Made available in DSpace on 2015-04-14T14:51:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 432437.pdf: 10723389 bytes, checksum: d0fa4e1abb05919515c5199dcf4ecc73 (MD5) Previous issue date: 2011-06-24 / O gene inhA de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) codifica a enzima enoil redutase, InhA, uma enzima chave no ciclo de alongamento de ?cidos graxos tipo II e t?m sido validada como um alvo efetivo para o desenvolvimento de agentes antimicrobianos. A InhA catalisa a redu??o NADH-dependente da liga??o dupla trans entre as posi??es C2 e C3 de substratos de ?cidos graxos. Ela ? o alvo da isoniazida, uma droga de primeira linha no tratamento da tuberculose. Muta??es no gene estrutural da InhA est?o associadas com a resist?ncia ? isoniazida in vivo. Mesmo que muta??es no gene inhA sejam conhecidas por facilitar a resist?ncia ? isoniazida, InhA ainda ? uma excelente candidata a alvo para o planeamento de f?rmacos porque: (i) a grande maioria das muta??es encontradas em isolados cl?nicos de cepas resistentes ? isoniazida est?o associadas com o ativador da isoniazida (KatG catalase-peroxidase); (ii) apenas uma enoil-ACP redutase ? encontrada em M. tuberculosis, ao contr?rio de outras enzimas dos sistemas FAS-II de bact?rias; (iii) a especificidade da InhA por substratos de cadeia mais longa a distingue das enoil-ACP redutases de outros tipos. Nosso objetivo com este trabalho foi de analisar em detalhe as informa??es estruturais e f?sico-qu?micas dispon?veis sobre a InhA de Mtb utilizando ferramentas de bioinform?tica. Como resultado, foi desenvolvido um modelo farmacof?rico baseado na estrutura do s?tio de liga??o ao substrato da InhA, permitindo a aplica??o de uma metodologia de triagem virtual focada em selecionar ligantes que satisfizessem essas caracter?sticas, permitindo assim, a melhor complementariedade com a prote?na alvo. Al?m disso testamos a habilidade de quatro algoritmos de docagem molecular em encontrar conforma??es semelhantes para uma mesma mol?cula, fornecendo ind?cios de que esta seja a conforma??o mais pr?xima ?quela adotada in vivo. Por fim, simula??es de din?mica molecular foram empregadas para melhor compreens?o da intera??o da enzima InhA com um inibidor j? conhecido desta enzima

Made available in DSpace on 2015-04-14T14:51:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 432505.pdf: 1390397 bytes, checksum: 39fab4614d11925a0667ad6e40789290 (MD5) Previous issue date: 2011-03-22 / Em focos de introdu??o recente da esquistossom?se, como Esteio na regi?o metropolitana de Porto Alegre, a parasitose ocorre com baixas preval?ncias e cargas parasit?rias, resultando em dificuldades para o diagn?stico parasitol?gico, em virtude da sensibilidade inadequada dos m?todos cl?ssicos. O principal objetivo deste trabalho foi otimizar o desempenho de m?todos de diagn?stico, em situa??es que os ovos nas fezes s?o um evento raro. A estrat?gia foi examinar grandes quantidades de fezes, o que resultou na descri??o e avalia??o de um novo m?todo de diagn?stico para detec??o de ovos de Schistosoma mansoni nas fezes denominado Helmintex. Este ? um m?todo de concentra??o, onde as fezes passam por uma sequ?ncia de sedimenta??o espont?nea, tamisagem, centrifuga??o com acetato de etila (Ritchie) e uma etapa final onde os ovos s?o isolados atrav?s de intera??o com part?culas paramagn?ticas em um campo magn?tico. Ap?s a concentra??o, na etapa de detec??o dos ovos todo o sedimento resultante ? analisado atrav?s de microscopia ?ptica. Na segunda etapa deste trabalho o objetivo foi avaliar o desempenho da PCR em tempo real (tecnologia Taqman) como alternativa de m?todo de detec??o no sedimento final do Helmintex, substituindo a an?lise microsc?pica. Para realiza??o da primeira etapa, ovos de S. mansoni foram adicionados em 30 g de fezes negativas para a infec??o, formando suspens?es de 0,1 a 1,34 ovos por grama de fezes (opg), e as fezes foram submetidas a todas as etapas de concentra??o do m?todo. Para cada suspens?o testada foi encontrado pelo menos 1 ovo em 20% (0.1 opg); 50% (0.24); 50% (0.34); 60% (0.67); 80% (1.0) e 100% (1.34) das tentativas testadas para cada suspens?o. Para a avalia??o do desempenho da PCR, "primers" e sonda para o gene da citocromo-C oxidase subunidade 1 foram desenhados para a amplifica??o do DNA de S. mansoni. Para a extra??o do DNA foram avaliados 4 protocolos diferentes. Foram preparadas suspens?es de ovos em ?gua destilada e fezes, contendo 1, 10, 20, 40 e 80 ovos. E amostras de 1000 ovos foram extra?das para a constru??o de uma curva padr?o da estimativa de concentra??o de DNA, para verifica??o do limite de detec??o da rea??o. A amplifica??o do DNA do parasito pode