ATP-difosfohidrolases, comumente denominadas de apirases, descritas pela primeira vez à cerca de quarenta anos atrás, são enzimas que hidrolisam nucleosídeos di ou trifosfatados por um mecanismo que parece ser sequencial, mas sem a formação de um intermediário energético, e de funções metabólicas ainda desconhecidas. Elas tem sido encontradas nas células dos mais diversos pró- e eucariotos investigados e também em tumores. A vasta abundância dessas enzimas e a sua alta atividade enzimática sugerem que as mesmas estariam envolvidas em importantes funções do metabolismo celular. No presente trabalho, identificamos e caracterizamos a presença de uma nova enzima em Trypanosoma cruzi, o agente causador da doença de Chagas, uma apirase, com características semelliantes à outras apirases já descritas em diversos organismos. Diversos ensaios enzimáticos foram feitos mostrando uma atividade enzimática que não foi anulada pelos inibidores clássicos de ATPases tipo-P, tipo-F ou tipo-V. Esta enzima mostrou depende~n·cla para Mg2+, na~o acontecendo o mesmo para Ca2+. Experimentos usando soros imunes contra apirases de outras fontes, reveleram não apenas reação cruzada, mas também sugeriram que a massa molecular dessa enzima no T cruzi, estaria em tomo de 57,5 kDa. Ensaios citoquímicos (imunoflorescência) com o soro imune anti- NTPase de Toxoxplasma gondii, apresentou fluorescência contra diferentes estágios desse protozoa. No entanto, a localização subcelular dessa enzima no T cruzi não ficou muito clara, tomando-se necessário uma microscopia eletrônica para resolver esse problema. Um dado interessante e particular nesse traballio, foi a presença dessa enzima nos diversos estágios do ciclo de vida do parasita, com atividades enzimáticas diferentes para esses mesmos estágios. / ATP-diphosphohydrolases which are generally called apyrases were described for the first time some forty years ago. These are enzymes which hydrolyze di- and triphosphate nucleosides through a mechanism which seems to be sequential, without forming a high-energy enzyme intermediate. Their metabolic function is yet unknown. ATP-diphosphohydrolases have been found in a number of pro- and eucariotic cells and also in tumor cells. The vast abundance ofthese enzymes and their high enzymatic activity suggest that they are involved in important functions in the cell metabolism. In the present work we have identified and characterized the presence of a new enzyme in Trypanosoma cruzi, the agent of Chagas disease, namely an apyrase with characteristics which are similar to other apyrases already described in different organisms. A number of enzymatic assays showed that the enzyme is not inhibited by the classical inhibitors of P-type, F-type or V-type ATPases. The enzyme exhibited a marked dependence on Mg2+ and not on Ca2+. Experiments using immune sera against apyrases of other sources showed cross- reactivity and suggested that the molecular mass of the enzyme in cruzi is around 57.5 kDa. Immunofluorescence cytochemistry using antiToxoplasma gondii NTPase antibodies showed that fluorescence was present in different stages of the protozoa. However, the exact sub-cellular localization of the enzyme in T cruzi was not clear and electron microscopy will be necessary to answer this question. An interesting result of our work is the identification of the enzyme in different stages of the life cycle of the parasite, with different enzymatic activities among the stages.

Com o objetivo de analisar a expressão diferencial de genes em cepas de Trypanosoma cruzi pela técnica de microarranjos de DNA, construímos um protótipo de lâminas contendo 710 etiquetas de seqüências transcritas (ESTs) de epimastigotas de CL Brener e 20 genes de várias cepas do parasita. A seqüência nucleotídica estava disponível para 576 ESTs. Desta forma, seqüenciamos as 134 ESTs restantes e sua seqüência foi depositada no dbEST do GenBank. O agrupamento das sondas indicou que a lâmina continha 665 seqüências únicas. Inicialmente, avaliamos o microarranjo para a análise de genômica comparativa entre as cepas CL Brener (T. cruzi II) e Silvio (T. cruzi I). Um total de 4 hibridizações foram realizadas. Verificamos, com uma significância estatística (P≤ 0,01 no teste-t) que 31 seqüências do microarranjo (4,3%) apresentaram maior sinal de hibridização com o DNA de CL Brener, enquanto 37 sondas (5,0%) apresentaram situação inversa. Esse resultado sugere diferenças no número de cópias gênicas e/ou variação na similaridade das seqüências. Várias sondas com hibridização diferencial foram confirmadas em experimentos de Southern blot com DNA genômico dos dois isolados. Em seguida, o microarranjo foi avaliado para a análise da expressão diferencial de genes. Para isto, a lâmina foi hibridizada com cDNA de formas epimastigotas (fase midlog de crescimento) de CL Brener e Silvio. Um total de 8 experimentos de hibridização foi realizado com preparações de RNA obtidas de três cultivos independentes. Identificamos, com uma significância estatística (P≤ 0,01), 84 sondas (84/730; 11,5%) diferencialmente expressas: 35 sondas mais expressas em Silvio e 49 sondas mais expressas em CL Brener. Algumas destas sondas foram confirmadas por Northern blot. A comparação dos dados dos experimentos de hibridização do microarranjo com DNA e cDNA das duas cepas permitiu concluir que não há uma correlação direta entre a abundância de determinado ene e seu nível de expressão. Em alguns casos, observamos que seqüências com maior hibridização com o DNA de uma cepa são mais expressas na outra. Visando iniciar os estudos de expressão diferencial de genes em cepas isoladas de pacientes chagásicos, escolhemos as cepas Famema e Hem 179 (T. cruzi II), isoladas, respectivamente, de um paciente com a forma indeterminada da doença de Chagas e de um paciente com alterações cardíacas e digestivas. Observamos que aproximadamente 2,5% (18/730) das sondas apresentaram expressão diferencial nas formas epimastigotas das duas cepas e que 9,0% (65/730) das sondas mostraram razões de hibridização diferente nas formas infectantes (tripomastigotas metacíclicos). Algumas destas sondas foram confirmadas por Northern blot. Entre as sondas mais expressas em Hem 179, está a seqüência que codifica a subunidade 7 da NADH desidrogenase (ND7). O conjunto de dados permitiu concluir que microarranjos contendo predominantemente ESTs de CL Brener são uma ferramenta útil para estudos de genômica comparativa, análise de expressão gênica em isolados de T. cruzi, bem como para a descoberta de novos genes. Além disto, este