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Malato sintase de Paracoccidioides brasiliensis é uma proteína ligada à superfície que se comporta como uma anchorless adesina / The malate synthase of Paracoccidioides brasiliensis is a linked surface protein that behaves as an anchorless adhesinSILVA NETO, Benedito Rodrigues da 11 May 2009 (has links)
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Previous issue date: 2009-05-11 / The pathogenic fungus Paracoccidioides brasiliensis causative of
Paracoccidioidomycosis (PCM), a pulmonary mycose acquired by inhalation of fungal
airborne propagules, which may disseminate to several organs and tissues leading to a
severe form of the disease. Adhesion and invasion to host cells are essential steps
involved in the internalization and dissemination of pathogens. Inside host, P.
brasiliensis use the glyoxylate cycle for intracellular survival. Here, we provide
evidence that malate synthase of P. brasiliensis (PbMLS) is localized on the cell wall,
and is secreted. PbMLS was overexpressed in Escherichia coli, and polyclonal antibody
against this protein was obtained. By using Confocal Laser Scanning Microscopy and
Western blot analysis, PbMLS was detected in the cytoplasm and the cell wall of the
yeast phase of P. brasiliensis of mother and bud yeast cells. PbMLSr and the respective
polyclonal antibody produced against this protein inhibited the interaction of P.
brasiliensis to in vitro cultured epithelial cells A549. These observations indicated that
cell wall-associated MLS of P. brasiliensis could be mediating the binding of fungal
cells, thus contributing to the adhesion of fungus to host tissues and to the dissemination
of infection. / O fungo de patogênico Paracoccidioides brasiliensis agente causador da
Paracoccidioidomicose (PCM), uma micose pulmonar adquirida pela inalação de
propágulos aéreos do fungo que pode se disseminar a vários órgãos e tecidos levando a
uma forma severa da doença. Dentro do hospedeiro, P. brasiliensis usa o ciclo do
glioxalato (CG) para sobrevivência intracelular. Adesão e invasão das células do
hospedeiro são passos essenciais envolvidos na internalização e disseminação do
patógeno. Aqui, nós evidênciamos que malato sintase de P. brasiliensis (PbMLS) é
secretada, e é localizada na parede da célula. PbMLS foi superexpressa em Escherichia
coli, e o anticorpo policlonal contra esta proteína foi obtido. Usando Microscopia Laser
Confocal (CLSM) e análise de Western blot, PbMLS foi encontrada no citoplasma e na
parede da célula na fase leveduriforme de P. brasiliensis nas células mãe e broto.
PbMLSr e o respectivo anticorpo policlonal produzido contra esta proteína inibiram a
interação de P. brasiliensis com células epiteliais A549 cultivads in vitro. Estas
observações indicariam que MLS associada à parede da célula de P. brasiliensis pode
estar mediando a ligação do fungo às células, contribuindo assim com a adesão do
fungo aos tecidos hospedeiros e para a disseminação da infecção.
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Extração e caracterização do amido de lobeira (solanum lycocarpum) / Extraction and characterization of the starch lobeira (solanum lycocarpum)Pascoal, Aline Mendonça 28 March 2014 (has links)
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Previous issue date: 2014-03-28 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Goiás - FAPEG / This study was conducted to evaluate the chemical, physical-chemical,
biochemical and rheological properties of starch from Solanum lycocarpum. The
pulp from Solanum lycocarpum fruits was used as raw material for extraction of
starch, resulting in a yield of 51%. The starch granules were heterogeneous in
size, presenting a conical appearance, very similar to those from high-amylose
cassava starch. The elemental analysis (CHNS) revealed 64.33% carbon,
7.16% hydrogen and 0.80% nitrogen. FT-IR spectroscopy showed the peaks
characteristic of polysaccharides and NMR analysis confirmed the presence of
the α-anomer of D-glucose. The S. lycocarpum starch was characterized by
high value of intrinsic viscosity (3515 mPa s) and estimated molecular weight
around 645.69 kDa. Furthermore, this starch was classified as a C-type and
high amylose content starch, presenting 34.66% of amylose and 38%
crystallinity. Endothermic transition temperatures (To = 61.25°C; Tp = 64.5°C;
Tc = 67.5°C), gelatinization temperature (∆T = 6.3°C) and enthalpy changes
(∆H= 13.21 J g−1) were accessed by DCS analysis. The thermogravimetric
analysis of S. lycocarpum starch showed a typical three-step weight loss
pattern. Microscopy revealed significant changes in the granule morphology
after thermal treatment. Samples treated at 50°C for 10 min lost 52% of their
crystallinity, which was partially recovered after storage for 7 days at 4°C.
However, samples treated at 65°C for 10 min became were totally amorphous.
This treatment was sufficient to completely disrupt the starch granule, as
evidenced by the absence of an endothermic peak in the DSC thermogram. The
RVA of S. lycocarpum starch revealed 4440.7 cP peak viscosity, 2660.5 cP
breakdown viscosity, 2414.1 cP final viscosity, 834.3 cP setback viscosity, and
a pasting temperature of 49.6°C. The low content of resistant starch (10.25%)
and high content of digestible starch (89.78%) in S. lycocarpum suggest that
this starch may be a good source for the production of hydrolysates, such as
glucose syrup and its derivatives. These results make the S. lycocarpum fruit a
very promising source of starch for biotechnological applications. / Este trabalho foi realizado para avaliar as propriedades químicas, físico-
químicas, bioquímicas e reológicas do amido de Solanum lycocarpum. Polpas
dos frutos de Solanum lycocarpum foram utilizadas como matéria-prima para a
extração de amido, resultando em um rendimento de 51%. Os grânulos de
amido apresentaram tamanho heterogêneo, com aparência cônica, muito
semelhante ao amido de mandioca, com alto teor de amilose. A análise
elementar (CHNS) revelou 64,33% de carbono, 7,16% de hidrogênio e 0,80%
de nitrogênio. A espectroscopia FT-IR revelou picos característicos de
polissacarídeos e a análise de RMN confirmou a presença do carbono αanomérico
da D-glicose. O amido de S. lycocarpum apresentou elevada
viscosidade intrínseca (3515 mPa s) e peso molecular estimado de 645,69 kDa.