ser vista em todas as suspens?es testadas, inclusive a que continha 1 ovo. Dos 4 protocolos de extra??o avaliados, o Illustra Tissue and Cell GenomicPrep Mini Spin Kit (GE Healthcare), um kit de extra??o comercial, foi o que apresentou o melhor rendimento. A curva padr?o constru?da a partir de 1000 ovos apresentou um limite de detec??o de 1 pg com reprodutibilidade de 13,8%. Considerando 100% de reprodutibilidade, a rea??o apresentou limite de detec??o de 100 pg. O novo m?todo Helmintex descrito neste trabalho representa grande avan?o no diagn?stico da esquistossom?se em infec??es com baixas cargas parasit?rias, al?m disso, apresentam-se 2 op??es de m?todos de detec??o (visualiza??o microsc?pica e amplifica??o de DNA dos ovos pela PCR em tempo real). Estes avan?os contribuem para o esfor?o em curso de reduzir mundialmente a morbidade e a dissemina??o das ?reas de transmiss?o das esquistossom?ases

Made available in DSpace on 2015-04-14T14:51:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 432578.pdf: 7523354 bytes, checksum: fb90e3b4e65279b64dfbdb3b93e8f365 (MD5) Previous issue date: 2011-03-25 / A tuberculose tem sido um flagelo da humanidade desde os tempos antigos. Esta doen?a tem cobrado um pre?o alto em vidas humanas, por esta raz?o muitos esfor?os tem sido feitos com o intuito de derrotar o Mycobacterium tuberculosis. A sequ?ncia gen?mica do Mycobacterium tuberculosis deu in?cio a uma nova era e foi de grande impacto para o presente conhecimento deste pat?geno como tamb?m na pesquisa de drogas anti-microbiais. Com estes avan?os foi poss?vel identificar genes e mais tarde validar vias metab?licas. O melhor entendimento das vias metab?licas presentes no Mycobacterium tuberculosis corresponde ao primeiro passo e configura uma possibilidade de identifica??o de novos alvos moleculares que possam erradicar o bacilo. Entretanto, ainda h? muito a fazer, desde a descoberta da Rifampicina, a droga de primeira linha efetivamente utilizada contra TB, nenhuma nova droga quimioter?pica foi identificada. Nos dias de hoje, a TB ? respons?vel pela morte de dois milh?es de pessoas por ano, sendo considerada uma emerg?ncia global, a qual precisa ser urgentemente erradicada. O presente projeto tem o objetivo de realizar a an?lise estrutural da enzima Citidina Deaminase (CDA; EC 3.5.4.5) de Mycobacterium tuberculosis associada com seus substratos e produtos, aliando t?cnicas de Din?mica e Docagem molecular.

Made available in DSpace on 2015-04-14T14:51:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 432629.pdf: 1205132 bytes, checksum: 285a03123ae11a282e2fd8cb75c42095 (MD5) Previous issue date: 2011-03-29 / A regi?o Neotropical abriga aproximadamente 30% da diversidade de esp?cies das fam?lias Felidae (subordem Feliformia) e Canidae (subordem Caniformia) (Eisenberg & Redford 1999), as quais migraram para a Am?rica do Sul ap?s a forma??o do istmo do Panam?, h? cerca de 3 milh?es de anos. Devido ao recente processo de especia??o que caracteriza estes grupos, alguns aspectos de sua estrutura filogen?tica permanecem controversos, especialmente no que tange ?s rela??es evolutivas entre esp?cies pertencentes a duas linhagens, o g?nero Leopardus (Feliformia, Felidae) e o g?nero Lycalopex (Caniformia, Canidae). O objetivo do presente estudo ? caracterizar de forma comparativa a hist?ria evolutiva dos g?neros Leopardus e Lycalopex, empregando seq??ncias de m?ltiplos segmentos nucleares e m?ltiplos indiv?duos por esp?cie, avaliando a efic?cia deste tipo abordagem para a resolu??o de processos recentes de diversifica??o atrav?s do programa *BEAST. Para cada um dos genes analisados, observamos a ocorr?ncia de varia??o interespec?fica e intra-espec?fica em ambas as linhagens. Discrep?ncias geneal?gicas consider?veis foram constatadas entre os segmentos, evidenciando a complexidade da tarefa de reconstruir a filogenia destes grupos com marcadores nucleares. As genealogias estimadas demonstraram que em muitos casos as esp?cies n?o se apresentam monofil?ticas, o que ocorre em paralelo com o compartilhamento de hapl?tipos entre esp?cies. N?o obstante, para Leopardus, obtivemos uma species tree com alta resolu??o. Para Lycalopex, entretanto, a maior parte dos n?s internos permaneceu com baixo suporte, indicando que um n?mero maior de genes ser? provavelmente necess?rio para que se busque uma resolu??o consistente da filogenia deste grupo empregando estrat?gias multi-locus. De forma geral, nossos resultados demonstraram de forma emp?rica a ocorr?ncia de discord?ncia geneal?gica em ambas as linhagens, e ilustraram o potencial de an?lises multi-locus na resolu??o de filogenias que envolvam processos recentes de diversifica??o.