estudo indicou uma regulação pós-transcricional intensa dos níveis de RNA em T. cruzi. Ampliamos os estudos para um maior número de cepas e construímos outro microarranjo contendo 710 ESTs de CL Brener (forma epimastigota), 45 ESTs da cepa Tulahuen (forma amastigota) e 32 genes de várias cepas do parasita. As 787 seqüências representam 714 seqüências únicas. O RNA total foi isolado de formas epimastigotas de cepas de três pacientes com a forma cardíaca (cepas 115, B13 e 147), e de três pacientes assintomáticos (cepas VL10, Famema e Berenice 62). Cinco da seis cepas são de regiões endêmicas de Minas Gerais (exceto Famema que é do estado de São Paulo). Após hibridização competitiva, a análise estatística dos dados indicou expressão diferencial de 14 sondas (14/787; 17,7%) entre os dois grupos de cepas. Destas, 9 sondas estão induzidas em todas as cepas isoladas de pacientes cardíacos e 4 sondas estão reprimidas em todas as cepas de cardíacos quando comparadas com as cepas de assintomáticos. Dentre as sondas mais expressa em cepas de cardíacos estão: as ESTs que codificam a subunidade 7 da NADH desidrogenase (ND7), a aspartato aminotransferase, enzima importante no processo de regeneração de metionina, e a triparedoxina peroxidase de T. cruzi, envolvida na resistência a peróxidos exógenos. Também foram reveladas 8 ESTs que não apresentam similaridade em bancos de dados. Parte destas sondas foi confirmada por Northern blot com RNA total de todas as cepas. Em alguns casos, identificamos diferenças do tamanho de transcritos entre as cepas. Em resumo, a análise da expressão diferencial de genes em cepas de pacientes com a forma cardíaca e indeterminada da doença de Chagas permitiu identificar alguns genes que podem estar relacionados à patogênese e/ou serem usados como alvo para o prognóstico da evolução doença. Posteriormente, realizamos um experimentos-piloto para investigar a resposta transcricional de fibroblastos humanos em cultura à infecção com duas cepas de T. cruzi: VL10 (isolada de indivíduo assintomático) e 147 (isolada de indivíduo com cardiopatia severa). Após 24 horas de infecção, os RNAs das monocamadas foram extraídos. No mesmo período, RNA foi extraído de fibroblastos humanos não infectados e usado como referência. Experimentos de hibridização competitiva foram realizados em lâminas de microarranjo contendo oligonucleotídios derivados de 24.000 genes humanos, construídas o Laboratório de Tecnologia Molecular do Instituto Nacional do Câncer do NIH, em Frederick, EUA chefiado pelo Dr. David Munroe. Identificamos 28 sondas diferencialmente transcritas nas células infectadas com a cepa 147 (paciente cardíaco). Destas, 27 sondas (27/28; 96,4%) estão com expressão reduzida nas células infectadas. Por outro lado, apenas uma sonda, correspondente ao gene da \"heme oxigenase (decycling) 1\", apresentou indução nas células infectadas com 147. Na infecção de células com a cepa VL10, encontramos 17 sondas diferencialmente transcritas. Destas, 16 sondas (16/17; 94,1 %) estão com expressão aumentada nas células infectadas (dentre elas, a heme oxigenase), enquanto que apenas uma sonda (proteína 5 ligante do fator de crescimento do tipo insulina) mostra situação inversa. Concluímos que as diferenças de resposta da mesma célula hospedeira à infecção pelas duas cepas são marcantes, o que determina um estudo temporal ao longo da infecção para a confirmação das observações acima. Comprovamos por PCR em tempo real o aumento da expressão da heme oxigenase na infecção pelas duas cepas e repressão da expressão da proteína 5 ligante do fator de crescimento do tipo insulina apenas em células infectadas por VL10. / To investigate differential gene expression in Trypanosoma cruzi strains by microarray DNA technology, we have constructed a prototype slide that contains 710 expression sequence tags (ESTs) of CL Brener epimastigotes and 20 genes of various parasite strains. The nucleotide sequence was available for 576 ESTs. Therefore, we have sequenced 134 additional ESTs and the sequences have been deposited in dbEST of GenBank. Clustering of these probes indicated that slide contains 665 unique sequences. Initially, we have evaluated the microarray for comparative genomic analysis between CL Brener (T. cruzi II) and Silvio (T. cruzi I) strains. Four independent experiments were performed. We verified that 31 probes (4.3%) showed statistical significant (P≤, 0.01 in t-test) higher hybridization with CL Brener DNA, whereas 37 probes (5.0%) showed the inverse situation. This suggests differences in the abundance of the genes in the genomes of the strains and/or variation in sequence similarity. Some of these probes were confirmed by Southern blot with genomic DNA of both strains. Next, we evaluated the microarray for the analysis of differential gene expression. For this purpose, the slide with hybridized with cDNA obtained from epimastigote forms in mid-log growth phase of CL Brener and Silvio strains. A total of eight hybridization experiments were perfonned with RNA preparations obtained from three independent parasite harvests. We identified 84 probes (841730; 11.5%) that showed statistically significant changes (P≤, 0.01 in t-test) in expression: 35 probes up regulated in Silvio and 49 probes up regulated in CL Brener. Some of these probes were confirmed by Northern blot. When we compared the data of the hybridization of the microarray with genomic DNA and cDNA of CL Brener and Silvio, we verified no correlation between the putative abundance of a particular gene and its expression level. In a few cases, we noticed that sequences with higher hybridization with genomic DNA of one strain were more expressed in the other. In an initial attempt of investigate differential gene expression in human T. cruzi isolates, we selected the strains Famema and Hem 179 (both T. cruz II), obtained, respectively, from an asymptomatic individual and from a patient with severe cardiopathy and digestive disorders. Differential expression of 2.5% (181730) and 9.0% (651730) of the probes was observed, respectively, in epimastigotes and metacyclic trypomastigotes of the two strains. Some of the probes were confirmed by Northern blot. Among the probes more expressed in Hem 179 is the gene encoding subunit 7 of theNADH dehydrogenase (ND7). We concluded that microarrays, containing predominantly ESTs of CL Brener, are a powerful tool for comparative genomics and gene expression analyses in T. cruzi as well as for discovery of new genes. In addition, this study has provided further evidence for a