Além disso, este amido foi classificado como um amido do tipo C,
apresentando 34,66% de amilose e 38% de cristalinidade. Através de análises
por DCS determinou-se as temperaturas de transição endotérmica (To =
61,25°C; Tp = 64,5°C; Tc = 67,5°C), a variação da temperatura de
gelatinização (∆T = 6,3°C) e a variação de entalpia (∆H = 13,21 J g-1). A análise
termogravimétrica do amido de S. lycocarpum apresentou um padrão típico de
perda de peso de três etapas. A microscopia revelou alterações significativas
na morfologia dos grânulos após o tratamento térmico. As amostras tratadas a
50°C, durante 10 minutos, perderam 52% de sua cristalinidade, a qual foi
parcialmente recuperada após armazenamento a 4°C, por 7 dias. No entanto,
as amostras tratadas a 65°C, por 10 minutos, perderam totalmente sua
cristalinidade, apresentando estrutura totalmente amorfa. Este tratamento foi
suficiente para romper completamente o grânulo de amido, conforme
evidenciado pela ausência do pico endotérmico na curva do DSC desta
amostra. O RVA do amido de S. lycocarpum revelou um pico de viscosidade de
4440,7 cP, quebra de viscosidade 2660,5 cP, viscosidade final 2414,1 cP,
tendência a retrogradação 834,3 cP e temperatura de pasta de 49,6°C. O baixo
teor de amido resistente (10,25%) e o elevado teor de amido digerível (89,78%)
sugerem que este amido pode ser uma boa fonte para a produção de
hidrolisados, tais como xarope de glicose e seus derivados. Os resultados
obtidos neste estudo fazem do fruto de S. lycocarpum uma fonte promissora de
amido para aplicações biotecnológicas.
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Metabolismo de lipídeos em inseto coleóptero: digestão e transporte de ácidos graxos / Lipid metabolism in coleóptera insect: digestion and transport of fatty acidsFreire, Camilla Camerino Santana Davino 17 August 2018 (has links)
Coleoptera is an order of insects well known as beetles. Most coleopteran species are phytophagous insects and for this reason are essential to crop and storage pests such as the Tribolium castaneum. Lipid metabolism is vital for the biological functions of insects, playing a role in the generation of metabolic energy and other cellular processes. Fatty acid transport proteins (FATPs) play a crucial role in the transport of extracellular fatty acids to cells, have a conserved sequence between species and are involved in the synthesis of hormones and pheromones. Recent studies show that silencing the gene for FATPs through interfering RNAi techniques (RNAi) in insects affects fatty acid uptake and pheromone synthesis. This work aims to characterize proteins homologous to FATPs present in the genome of Tribolium castaneum, to evaluate the gene expression in tissues, developmental stages and insects treated with Orlistat and to evaluate the effect of FATP silencing on energy metabolism. Bioinformatics analyzes were performed with the amino acid sequences, and real-time PCR evaluated the gene expression. The effects of the drug Orlistat were evaluated through qPCR and analysis of nutritional index. The search for sequences in the T. castaneum genome revealed two sequences of proteins homologous to FATPs and bioinformatic analysis was performed. The study of the gene expression of FATPs by qPCR demonstrated more significant expression of the two genes in the fat body of larvae and many expressions in all stages of development of the insect, with higher expression in the pupa stage. The effects of Orlistat on the expression of FATPs evidenced the influence of diet composition on the regulation of the gene expression of these proteins. Gene silencing of TcasFATP was achieved, but no direct effects on the energetic dynamics of the larvae were observed since triacylglycerol levels, and β-oxidation rates were not affected. Thus, more detailed studies with the use of gene silencing will be necessary to characterize FATPs better and elucidate their role in insect energy metabolism. / FAPEAL - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Alagoas / Os coleópteros constituem uma ordem de insetos bastante conhecidos como besouros. A maioria das espécies de coleóptero são insetos fitófagos e por esta razão constituem importantes pragas de culturas e de armazenamento, como o Tribolium castaneum. O metabolismo de lipídeos é importante para as funções biológicas de insetos, exercendo papel na geração de energia metabólica e em outros processos celulares. As proteínas transportadoras de ácidos graxos (FATPs) exercem papel crucial no transporte de ácidos graxos extracelulares para as células, possuem sequência conservada entre as espécies e estão envolvidas na síntese de hormônios e feromônios. Estudos recentes mostram que o silenciamento do gene para FATPs através de técnicas de RNA de interferência (RNAi) em insetos afetam a absorção de ácidos graxos e a síntese de feromônio. Este trabalho tem como objetivo caracterizar proteínas homólogas à FATPs presentes no genoma de Tribolium castaneum, avaliar a expressão gênica nos tecidos, fases de desenvolvimento e em insetos tratados com Orlistate e avaliar o efeito do silenciamento de FATPs no metabolismo energético. Foram realizadas análises bioinformáticas com as sequências de aminoácidos e a avaliação da expressão gênica foi realizada por PCR em tempo real. Os efeitos do fármaco Orlistate foram avaliados através de qPCR e análise dos índices nutricionais. A busca de sequências no genoma do T. castaneum revelou duas sequências de proteínas homólogas à FATPs e a análise bioinformática foi realizada. O estudo da expressão gênica de FATPs por qPCR demonstrou maior expressão dos dois genes no corpo gorduroso de larvas e expressão considerável em todos os estágios de desenvolvimento do inseto, com maior expressão no estágio de pupa. Os efeitos do Orlistate na expressão das FATPs evidenciaram a influência da composição da dieta na regulação da expressão gênica dessas proteínas. O silenciamento gênico de TcasFATP foi alcançado, mas não foram observados efeitos diretos na dinâmica energética das larvas, pois os níveis de triacilglicerol e as taxas de β-oxidação não foram afetadas. Dessa forma, estudos mais detalhados com uso do silenciamento gênico serão necessários para melhor caracterização funcional das FATPs e elucidação do seu papel no metabolismo energético do inseto.
