Made available in DSpace on 2013-12-27T01:01:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000452977-Texto+Completo-0.pdf: 5521705 bytes, checksum: 123159632e5331d0676a4575af283f7b (MD5) Previous issue date: 2013 / Modafinil is a drug that promotes increased alertness. It was approved for the treatment of excessive daytime sleepness in narcolepsy and obstructive sleep apnea. Some studies indicate that Modafinil can improve learning, memory and reverse cognitive loss induced by sleep deprivation and stress. This study was aimed to characterize the effects of modafinil on control adult rat’s memory. Further, its effects were also studied using three models of cognitive decline to assess modafinil effects on memory. The iron overload model on neonatal period related to the degenerative diseases, maternal deprivation on neonatal period that generates emotional and cognitive impairment on adulthood, and, paradoxal sleep deprivation, which is known to interfere with on memory consolidation. The first experiment investigated the effects of the drug on memory consolidation and retrieval using distinct paradigms of learning; object recognition and inhibitory avoidance (aversive memory task) in healthy adult rats. Male Wistar rats received a single injection of acute modafinil (0. 0; 0. 75; 7. 5 or 75 mg/kg) immediately after training or one hour before object recognition or inhibitory avoidance retention tests. Acute administration of modafinil to healthy rats did not affect memory consolidation or retrieval. The second experiment examined the acute or chronic administration of modafinil on the reversal of memory deficits induced by iron overload in the neonatal period, a model of cognitive decline related to neurodegenerative disorders. Rats treated with iron between 12 and 14 postnatal days received in adulthood, acute intraperitoneal injection of modafinil (0. 0; 0. 75; 7. 5 and 75 mg/kg) immediately after training in the recognition task object. A single injection of modafinil at the highest dose was able to recover recognition memory in rats treated with iron. In order to investigate the effects of chronic treatment with modafinil, irontreated rats received intraperitoneal injections of modafinil at the same doses for seventeen days. Twenty-four hours after the last injection, the animals were submitted to object recognition or inhibitory avoidance training. Memory retention tests were performed twenty four hours after training. Chronic administration of modafinil fully recovered memory deficits induced by iron both in recognition memory and emotional memory. Experiment III evaluated the effects of maternal deprivation combined with paradoxical sleep deprivation (PSP) on recognition memory. Wistar rats separated from their mothers for fourteen days, three hours per day, underwent PSP for twenty four hours in adulthood. The model allowed to investigate the ability to reverse such deficits with administration of modafinil that was effective in restoring cognitive decline caused by maternal deprivation and PSP. The use and commercialization of modafinil as a stimulant is widely proved. To support its application in the memory loss associated with neurodegenerative disorders, stress in early life and PSP, additional preclinical and clinical research are needed. This study shows, however, through the proposed models of cognitive decline, the drug effectiveness in reversing such memory deficits. / O Modafinil é um fármaco que promove o aumento do estado de alerta, e foi aprovado para o tratamento da sonolência diurna excessiva na narcolepsia e apnéia obstrutiva do sono. Alguns estudos indicam que o modafinil pode melhorar a aprendizagem, a memória e reverter déficits cognitivos induzidos pela privação de sono e estresse. No presente trabalho tivemos como objetivo caracterizar os efeitos do modafinil sobre a memória em ratos adultos saudáveis. Além disso, seus efeitos também foram estudados utilzando-se três modelos de declínio cognitivo para avaliar os efeitos do modafinil sobre a memória: o modelo da sobrecarga de ferro no período neonatal relacionado com as doenças neurodegenerativas, a separação materna no período neonatal que gera um prejuízo emocional e cognitivo na idade adulta e, por fim, a privação de sono paradoxal que interfere na consolidação da memória. No experimento I foram investigados os efeitos do fármaco sobre a consolidação e a evocação da memória utilizando-se distintos paradigmas de aprendizagem: reconhecimento de objetos e esquiva inibitória (tarefa de memória aversiva) em ratos adultos saudáveis. Ratos Wistar adultos receberam uma injeção aguda de modafinil (0,75; 7,5 ou 75 mg/kg) ou veículo imediatamente após o treino ou 1 hora antes do teste nas tarefas de reconhecimento de objetos ou de esquiva inibitória. A administração aguda de modafinil em ratos saudáveis não afetou a consolidação e nem a evocação da memória. O experimento II analisou os efeitos da administração aguda ou crônica de modafinil sobre os déficits de memória induzidos pela sobrecarga de ferro no período neonatal, um modelo de declínio cognitivo relacionado a distúrbios neurodegenerativos. Ratos tratados com ferro entre o 12º e 14º dia pós natal receberam, na idade adulta, uma injeção intraperitoneal aguda de modafinil (0,75; 7,5 e 75 mg/kg) ou veículo imediatamente após o treino da tarefa de reconhecimento de objeto. Uma injeção aguda de modafinil na dose mais elevada foi capaz de recuperar a memória de reconhecimento em ratos tratados com ferro. A fim de investigar os efeitos do tratamento crônico com modafinil, os ratos tratados com ferro receberam injeções diárias de modafinil nas mesmas doses por 17 dias. Vinte e quatro horas após a última injeção, os animais foram submetidos às tarefas de reconhecimento de objetos e esquiva inibitória. Os testes de retenção de memória foram realizados 24 horas após o treino. A administração crônica de modafinil recuperou completamente os déficits de memória induzidos pelo ferro, tanto na memória de reconhecimento quanto na memória emocional. O experimento III avaliou os efeitos da separação materna combinada com a privação de sono paradoxal (PSP) sobre a memória de reconhecimento. Ratos Wistar separados da mãe durante 14 dias, três horas por dia, foram submetidos a PSP por vinte e quatro horas na idade adulta. O modelo permitiu investigar a capacidade de reversão de tais déficits com a administração de modafinil que foi efetivo em recuperar o declínio cognitivo causado pela separação materna e pela PSP. A utilização e a comercialização do modafinil como estimulante são amplamente fundamentadas. Para dar suporte à sua aplicação na perda de memória associada às perturbações neurodegenerativas; ao estresse no início da vida e à PSP, pesquisas pré clínicas e clínicas adicionais são necessárias. Este estudo comprova por meio dos modelos de declínio cognitivo propostos, a efetividade do fármaco em reverter tais déficits de memória.