high level of post-transcriptional regulation of RNA abundance in T. cruzi. We have extended the analysis to a larger number of strains and constructed a new set of microarray slides, which contain 710 ESTs of CL Brener epimastigotes, 45 ESTs Tulahuen strain amastigotes and 32 characterized genes of various strains. These probes represent 714 unique sequences. Total RNA was extracted from mid-log phase epimastigotes of three strains isolated from patients with cardiac disorders (115, B13 and 147) and three strains from asymptomatic patients (VL10, Famema and Berenice 62). Five of these strains are from endemic areas of Minas Gerais (except Famema that is from the state of São Paulo). After competitive hybridization with the microarray, statistical analysis of the data indicated differential expression of 14 probes (14/787, 17.7%) between the two groups of strains. Among these sequences, 9 probes are up regulated in all the strains from cardiac patients and 4 probes are down regulated in all these strains as compared with all the strains isolated from asymptomatic individuals. Among the probes up regulated in the strains from cardiac patients there are ESTs encoding subunit 7 of the NADH dehydrogenase (ND7); aspartate aminotransferase, key enzyme in the methionine regeneration process; and T. cruzi tryparedoxin peroxidase, an important enzyme for resistance to exogenous peroxides. Eight ESTs with no similarity matches in databases were also disclosed. Some of these probes were confirmed by Northern blot assays with RNA of all the strains. In some cases, we noticed differences of the molecular size of the transcripts among the strains. In summary, the analysis of differential gene expression in strains isolated from human chagasic patients with the cardiac and indeterminate forms allowed the identification of some potential genes that may be related to pathogenesis and/or may be used as targets for prognosis of the evolution of Chagas disease. Subsequently, we performed a pilot experiment to investigate the transcriptional response of human fibroblasts in culture to the infection by two T. cruzi strains: VL10 (isolated from an asymptomatic patient) and 147 (isolated from a patient with severe cardiomyopathy). After 24 hours of infection, total RNA was extracted from the infected monolayers. In the same period, RNA was extracted from not infected human fibroblasts, and used as a control. Competitive hybridization experiments were performed in microarray slides containing oligonucleotides representing 24,000 human genes, constructed in the Laboratory of Molecular Technology of the National Institute of Cancer of N1H, in Frederick, EUA headed by Dr. David Munroe. We identified 28 probes differentially transcribed in cells infected with 147 strain. Of these, 27 probes (27/28; 96.4%) were down regulated in the infected celIs, and only one probe, corresponding to the heme oxygenase (decycling) 1 gene, showed up regulation. For the fibroblast infected with VL 10 strain, we found 17 probes differentially transcribed. Of these, 16 probes (16/17; 94.1%) were up regulated (among these probes there is the heme oxigenase sequence), and only one probe (insulin-like growth factor binding protein 5) showed the inverse situation. We concluded that there are drastic differences in the response of the same cell line to the infection by two parasite stmins. This determines that a temporal analysis of gene expression during the infection process should be performed to corroborate the above observations. The increase of heme oxigenase transcripts in fibroblasts infected by the two strains was comrrmed by real time-PCR This methodology also confirmed down-regulation of the insulin-like growth factor binding protein 5 rnRNA in fibroblasts infected with VL 10 strain.

Este trabalho descreve a produção dos FGFs básico bovino e ácido humano (há) em E. coli utilizando o vetor pET. Para expressar o haFGF utilizamos o cDNA nativo com pequenas modificações, obtendo cerca de 40 mg da proteína por litro de cultura induzida. No caso do bbFGF, cerca de 60 pares de bases da extremidade 5 do cDNA nativo foram substituídos por oligonucleotídeos sintéticos contendo condons frequentemente usados em genes bacterianos altamente expressos e apresentando menor conteúdo de C+G do que a sequência nativa. Com este cDNA modificado, obteve-se cerca de 10mg 1-1 de bbFGF. Os FGFs intracelulares solúveis foram purificados a partir do extrato bacteriano por chromatografia de afinidade em Heparina-Sepharose atingindo um grau de pureza da ordem de 95%. O haFGF sozinho é ativo sobre fibroblastos 3T3 em cultura na concentração de ng ml-1; na presença de heparina, a atividade desloca-se para a faixa de pg ml-1. O bbFGF é ativo na concentração de pg ml-1 e sua atividade não é significantemente potenciada pela heparina. O sequenciamento da extremidade N-terminal e a análise de aminoácidos mostraram somente uma forma de haFGF recombinante correspondente à proteína autêntica de 154 aminoácidos. Foram encontradas duas formas de bbFGF recombinante, uma correspondente à proteína autêntica de 154 resíduos e outra contendo 153, onde os dois primeiros foram removidos. / Here we describe the use of the pET expression system to produce the 154 amino acid bovine basic (bb) and human acidic (ha) FGFs. To express haFGF we have used the native cDNA sequencewith minor modifications, obtaining about 40 mg of growth factor per liter of bacterial culture. In the case of bbFGF, about 60 base pairs form the 5-end of the native cDND were replaced with synthetic oligonucleotides containing codons frequently used in highly expressed bacterial genes and having a lower G+C content than the native sequence. By using this modified cDNA about 10 mg 1-1 of bbFGF was obtained. The intracellular, soluble FGFs were partially purified from bacterial extracts by heparin-affinity chromatography and shown to be more than 95% pure. The haFGF alone is active upon 3T3 fibroblasts in culture at the level of ng ml-1 or in the range of pg ml-1 when heparin is added to the incubation medium. The bbFGF is active in the range of pg ml-1 and its activity is not significantly potentiated by heparin. Only one form of recombinant haFGF corresponding to the authentic protein of 154 amino acids was found by N-terminal protein sequencing and amino acid analysis. Two forms of recombinant bbFGF were found, one corresponding to the authentic protein of 154 amino acids (about 75%) and another containing 153 amino acids where the first two residues were removed (about 25%>).