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Estudo morfoanatômico, avaliação da atividade biológica e composição química e variabilidade do óleo essencial da Memora nodosa (SILVA MANSO) Miers - Bignoniaceae / Morphological and anatomical study, evaluation of biological activity and chemical composition and variability of essential oil Memora Nodosa (Silva Manso) Miers - BignoniaceaeTRESVENZOL, Leonice Manrique Faustino 18 December 2008 (has links)
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Previous issue date: 2008-12-18 / Memora nodosa (Silva Manso) Miers is a native savannah plant popularly used for
wound cicatrization (leaves and stems) and for treating abdominal pains and scabies (roots).
The purpose of this work is to study the morphoanatomy and determine the composition and
variability of the constituents of the essential oil obtained from the M. nodosa leaves, as well
as its antimicrobial, leishmanicidal, cicatrizing activity and toxicity. Morphologically, M.
nodosa is a bush with clumps of straight or curved stems. It has a deep, pivoting root and
presents a chandelier shaped structure in the upper part from where the stems sprout. It
presents compound, bipinnate, imparipinnate, oppositely crossed leaves. The inflorescence is
racemose with golden-yellow flowers. It is characterized by septifrague capsule type fruit
with replum and winged seeds. Anatomically the leaves are hypostomatic with
predominantly paracytic stomates. The epidermis is uniseriate with a thick cuticle and
glandular trichomes throughout the structure of the young leaves. The essential oil from the
M. nodosa leaves collected from seven different locations in the Brazilian savannah was
analyzed by GC(FID) and GC/MS. Five substances were identified, benzaldehyde and 1-
octene-3-ol were the main constituents. Two different classes regarding sampling location
and constituents were identified by means of the principal component and grouping analyses.
The antimicrobial activity of the ethanolic extracts from leaves, stems, roots and of essential
oil from leaves, and the fractions obtained from the roots, were assessed against Grampositive
and Gram-negative bacteria, as well as the Candida albicans fungus, using well
diffusion test and the agar dilution method. The ethanolic extract from the roots presented
small antimicrobial activity while the hexane and dichloromethane fractions obtained from
this extract presented MIC 0.39 mg/mL and 0.78 mg/mL against a number of Gram-positive
bacteria and the Candida albicans fungus. The essential oil presented MIC 0.78 mg/mL to
1.56 mg/mL. The antimicrobial activity of the essential oil was the result of synergic action
between the benzaldehyde, 1-octene-3-ol, 1-octanol, linalool and the mandelonitrile,
constituents of the essential oil. Promastigote forms of Leishmania chagasi were used for the
leishmanicidal assessment and it was verified that the ethanol extract from the leaves
presented an IC50 of 93.2 μg/mL and from the roots presented an IC50 of 95.87 μg/mL. The
hexane fraction from the roots presented an IC50 of 13.51μg/mL. A mixture of β-sitosterol
and stigmasterol was isolated and identified in the hexane fraction obtained from the ethanol
extract from the roots. This mixture was tested against L. chagasi resulting in an IC50 of
69.79 μg/mL. The cicatrizing activity of the ethanol extract from the leaves and roots was assessed on skin wounds in rats, and it be noted reepithelization occurred faster only in the
group treated with a 2% aqueous solution of the ethanol extract from the roots. This action
may be related to the alantoine isolated in the ethanol extract from the roots. The toxicity
assessment of the ethanol extracts from roots, leaves and hexane fraction obtained from M .