Made available in DSpace on 2014-08-01T02:01:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000460008-Texto+Completo-0.pdf: 656276 bytes, checksum: f353cd5be78400bf9c6ccd1015321021 (MD5) Previous issue date: 2014 / Healthy aging is characterized by the ability of the immune system in preserve some of their functions intact, avoiding the appearance of some age-related diseases and thus contributing to reaching longevity. Furthermore, healthy aging is associated to a better stress coping. Studies have demonstrated immunological changes occurred in old individuals, as well as the consequences of stress on aging. However, few studies have addressed such changes in very old subjects. Here, we analyzed emotional factors and the changes in the lymphocytes subpopulations involved on aging, and the role of these changes to reach longevity healthily. A group of twenty healthy very old subjects together with a group of healthy old individuals and a groups of healthy young adults were recruited in this study. Stress levels were assessed by Perceived Stress Scale (PSS), while depression levels were investigated by Beck Depression Inventories – II (BDI-II). Lymphocytes were isolated and assessed by flow cytometry. We observed some age-related changes in lymphocyte subpopulations. In particular, it was evidenced a similar CD4/CD8 ratio between very old subjects and young adults, with this rate being increased in old subjects. A significant increase in the percentage of Natural Killer cells (CD56+CD16+) was observed in the very old subjects, showing that the activity of these cells is well preserved in this group of subjects. Also, we noticed that very old subjects are less stressed, when compared to the other groups. Our data suggests that the combination between increasing and decreasing specific immune functions may generate a balance in the immune system, contributing to reach longevity healthily. / O envelhecimento bem sucedido é caracterizado pela habilidade do sistema imune em manter algumas de suas funções intactas, evitando, assim, o aparecimento de doenças relacionadas à idade, e, portanto, contribuindo para o alcance da longevidade. Além disso, o envelhecimento bem sucedido também está relacionado a uma melhor maneira de lidar com o estresse. Diversos estudos vêm demonstrando as alterações imunológicas ocorridas em indivíduos idosos, assim como as consequências do estresse para o envelhecimento. No entanto, poucos são os estudos que visam observar essas alterações em indivíduos longevos. Neste estudo, analisamos fatores psíquicos e alterações nos subtipos linfocitários envolvidos no envelhecimento e o papel destas alterações para o alcance da longevidade de maneira saudável. Vinte longevos (86-99 anos), 15 idosos (60-80 anos) e 13 jovens adultos saudáveis (20-50 anos) foram recrutados neste estudo. Os níveis de estresse foram avaliados pela Escala de Estresse Percebido (PSS), enquanto que os níveis de depressão foram investigados através do Inventário de Depressão Beck – II (BDI-II). As células mononucleares de sangue periférico foram isoladas e os subtipos linfocitários avaliados por citometria de fluxo. Dentre as populações avaliadas estão as células T CD4+, T CD8+, B CD19+ e células NK CD56+. Observamos diversas alterações idade dependente nos subtipos linfocitários. Em particular, foi evidenciada uma razão CD4/CD8 similar entre longevos e jovens, com um aumento desta razão ocorrendo em indivíduos idosos. Um aumento significativo na percentagem das células Natural Killers (CD56+CD16+) foi observado nos longevos, sugerindo que a atividade destas células está bem preservada nestes indivíduos. Além disso, foi visto que os longevos são menos estressados, quando comparados aos outros grupos. Concluindo, nossos resultados sugerem que a combinação entre o aumento e o decréscimo de funções imunes específicas pode gerar um balanço no sistema imune, contribuindo para que se alcance a longevidade de forma saudável.

Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro / O câncer colorretal (CCR) é o terceiro tipo de câncer mais incidente no mundo para o sexo masculino, o segundo para o sexo feminino e a radioterapia é um dos tratamentos de primeira linha no combate a este tipo de câncer. Durante a progressão do CCR as células sofrem alterações morfogenéticas, sendo a desorganização do complexo juncional apical (CJA) um dos eventos iniciais desse processo. As junções oclusivas (JTs) são um dos principais componentes da CJA e desempenham papel importante no controle do fluxo paracelular, na determinação da polaridade celular e na transdução de sinais relacionados com a progressão tumoral. As claudinas são proteínas transmembrana, constituintes das JTs e cumprem um importante papel no controle desses eventos. Alterações na expressão das claudinas são observadas em tumores de diferentes órgãos e têm sido relacionadas com a progressão tumoral. No entanto os mecanismos que regulam essas alterações e sua consequência na progressão do CCR são poucos conhecidos. Desta forma, o presente estudo teve como objetivo avaliar a influência da superexpressão da claudina-3 na radiorresposta de células CCR. Nossos resultados mostraram que a superexpressão de claudina-3 minimiza alterações morfológicas causadas pela radiação, causa diminuição da resistência elétrica transepitelial e não tem efeito na permeabilidade a macromoléculas após a irradiação. Além disso, observamos que a superexpressão de claudina-3 aumenta o potencial proliferativo das células e que esta característica torna as células mais sensíveis a radiação. Porém quando avaliamos eventos celulares relacionados a progressão tumoral observamos que apesar da radiação diminuir a capacidade migratória das progênies, as células que superexpressam claudina-3 apresentam migração mais elevada. Além disso, verificamos que a superexpressão de claudina-3 diminui a invasão e a capacidade de formação de colônias frente ao tratamento com a radiação. Em seguida fomos avaliar o efeito da inibição das vias de proliferação (MEK/ERK) e sobrevivência (PI3K-Akt) na resposta das células que superexpressam claudina-3 frente a radiação. Observamos que a inibição de MEK é capaz de sensibilizar as células que superexpressam claudina-3 à radiação no ensaio de proliferação celular, no entanto a inibição de MEK e PI3K antes da exposição à radiação é capaz aumentar a migração e a capacidade de formação de colônias de células que superexpressam claudina-3 contribuindo para o aumento do potencial maligno. Em conjunto nossos resultados mostram que a superexpressão de claudina-3 contribui para um fenótipo mais maligno, no entanto frente ao tratamento com a radiação é capaz de sensibilizar as células. / Colorectal cancer (CRC) is the third more incident cancer for males, the second for females worldwide and radiotherapy is one of the first-line treatments to fighting this type of cancer. During the progression of CRC cells undergo morphogenetic alterations and the apical junctional complex disorganization (AJC) is one of the initial events of this process. The tight junctions (TJs) is a major component of AJC and play an important role in paracellular flux control, determination of cell polarity and in signal transduction related to tumor progression. Claudins are transmembrane proteins, members of TJs and play an important role on these events. Changes on claudins expression are found in tumors of different organs and have been associated with tumor progression. However the mechanisms that regulate these changes and their consequences in the CRC progression are not completely understood. Thus, this study aimed to evaluate the influence of claudin-3 overexpression on cellular response after radiation treatment of CRC cells. Our results show that claudin-3 overexpression minimizes morphological changes caused by the radiation, decrease transepithelial electrical resistance, and has no effect on macromolecules permeability after irradiation. Moreover, we observed that claudin-3 overexpression increases the proliferation rate of cells and that this feature makes the cells more sensitive to radiation. However, when evaluating the cellular events associated tumor progression we observed that despite decrease on migratory capacity caused by radiation, cells that overexpress claudin-3 have higher migration. In addition, we found that claudin-3 overexpression decreases the invasion and the capacity to form colonies after treatment with radiation. Then we evaluate the effect of inhibition of proliferation (MEK / ERK) and survival (PI3K-Akt) pathways in cells that overexpress claudin-3 in the response to radiation. We observed that inhibition of MEK could sensitize cells overexpressing claudin-3 radiation on cell proliferation assay, but the inhibition of MEK and PI3K before radiation exposure can increase the migration and colony forming ability cells overexpressing claudin-3 contributes to the increase of malignant potential. Altogether, our results show that claudin-3 overexpression contributes to a more malignant phenotype, however, claudin-3 overexpression is able to sensitize the cells to radiation.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A junção aderente (JA) é um dos principais componentes do complexo juncional apical. Esta juncão é um complexo multiprotéico em que a E-caderina, uma glicoproteína transmembrana, atua como principal mediadora da adesão célula-célula. Sua ancoragem ao citoesqueleto de actina ocorre via proteínas da família das cateninas. Modificações pós-traducionais da E-caderina, como fosforilação e glicosilação, podem modular a estabilidade e organização das JAs. Muitos estudos têm sugerido que no câncer a invasão e a metástase podem estar associadas a arranjos de glicanos na superfície celular. Em câncer colo-retal, o papel de alterações na expressão de glicanos sobre a estabilidade da adesão mediada por Ecaderina ainda não está claro. Neste estudo, investigamos a relação entre estas alterações e a estabilidade das JAs em células de câncer colo-retal. Nós utilizamos duas linhagens celulares com diferentes potenciais metastáticos, Caco-2 and HCT- 116, que constituem dois modelos de JAs: estáveis