[ES] El cáncer de pulmón es el tipo de cáncer más frecuentemente diagnosticado y la principal causa de muerte debida a cáncer en el mundo, con sólo un 15% de pacientes con una supervivencia mayor a 5 años tras el diagnóstico. La resección quirúrgica es el tratamiento estándar para los pacientes en estadios tempranos con un buen ECOG, pero el 75% de los pacientes son diagnosticados en estadios avanzados, cuando la intervención quirúrgica no es posible y entre un 35% y un 50% de los pacientes operados recaen tras una cirugía aparentemente exitosa. En los últimos años, se han logrado importantes avances en el desarrollo de la inmunoterapia y de tratamientos contra mutaciones conductoras, pero muchos pacientes todavía desarrollan resistencia, progresan y mueren. Esta resistencia terapéutica ha sido asociada a las células madre tumorales (CMTs), una población tumoral con propiedades de célula madre capaz de sobrevivir a las terapias convencionales y regenerar el tumor incluso cuando son indetectables. En esta tesis doctoral, se establecieron cultivos primarios de pacientes de cáncer de pulmón no microcítico (CPNM) resecados, usando ensayos de formación de tumoresferas para el enriquecimiento en CMTs y condiciones de adherencia para los controles. Las tumoresferas derivadas de pacientes mostraron capacidad de autorenovación y crecimiento exponencial ilimitado, alta resistencia a agentes quimioterápicos, capacidad de invasión y diferenciación in vitro y un elevado potencial tumorigénico in vivo. Usando PCR cuantitativa, se analizaron los perfiles de expresión de los cultivos y se determinó que NANOG, NOTCH3, CD44, CDKN1A, SNAI1 e ITGA6 eran los genes más diferencialmente expresados entre tumoresferas y células adherentes. Los análisis de inmunoblot e inmunofluorescencia confirmaron que las proteínas codificadas por estos genes se encuentran aumentadas en tumoresferas de los pacientes con adenocarcinoma y mostraron patrones de expresión y localización diferencial entre éstas y los controles en adherencia. El valor pronóstico de los genes significativamente sobreexpresados en tumoresferas fue evaluado in silico en una cohorte de 661 pacientes con CPNM procedente del TCGA. De todos ellos, CDKN1A, SNAI1 y ITGA6 mostraron estar relacionados con el pronóstico de los pacientes de acuerdo a un análisis de regresión de Cox y fueron seleccionados para construir una firma de expresión génica, denominada firma de CMTs. Los análisis de supervivencia por Kaplan-Meier mostraron que los pacientes con valores elevados de la firma tienen una supervivencia global (SG) menor para la cohorte completa de CPNM [37,7 vs. 60,40 meses, p = 0,001] y para la subcohorte de adenocarcinoma (ADC) [36,6 vs. 53,5 meses, p = 0,003], pero no para la de los epidermoides. Además, el análisis multivariante mostró que la firma de CMTs es un marcador pronóstico independiente para la SG de los pacientes en la cohorte completa [hazard ratio (HR): 1,498; intervalo de confianza (IC) 95%, 1,167-1,922; p = 0,001] y la subcohorte de ADC [HR: 1,869; IC 95%, 1,275-2,738; p = 0,001]. Esta firma fue también analizada en un grupo independiente de 245 pacientes procedentes del Consorci Hospital General Universitari de València, confirmando su valor pronóstico en los pacientes con ADC [42,90 vs. no alcanzado (NA) meses, p = 0,020]. En resumen, nuestros hallazgos aportan información pronóstica relevante para los pacientes con ADC de pulmón y establecen las bases para el desarrollo de nuevos tratamientos. / [CA] El càncer de pulmó és el tipus de càncer més diagnosticat i la principal causa de mort deguda a càncer en el món, amb només un 15% de pacients amb una supervivència major a 5 anys després del diagnòstic. La resecció quirúrgica és el tractament estàndard per als pacients en estadis primaris amb un bon ECOG, però el 75% dels pacients són diagnosticats en estadis avançats, quan la intervenció quirúrgica no és possible i entre un 35% i un 50% dels pacients operats recauen després d'una cirurgia aparentment satisfactòria. En els últims anys, s'han aconseguit importants avanços en el desenvolupament de la immunoteràpia i de tractaments contra mutacions conductores, però molts pacients encara desenvolupen resistència, progressen i moren. Aquesta resistència a les teràpies ha estat relacionada amb les cèl·lules mare tumorals (CMTs), una població tumoral amb propietats de cèl·lula mare capaç de sobreviure a les teràpies convencionals i regenerar el tumor fins i tot quan són indetectables. En aquesta tesi doctoral, es van establir cultius primaris de pacients de càncer de pulmó no microcític (CPNM) ressecats, usant assajos de formació de tumoresferes per a l'enriquiment en CMTs i condicions d'adherència per als controls. Les tumoresferes derivades de pacients van mostrar capacitat d'autorenovació, creixement exponencial il·limitat, alta resistència a agents quimioteràpics, capacitat d'invasió i diferenciació in vitro i un elevat potencial tumorigènic in vivo. Usant PCR quantitativa, es van analitzar els perfils d'expressió dels cultius i es va determinar que NANOG, NOTCH3, CD44, CDKN1A, SNAI1 i ITGA6 eren els gens més diferencialment expressats entre tumoresferes i cèl·lules adherents. Les anàlisis de immunoblot i immunofluorescència van confirmar que les proteïnes codificades per aquests gens es troben augmentades en tumoresferes dels pacients amb adenocarcinoma i van mostrar patrons d'expressió i localització diferencial entre aquestes i els controls en adherència. El valor pronòstic dels gens significativament sobreexpressats en tumoresferes va ser avaluat in silico en una cohort de 661 pacients amb CPNM procedent del TCGA. De tots ells, CDKN1A, SNAI1 i ITGA6 van mostrar estar relacionats amb el pronòstic dels pacients d'acord a una anàlisi de regressió de Cox i van ser seleccionats per a construir una signatura d'expressió gènica, denominada signatura de CMTs. Les anàlisis de supervivència per Kaplan-Meier van mostrar que els pacients amb valors elevats de la signatura tenen una supervivència global (SG) menor per a la cohort completa de CPNM [37,7 vs. 60,40 mesos, p = 0,001] i per a la subcohort d'adenocarcinoma (ADC) [36,6 vs. 53,5 mesos, p = 0,003], però no per a la dels escamosos. A més, l'anàlisi multivariant va mostrar que la signatura de CMTs és un marcador pronòstic independent per a la SG dels pacients en la cohort completa [hazard ratio, (HR): 1,498; interval de confiança (IC) 95%, 1,167-1,922; p = 0,001] i la subcohort d'ADC [HR: 1,869; IC 95%, 1,275-2,738; p = 0,001]. Aquesta