nodosa roots, tested on rats, mice and Artemia salina proved that this plant is not potentially
toxic. In conclusion, according to the tests performed, the best results were obtained with
ethanolic extract and it presented antimicrobial, wound cicatrization and leishmanicidal
activities. Hexane and dichloromethane fractions obtained from roots extract presented
antimicrobial activity against Gram-positive bacteria and the Candida albicans fungus and
hexane fraction strong leishmanicidal activity. / A Memora nodosa (Silva Manso) Miers é uma planta nativa do Cerrado e utilizada
popularmente na cicatrização de feridas (folhas e caules) e no tratamento de dores abdominais
e sarnas (raízes). Este trabalho objetivou realizar o estudo morfoanatômico, determinar a
composição química e a variabilidade dos constituintes do óleo essencial obtido das folhas e
avaliar a atividade antimicrobiana, leishmanicida e cicatrizante e a toxicidade dos extratos e
frações da M. nodosa. Morfologicamente, observou-se que a M. nodosa é um arbusto com
caules retos ou escandentes reunidos em touceiras. A raiz é pivotante, profunda e apresenta,
na parte superior, uma estrutura em candelabro de onde se originam os caules. As folhas são
opostas cruzadas, recompostas, bipinadas, imparipinadas, com foliólulos lanceolados. A
inflorescência é racemosa com flores de cor amarelo-ouro. O fruto é do tipo cápsula septífraga
com abertura longitudinal e sementes aladas. Anatomicamente, as folhas são hipoestomáticas,
com estômatos predominantemente paracíticos. A epiderme é unisseriada, com cutícula
espessa em todas as estruturas das folhas. Tricomas glandulares e tectores são observados nas
folhas e caules jovens. O óleo essencial das folhas da M. nodosa coletadas em sete localidades
diferentes do Cerrado brasileiro foi analisado por CG (DIC) e CG/EM. Cinco substâncias
foram identificadas, sendo o benzaldeído e o 1-octen-3-ol os principais constituintes. A
análise dos componentes principais e dos agrupamentos possibilitou a distinção de duas
classes diferenciadas em relação ao local da amostragem e aos constituintes. As atividades
antimicrobianas dos extratos etanólicos das folhas, dos caules e das raízes, do óleo essencial
das folhas e das frações obtidas das raízes foram avaliadas usando teste de difusão em poço e
o método de diluição em ágar. O extrato etanólico das raízes apresentou atividade
antimicrobiana fraca, enquanto as frações hexano e diclorometano, obtidas desse extrato,
mostraram atividade de forte a moderada contra várias bactérias Gram-positivas e contra o
fungo Candida albicans. O óleo essencial obtido das folhas apresentou CIM de 0,78 mg/mL a
1,56 mg/mL contra bactérias Gram-positivas e Candida albicans. Constatou-se que a
atividade antimicrobiana do óleo essencial se deve a ação sinérgica entre o benzaldeído, o 1-
octen-3-ol, o 1-octanol, o linalol e a mandelonitrila, constituintes do óleo essencial. A
atividade cicatrizante dos extratos etanólicos das folhas e raízes foi avaliada em feridas
cutâneas de ratos e observou-se uma aceleração na reepitelização apenas no grupo tratado
com solução aquosa a 2% do extrato etanólico das raízes. Essa ação pode estar relacionada
com a alantoína, isolada do extrato etanólico das raízes. Na avaliação da atividade
leihsmanicida, empregaram-se culturas com formas promastigotas de Leishmania chagasi e verificou-se que o extrato etanólico das folhas apresentou IC50
de 93,2 μg/mL e as raízes IC50
de 95,87 μg/mL. A fração hexano obtida das raízes apresentou IC50 de 13,51 μg/mL. Da
fração hexano obtida do extrato etanólico das raízes foi isolado e identificado uma mistura de
β-sitosterol e estigmasterol. Essa mistura foi testada contra L. chagasi, obtendo-se IC50 de
69,79 μg/mL. A avaliação da toxicidade aguda dos extratos etanólicos das folhas, das raízes e
da fração hexano obtidas das raízes empregando como modelos experimentais ratos e
camundongos e o teste de citotoxicidade utilizando Artemia salina mostraram que essa planta
não é potencialmente tóxica. Conclui-se que os melhores resultados foram obtido com extrato
etanólico das raízes, que apresentou atividade antimicrobiana, cicatrizante e leishmanicida.As
frações hexano e diclorometano, obtidas das raízes, apresentaram bom potencial
antimicrobiano contra bactérias Gram-positivas e o fungo C. albicans e a fração hexano forte
atividade leishmnicida.
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Avaliação da atividade citotóxica, clastogênica e genotóxica do composto ditionato de cis-tetraamino(oxalato)rutênio(III) em linfócitos do sangue periférico humano / Evaluation of cytotoxic activity, clastogenic and genotoxic compound ditionato tetraamino cis-(oxalate) ruthenium (III) in human peripheral blood lymphocytesREZENDE, Manuela da Rocha Matos 24 February 2010 (has links)
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Previous issue date: 2010-02-24 / Chemotherapy agents are increasingly being utilized due to their promising effects in cancer treatment. The desired actions of these drugs are obtained at the cost of frequent and severe side effects. It is essential that drugs utilized for cancer treatment are tested in relation to not only their cytotoxic, but also their clastogenic and genotoxic potentials to establish their clinical risk. Thus, there is increased interest in searching for new metallic compounds presenting antitumor activity with therapeutic potential and reduced side effects, such as those containing platinum (Pt), iron (Fe), titanium (Ti), rhodium (Rh), gold (Au) and ruthenium (Ru). In this work, the cytotoxic, clastogenic and genotoxic properties of cis-tetraamine(oxalato)ruthenium(III) dithionite, cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6), were evaluated in peripheral human blood lymphocytes in vitro. Mitotic index (MI), chromosomal aberrations (CA) and DNA damage were analyzed by comet assay. The MI values of human peripheral blood lymphocyte cultures treated with 0.0075, 0.075, 0.75 and 7.5 μM cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) were 6.1, 3.9, 3.2 and 0.2%, respectively. The lowest concentration 0.0075 did not show cytotoxic activity compared to negative control. The CA values obtained for the 0.0075, 0.075 and 0.75 μM concentrations presenting low frequency (1.5, 1.6 and 2.3%, respectively) not expressing clastogenic activity compared to negative control and only at the highest concentration 7.5 μM, showed clastogenic activity, predominantly chromatid breaks and gaps. The data obtained by the comet assay, using cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6), suggest that this compound does not show genotoxic activity at concentrations lower than 0.0075 μM. The results of these studies show that cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6) has no potential cytotoxic, clastogenic and genotoxic in vitro at concentrations less than or equal to 0.0075 μM. / Estudos de citoxicidade e genotoxicidade têm sido realizados para o desenvolvimento de novos agentes anticâncer com maior seletividade e menores efeitos colaterais de agentes antitumorais convencionais. Neste trabalho, foram avaliadas as propriedades citotóxicas, clastogênicas e genotóxicas do composto ditionato de cis-tetraamino(oxalato)rutênio(III), {cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6)}, em cultura de linfócitos de sangue periférico humano in vitro. Foram analisados os parâmetros índice mitótico (IM), aberrações cromossômicas (ACs) e danos induzidos no DNA detectados pelo ensaio cometa. O IM de cultura de linfócitos de sangue periférico humano tratados com 0,0075; 0,075; 0,75 e 7,5μM de {cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6)} foram 6,1; 3,9; 3,2 e 0,2%, respectivamente. A menor concentração 0,0075 não apresentou atividade citotóxica comparada ao controle negativo. As ACs derivadas das concentrações 0,0075; 0,075 e 0,75, apresentaram frequência de 1,5; 1,6 e 2,3 %, respectivamente, não manifestando atividade clastogênica comparadas ao contole negativo e somente na concentração de 7,5μM, demonstrou atividade clastogênica, predominando quebras e falhas cromatídicas. Os dados obtidos por meio do ensaio cometa, utilizando {cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6)}, sugerem que este composto não apresenta atividade genotóxica em concentrações menores que 0,0075 μM. Os resultados desses estudos demonstram que {cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6)} não possui potencial citotóxico, clastogênico e genotóxica in vitro em concentrações menor ou igual a 0,0075 μM.