e instáveis, respectivamente. Ensaios de precipitação de lectinas e immunoblotting demonstraram que em HCT- 116, a linhagem mais invasiva, a E-caderina apresenta uma diminuição de glicanos reconhecidos pelas lectinas HPA e WGA, que reconhecem resíduos de Nacetilgalactosamina e, _-N-acetilhexosaminas e ácido siálico, respectivamente. Concomitantemente, em HCT-116 também foi observado um aumento de glicanos reconhecidos pelas lectinas L-PHA e E-PHA, que reconhecem respectivamente: acetilglicosamina_1,6-ligada formando N-glicanos tri- e tetraantenados e, Nacetilglicosamina bisectante _1,4-ligada formando N-glicanos biantenados. Ensaios de imunofluorescência mostraram que a presença desses glicanos reconhecidos por L-PHA, em HCT-116, é intensa na região de contato célula-célula quando comparada com células Caco-2, em que a marcação foi observada, predominantemente, na região apical. Além disso, a inibição completa da Nglicosilação por tunicamicina ou a inibição da síntese de N-glicanos complexos por swainsonina, aumentou a associação da E-caderina com o citoesquleto de actina em células HCT-116, mas não em Caco-2. Em células HCT-116, a inibição de Nglicosilação por tunicamicina produziu uma diminuição da atividade de ERK1/2 e a formação de adesão célula-célula foi mais evidente. Estes dados sugerem que alterações na expressão e localização subcelular de diferentes glicanos podem ser importantes eventos associados à perda da estabilidade das JAs em câncer coloretal. / The adherent junction (AJ) is one of the main components of the apical junctional complex. It is a multiprotein complex where E-cadherin, a transmembrane glycoprotein, acts as the main mediator of cell-cell adhesion in epithelium. This protein is anchored to the actin cytoskeleton via proteins of the catenin family. Posttranslational modifications of E-cadherin, such as phosphorylation and glycosylation, can modulate the assembly of AJs. Various studies have suggested that invasion and metastasis is associated to glycan patterns on the cell surface of tumor cells. In colorectal cancer the role of altered glycans expression and stability of E-cadherin-mediated adhesion is not clear. In this study we investigated the relation between changes of the glycans expression and AJs stability in colorectal cancer cells. We used two colon adenocarcinoma cell lines with different metastatic potential, Caco-2 and HCT-116, both models of stable and unstable AJs, respectively. Lectin binding assays demonstrated that in HCT-116, the more invasive cell line, E-cadherin presents a decrease of the glycans recognized by HPA and WGA lectins, which recognize N-acetylgalactosamine and, _-N-acetylhexosamines and sialic acid, respectively. Conversely, in HCT-116, there was an increase of glycans recognized by E-PHA and L-PHA lectins, which recognize bisecting _1,4- branched and _1,6-branched N-acetylglucosamine, respectively. Immunofluorescence assays showed a stronger L-PHA binding on cell-cell contact regions of HCT-116 cells when compared with Caco-2. Furthermore, in HCT-116 cells a complete inhibition of N-glycosylation by tunicamycin or inhibition of complex N-glycans synthesis by swainsonine increased the association of E-cadherin with the actin cytoskeleton. Finally, it was possible to observe that the inhibition of N-linked glycosylation by tunicamycin, leaded to a decreasing of ERK1/2 phosphorylation concomitantly with the formation of more intimate cell-cell contacts. These findings suggest that altered expression and subcellular localization of different glycans can be important events associated to loss of AJs stability in colorectal cancer.

Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Several studies involving Trypanosoma cruzi infection have shown anti-tumor characteristics of the parasite and some of its proteins. A protein with a molecular weight of 21kDa was sequenced, cloned and characterized as being a protein secreted by the parasite which is directly involved in cell invasion by amastigote and trypomastigote forms, this protein was named P21. Studies carried out with recombinant form of this protein, rP21 shows that it has some biological activities which may some beneficial role of this protein in inflammatory processes and even the development of tumors. Breast cancer is the second most common cancer in the world and the experimental model used most commonly to represent is the Ehrlich tumor. This study aimed to evaluate the effects of recombinant protein rP21 of T. cruzi in Ehrlich tumor cells. Initially, the cell viability was analyzed using Ehrlich cells and peritoneal macrophages from BALB/c mice exposed to different concentrations of rP21 in different exposure times and both types of cells remained viable at all times and the protein concentrations. The effect of this chemoattractant protein was evaluated by an invasion assay, which demonstrated that the protein was not able to induce cell invasion Ehrlich, however, the protein was able to induce the invasion of peritoneal macrophages. After that, the capacity of the polymerization of actin cytoskeleton by rP21 was analyzed, showing that the protein is capable of polymerization cytoskeleton in a dose-dependent manner. It was also seen that the solid Ehrlich tumor model, treatment with rP21 shown to inhibit tumor growth. From these features, the biological activities of the protein rP21 are restated, showing the possibility of use of the protein in the anti-tumor treatment. / Vários estudos envolvendo infecção por Trypanosoma cruzi têm mostrado características anti-tumorais tanto do parasita quanto de algumas de suas proteínas. Uma proteína com peso molecular de 21kDa foi sequenciada, clonada e caracterizada sendo uma proteína secretada pelo parasita e que está envolvida diretamente na invasão celular por formas amastigota e tripomastigota, essa proteína foi denominada de P21. Estudos desenvolvidos com a forma recombinante dessa proteína, rP21 mostra que ela apresenta algumas atividades biológicas, o que poderia garantir algum papel benéfico dessa proteína em processos inflamatórios e até mesmo no desenvolvimento de tumores. O câncer de mama é o segundo tipo mais comum de câncer no mundo, sendo que o