signatura va ser també analitzada en un grup independent de 245 pacients procedents del Consorci Hospital General Universitari de València, confirmant el seu valor pronòstic en els pacients amb ADC [42,90 vs. no arribat (NA) mesos, p = 0,020]. En resum, els nostres resultats aporten informació pronòstica rellevant per als pacients amb ADC de pulmó i estableixen les bases per al desenvolupament de nous tractaments. / [EN] Lung cancer is the most commonly diagnosed type of cancer and the leading cause of cancer-related death worldwide, with approximately 15% of patients surviving 5 years after diagnosis. Curative surgery is the standard of care for early-stage patients with a good performance status, but 75% are diagnosed at advances stages, when surgery is not possible, and 35-50% of the resected patients relapse after an apparently successful surgical treatment. Significant advances in the development of therapies against driver mutations and immune-based treatments for these patients have been achieved in recent years, but many patients still develop treatment resistance, progress, and die. The high resistance against these therapies has been associated to cancer stem-like cells (CSCs), a population with stem properties which is able to survive after conventional treatments and regenerate tumor even when are undetectable. In this thesis, primary cultures from early-stage non-small cell lung cancer (NSCLC) patients were established, using sphere-forming assays for CSCs enrichment and adherent conditions for the control counterparts. Patient-derived tumorspheres showed self-renewal and unlimited exponential growth potentials, resistance against chemotherapeutic agents, invasion and differentiation capacities in vitro, and superior tumorigenic potential in vivo. Using RTqPCR, gene expression profiles were analyzed, and NANOG, NOTCH3, CD44, CDKN1A, SNAI1, and ITGA6 were selected as the best contributors to distinguish tumorspheres from adherent cells. Immunoblot and immunofluorescence analyses confirmed that proteins encoded by these genes were consistently increased in tumorspheres from adenocarcinoma patients and showed differential localization and expression patterns. The prognostic role of genes significantly overexpressed in tumorspheres was evaluated in silico in a cohort of 661 NSCLC patients from TCGA. Based on a Cox regression analysis, CDKN1A, SNAI1 and ITGA6 were found to be associated with prognosis and used to calculate a gene expression score, named CSCs score. Kaplan-Meier survival analysis showed that patients with high CSCs score have shorter overall survival (OS) in the entire cohort [37.7 vs. 60.4 months, p = 0.001] and in the adenocarcinoma (ADC) subcohort [36.6 vs. 53.5 months, p = 0.003], but not in the squamous cell carcinoma one. Multivariate analysis indicated that this gene expression score is an independent biomarker of prognosis for OS in both, the entire cohort [hazard ratio (HR): 1.498; 95% confidence interval (CI), 1.167-1.922; p = 0.001], and the ADC subcohort [HR: 1.869; 95% CI, 1.275-2.738; p = 0.001]. This score was also analyzed in an independent group of 245 patients from Consorci Hospital General Universitari de València, confirming its prognostic value in the ADC subtype [42.90 vs. not reached (NR) months, p = 0.020]. In conclusion, our findings provide relevant prognostic information for lung ADC patients and the basis for developing novel therapies. / Herreros Pomares, A. (2020). Tumorspheres as an in vitro model for cancer stem-like cell characterization in non-small cell lung cancer. Prognostic implications [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/137036

Tesis por compendio / [ES] La inmunoterapia es un tratamiento prometedor para el cáncer de mama triple negativo (TNBC), pero los pacientes recaen, lo que destaca la necesidad de comprender los mecanismos de resistencia. En esta tesis doctoral hemos descubierto que, en el tumor primario de cáncer de mama, las células tumorales que resisten el ataque de los linfocitos T son quiescentes. Las células cancerosas quiescentes (QCC) forman nichos con baja infiltración inmune. Estas células QCC exhiben mayor capacidad de regenerar tumores 2 y tienen un perfil de expresión génica relacionado con resistencia a quimioterapia y pluripotencia. Adaptamos la secuenciación de ARN unicelular para obtener también una resolución espacial precisa que nos permitiese analizar los infiltrados dentro y fuera del nicho de QCC. Este análisis transcriptómico reveló la inducción de programas relacionados con la hipoxia e identificó células T más agotadas, fibroblastos supresores y células dendríticas disfuncionales dentro de las áreas de QCC. Esto pone de manifiesto los fenotipos diferenciales en las células infiltrantes según su ubicación intratumoral. Fuimos capaces además de identificar la activación HIF1a específicamente en las QCC como el responsable del fenotipo de exclusión y disfuncionalidad inmune. La activación forzada de HIF1a en células tumorales era suficiente para recapitular el fenotipo observado en las áreas con QCC. Por todo esto, hemos demostrado que las QCC constituyen reservorios resistentes a la inmunoterapia al orquestar un medio inmunosupresor hipóxico localizado que bloquea la función de las células dendríticas y por tanto de los linfocitos T. La eliminación de las QCC es la clave que promete contrarrestar la resistencia a la inmunoterapia y prevenir la recurrencia de la enfermedad en el TNBC. / [CA] La immunoteràpia és un tractament prometedor per al càncer de mama triple negatiu (TNBC), però els pacients recauen, fent destacar la necessitat de comprendre els mecanismes de resistència. En aquesta tesi doctoral hem descobert que al tumor primari de càncer de mama, les cèl·lules tumorals que resisteixen l'atac dels limfòcits T són quiescents. Les cèl·lules canceroses quiescents (QCC) formen nínxols amb baixa infiltració immune. Aquestes cèl·lules QCC exhibeixen més capacitat de regenerar tumors i tenen un perfil d'expressió gènica relacionat amb resistència a quimioteràpia i pluripotència. Hem adaptat la sequ¿enciació d'ARN unicel·lular per obtenir també una resolució espacial precisa que ens permetés analitzar els infiltrats dins i fora del nínxol de QCC. Aquesta anàlisi transcriptòmica va revelar la inducció de programes relacionats 3 amb la hipòxia i va identificar cèl·lules T més esgotades, fibroblasts supressors i cèl·lules dendrítiques disfuncionals dins de les àrees de QCC. Això posa de manifest els fenotips diferencials