Made available in DSpace on 2015-04-14T14:51:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 434989.pdf: 1142086 bytes, checksum: a3159771198bb7762a52adf37be5227f (MD5) Previous issue date: 2011-08-29 / I offer this thesis, which is fulfill the purposes of the cooperation agreement between the Programa de P?s-Gradua??o em Biologia Celular e Molecular, PUCRS and Instituto Geral de Per?cias, State Security from Rio Grande do Sul, with the intention to establish a routine for molecular identification of human DNA from degraded to be functional and scientific basis. Even with the advances of commercial amplification kits and equipment for DNA extraction and genotyping, forensic samples remain challenging. With the occurrence of massive disasters or the increase in trace samples that will be part of the CODIS database, it is very important that forensic laboratories have the available markers to amplify fragments of small size and the use of miniSTRs may be an important tool for this purpose. The use of miniSTRs for the identification of degraded DNA samples and obtaining the allele frequency of six miniSTRs took place in samples from the population of Rio Grande do Sul for its use in forensics. The validation study was conducted as directed by the Scientific Working Group on DNA Analysis Methods (SWGDAM). The validation is to examine the robustness of miniPlex NC01 and NC02 in forensic cases. This study evaluated factors that potentially affect the results of genotyping obtained by amplification of STRs. The study of forensic samples of degraded DNA was performed with 22 samples of human remains (21 teeth and one bone). Due to the difficult amplification of such samples in forensic laboratories often is necessary to use the technique of sequencing of the mtDNA that is time consuming, costly and only indicates the maternal bond. Thus, the use of miniSTRs NC01 and NC02 in challenging samples proved to be a useful tool in generating human identification profile in all samples. The use of miniSTRs NC01 and NC02, in conjunction with other commercial kits with markers of small size will be of great assistance to the Forensic Scientists. With the study population as possible is the immediate use of these markers for forensic and criminal cases in the identification of family linkages, increasing the odds obtained by the statistical calculations. / Apresento esta tese, a qual vem atender aos prop?sitos do conv?nio de coopera??o entre o Programa de P?s-Gradua??o em Biologia Celular e Molecular da PUCRS e o Instituto Geral de Per?cias da Secretaria de Seguran?a do Estado do Rio Grande do Sul, na inten??o de estabelecer uma rotina de identifica??o molecular humana a partir de DNA degradado que seja funcional e que tenha embasamento cient?fico. Mesmo com os avan?os dos kits comerciais de amplifica??o de DNA e dos equipamentos para extra??o e genotipagem, as amostras forenses continuam sendo desafiadoras. Com a ocorr?ncia de desatres massivos ou com o aumento de amostras de vest?gios, que ir?o fazer parte do banco de dados CODIS, ? de extrema import?ncia que os Laborat?rios Forenses tenham a disposi??o marcadores que logrem amplificar fragmentos de tamanho reduzidos. O uso de miniSTRs ? uma ferramenta importante para esse fim. Tanto o uso de miniSTR para a identifica??o de amostras de DNA degradado quanto a obten??o da frequ?ncia al?lica de seis miniSTR foram realizados nas amostras de indiv?duos provenienstes da popula??o do Rio Grande do Sul. O estudo de valida??o foi realizado conforme orienta??o do Scientific Working Group on DNA Analysis Methods (SWGDAM), cujo objetivo foi examinar a robustez dos MiniPlex de miniSTR NC01 e NC02 em casos forenses. Neste estudo de valida??o foram testados fatores que potencialmente afetam negativamente as tentativas de genotipagens atrav?s da amplifica??o de STRs. O estudo do DNA degradado de amostras forenses foi realizado com 22 amostras de restos humanos (21 dentes e 1 osso). Devido ? difilculdade de amplifica??o deste tipo de amostras nos laborat?rios forense muitas vezes se faz necess?rio o uso da t?cnica do seq??nciamento do mtDNA que ? demorada, de elevado custo e que indica somente o v?nculo materno. Neste caso, o uso dos miniSTRs NC01 e NC02 para amostras dif?ceis se mostrou uma ferramenta plenamente eficiente, uma vez que permitiu a oben??o do perfil gen?tico em todas as amostras analisadas. Diante dos resultados do presente trabalho, ? poss?vel sugerir que o uso dos miniSTRs NC01 e NC02, em conjunto com outros kits comerciais de marcadores de tamanho reduzido, ser? de grande aux?lio para os Cientistas Forenses. Com o estudo populacional aqui realizado passa a ser poss?vel o emprego imediato destes marcadores nos casos forenses criminais e na identifica??o de v?nculos familiares, dado que aumentam os ?ndices obtidos atrav?s dos c?lculos estat?sticos.