modelo experimental utilizado mais comumente para representá-lo é o tumor de Ehrlich. Assim, este estudo teve como objetivo avaliar os efeitos da proteína recombinante rP21 de T. cruzi em células de tumor de Ehrlich. Inicialmente, a viabilidade celular foi analisada utilizando células de Ehrlich e macrófagos peritoneais de BALB/c expostos a diferentes concentrações de rP21 em diferentes tempos de exposição, sendo que ambos os tipos celulares permaneceram viáveis em todos os tempos e concentrações da proteína. O efeito quimioatraente desta proteína foi avaliada por um ensaio de invasão, que demonstrou que a proteína não foi capaz de induzir a invasão de células de Ehrlich, no entanto, a proteína foi capaz de induzir a invasão de macrófagos peritoneais. Após isso, a capacidade de polimerização do citoesqueleto de actina pela rP21 foi analisada, mostrando que a proteína apresenta a capacidade de polimerização do citoesqueleto de uma forma dose-dependente. Também foi visto que no modelo de tumor sólido de Ehrlich, o tratamento com a rP21 demonstrou inibir o crescimento tumoral. A partir dessas características, as atividades biológicas da proteína rP21 são reafirmadas, mostrando a possibilidade de um emprego da proteina no tratamento anti-tumoral. / Mestre em Biologia Celular e Estrutural Aplicadas

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that presents different strain types and degrees of virulence. The strains are classificated like clonal or typical and exotic or atypical. This parasite presents several evasion mechanisms, which guarantees the successful replication in the host cell and, between these mechanisms, there is ability to modulate apoptosis of infected cells as well of cells in the microenvironment of infection. The present work aimed to evaluate de ability of two atypical strains of T. gondii (Udi1CH-05 and Udi2CH-05) on modulation of apoptosis in BeWo cells, the susceptibility of these cells by infection, as well as the influence of those strains on the standard of secretion of cytokines by the trophoblastic cells lineage. These parameters were evaluated from the perspective of the immediate origin of the strains derived directly from cell culture or from animals and maintained for a short period in culture (here called Calomys callosus / culture). The Udi1CH-05 culture category upregulated apoptosis from 12 hours post infection, and from 2 hours of infection by Udi2CH-05, culture category, apoptosis was uncontrolled in BeWo cells. The condition C. callosus / culture of both strains didn t control apoptosis when compared to uninfected control. BeWo cells infected with Udi2CH-05, C. callosus / culture category produce high levels of IL-12 in the early stages of infection, suggesting a typical inflammatory response. Levels of TNF-α were higher in the early stages of infection and with a gradual decrease production, coinciding with failure to induce apoptosis when cells were infected BeWo Udi2CH-05, C. callosus / culture category. The levels of IL-10 found during infection of BeWo cells by Udi1CH-05 indicate that other cytokines may be involved in the control of infection, whereas this cytokine acts in controlling the immune response induced by infection of cells by BeWo Udi2CH-05, C. callosus / culture category. The production of TGF-β detected by infection Udi1CH-05 C. callosus / culture or Udi2CH-05 of both categories, shows that this cytokine acts in the immunoregulation of infected cells, whereas infection by Udi1CH-05, culture category, suggests that other anti-inflammatory cytokines can participate in immunoregulation, since the increase the apoptosis rate coincided with the decreased production of TGF-β. / Toxoplasma gondii é um parasito intracelular obrigatório que apresenta diferentes tipos de cepas e graus variados de virulência. As cepas são classificadas como clonais e cepas exóticas ou atípicas. Este parasito apresenta diversos mecanismos de evasão, o que garante o sucesso na replicação na célula hospedeira e, entre estes mecanismos, destaca-se habilidade de modular a apoptose tanto de células infectadas quanto de células presentes no microambiente da infecção. O presente trabalho objetivou avaliar a habilidade de duas cepas atípicas de T. gondii (Udi1CH-05 e Udi2CH-05) em modular a apoptose de células BeWo, a susceptibilidade destas células a este parasito, bem como a influência de tais cepas no padrão de secreção de citocinas por esta linhagem de células trofoblásticas. Estes parâmetros foram avaliados sob a perspectiva da procedência imediata das cepas oriundas diretamente de cultura celular ou oriundas de animais e mantidas por curto período em cultura (aqui denominada Calomys callosus/cultura). A categoria cultura de Udi1CH-05 modulou positivamente a apoptose a partir de 12 horas de infecção, e a partir de 2 horas de infecção por Udi2CH-05, categoria cultura a apoptose não foi controlada em células BeWo. A condição C. callosus/cultura de ambas as cepas não controlou a apoptose quando comparado ao controle não infectado. As células BeWo infectadas com Udi2CH-05, categoria C. callosus/cultura produzem altos níveis de IL-12 nos estágios iniciais da infecção, sugerindo o desencadeamento de resposta inflamatória típica. Os níveis de TNF-α foram maiores nos estágios iniciais de infecção e com diminuição gradativa de produção, coincidindo com incapacidade em induzir a apoptose quando células BeWo foram infectadas por Udi2CH-05, categoria C. callosus/cultura. Os níveis de IL-10 encontrados durante a infecção de células BeWo por Udi1CH-05, indicam que outras citocinas podem estar envolvidas no controle da infecção, enquanto que essa citocina atua no controle da resposta imune desencadeada pela infecção de células BeWo por Udi2CH-05, categoria C. callosus/cultura. A produção de TGF-β detectada mediante a infecção por Udi1CH-05 C. callosus/cultura ou por Udi2CH-05 de ambas as categorias, demonstra que essa citocina atua na imunorregulação de células infectadas, enquanto que a infecção por Udi1CH-05, categoria cultura sugere que outras citocinas anti-inflamatórias possam participar da imunorregulação, pois o aumento do índice de apoptose coincidiu com a diminuição da produção de TGF-β. / Mestre em Biologia Celular e Estrutural Aplicadas