a les cèl·lules infiltrants segons la seva ubicació intratumoral. Vam ser capaços a més d'identificar l'activació de HIF1a específicament a les QCC com a responsable del fenotip d'exclusió i disfuncionalitat immune. L'activació forçada de HIF1a en cèl·lules tumorals era suficient per recapitular el fenotip observat a les àrees amb QCC. Per tot això, hem demostrat que les QCC constitueixen reservoris resistents a la immunoteràpia en orquestrar un micro-ambient immunosupressor hipòxic localitzat que bloqueja la funció de les cèl·lules dendrítiques i per tant dels limfòcits T. L'eliminació de les QCC és la clau que promet contrarestar la resistència a la immunoteràpia i prevenir la recurrència de la malaltia al TNBC. / [EN] Immunotherapy is a promising treatment for Triple-Negative Breast Cancer (TNBC), but many patients relapse or do not respond, highlighting the need to understand mechanisms of resistance. In this doctoral thesis we discovered that in primary breast cancer, tumor cells that resist T cell attack are quiescent. These Quiescent Cancer Cells (QCCs) form clusters with reduced immune infiltration. They also display superior tumorigenic capacity and higher expression of chemotherapy resistance and stemness genes. We adapted single-cell-RNA-sequencing with precise spatial resolution to profile infiltrating cells (stromal and immune cells) inside and outside the QCC niche. This transcriptomic analysis revealed hypoxia-induced programs and identified the presence of more abundant exhausted T-cells, tumor-protective fibroblasts, and dysfunctional dendritic cells inside clusters of QCCs. This uncovered differential phenotypes in infiltrating cells based on their intra-tumor location with respect to QCCs. We were also able to identify HIF1a expression in QCC as the driver of immune exclusion and dysfunction. Forced activation of a HIF1a program in cancer cells recapitulated the immune phenotype observed in the QCCs' niche. Thus, QCCs constitute immunotherapyresistant reservoirs by orchestrating a local immune-suppressive milieu that blocks DC activation impairing T-cell function. Eliminating QCCs holds the promise to counteract immunotherapy resistance and prevent disease recurrence in TNBC. / Baldominos Flores, P. (2024). Study of immune resistant mechanisms in mouse models of breast cancer [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/203657 / Compendio

A fosfatase de especifidade dual 12 (DUSP12) é membro da família das proteínatirosina fosfatases DUSPs atípicas. Ela pode desfosforilar resíduos de serina/treonina além de tirosina. Além de seu domínio catalítico, possui um domínio de dedo-de-zinco, um motivo comum nas proteínas, base para interação com outras biomoléculas. A DUSP12 tem expressão alta na maioria dos tecidos humanos, e localização predominantemente nuclear, participando de diversos processos já descritos, como o ciclo celular, a resposta ao estresse, a diferenciação celular, a maturação ribossômica e há indícios de que seja importante para o desenvolvimento embrionário humano. Porém, pouco se sabe sobre os mecanismos moleculares subjacentes. Neste projeto, buscamos identificar alvos nucleares da DUSP12,expondo as células tumorais de pulmão, A549, e de mama, MCF-7, a diferentes estímulos genotóxicos, a fim de observar mudanças no padrão de interação dos alvos capturados. Lançando mão de ensaios de co-precipitação e identificação por espectrometria de massas, identificamos uma lista de alvos potenciais da fosfatase. A partir de análises computacionais, destacamos na lista diversas proteínas e processos centrais às redes de interação já descritas na literatura. Encontramos proteínas ribonucleoproteínas envolvidas na maturação ribossômica e nos grânulos de estresse, e outras cuja relação seria menos óbvia, como proteínas da coesina e da regulação da estrutura da cromatina. Adicionalmente, identificamos processos cuja relação não havia sido proposta ou investigada, como a dinâmica do citoesqueleto e o splicing de mRNA. Comprovamos a presença de DUSP12 em regiões de heterocromatina, onde pode exercer influência regulatória. Estabelecemos a interação e colocalização com partículas ribonucleoproteicas que contêm a NOP56, proteína central das nossas análises. Enfim, também observamos sugestão de interação com NAT10, indicando possível influência nos processos de dinâmica de microtúbulos, relevantes para a separação cromossômica, e das histonas, relevante para a expressão gênica e ciclo celular. / Dual Specificity Phosphatase 12 (DUSP12) is a member of the atypical DUSP protein-tyrosine phosphatases. It can dephosphorylate serine/threonine residues, besides tyrosine. In addition to its catalytic domain, it has a zinc finger domain, a common domain for proteins, and a starting point for the interaction with other biomolecules. DUSP12 displays high expression in most human tissues, and mostly nuclear localization, taking part in several known processes, such as cell cycle, stress response, differentiation, ribosomal maturation, and there are signs that it might be important for human embryonic development. However, little is known about the subjacent molecular mechanisms. In this project, we sought to identify nuclear targets of DUSP12, exposing lung (A549) and breast (MCF-7) tumoral cells to different genotoxic stimuli, aiming to identify shifts in the pattern of identified targets. Using co-precipitation followed by mass spectrometry, we identified a list of potential targets of this phosphatase. From computational analyses, we highlighted several proteins and processes which are central to the interaction networks that were already described in the literature. We found ribonucleoproteins involved in the ribosomal maturation and stress granules, and others whose relationship would be less obvious, such as cohesin proteins and regulators of chromatin structure. Additionally, we identified processes whose relation to DUSP12 had not been proposed or identified, such as the cytoskeleton dynamics and mRNA splicing. With biochemical validations, we showed the presence of DUSP12 in regions of heterochromatin, where it can exert regulatory influence. We established the interaction and colocalization with ribonucleoprotein particles that contain NOP56, central to our analyses. Lastly, we also observed a suggestion of interaction with NAT10, indicating a possible influence in the processes of microtubule dynamics, relevant to chromosomal segregation, and histone dynamics, relevant for gene expression and cell cycle.