Made available in DSpace on 2015-04-14T14:51:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 435930.pdf: 928390 bytes, checksum: 7d9c63e8c3ebdc0a8df50f72dcdee9ab (MD5) Previous issue date: 2011-08-26 / Nanocomposites derived from carbon atoms have been the focus of interest in various industrial fields such as electronic engineering, pharmaceuticals, medical devices, cosmetics, food packaging and other, since its discovery in 1985. Fullerene C60 is a nanocomposite with 60 carbon atoms, which has been the subject of numerous studies for its ability to store atoms in the interior and accept various structural modifications. The importance of understanding all the possible effects of exposure to fullerenes is very great, since its production and its use is growing every day increasing environmental exposure to this compound. The cholinergic system has as its main neurotransmitter acetylcholine (ACh). The acetylcholinesterase (AChE, EC3.1.1.7) is an important regulatory enzyme that controls the transmission of nerve impulses across cholinergic synapses by hydrolysis of the ACh. AChE levels are controlled by the interaction of ACh with its receptors, and when the interaction is enhanced, the levels of AChE are increased. Therefore, AChE can be used as a marker of cholinergic function. In this study our goal was to determine whether intraperitoneal injections of fullerene C60 at the doses of 7.5, 15 and 30 mg/kg and the time of 6h, 12h and 24h of exposure would cause a change in the modulation of the cholinergic system. We observed that the dose of 30 mg/kg in the exposure time of 24 hours showed a 84% increase in enzyme activity compared with the vehicle control group. These results suggest a possible neurotoxic effect. Further studies should be conducted to extend these findings. / Nanocompostos derivados de ?tomos de carbono t?m sido foco de interesse para aplica??es em v?rios campos industriais, tais como engenharia eletr?nica, produtos farmac?uticos, dispositivos m?dicos, cosm?ticos, embalagens de alimentos, entre outros, desde seu descobrimento em 1985. O fulereno C60 ? um nanocomposto com 60 ?tomos de carbono que tem sido alvo de in?meros estudos por suas propriedades como a capacidade de armazenar ?tomos em seu interior e aceitar diversas modifica??es estruturais. A import?ncia de entendermos todos os poss?veis efeitos de uma exposi??o aos fulerenos ? muito grande, j? que a sua produ??o e sua utiliza??o est?o crescendo a cada dia aumentando a exposi??o do meio ambiente a este composto. O sistema colin?rgico tem como principal neurotransmissor a acetilcolina (ACh). A acetilcolinesterase (AChE, E.C.3.1.1.7) ? uma importante enzima regulat?ria que controla a transmiss?o de impulsos nervosos atrav?s da sinapse colin?rgica pela hidr?lise da ACh. Os n?veis de AChE s?o controlados pela intera??o da ACh com seus receptores, sendo que quando a intera??o ? acentuada, aumentam os n?veis de AChE Portanto, a AChE pode ser usada como um marcador da fun??o colin?rgica. Neste estudo nosso objetivo foi verificar se inje??es intraperitoneais de fulereno C60 nas doses de 7,5; 15 e 30 mg/kg e nos tempos de 6h, 12h e 24h de exposi??o causaria alguma altera??o na modula??o do sistema colin?rgico. Observamos que a dose de 30 mg/kg, no tempo de exposi??o de 24h, apresentou um aumento de 84% na atividade enzim?tica quando comparado com o grupo controle-ve?culo. Estes resultados sugerem um poss?vel efeito neurot?xico, embora estudos adicionais devam ser realizados para estender estes achados.