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Diabetes mellitus (DM) consists of a group of syndromes characterized by hyperglycemia, altered lipid metabolism, carbohydrates, proteins, and an increased risk of complications. The aqueous extract of Vochysia rufa (AEVR), has been used to treat DM due to its hypoglycemic effect. Despite the popular use, there is a lack of information regarding the effect of AEVR in liver. The aim of this study was evaluate the effects of AEVR in oxidative stress, apoptosis index and morphological alterations in liver of rats. The animals were divided in six groups: non- (ND) and diabetic (DB) treated with AEVR (500mg/kg), glibenclamide (6mg/kg) and water. The rats were treated during 43 days. Liver was removed and stored at -80ºC to oxidative stress analysis. And fixed in 10% phosphate-buffered formalin, than were processed, embedded in paraffin, sectioned at 4μm and stained with hematoxylin and eosin for histological examination under a light microscope. Nuclei of hepatic cells were isolated and analyzed by flow cytometry to determine the apoptotic index. The DB group shows an increase in activity of antioxidant enzymes GPx, SOD and lipid peroxidation (TBARS), and decrease in GHS, GST, CAT rates. On the other hand, the DB-AEVR group got this oxidative parameters restored to normal levels. Although, a decreased apoptotic index was observed in DB group, and an increased in ND-GB group. And was observed a reduction of apoptosis in this groups: ND-AEVR, DB-AEVR and DB-GB. Histological analysis demonstrated there wasn't difference in groups. According to experimental conditions, the AEVR was efficient to reduce oxidative stress induced by STZ, apparently has an anti-apoptotic effect, and weren't observed pathologic changes in hepatic tissue. / O Diabetes Mellitus (DM) é caracterizado pelo aumento significativo de glicose circulante no sangue, resultado de anormalidades na secreção e/ou ação da insulina. O extrato aquoso de Vochysia rufa (EAVR) tem sido utilizado popularmente para o tratamento do diabetes, no entanto, existem poucos estudos demonstrando o efeito dessa planta para o fígado. O objetivo do estudo foi avaliar os efeitos do EAVR no estresse oxidativo e alterações histopatológicas em fígado de ratos. Os animais foram divididos em seis grupos: (n = 10): não-diabético (ND) e diabético (DB) tratado via gavagem com o EAVR (500 mg/kg), glibenclamida (6mg/kg) e não tratados. O tratamento foi de 43 dias. Após o sacrifício, o fígado foi dissecado, pesado e armazenado a -80ºC para avaliação do estresse oxidativo. E fixado em formaldeído tamponado a 10%, sendo posteriormente processado para análise histológica. Os núcleos dos hepatócitos foram isolados e avaliados, por meio da citometria de fluxo, para determinação do índice de apoptose. No grupo DB houve aumento da atividade das enzimas SOD, GPx, e peroxidação lipídica (TBARS), e diminuição da atividade das enzimas CAT, GST e nos níveis de GSH, evidenciando a ocorrência do estresse oxidativo devido ao diabetes induzido por STZ. Por outro lado, no grupo DB-EAVR evidenciou-se uma restauração dos parâmetros analisados a níveis próximos do grupo ND. Não foram evidenciadas alterações histopatológicas significativas nos grupos estudados. No entanto, houve menor índice de apoptose nos grupos DB, ND-EAVR, DB-EAVR e DB-GB, enquanto que houve maior frequência de apoptose para o grupo ND-GB. Em conclusão, o tratamento dos animais diabéticos com o extrato aquoso de Vochysia rufa foi eficiente para restaurar os níveis normais das enzimas relacionadas à defesa antioxidante, bem como o extrato apresentou efeito antiapoptótico, porém não exibiu efeito significativo no peso corporal e na morfologia do fígado. / Mestre em Biologia Celular e Estrutural Aplicadas

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A fatty high diet causes inflammation in the hypothalamus, mainly in the neurons that control satiety and thermogenesis. Moreover, activation of apoptosis via TLR4 (toll like receptor 4) is observed in conjunction with inflammatory condition. The neuronal death is a process that involves the release of cytokines and glial activation. The microglia have immune function in nervous tissue, but the astrocytes, the main component of glia, is more involved in synaptic plasticity and chronic responses of the Central Nervous System. Moreover, these cells in the hypothalamus, which is the center of energy metabolism control, have specific characteristics, with receptors for fatty acids, glucose and leptin. In this context, we investigated the response of astrocytes after in vitro treatment with fatty acids on cortical and hypothalamic astrocytes. To that end, we made the dissociation of the cortex and hypothalamus of Swiss mice (1-2 days) and the cells were plated for procedures. Treatments were performed with different doses of stearate (100μM, 200μM and 2mM) and palmitate (200μM, 500μM and 5mM) for one week. Immunocytochemistry was performed with anti-GFAP (evaluates the astroglial reactivity) and anti-NFB (transcription factor that participates in the TLR-4 pathway) and TNF- dosage by ELISA. Dosage of 200μM medium were reserved after 3 days of contact with astrocytes that were treated with palmitate or stearate, for obtaining conditioned medium that were stocked for neurons culture treatment. Cultures of hypothalamic neurons (lineage CLU189) were treated for 3 or 6 days with conditioned medium, in sequence, in this cultures, were performed immunocytochemistry with caspase3 (apoptosis marker) and anti- Ki-67 (cell proliferation marker). The immunostaining was quantified and statistically treated for comparison of experimental and control groups. The results showed that treatment with stearate enhances the expression of GFAP and NFB only in astrocytes from the hypothalamus. The TNF- was upregulated in conditionated medium used for treatment of hypothalamic cells, however this augment did not interfere with apoptosis rate in CLU 189 cultures in first three days of contact with conditionated medium and, in the sixth day, in comparison to conditioned control medium only in astrocytes. Such results showed the protection