As pesquisas com os peptídeos hormonais de plantas se iniciaram na década de noventa com a descoberta da sistemina. Hoje existem diversos peptídeos identificados, e alguns deles já em avançado estágio de caracterização. O envolvimento desta classe de moléculas em diversas funções básicas e específicas da biologia dos vegetais despertou o interesse da comunidade científica. Dentre os peptídeos em fase de caracterização, destacam-se os representantes da família RALF. Os peptídeos RALF estão presentes em basicamente todo o reino vegetal, desde o musgo Physcomitrela pattens até as plantas superiores mono e dicotiledôneas. A conservação destes peptídeos no reino vegetal sugere um importante papel na fisiologia vegetal, e evidências recentes indicam a participação de RALF em processos básicos do desenvolvimento das plantas. O mecanismo pelo qual o peptídeo RALF atua e é percebido pela célula constitui etapa fundamental para sua caracterização funcional. Para tanto, no presente trabalho foram empregadas técnicas para identificação de proteínas de interação com RALF. Os resultados indicam que este peptídeo possivelmente tem sua atividade regulada pelo íon cálcio, através da interação com uma proteína de ligação a cálcio que, assim como o RALF, é secretada para o apoplasto. Estes dados colocam RALF em um cenário até o momento inédito no mecanismo de ação hormonal em plantas. A exemplo de animais e leveduras, observou-se também que o processamento de RALF ocorre em um sítio dibásico. A mutação de um dos aminoácidos deste sítio foi suficiente para impedir processamento do peptídeo in vivo e in vitro. A utilização de extratos protéicos da fração microsomal de Arabidopsis no ensaio in vitro indica que esta atividade é desempenhada por uma protease presente no sistema de endomembranas celular, provavelmente da classe das convertases. Os resultados publicados marcam o início dos estudos de caracterização do processamento de prohormônios em plantas. / The peptide hormone research has begun during the 90s decade with the systemin discovery. Nowadays several peptides have already been identified, and some of them are further characterized. The involvement of these molecules with a range of basic and specific biological functions has raised the scientific communitys interest. Among the peptides being studied, the RALF family is particularly intriguing. The RALF peptides can be found throughout the plant kingdom, from the moss Physcomitrella patens to the mono and dicot plant groups. The conserved occurrence of these peptides along the plant kingdom suggests an important role in the plant physiology field. Recent evidences indicate that RALF plays a role in basic mechanisms of plant development. The RALF mechanism of action and its perception by the cell are fundamental information in order to characterize this peptide function. In the present work experiments to identify RALF interacting proteins were employed. The results indicate that RALF peptides activity is possibly regulated by the calcium ion. This regulation is mediated by the interaction with a calcium binding protein. This calcium binding protein was found to be secreted to the apoplast. Presented data suggests that RALF is regulated by a mechanism never described before in the plant hormone research field. As previously described in animals and yeast the RALF propeptide processing takes place in a dibasic site. A single amino acid site specific mutation disrupted peptide processing in vivo and in vitro. The correct processing is mediated by proteases of the Arabidopsis microsomal fraction. This processing seems to occur at the endomembrane system, possibly catalized by a convertase class enzyme. The published results points the beginning of the peptide processing studies in plants.

Tripomastigotas, formas infectivas do T. cruzi, expressam em sua superfície uma família de glicoproteínas denominada Tc-85, que pertence à superfamília gênica das gp85/trans-sialidases. Nosso laboratório clonou e caracterizou um membro da família da Tc85 (Tc85-11), cuja região carboxila terminal (clone Tc85-1) adere em laminina e em células de mamíferos. O uso de peptídeos sintéticos, correspondendo em sequência à Tc85-1 possibilitou a caracterização do motivo mais conservado da superfamília gênica das gp85/trans-sialidases (VTVxNVfLYNR), que não está relacionado com a adesão a laminina, como o domínio de adesão em células de mamíferos. Por cromatografia de extratos de membrana de células LLC-MK2 numa coluna de afinidade contendo o motivo de adesão, foi isolada uma molécula de 45 kDa identificada como citoqueratina 18 (CK18). Dados da literatura, de acordo com experimentos realizados em nosso laboratório, indicam que células epiteliais apresentam CK18 em sua superfície. Além disso, células K562, que não são infectadas pelo T. cruzi e não ligam ao motivo VTVxNVfLYNR nem à Tc85-1, não expõem CK18 em sua superfície. A adição de anticorpos anti-CK18 ao meio de cultura inibe a infecção de células epiteliais pelo T. cruzi, enquanto que a adição de pf-Tc85-11 ou VTVxNVfLYNR estimula a infecção. Esses dados sugerem que a adesão de membros da família das trans-sialidases a CK18 prepara a célula para invasão. / Trypomastigotes, which are the infective form of Trypanosoma cruzi, express a set of surface glycoproteins known, collectively, as Tc-85, a subset of the gp85/transsialidase supergene family. A member of that family, Tc85-11, has been cloned, whose carboxy-terminal fragment (Tc85-1) showed adhesive properties to laminin and cell surfaces (Giordano et al., 1999). The use of synthetic peptides, corresponding to the Tc85-1 sequence, enabled us to characterize the most conserved motif of the Trypanosoma trans-sialidase supergene family (VTVxNVfLYNR) as the mammalian cell binding domain. Although Tc85-1 binds to laminin, this domain does not bind to laminin nor inhibits cell binding to it. Affinity chromatography experiments with LLC-MK2 cell membrane extract enabled us to isolate the VTVxNVfLYNR motif receptor as a 45 kDa molecule that was identified as cytokeratin 18 (CK18) after trypsin digestion. This result is in agreement with published data, showing that CK18 is exposed on the outer membrane surface of epithelial cells. Furthermore, K562 cells which are not susceptible to T. cruzi infection, did not bind to Tc85-1 nor showed CK18 on their surface. The addition of anti-cytokeratin antibodies to the culture medium significantly inhibited the infection of epithelial cells by T. cruzi, while addition of fusion proteinTc85-11 or VTVxNVFLYNR slightly stimulated the infection. These results indicate that, the binding of the trans-sialidase family members to CK18 may prepare the hostcell for parasite invasion. Furthermore, our data suggest that Tc85-11 is a multiadhesive glycoprotein, encoding at least two diferent binding sites, one for laminin and one for CK18 that help the parasite to overcome the barriers interposed by cell membranes, extracellular matrices and basal laminae.

A colina quinase, 1ª enzima de uma via que forma 45% da membrana de P. falciparum foi clonada, expressa e purificada, e um anticorpo policlonal desenvolvido. Estudos de transporte da enzima demonstraram que a PfChok é transportada para o citossol por uma via independente do inibidor Brefeldina A. Obteve-se informação da estrutura secundária e uma modelagem da estrutura terciária da proteína, tendo sido localizados sítios de fosforilação para proteínas quinases. Através de uma nova abordagem em genômica funcional de Plasmodium, o gene da proteína adaptadora PfRACK foi códon otimizado e inserido em células de mamíferos. Estudos de dinâmica de Ca2+ em microscopia confocal indicaram que sua sinalização nas células estudadas é inibida na presença de PfRACK, dependente da interação direta com receptores de IP3. A enzima localiza-se distintivamente em relação à RACK1 endógena. Nossos resultados abrem a possibilidade de novos estudos, ao estabelecer a transfecção de genes do parasita para estudos de mecanismos de transdução de sinal na interação Plasmodium-hospedeiro. / Choline Kinase, the first enzyme of a pathway responsible for up to 45% of Plasmodium falciparum parasite membrane, was cloned, expressed and purified, and a policlonal antibody was developed to follow its localization along the intraerythrocytic cycle. The enzyme is transported to parasite´s cytosol, through a pathway independent of the Endoplasmic Reticulum to Golgi apparatus. Information about the secondary structure was obtained, as well a model of the tertiary structure, where several kinases phosphorylation sites were identified. The PfRACK gene was codon-optimized and transfected in mammalian cells. Dynamic Ca2+ studies by confocal microscope have revealed that Ca2+ signaling of the transfected cells was inhibited by PfRACK, dependent on direct interaction with InsP3 receptors. The protein co-localizes distinctly of the endogenous RACK1. Our results open new possibilities of malaria functional genomics, by establishing the transfection of parasites genes into mammalian cells with the aim to study transduction signals mechanisms of the Plasmodium-host interaction.