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Caracterização e Análise Funcional da Beta -1,3-glicanosiltransferase 2 de Paracoccidioides brasiliensis / Characterization and Functional Analysis of Beta-glucanosyltransferases -1.3 2 of Paracoccidioides brasiliensisLIMA, Patrícia de Sousa 29 January 2010 (has links)
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Previous issue date: 2010-01-29 / Paracoccidioides brasiliensis is the causative agent of paracoccidioidomycosis (PCM),
a systemic disorder geographically restricted to Central and South America, and one of the
most important endemic mycoses in these regions, especially among the male rural populations.
The disease is most likely caused by the inhalation of asexual spores (conidia) produced by the
mycelia form of the fungus, propagules that once in the lungs undergo differentiation towards
the parasitic yeast form. The cell wall of P. brasiliensis is a dynamic structure, essentially
composed of branched glucan (β-1,3 and β-1,6 glucans), chitin, lipids and mannoproteins.
Many enzymes are responsible for cell wall remodeling. One of them is the Beta-1,3-
glucanosyltransferase 2 (PbGel2p) presented here. The amino acid deduced sequence of
PbGel2p presented similarity to others proteins involved in fungal cell wall biosynthesis and
morphogenesis and it was characterized as a member of GH72 family, GH72_ subfamily. The
recombinant rPbGel2p was overexpressed in Escherichia coli and the polyclonal antibody was
obtained. The PbGel2p mRNA, as well as the protein, were detected at the highest level in the
mycelium phase. The potencial role of PbGel2p in cell wall biosynthesis and morphogenesis
was analyzed by assessing its ability to rescue the phenotype of the Saccharomyces cerevisiae
GAS1Δ. The results indicated that PbGel2p is a cell wall-associated protein that probably works
as a β-1,3-glucan elongase capable of mediating fungal cell wall integrity. In addition,
predicted protein-protein interactions between PbGel2p and others proteins of the fungus P.
brasiliensis were assessed by using a S. cerevisiae two hybrid system and pull-down assay. The
proteins that were found to interact with PbGel2p are: anthranilate synthase component 2
(involved in the tryptophan pathway), MYND domain protein SamB (related to fungal
morphogenesis), mitotic spindle checkpoint protein Mad2B (required of the organization of the
cytoskeleton and control of cell cycle), G protein complex beta subunit CpcB (organize the
cytoskeleton of actin), WD repeat protein (involved in the control of cell cycle),
phosphatidylinositol-4-phosphate-5-kinase its3 (required of the organization of the actin
cytoskeleton), Hsp60 (related of stress conditions like temperature) and ATPase (localized in
the plasma membrane / involved in the glucose metabolism). This suggested the relation of
PbGel2p in other process to maintenance of cell wall integrity. / Paracoccidioides brasiliensis é o agente causador da paracoccidioidomicose (PCM),
prevalente em países da América Central e do Sul sendo considerada uma das mais importantes
micoses endêmicas, especialmente entre a população rural masculina. A doença é causada pela
inalação dos esporos assexuais (conídios) produzidos pela forma miceliana do fungo. Nos
pulmões, os propágulos tendem à diferenciação para a forma leveduriforme parasitária. A
parede celular de P. brasiliensis é uma estrutura dinâmica, composta essencialmente por
glicanas ramificadas (ligações β-1,3 e β-1,6), quitina, lipídeos e manoproteínas. Muitas enzimas
estão envolvidas no seu remodelamento. Uma delas é a Beta-1,3-glicanosiltransferase 2
(PbGel2p), apresentada aqui. A sequência deduzida de aminoácidos de PbGel2p mostrou
similaridade com outras proteínas envolvidas na morfogênese e biossíntese da parede celular
fúngica e foi caracterizada como parte da família GH72, subfamília GH72_ . A proteína
recombinante rPbGel2p foi superexpressa em Escherichia coli e o anticorpo policlonal obtido.
Os níveis de transcritos que codificam para PbGel2p, assim como os de proteína, foram
detectados em maior teor na fase miceliana do fungo. O papel de PbGel2p na morfogênese e
biossíntese da parede celular foi analisado pela habilidade da proteína em resgatar o fenótipo
mutante para GAS1Δ de Saccharomyces cerevisiae. Os resultados indicaram que PbGel2p é
uma proteína associada à parede celular que provavelmente atua no alongamento da β-1,3-
glicana mediando a integridade da parede celular. Ainda, as interações proteína-proteína
preditas entre PbGel2p e outras proteínas de P. brasiliensis usando o sistema de duplo híbrido e
pull-down foram: componente 2 da antranilato sintase (envolvida na via do triptofano), proteína
SamB com domínio MYND (relacionada com a morfogênese fúngica), proteína Mad2B
(requerida na organização do citoesqueleto e controle do ciclo celular), subunidade beta da
CpcB (organiza o citoesqueleto de actina), proteína com repetição WD (envolvida no controle
do ciclo celular), fosfatidilinositol-4-fosfato-5-quinase (requerida para organização do
citoesqueleto de actina), Hsp60 (relacionada à condições de estresse como temperatura) e
ATPase (localizada na membrana plasmática/ involvida no metabolismo de glicose). Essas
interações sugerem a relação de PbGel2p em outros processos celulares para manutenção da
integridade da parede celular.