Made available in DSpace on 2015-04-14T14:51:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 437677.pdf: 769775 bytes, checksum: c4cb9d9a52d21b8a9826564fdceb6ea8 (MD5) Previous issue date: 2012-01-13 / Biopharmaceutical drugs are mainly recombinant proteins produced by biotechnological tools. Currently on the market L-asparaginase preparations, derived either from Escherichia coli or Erwinia chrysanthemi, have been used as a therapeutic agent on the effective treatment of acute lymphoblastic leukemia (ALL) for more than 40 years. The interest in Erwinia carotovora L-asparaginase type II stems from its significantly lower glutaminase- and similar asparaginase-activity compared to current therapeutic preparations, this is particularly important since the glutaminase-activity has been implicated in causing serious side effects. The aim of this work is to apply a combination of technologies to develop a productive and simplified process for production of homogeneous and active recombinant L-asparaginase II from Erwinia carotovora (rErAII) in E. coli as host cells. The shake flasks and bioreactor conditions for productive rErAII expression are described, as well as a one-step ion-exchange liquid chromatography purification protocol followed by enzyme kinetics and thermodynamics through isothermal titration calorimetry (ITC). By using a robust fed-batch technique with pre-determined exponential feeding rates the bioreactor culture system yielded 30.7 gram of dry cell weight and 0.9 gram of recombinant rErAII protein in soluble form per liter of culture broth. This was achieved in cultures maintained at 30 ?C, in Terrific Broth medium under isopropil ?-D-tiogalactopiranosideo (IPTG) induction and using E. coli C43 (DE3) as a host cell. The established one-step purification protocol yielded more than 5 mg of homogeneous rErAII per gram of dry cell weight, corresponding to 168 mg of rErAII protein per culture liter. The work shows that it is possible to produce an active homogeneous rErAII enzyme in the soluble cell fraction through IPTG-induced E. coli fed-batch cultivation. The rErAII proved to be a promising alternative therapy in the treatment of ALL, due to its lower glutaminase activity. When compared to well-established spectrophotometric assays, the straightforward calorimetric techniques for enzyme kinetics determination are accurate and precise either for purified enzymes or crude extracts. These data will contribute to biopharmaceutical companies interested in developing biosimilars, to healthcare policies, and quality control improvement. / Biof?rmacos s?o, na sua maioria, prote?nas recombinantes produzidas por ferramentas biotecnol?gicas. Prepara??es de L-asparaginase que atualmente est?o no mercado, derivadas de Escherichia coli ou Eravinia chrysanthemi, t?m sido utilizadas como agentes terap?uticos no tratamento efetivo de leucemia linfobl?stica aguda (ALI-) por mais de 40 anos. O interesse em L-asparaginase tipo 11 de Ertivinicr carotovora decorre da sua atividade de glutaminase reduzida e sua atividade de asparaginase similar quando comparada a prepara??es terap?uticas atualmente em uso. Isso ? particularmente importante uma vez que a atividade de glutaminase foi relacionada a s?rios efeitos colaterais. O objetivo desse trabalho ? aplicar uma combina??o de tecnologias para desenvolver um processo simplificado e produtivo para a produ??o de L-asparaginase II recombinante homog?nea e ativa de Envinia carolovora (rErAll) em c?lulas hospedeiras de E. coli. Neste trabalho s?o descritas as condi??es para a express?o produtiva de rErAll em agitador orbital e em biorreator, assim como um protocolo de purifica??o em uma ?nica etapa, por cromatografia l?quida de troca f?nica, seguida pela determina??o dos par?metros cin?ticos e termodin?micos da enzima atrav?s de calorimetria de titula??o isot?rmica (ITC). Usando uma t?cnica robusta de batelada alimentada, com vaz?o em perfil exponencial pr?-determinado, o sistema de cultivo em biorreator rendeu 30,7 gramas de c?lulas secas e 0,9 gramas de prote?na rErAll na fra??o sol?vel por litro de meio de cultivo. Os resultados foram atingidos em cultivos mantidos a 30?C, em meio de cultura Terrific Broth sob indu??o de isopropil 0-D-tiogalactopiranosideo (IPTG) e utilizando E. coli C43 (DE3) como c?lula hospedeira. O protocolo de purifica??o de uma ?nica etapa rendeu aproximadamente 5 mg de rErAll homog?nea por grama de c?lula seca, correspondendo a 168 mg de prote?na rErAll por litro de meio de cultura. O trabalho demonstra que ? poss?vel produzir na fra??o celular sol?vel a enzima rErAII ativa e homog?nea, por meio de cultivos de E. coli em batelada alimentada sob a indu??o de IPTG. A rErAll mostrou ser uma terapia alternativa promissora para o tratamento de ALL devido a sua atividade de glutaminase reduzida. Quando comparada a ensaios espectrofotorn?tricos bem estabelecidos, as t?cnicas calorim?tricas diretas para determina??o de cin?tica enzim?tica s?o exatas e precisas, tanto para enzimas purificadas quanto para extratos brutos. Esses dados poder?o contribuir para ind?strias farmac?uticas interessadas em desenvolver biosimilares. para pol?ticas de sa?de e para o melhoramento do controle de qualidade de enzimas terap?uticas.