O Trypanosoma cruzi é um protozoário flagelado agente causador da Doença de Chagas, patologia endêmica da América Latina. Tripomastigotas de T. cruzi expressam em sua superfície celular glicoproteínas denominadas Tc-85 e pertencentes à superfamília gp85/trans-sialidase. Vários membros desta superfamília têm sido implicados na invasão das células hospedeiras pelo T. cruzi e componentes da matriz extracelular, como fibronectina e laminina, foram descritos como alguns de seus ligantes. Utilizando a técnica de phage display, a seqüência GGIALAG foi identificada por ligar-se especificamente e de uma forma dose-dependente ao H3.3p, uma proteína recombinante que corresponde a um fragmento interno de um membro clonado da Tc85 (Tc85-11). A análise através de alinhamento identificou o receptor de procineticina 2 (PKR2) como candidato putativo. Os receptores de procineticina (PKR1 e PKR2) são expressos em muitos tecidos e estruturalmente são membros da família da rodopsina, com sete domínios transmembranares e sítios putativos para modificações pós-traducionais. Os ligantes, as procineticinas 1 e 2, são peptídeos envolvidos em uma variedade de processos biológicos, tais como angiogênese, hematopoiese, diferenciação de monócitos, ativação de macrófagos, sobrevida neuronal, ativação do bulbo olfatório, motilidade gastrointestinal, nocicepção, ritmo circadiano, coordenação do comportamento circadiano e sua fisiologia e na função reprodutiva. Com o objetivo de verificar se os PKRs poderiam ser receptores de Tc85, foi utilizada a linhagem epitelial MCF10A, derivada de células mamárias humanas, que expressam PKR2 e PKR1, avaliado pelas técnicas de imunofluorescência, Western Blot e RT-PCR. A estratégia envolveu ensaios de ligação da proteína recombinante H3.3p e ensaios de inibição da invasão por T. cruzi em células MCF10A utilizando anticorpo anti-PKR2 ou um peptídeo sintético com a sequência GGIALAG. Este trabalho mostrou que 1. H3.3p se liga à superfície de MCF10A, detectado por imunofluorescência indireta, utilizando anticorpo monoclonal G1/G8 (que reconhece H3.3p); 2. H3.3p se liga a uma banda de ~45 kDa em um extrato de MCF10A, observado em um blot de nitrocelulose (\"overlay\") 3. O peptídeo sintético GGIALAG inibe a ligação do H3.3p à banda de ~45 kDa do extrato de MCF10A, região reconhecida pelo anticorpo anti-PKR2; 4. Os antígenos reconhecidos por anticorpos anti-PKR2 e anticorpos anti-GGIALAG colocalizam na superfície da célula MCF10A, avaliada por microscopia confocal; 5. Anticorpos anti-PKR2 inibem até ~ 60% da infecção de MCF10A pelo T. cruzi; 6. O peptídeo sintético GGIALAG (0,2mM) inibe até ~ 40% da infecção de MCF10A pelo T. cruzi; 7. Anticorpos anti-PKR1 inibem até ~ 60% da infecção de MCF10A pelo T. cruzi. Em conjunto, e aliado ao fato de PKRs serem expressos numa grande variedade de tecidos e órgãos, incluindo alguns classicamente alvo de T. cruzi, os dados sugerem que PKRs são ligantes para T. cruzi durante a infecção. Os dados sugerem ainda que a seqüência de aminoácidos GIALAG, presente em PKR2 estaria envolvida neste processo. / Trypanosoma cruzi is a flagellated protozoan causing Chagas\' disease. Trypomastigotes, an infective stage of T. cruzi, express at the cell surface members of Tc85, glycoproteins that belong to the gp85/trans-sialidase gene superfamily. Several members of the superfamily have been implicated in the invasion of host cells by T. cruzi and components of the extracellular matrix, as fibronectin and laminin, were described as their ligands. Using the phage display technique, a sequence (GGIALAG) was identified that specifically binds in a dose-dependent manner to H3.3p, a recombinant protein corresponding to an internal fragment of a cloned member of Tc-85. Alignment analysis identified the prokineticin receptor 2 (PKR2), as a putative candidate. Prokineticin receptors (PKR1, PKR2) are expressed in many tissues and are members of the rhodopsin family, with seven transmembrane domains and putative post-translational modifications. The ligands, prokineticins 1 and 2, are peptides involved in a variety of biological processes, such as angiogenesis, hematopoiesis, monocyte diferentiation, neuronal survival, machophage activation, olfactory bulb activation, gastrointestinal motility, pain sensitization, circadian rhythm and coordination of circadian behavior and physiology, as well as in reproduction function. In order to verify whether PKRs may be Tc85 receptors, MCF10A, a human mammary epithelial cell line, which expresses PKRs, as assessed by indirect immunofluorescence, Western Blot and RT-PCR, was employed as host cell. The strategy involved binding assays of H3.3p to MCF10A and invasion assay of MCF10A by T. cruzi in the presence of the synthetic peptide GGIALAG or in the presence of anti-PKR1, anti-PKR2 and anti-GGIALAG antibodies. This work shows that: 1. H3.3p binds to the surface of MCF10A; 2. H3.3p binds to a ~45 kDa band in a nitrocellulose blot of MCF10A cell extract (overlay); 3. The synthetic peptide GGIALAG inhibits the binding of H3.3p to the ~45 kDa band of MCF10A cell extract in the same region recognized by anti-PKR2 antibody; 4. The antigens recognized by anti-PKR2 antibody and by anti-GGIALAG antibody co-localize at the cell surface of MCF10A; 5. Anti-PKR2 antibody inhibits by ~60% the infection of MCF10A by T. cruzi; 6. The synthetic peptide GGIALAG (0.2 mM) inhibits by ~40% the infection of MCF10A by T. cruzi. 7. Anti-PKR1 antibody inhibits by ~60% the infection of MCF10A by T. cruzi; Altogether, and supported by the fact that PKR2 is widely expressed, including some classical targets of T. cruzi, the data herein indicate a possible role of PKR2, in particular the amino acid sequence GGIALAG, as a ligand for T. cruzi infection.