultados demonstram que, embora a Hcy não tenha induzido anomalias congênitas aparentes no SNC, o tratamento comprometeu os processos de proliferação celular, diferenciação glial e sobrevivência neural em G. domesticus.<br> / Abstract : High levels of amino acid homocysteine (Hcy) are characterized as a metabolic disorder named hyperhomocysteinemia, which is related to the occurrence of congenital anomalies. Specifically in the nervous system (CNS), this condition is associated with DNA damage, neuronal cytotoxicity, oxidative stress and impaired neurotransmitter synthesis. This study evaluated the effect of Hcy on the expression of cell cycle proteins, neuronal differentiation and survival. Additionally we investigated the effect of Hcy on the ultrastructure of midbrain in embryos aged E6 and E10. Thus, fertilized eggs of Gallus domesticus were treated at 48 hours of incubation (E2). Two experimental groups were organized: Control - 50 µl saline and Hcy - 20 µmol Hcy/50 µl saline. Embryos were analyzed at two embryonic ages - E6 and E10. Immunohistochemistry showed a significant reduction in expression cell proliferation in the ependymal layer of the midbrain at E6. Evaluation of expression of the other proteins involved in cell cycle such as p53, p21, cyclin E and PCNA were performed by the combination of flow cytometry and immunohistochemistry Hcy treatment induced an increase in p53 expression, and a decrease in the expression of the proteins p21 and cyclin E. Proteins involved in apoptosis, as BCL2 and BAK, not showed significant differences in both ages examined. The analysis of neural differentiation found a significant increase in protein expression GFAP at E6, which characterized as a process of cellular response termed reactive gliosis, but this response was standardized at E10. The quantification of the proteins neuronal survival BDNF and GDNF were quantified by flow cytometry and a significant reduction was found in embryos exposed to Hcy at E6, and this pattern is reversed at E10. Finally, by technique of transmission electron microscopy, the ultrastructural analysis of the cells showed changes related to the perinuclear space and the anomalous formation of membrane in embryos exposed to Hcy at E6 and E10. The results demonstrated that although Hcy did not induce congenital anomalies in the CNS, the treatment impaired the cellular processes of proliferation, differentiation glial and neuronal survival in G. domesticus.