Made available in DSpace on 2015-04-14T14:51:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 437675.pdf: 3014292 bytes, checksum: 10c5c967edfd4e61677f7867c8186a73 (MD5) Previous issue date: 2011-12-09 / Tuberculosis (TB) is an infectious disease mainly caused by Mycobacterium tuberculosis, which currently infects one-third of the world s population. Despite the availability of the Bacille Calmette-Gu?rin vaccine and effective short-course chemotherapy, the increasing global burden of TB has been linked to the co-infection with HIV, the emergence of multi, extensively and now totally drug-resistant strains. Furthermore, the capacity of M. tuberculosis to remain viable within infected hosts in a long-term asymptomatic infection is an additional problem for the control of TB. Nucleotides biosynthesis pathways provide promising molecular targets for the development of new vaccines and therapeutic strategies to control the global incidence of TB. Uracil phosphoribosyltransferase (UPRT) catalyzes the conversion of uracil and 5'-phosphoribosyl-a- 1'-pyrophosphate (PRPP) to uridine 5'-monophosphate (UMP) and pyrophosphate (PPi). UPRT plays an important role in the pyrimidine salvage pathway since its product (UMP) is a common precursor of all pyrimidine nucleotides. This work presents cloning, recombinant expression in Escherichia coli, and purification of the upp-encoded M. tuberculosis UPRT (MtUPRT). Mass spectrometry analysis and N-terminal amino acid sequencing confirmed the identity of homogeneous MtUPRT. The molecular mass of the native MtUPRT was shown to follow a monomer-tetramer association model by analytical ultracentrifugation. This enzyme did not show a pronounced regulation by GTP as this nucleotide did not affect enzyme kinetic parameters, and its binding was not detected by isothermal titration calorimetry (ITC). Initial velocity and ITC studies suggested that catalysis proceeds through a sequential ordered mechanism, in which PRPP binds first, followed by uracil binding, and PPi is the first product to be released, followed by UMP. ITC also showed that PRPP and UMP binding are thermodynamically favorable processes. The pH-rate profiles indicated that groups with pK values of 5.7 and 8.1 are important for catalytic activity and a group with a pK value of 9.45 is involved in PRPP binding. Pre-steady-state kinetic data suggested that product release is not the rate-limiting step of the reaction catalyzed by MtUPRT. Kinetic fluorescence studies demonstrated two forms of enzyme in solution of which only one can bind to PRPP. Knockout of the upp gene showed that this gene is not essential for M. tuberculosis H37Rv in the employed experimental conditions and the absence of upp gene did not affect the mycobacterium growth. UPRT is expressed in both high and low oxygen conditions of M. tuberculosis H37Ra growth. MtUPRT is inhibited by an active metabolite of isoxyl, which does not seem to inhibit RNA polymerase, adenine phosphoribosyltransferase and hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase. Minimum inhibitory concentration of isoxyl for M. tuberculosis mutant for upp gene, complemented and wild type strains was 12.8 μg/mL, meaning that the absence of the upp gene did not affect M. tuberculosis sensitivity to isoxyl. Altogether, these data may be useful for a better understanding about the nucleotide biosynthesis pathway in M. tuberculosis and as a framework on which to base efforts towards the development of efficient prophylactic and therapeutic strategies to decrease the global incidence of this pathogen. / A tuberculose (TB) ? uma doen?a infecciosa causada principalmente pelo Mycobacterium tuberculosis, o qual atualmente infecta um ter?o da popula??o mundial. Apesar da disponibilidade da vacina Bacille Calmette-Gu?rin e da eficaz quimioterapia de curta dura??o, o aumento na incid?ncia global da TB est? relacionado ? co-infec??o com o HIV e ao surgimento de cepas multi, extensivamente e agora totalmente resistente a drogas. Al?m disto, a capacidade do M. tuberculosis de permanecer vi?vel dentro do hospedeiro infectado por longo per?odo em uma infec??o assintom?tica ? um problema adicional para o controle da TB. As rotas de bioss?ntese de nucleot?deos fornecem alvos moleculares promissores para o desenvolvimento de novas vacinas e estrat?gias terap?uticas para controlar a incid?ncia global de TB no mundo. A uracil fosforribosil transferase (UPRT) catalisa a convers?o de uracil e 5 - fosforribosil-a-1 -pirofosfato (PRPP) a uridina 5 -monofosfato (UMP) e pirofosfato (PPi). A UPRT tem um papel importante na rota de salvamento das pirimidinas j? que seu produto (UMP) ? o precursor comum de todos os nucleot?deos pirim?dicos. Este trabalho apresenta a clonagem, express?o recombinante em E. coli, e a purifica??o da UPRT de M. tuberculosis codificada pelo gene upp (MtUPRT). Adicionalmente, foram realizadas an?lises de espectrometria de massas e sequenciamento N-terminal que confirmaram a identidade da MtUPRT homog?nea. A massa molecular da MtUPRT nativa seguiu um modelo de associa??o mon?mero-tetr?mero por ultracentrifuga??o anal?tica. Esta enzima n?o mostrou uma regula??o pronunciada por GTP j? que este nucleot?deo n?o afetou os par?metros cin?ticos da enzima, e a sua liga??o n?o foi detectada por calorimetria de titula??o isot?rmica (ITC). A velocidade inicial e os estudos de ITC sugeriram que a cat?lise procede atrav?s de um mecanismo ordenado sequencial, no qual o PRPP liga primeiramente, seguido pela liga??o de uracil, e PPi ? o primeiro produto a ser liberado, seguido pelo UMP. ITC tamb?m mostrou que a liga??o de PRPP e UMP s?o processos termodinamicamente favor?veis. O perfil de pH indicou que grupamentos com os valores de pK pr?ximos de 5,7 e 8,1 s?o importantes para a atividade catal?tica e um grupamento com valor de pK pr?ximo a 9,45 est? envolvido na liga??o do PRPP. Dados de cin?tica no estado pr?-estacion?rio sugeriram que a libera??o de produto n?o ? a etapa limitante da rea??o catalisada pela MtUPRT. Estudos de fluoresc?ncia demonstraram a exist?ncia de duas formas da enzima em solu??o, das quais apenas uma pode ligar ao PRPP. O nocaute do gene upp demonstrou que este gene n?o ? essencial para o M. tuberculosis H37Rv nas condi??es empregadas no experimento e a aus?ncia do gene upp n?o afetou o crescimento micobacteriano. A UPRT mostrou ser expressa tanto em altas como em baixas concentra??es de oxig?nio. A MtUPRT foi inibida por um metab?lito ativo do isoxyl, que n?o parece inibir as enzimas RNA polimerase, adenina fosforribosil transferase e hipoxantinaguanina fosforribosil transferase. A concentra??o inibit?ria m?nima de isoxyl para as cepas de M. tuberculosis mutante para o gene upp, complementada e tipo selvagem foi de 12,8 μg/mL, o que significa que a aus?ncia do gene upp n?o afetou a sensibilidade do M. tuberculosis ao isoxyl. Assim, estes dados podem ser ?teis para um melhor entendimento sobre a via de bioss?ntese de nucleot?deos em M. tuberculosis e podem servir como base para o desenvolvimento de estrat?gias terap?uticas e preventivas eficientes para diminuir a incid?ncia global deste pat?geno.