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Indicadores microbiológicos e bioquímicos da qualidade do solo em transição para cultivo orgânico de feijoeiro comum (Phaseolus vulgaris L.) / Microbiological and biochemical indicators of the quality of ground transitioning to organic cultivation of common bean (Phaseolus vulgaris L.)ROSA, Joyce Rover 30 May 2009 (has links)
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Previous issue date: 2009-05-30 / The soil quality indicators analyses during and after the transition period of
conventional to organic production system are very important to evaluated the
sustainability of agricultural systems. Soil microbiological and biochemical indicators
shall quickly indicate changes occurred on both, soil management and production
systems. The objective of this work was to evaluated shifts on microbiological and
biochemical soil indicators of a conventional common bean production system in
transition to an organic system, under conventional and non-tillage soil management
systems after cover crops. Total enzymatic activity (AET), betaglucosidase activity
(betaglucosidase), acid fosfatase activity (fosfatase), carbon (CBM) and nitrogen
(NBM) of the microbial biomass, the basal soil respiration (RBS) and the metabolic
quotient (qCO2) were evaluated on soil samples collected at tillage common bean cycle.
The experiment was carried out at Embrapa Rice and Beans, in Santo Antônio de Goiás
GO, and it was also collected soil samples in a secondary forest area close to the
experiment to be used as a reference. The content of carbon and nitrogen of the soil
microbial biomass, as well as, microbial and enzymatic activities in conventional and
non-tillage systems were independent of the cover crop specie used. Under the
experimental conditions, the soil management systems did not show effect in the
enzymatic and microbial soil activities. The total and acid fosfatase enzymatic activities
of the cropped soils were lower than in the forest soil. The betaglucosidase enzymatic
activity was higher in cropped soil than under forest soil in the raining season and lower
in the dry season. The soil tillage performed before common bean sowing promoted
shifts on the CO2 efflux from soil to the atmosphere, which was verified by an increase
on both, basal soil respiration and metabolic quotient. / A análise da qualidade do solo durante e após o período de transição de um sistema
produtivo convencional para um sistema orgânico é importante como indicador de
sustentabilidade. Indicadores microbiológicos e bioquímicos da qualidade do solo
devem responder rapidamente a mudanças no manejo e alterações nos sistemas de
produção. Assim, este experimento teve como objetivo avaliar as alterações nos
indicadores microbiológicos e bioquímicos do solo em um sistema de produção em
transição para cultivo orgânico do feijoeiro comum (Phaseolus vulgaris L.), sob sistema
de preparo convencional (SPC) e direto (SPD) do solo, após o manejo de diferentes
plantas de cobertura de solo. Avaliaram-se a atividade enzimática total (AET), a
atividade de betaglicosidase (β-glicosidase) e de fosfatase ácida (Fosfatase), o carbono
(CBM) e o nitrogênio (NBM) da biomassa microbiana, a respiração basal do solo (RBS)
e o quociente metabólico (qCO2) em amostras de solo coletadas durante o ciclo de
cultivo do feijoeiro comum. O experimento foi conduzido na Embrapa Arroz e Feijão,
em Santo Antônio de Goiás GO e área de mata nativa próxima ao ensaio foi utilizada
como referência. O teor de carbono e nitrogênio da biomassa microbiana no solo, assim
como de atividades microbianas e enzimáticas avaliadas, tanto sob SPD quanto sob
SPC, foi independente da espécie de planta de cobertura de solo utilizada. Nas
condições testadas, o sistema de preparo de solo não teve influência na atividade das
enzimas do solo e nem na atividade microbiana do solo. No solo agricultável testado, a
atividade enzimática total e de fosfatase ácida foi menor do que em solo não
agricultável. No período chuvoso, a atividade de betaglicosidase foi maior em solo
agricultável do que em solo não agricultável e menor no período seco. O preparo do
solo para a semeadura do feijoeiro comum provocou aumento da perda de gás
carbônico, verificado em decorrência de aumento na respiração basal do solo e no
quociente metabólico.