provided for substances had released by reactived astrocytes from hypothalamus. Also, our results showed that neurons could respond to fatty acid without other cell intervention. / Uma dieta rica em gorduras provoca inflamação no hipotálamo, principalmente nos neurônios que controlam a saciedade e termogênese. Além disso, a ativação de apoptose via TLR4 (toll like receptor 4) também foi observada. A morte neuronal é um processo que envolve a ativação da glia e liberação de citocinas. A microglia tem a função imune no tecido nervoso, mas os astrócitos, o componente mais abundante das células gliais, está mais envolvido com a plasticidade sináptica e respostas crônicas do Sistema Nervoso Central. Além disso, essas células, no hipotálamo, que é o centro controlador do metabolismo energético, têm características específicas, apresentando receptores para ácidos graxos, glicose e leptina. Neste contexto, investigamos a reação dos astrócitos após o tratamento com ácidos graxos em culturas de astrócitos hipotalâmicos e corticais. Para tanto, foi feita a dissociação do córtex e hipotálamo de camundongos Swiss (1-2 dias) e os astrócitos foram plaqueados para os experimentos. Essas culturas foram tratadas com doses diferentes de estereato (100μM, 200μM e 2mM) e palmitato (200μM, 500μM e 5mM) durante uma semana. Foi realizada a imunocitoquímica com o anticorpo anti-GFAP (avalia a reatividade dos astrócitos) e anti- NFB (fator de transcrição que participa da via de ativação TLR-4) e a dosagem de TNF- por ELISA. O meio na dose de 200μM foi recolhido após 3 dias de contato com astrócitos tratados com estereato ou palmitato, para a obtenção de meio condicionado, o qual foi estocado para tratamento de culturas de neurônios. Foram utilizadas culturas de neurônios hipotalâmicos (linhagem CLU189) para o tratamento, por 3 ou 6 dias, com o meio condicionado, e posteriormente, nessas culturas, foi realizada a imunocitoquímica com os anticorpos anti-caspase3 (avalia morte celular por apoptose) e anti-ki-67 (marcador de célula em proliferação). As imunomarcações foram quantificadas e tratadas estatisticamente para comparação dos grupos experimentais e controles. Os resultados mostraram que o tratamento com estereato intensifica a expressão de GFAP e NFB somente em astrócitos do hipotálamo. O TNF- estava aumentado no meio condicionado usado no tratamento de células do hipotálamo, mas esse aumento não interferiu na apoptose nas culturas de CLU189 nos 3 primeiros dias para os meios condicionados, e no 6º dia, em relação ao meio condicionado somente em astrócitos. Mostrando certa proteção fornecida por substâncias produzidas pelos astrócitos hipotalâmicos. Ainda, nossos dados também mostraram que os neurônios respondem, sem mediação de outro tipo de célula, ao tratamento com ácido graxo. / Mestre em Biologia Celular e Estrutural Aplicadas

The Diabetes Mellitus (DM) is a group of metabolic diseases, with hiperglycemia resulting from defects in insulin secretion (type 1 DM) and / or action (type 2 DM), promoting the elevation of blood glucose levels, which can damage target organs (eyes, kidneys, nerves, heart). In the kidney presents as diabetic nephropathy (DN), characterized by increased levels of urinary albumin excretion (UAE), which could progress to end stage kidney disease. The renin-angiotensin-aldosterone system (RAAS) is an important mediator of the pathophysiological changes of DN. The pharmacological blockade of this system has been shown as a combined treatment of DN, decreasing urinary albumin excretion. The aim of this study was to evaluate the effects of triple RAAS blockade on kidney structure and function, as well as albuminuria in diabetic Wistar rats with DN in development. Induction of diabetes in rats was performed with intravenous administration of alloxan (50mg/kg) diluted in 0.9% saline and glycemia observed 24h after the induction of diabetes; animals with blood glucose greater than 200 mg/dL were considered diabetic and were divide into 5 groups: I) control group - no treatment (CG); II) experimental group 1 - treated with enalapril (EN) (angiotensin converting enzyme inhibitor - ACEI), III) experimental group 2 - treated with losartan (LO) (angiotensin receptor blocker - ARB), IV) experimental group 3 - treated with aliskiren (AL) (direct renin inhibitor - DRI); V) experimental group 4 - treated with triple blockade ACEIARB- DRI (EN+LO+AL). After 90 days of treatment, animals were placed in metabolic cages to collect 24-hour urine and thereafter for determination of blood, proteinuria, and glomerular filtration rate by creatinine clearance. Then, the animals were anesthetized and had their kidneys removed for histological and immunohistochemical studies (&#945;-SMA and PCNA). After induction, all animals that became diabetic, remained with high glycemic levels throughout the treatment period. Histology showed on CG glomerular collagen deposition and tubulointerstitial, tubular dilation, space capsule expansion and inflammatory infiltration; those changes were attenuated by treatments with EN, LO, AL and EN+LO+AL. The treatments reduced the expression of &#945;-SMA glomerular (EN p<0.01; LO p<0.01; AL p<0.05, EN+LO+AL p<0.01) and tubulointerstitial (EN p<0.05, AL p<0.01, EN+LO+AL p<0.05) compared to CG. There were no significant differences in the number of PCNA glomeruli positive cells and in the analysis of plasma concentrations of sodium, potassium and urea between groups. However, EN and LO preserved a largest number of proliferating tubulointerstitial cells. Rats treated with AL (p<0.05) and EN+LO+AL (p<0.05) had a higher glomerular filtration rate (GFR) when compared to CG, EN and LO. AL and EN+LO+AL significantly reduced proteinuria in these animals when compared to CG (p<0.01). The treatment with EN+LO+AL reduced the expression of &#945;-SMA glomerular and tubulointerstitial, preserved a greater number glomeruli, GRF and UAE. However, administration of AL resulted in similar data. / O Diabete Melito (DM) corresponde a um grupo de doenças metabólicas, com hiperglicemia resultante de defeitos na secreção (DM1) e/ou ação (DM2) da insulina, promovendo a elevação das taxas glicêmicas, que pode lesionar órgãos-alvo (olhos, rins, nervos ou coração). Nos rins manifesta-se como a nefropatia diabética (ND), caracterizada pelos níveis aumentados de excreção urinária de albumina (EUA), que poderá evoluir até a insuficiência renal crônica terminal, dialítica. O sistema Renina-Angiotensina-Aldosterona (SRAA) é um importante mediador das alterações fisiopatológicas da ND. O bloqueio farmacológico deste sistema tem-se mostrado como um aliado ao tratamento da ND, diminuindo a EUA. O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos do bloqueio triplo do SRAA na estrutura e função renais, bem como na proteinúria, de ratos Wistar diabéticos com ND em desenvolvimento. A indução do diabetes nos ratos foi feita com a administração intravenosa de aloxano (50mg/Kg) diluída em solução salina 0,9% e a glicemia verificada 12h, 24h e 48h após a indução do diabetes, animais com glicemia acima de 200mg/dL foram considerados diabéticos e divididos em 5 grupos: I) grupo controle sem qualquer tratamento (CO); II) grupo experimental 1 tratados com enalapril (EN) (iECA); III) grupo experimental 2 tratados com losartan (LO) (BRA); IV) grupo experimental 3 tratados com alisquireno (AL) (IR); V) grupo experimental 4 tratados com iECA-BRA-IR (EN+LO+AL). Após 90 dias de tratamento, os animais foram colocados em gaiolas metabólicas para coleta de urina 24 horas e, posteriormente, de sangue para determinação da proteinúria e taxa de filtração glomerular, através do clearance de creatinina. Em seguida, os animais foram anestesiados e tiveram seus rins retirados para estudos histológicos e imunohistoquímicos. Os animais de todos os grupos se apresentaram hiperglicêmicos após a indução e as glicemias se mantiveram elevadas durante todo o tempo de tratamento. A histologia mostrou no CO a deposição de colágeno glomerular e tubulointersticial, dilatação tubular, expansão do espaço capsular e presença de infiltrado inflamatório, alterações que foram atenuadas pelos tratamentos com EN, LO, AL e EN+LO+AL. Os tratamentos reduziram a expressão de &#945;-SMA glomerular (EN p<0,01; LO p<0,01; AL p<0,05; EN+LO+AL p<0,01) e tubulointersticial (EN p<0,05; AL p<0,01; EN+LO+AL p<0,05) quando comparados ao CO. Não houve diferenças significativas no número de células PCNA glomerulares positivas e nas análises das concentrações plasmáticas de sódio, potássio e uréia entre os grupos; entretanto, EN e LO preservaram o maior número de células em proliferação tubulointersticial. Os ratos tratados com AL (p<0,05) e EN+LO+AL (p<0,05) tiveram uma maior taxa de filtração glomerular, quando comparados ao CO, EN e LO. AL e EN+LO+AL reduziram significativamente a proteinúria desses animais, quando comparados ao CO (p<0,01). O tratamento com EN+LO+AL reduziu a expressão de &#945;-SMA glomerular e tubulointersticial, além de preservar um maior número de glomérulos, função renal e EUA, comuns nos quadros de ND. No entanto, a administração de AL resultou em dados semelhantes. / Mestre em Biologia Celular e Estrutural Aplicadas

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000412181-Texto+Completo-0.pdf: 1636756 bytes, checksum: 3138ac69bb4f361c6d1b29069af27d7a (MD5) Previous issue date: 2009 / Toll-like receptor 2 (TLR2) is a recognition receptor for the widest repertoire of pathogen-associated molecular patterns. Two polymorphisms of TLR2 could be linked to reduced NF-kB activation and to increased risk of infection (supposed-2029C>T and 2258G>A). We investigated the supposed-2029C>T and 2258G>A TLR2 polymorphisms in 422 critically ill patients with European origin from southern Brazil (295 with sepsis and 127 without sepsis), and we reviewed of 33 studies with these polymorphisms conducting a quality assessment with a score system. Among our patients we found only one heterozygote (1/422) for the supposed-2029C>T and none of 2258G>A (0/422) SNP. We have failed to find a clinical application of supposed-2029T and 2258A allele analysis in our southern Brazilian population. Our review detected that current TLR2 SNP assays had very controversial and contradictory results derivate from reports with a variety of quality criteria of investigation. We suggest that, if analyzed alone, the supposed-2029C>T and 2258G>A TLR2 SNP are not good candidates for genetic markers in studies that search for direct or indirect clinical applications between genotype and phenotype. Future efforts to improve the knowledge and to provide other simultaneous genetic markers might reveal a more effective TLR2 effect on the susceptibility to infections diseases. / O Toll-like receptor 2 (TLR2) é um receptor de reconhecimento de microorganismos que identifica um amplo repertório de padrões moleculares associados a patógenos. Entre os polimorfismos já descobertos no gene que codifica para o TLR2, dois SNPs (single nucleotide polimorphism) (supposed-2029C>T e 2258G>A) podem estar relacionados com a redução da ativação do NF-kB e, consequentemente, com o aumento do risco às doenças infecciosas. O objetivo deste estudo foi investigar os SNPs supposed-2029C>T e 2258G>A do TLR2 em 422 pacientes criticamente doentes oriundos de uma população do sul do Brasil (295 com sepse e 127 sem sepse), e realizar uma revisão sistematizada de 33 trabalhos publicados sobre esses SNPs conduzindo um estudo de avaliação de qualidade com um sistema de escores. Entre os pacientes admitidos no estudo foi encontrado apenas um heterozigoto (0,2%; 1/422) para o SNP supposed-2029C>T e nenhum para o SNP 2258G>A (0%; 0/422). Assim, não foi possível identificar qualquer aplicabilidade clínica entre esses SNPs do TLR2 nos pacientes críticos do sul do Brasil. A revisão sistematizada detectou que os atuais trabalhos com tais SNPs do TLR2 apresentam conclusões controversas e contraditórias resultantes de estudos com uma ampla variedade de critérios de qualidade. Os resultados sugerem que, quando analisados individualmente, os SNPs supposed-2029C>T e 2258G>A não são bons candidatos para os trabalhos que buscam por aplicações clínicas diretas entre genótipo e fenótipo. Esforços futuros para aumentar o conhecimento e para realizar análises simultâneas com outros polimorfismos poderão revelar efeitos mais efetivos do TLR2 na susceptibilidade às doenças infeciosas.