Made available in DSpace on 2015-04-14T14:51:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 437812.pdf: 154195 bytes, checksum: 6d937534253a5ebf131f023920cdd572 (MD5) Previous issue date: 2011-11-11 / Background: Age related reductions in contextual memory can impair daily functioning of older adults and have an important impact on their quality of life. Thus, the understanding of the neurobiological correlates of this memory decline is important to the establishment of effective cognitive interventions in healthy older adults. Objective: The current study was aimed to investigate the effects of aging and prefrontal cortex (PFC) function on contextual memory performance under different encoding conditions in a naturalistic experimental paradigm. Methods: Young (n=34, aged 20 - 35 years) and older adult men (n=31; aged 54 - 87 years) matched for education completed a recognition memory task for context (location of objects depicted in different rooms of a house) with or without an incidental binding cue at encoding. In addition, Wisconsin Card Sorting Test (WCST) was carried out to assess PFC function. Results: Results for contextual memory performance showed significant main effects of aging and encoding condition. Older adults performed significantly poorer than young controls in the encoding condition without incidental binding cue. The introduction of the incidental binding cue at encoding significantly improved the context recognition scores in young and older adults. A significant association between WCST scores and the performance for contextual memory were found only in the task without binding cue and just for the older adult men. Conclusion: The main findings indicate that the age related deficits on contextual memory are associated to age related impairments of PFC function, as indicated by the WCST. However, contextual memory of older adults improved with cognitive support at encoding and became independent of the scores on WCST, suggesting that incidental associative binding instructions at encoding can mitigate PFC deficits. / Introdu??o: Redu??es na mem?ria contextual relacionadas ? idade podem prejudicar o funcionamento di?rio dos idosos e t?m um impacto importante na sua qualidade de vida. Assim, a compreens?o dos correlatos neurobiol?gicos deste decl?nio da mem?ria ? importante para o estabelecimento de interven??es cognitivas eficazes em idosos saud?veis. Objetivo: O presente estudo teve como objetivo investigar os efeitos do envelhecimento e da fun??o do c?rtex pr?-frontal (CPF) sobre o desempenho da mem?ria contextual em condi??es diferentes de codifica??o em um paradigma experimental naturalista. M?todos: Jovens (n = 34; 26,02 ? 0,64) e idosos (n = 31; 69,09 ? 1,26) do sexo masculino pareados por n?vel educacional. Os volunt?rios foram submetidos a uma tarefa de mem?ria de reconhecimento de contexto (localiza??o de objetos representados em diferentes salas de uma casa) com ou sem uma estrat?gia de codifica??o associativa. Al?m disso, o Teste Wisconsin de Classifica??o de Cartas (WCST) foi realizado para avaliar a integridade funcional do CPF. Resultados: Os resultados para o desempenho da mem?ria contextual mostrou efeitos significativos do envelhecimento e da estrat?gia de codifica??o. Os idosos tiveram um desempenho significativamente pior do que controles jovens na condi??o de codifica??o sem estrat?gia de codifica??o. A introdu??o da estrat?gia de codifica??o melhorou significativamente as pontua??es do reconhecimento do contexto nos jovens e idosos. A associa??o significativa entre as pontua??es WCST e o desempenho da mem?ria contextual foram encontrados apenas nos idosos sem estrat?gia de codifica??o. Conclus?o: As principais conclus?es indicam que os d?ficits na mem?ria contextual e dist?rbios da fun??o do CPF est?o relacionados com a idade, como indicado pelo WCST. No entanto, a mem?ria contextual dos idosos melhorou, com o a introdu??o da estrat?gia de codifica??o associativa e tornou-se independente da pontua??o no WCST, sugerindo a estrat?gia de codifica??o associativa pode atenuar os d?ficits do CPF.