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Ação da fosfolipase B extracelular de Paracoccidioides brasiliensis na interação ex vivo com macrófagos alveolares / Action of extracellular phospholipase B of Paracoccidioides brasiliensis interaction with alveolar macrophage ex vivoSOARES, Deyze Alencar 26 March 2010 (has links)
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Dissertacao Deyze Alencar Soares.pdf: 632456 bytes, checksum: 33012995df8eabb3f4b7509fe372764d (MD5)
Previous issue date: 2010-03-26 / Paracoccidioides brasiliensis, a thermodimorphic fungus, is the causative agent of the most
prevalent systemic mycosis in Latin America, paracoccidioidomycosis. The phospholipase B
(PLB) enzyme is considered an important virulence factor in this dimorphic fungus, involved
in the immune response of the host-pathogen interaction. Our objective was to determine
whether a P. brasiliensis (Pb18) PLB is involved in adhesion / internalization of yeast and
evasion of host immune responses. The effect of PLB was analysed using specific inhibition
of PLB (alexidine dihydrochloride) and pulmonary surfactant in an ex vivo model (Pb18) of
alveolar macrophage (MHS cells) infection. PLB enzyme assays and real time RT-PCR (qRTPCR)
analysis of genes differentially expressed in the process of evasion: plb1 (phospholipase
B1), icl1 (isocitrate lyase) and sod3 (Cu, Zn dismutase) and immune responses: clec2 (C-type
lectin domain 2), cd14 (cluster of differentiation 14), tlr2 (toll-like receptor 2), nfkb (nuclear
factor kappa B), nkrf (NF-kappaB repressing factor), il1β (inteleukin-1β) and tnfα (tumor
necrosis factor alpha) were carried out using selective inhibition of PLB activity and
pulmonary surfactant. The levels of cytokines inteleukin 10 (IL-10), IL-12 and TNF-α) were
also determined by ELISA. PLB activity under adhesion conditions of P. brasiliensis (Pb18)
to alveolar macrophage cells was found at high levels up to 6 hours post-infection. In the
conditions of exposure to pulmonary surfactant and alexidine dihydrochloride, PLB activity
and the level of transcripts of genes related to phagocytosis and inflammatory response were
measured. We found that PLB activity had an influence on the phagocytic activity of alveolar
macrophages. Alexidine dihydrochloride (0,25 μM) selectively inhibited PLB activity by 66%
and decreased significantly the adhesion and internalization of yeast on MHS cells. Genes
involved in phagocytosis (trl2 and cd14) and inflammatory response (nrkf, tnfα and il1β) were
down-regulated in the presence of the PLB inhibitor. In contrast, the PLB activity and
internalization of fungal yeast cells increased significantly in the presence of pulmonary
surfactant (100 μg/mL) and genes such as clec2, important for effective phagocytosis by MHS
cells, and the pro-inflammatory inhibitor (nkrf) were up-regulated. Also, the pulmonary
surfactant did not alter cytokine production, while alexidine dihydrochloride decreased the
levels of IL-10 and increased the levels of IL-12 and TNF-α. In addition, through
simultaneous analyses of gene expression for the pathogen, P. brasiliensis, we found upregulation
of the genes sod3, icl1 and plb1, required for the evasion of alveolar macrophages.
P. brasiliensis PLB is important for the binding and internalization of yeast at macrophage
surfaces. The specific effect of inhibiting PLB enzyme activity indicates that adhesion may be
facilitated indirectly via fatty acid release from phospholipids of the membrane of host cells.
This is the first study to show that PLB activity may modulate immune responses to P.
brasiliensis infection. / Paracoccidioides brasiliensis, fungo dimórfico, é o agente etiológico principal micose
sistêmica da América Latina, paracoccidioidomicose. A enzima fosfolipase B (PLB) é
considerada um importante fator de virulência nesse fungo dimórfico e está envolvida na
resposta imune da interação patógeno-hospedeiro. Nosso objetivo foi determinar se a PLB de
P. brasiliensis (Pb18) está envolvida na adesão e internalização de leveduras e na evasão da
resposta imune hospedeira. O efeito da PLB foi analisado usando o inibidor seletivo de PLB
(alexidine dihydrochloride) e o surfactante pulmonar (Survanta) em um modelo ex vivo de
infecção de macrófagos alveolares (MHS) com Pb18. Ensaio enzimático de PLB e análise de
genes diferencialmente expressos por RT-PCR em tempo real (qRT-PCR) no processo de
evasão: plb1 (fosfolipase B1), icl1 (isocitrato liase) e sod3 (Cu, Zn dismutase); e na resposta
imune: clec2 (lecitina tipo-C 2), cd14 (cluster de diferenciação 14), tlr2 (receptor toll-like 2),
nfkb (fator nuclear kappaB), nkrf (repressor fator nuclear kappaB), il1β (interleucina- 1 beta) e
tnfα (fator de necrose tumoral alfa) foram realizados usando o inibidor seletivo da atividade
de PLB e surfactante pulmonar. Os níveis de citocinas interleucina 10 (IL-10), IL-12 e TNF-
α) foram determinados por ELISA. A atividade de PLB usadas em baixas condições para a
adesão de P. brasiliensis (Pb18) obteve altos níveis em 6 horas pós-infecção. Na presença do
surfactante pulmonar e alexidine dihydrochloride, a atividade da PLB e os níveis de
transcritos dos genes relacionados à fagocitose e à resposta inflamatória foram quantificados.
A PLB teve influência na atividade fagocítica dos macrófagos. Alexidine dihydrochloride
(0,25 μM) inibiu seletivamente a atividade PLB em 66% e diminuiu significativamente a
adesão e internalização de leveduras por macrófagos alveolares (MHS). Genes envolvidos na
fagocitose (trl2 e cd14) e resposta inflamatória (nrkf, tnfα e il1β) foram reprimidos na
presença do inibidor de PLB. Em contraste, a atividade PLB e internalização de leveduras
aumentou significativamente na presença do surfactante pulmonar (100 μg/mL) e genes assim
como clec2, importante para uma fagocitose efetiva pelos macrófagos alveolares (MHS), e o
inibidor pró-inflamatório (nkrf) foram induzidos. Entretanto, o surfactante pulmonar não
alterou a produção de citocinas, enquanto que alexidine dihydrochloride diminuiu os níveis de
IL-10 e aumentou os níveis de IL-12 e TNF-α. Em adição, nas análises simultâneas de
expressão de genes, P. brasiliensis, houve indução dos genes sod3, icl1 e plb1, requeridos
para a evasão dos macrófagos alveolares. A PLB de P. brasiliensis é importante na adesão e
internalização de leveduras pelos macrófagos alveolares. O efeito específico da inibição da
atividade da PLB indica que a adesão pode ser facilitada indiretamente via liberação de ácidos
graxos dos fosfolipídeos de membrana das células hospedeiras. Esse é o primeiro estudo
mostrando que a atividade da PLB pode modular a resposta imune à infecção pelo P.
brasiliensis.