Made available in DSpace on 2015-04-14T14:51:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 437833.pdf: 963349 bytes, checksum: 9fc7ce9b6fb62b2118fc694c4bf21677 (MD5) Previous issue date: 2012-03-02 / Hyperargininemia is a rare disease caused by an innate error of the metabolism (EIM) biochemically characterized by the accumulation of arginine in body tissues due to arginase deficits. Mental retardation and other neurological symptoms are common in hyperargininemic patients. Several mechanisms have been proposed to describe the neurotoxicity of hiperargininemia, such as changes in antioxidant enzyme systems and neurotransmission. The purinergic system is an important pathway for which uses extracellular nucleotides and nucleosides as signaling molecules. The extracellular ATP degradation and the consequent adenosine production are performed by a cellular surface enzyme family known as ectonucleotidases, which include the NTPDases (nucleoside triphosphate diphosphoohydrolases) and the ecto-5?-nucleotidase. Adenosine is a neuromodulator that acts through the activation of P1 metabotropic receptors (A1, A2A, A2B, A3) and plays a role as an endogenous neuroprotector. Thus, the NTPDase and ecto-51-nucleotidase control the levels of nucleotides and nucleosides, modulating the purinergic system. Whereas the zebrafish is an important tool for the study of developmental biology and the hiperargininemia is a disease that occurs in the early stages of development, the objective of this study was to evaluate the effects of arginine exposure in zebrafish larvae on different biochemical, behavioral, and molecular parameters. The results showed that exposure to arginine at a concentration of 0.1 mM in larvae of the zebrafish from to 7 days post-fertilization (dpf) was capable of changing ectonucleotidase activities, promoting an increase of ATP, ADP, and AMP hydrolysis and as causing morphological changes, such as larvae body size reduction, but did not alter the locomotor activity of animals. Acute arginine exposure (1h) in adult zebrafish was not able to alter the activity of ectonucleotidases. These data demonstrate that arginine can affect the ectonucleotidase activities and morphological parameters in zebrafish larvae, suggesting that the purinergic system is a target for neurotoxic effects induced by arginine in the early stages of developmental. / Hiperargininemia ? uma doen?a rara causada por um erro inato do metabolismo (EIM) bioquimicamente caracterizado pelo ac?mulo de arginina nos tecidos devido ? defici?ncia de arginase. Retardo mental e outras doen?as neurol?gicas s?o sintomas comuns em pacientes hiperarginin?micos. Diversos mecanismos foram propostos para descrever a neurotoxicidade da hiperargininemia, tais como, altera??es nos sistemas enzim?ticos antioxidantes e de neurotransmiss?o. O sistema purin?rgico ? uma importante rota de sinaliza??o celular que utiliza nucleot?deos e nucleos?deos extracelulares como mol?culas sinalizadoras. A degrada??o do ATP extracelular ? realizada por uma fam?lia de enzimas localizadas na superf?cie celular conhecidas como ectonucleotidases, que inclui as NTPDases (nucleos?deo trifosfato difosfoidrolases) e a ecto-5?-nucleotidase. A adenosina ? um neuromodulador que atua atrav?s da ativa??o de receptores metabotr?picos do tipo P1 (A1, A2A, A2B, A3) e pode agir como um neuroprotetor end?geno. As NTPDases hidrolisam nucleot?deos tri- e difosfatados originando a adenosina. Assim, as NTPDases e ecto-5 -nucleotidase controlam os n?veis de nucleot?deos e nucleos?deos, modulando o sistema purin?rgico. Considerando que o peixe-zebra ? uma importante ferramenta para o estudo da Biologia do Desenvolvimento e que a hiperargininemia ? uma doen?a que ocorre nas fases iniciais do desenvolvimento, o objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos do tratamento com arginina em larvas de peixezebra em diferentes par?metros bioqu?micos, comportamentais e moleculares. Foram avaliados os efeitos da exposi??o in vivo de larvas e adultos de peixe-zebra na atividade das ectonucleotidases e na locomo??o. Os resultados obtidos demonstraram que a exposi??o ? arginina na concentra??o de 0.1 mM em larvas de peixe-zebra do 3? ao 7? dia p?s-fertiliza??o (dpf) foi capaz de alterar a atividade das ectonucleotidases, promovendo um aumento na hidr?lise de ATP, ADP e AMP, assim como causar altera??es moleculares e morfol?gicas, como diminui??o do tamanho corporal, por?m n?o alterou a atividade locomotora dos animais. A exposi??o aguda (1h) a arginina em peixes zebra adultos n?o foi capaz de alterar a atividade das ectonucleotidases. Esses dados demonstram que a arginina pode afetar a atividade das ectonucleotidases e par?metros morfol?gicos em larvas de peixe-zebra, sugerindo que o sistema purin?rgico ? um alvo para os efeitos neurot?xicos induzidos pela arginina, nas fases iniciais do desenvolvimento.