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Ocorrência de mutações em loci ligados ao cromossomo Y na prole nascida de indivíduos expostos à radiação ionizante / Occurrence of mutations in loci linked to Y chromosome in the offspring born to individuals exposed to ionizing radiationARRUDA, Jalsi Tacon 13 May 2009 (has links)
Made available in DSpace on 2014-07-29T15:16:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1
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Previous issue date: 2009-05-13 / In September 1987, in Goiânia-GO, Brazil, one of the most serious radiological accidents
occurred at a radiotherapy unit involving a source of cesium-137. An area of 2,000 m2 was
contaminated and 249 people were exposed, both externally and internally, to substantial
doses of ionizing radiation, resulting in four fatalities due to acute radiation syndrome.
The current study examined the occurrence of possible mutations in the Y chromosome of
the exposed men and their male offspring divided into two groups: A) eight accidentally
exposed men and eight boys; B) twelve occupationally exposed men and sixteen boys; and
the control group with 8 men and 8 boys not exposed. DNA was isolated from peripheral
blood lymphocytes and 30 loci (SRY, AMELY, ZFY, AZFa-Prox1, SY83, AZFa-Prox2,
SY86, SY85, SY84, USP9Y, SY87, DBY, AZFa-Dist1, 12f2, AZFa-Dist2, UTYpe, SY106,
SY124, SY127, SY134, SY135, SY143, SY1197, SY1291, SY1125, SY1054, YDAZ3, SY254,
SY255, RH65618) were amplified by the polymerase chain reaction. All DNA tests had a
probability of paternity of at least 99.99%. All analyzed individuals amplified STS;
however, 4 fathers (8.4%) and 8 sons (21.2%) in group A, and 3 fathers (7.1%) and 3 sons
(63.3%) in group B showed mutations. The total mutation rates were 0.11. The first
generation of the accidentally exposed group showed 7 mutations in SY86, 12 mutations in
SY84, and 1 mutation both in 12f2 and SY135. The first generation of the occupationally
exposed group showed 2 mutations in SRY, AMELY, AZFa-Prox1, AZFa-Prox2, SY86,
SY85, SY84, USP9Y, SY87, AZFa-Dist1, UTYpe, SY106, SY124, SY127, SY134, SY135,
SY143, SY1125, SY1054, YDAZ3, SY254, SY255, and RH65618; and 4 mutations in 12f2.
In the control group, only one son showed an SY84 deletion. Recombination events
between repetitive regions are possibly the cause of the high incidence of de novo
mutations in the Y chromosome. The mutations were possibly generated by intrinsic
mechanisms that could have been increased by the ionizing radiation from cesium-137.
The exposure to ionizing radiation from cesium-137 can be detected in offspring of
exposed individuals, and the mutation rate can be attributed to radioactive exposure. / Em setembro de 1987, em Goiânia-GO, Brasil, ocorreu um dos mais graves acidentes
radiológicos envolvendo uma unidade de radioterapia com uma fonte de césio-137. Uma
área de 2.000m2 foi contaminada e 249 pessoas foram expostas, tanto externa quanto
internamente, a grandes doses de radiação ionizante, resultando em 4 óbitos, devido a
síndrome aguda da radiação. O presente estudo analisou a ocorrência de possíveis
mutações no cromossomo Y de homens expostos e seus descendentes do sexo masculino
divididos em dois grupos: A) 8 homens expostos acidentalmente e 8 meninos; B) 12
homens expostos ocupacionalmente e 16 meninos; e o grupo controle com 8 homens e 8
meninos não expostos. O DNA foi isolado de linfócitos de sangue periférico e 30 loci
(SRY, AMELY, ZFY, AZFa-Prox1, SY83, AZFa-Prox2, SY86, SY85, SY84, USP9Y,
SY87, DBY, AZFa-Dist1, 12f2, AZFa-Dist2, UTYpe, SY106, SY124, SY127, SY134,
SY135, SY143, SY1197, SY1291, SY1125, SY1054, YDAZ3, SY254, SY255, RH65618)
foram analisados pela reação em cadeia da polimerase. Todos os genomas apresentaram
um vinculo genético de pelo menos 99,99% de probabilidade acumulada de paternidade.
Todos os indivíduos analisados amplificaram os STS; entretanto 4 pais (8,4%) e 8 filhos
(21,2%) no grupo A, e 3 pais (7,1%) e 3 filhos (63,3%) no grupo B apresentaram
mutações. A taxa de mutação total foi 0,11. A primeira geração do grupo acidentalmente
exposto apresentou 7 mutações no SY86, 12 mutações no SY84, 1 mutação nos loci 12f2 e
SY135. A primeira geração do grupo ocupacionalmente exposto apresentou 2 mutações no
SRY, AMELY, AZFa-Prox1, AZFa-Prox2, SY86, SY85, SY84, USP9Y, SY87, AZFa-
Dist1, UTYpe, SY106, SY124, SY127, SY134, SY135, SY143, SY1125, SY1054,
YDAZ3, SY254, SY255, RH65618, e 4 mutações no 12f2. No grupo controle somente um
filho apresentou uma deleção no SY84. Acredita-se que eventos de recombinação entre
regiões repetitivas sejam a causa da alta freqüência de mutações de novo no cromossomo
Y. As mutações encontradas possivelmente foram geradas por mecanismos mutacionais
intrínsecos que podem ter sido aumentados pela radiação ionizante do césio-137. A
exposição à radiação ionizante de césio-137 pode ser biomonitorada na descendência dos
indivíduos expostos e a taxa de mutação pode ser atribuída à exposição à radiação.
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