Submitted by isabela.moljf@hotmail.com (isabela.moljf@hotmail.com) on 2017-06-19T16:07:50Z No. of bitstreams: 1 saramalagutiandradesoares.pdf: 1936313 bytes, checksum: bac06dfaa717be34b6dd2753dd6bf232 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2017-06-29T12:30:09Z (GMT) No. of bitstreams: 1 saramalagutiandradesoares.pdf: 1936313 bytes, checksum: bac06dfaa717be34b6dd2753dd6bf232 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-29T12:30:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 saramalagutiandradesoares.pdf: 1936313 bytes, checksum: bac06dfaa717be34b6dd2753dd6bf232 (MD5) Previous issue date: 2016-03-01 / FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / A obesidade é motivo de preocupação para a saúde pública em todo o mundo. Apesar de existirem muitos estudos sobre seu impacto no sistema imunológico, a influência nas doenças infecciosas é pouco relatado. A incidência da obesidade vem aumentando em países em desenvolvimento, assim é de grande importãncia o estudo do papel da obesidade na resposta imunológica a patógenos, principalmente em doenças infecciosas de grande relevãncia como a malaria. A obesidade é caracterizada por uma inflamação sistêmica de baixo grau crõnica, e acredita-se que as manifestações complicadas da malária, como a malaria cerebral, injuria respiratória, denominada malária grave, podem ser resultado da resposta inflamatória exagerada causada pelo sequestro de hemácias infectadas nos vasos endoteliais de orgãos vitais como cérebro e pulmão. Portanto a inflamação na obesidade pode alterar o curso da infecção do Plasmodium berguei ANKA, parasitas causadores da malária cerebral em modelo murino. Neste trabalho, investigamos a influência da obesidade na resposta imune frente à infecção por Plasmodium berguei ANKA. Para isso foram utilizados camundongos C57BL/6 machos, com idade de 4 a 6 semanas, alimentados durante 12 semanas por uma dieta hiperlipídica com 60% das quilocalorias advindas de lipídeos. Após esse período os animais foram infectados com a cepa ANKA de Plasmodium berguei. Nos animais alimentados com a dieta hiperlipídica, observou-se aumento do peso corporal, assim como da gordura perigonadal dos animais alimentados pela dieta hiperlipídica, sem aumento do consumo de ração. A resistência ao desenvolvimento da malária grave foi observada nos animais obesos; além de conseguir controlar a parasitemia, . Somente esses animais sobreviveram à infecção, por 25 dias após o desafio, sem apresentar sintomas clínicos da doença, ao contrário, os não obesos infectados, vieram a óbito após oito dias de infecção. Foram observadas diferenças no perfil celular dos animais obesos infectados quando comparados aos controles infectados, sugerindo que a inflamação prévia dos animais obesos pode ter influenciado o curso da infecção. Assim, os resultados indicam que alterações na resposta imunológica do camundongo obeso conseguem protege-lo contra o desenvolvimento da malaria grave. / Obesity is a public heaith concern currentiy affecting worldwide, aithough there are many studies on the impact of obesity on the immune system, the various aspects of the association between obesity and infection is seidom reported. The incidence of obesity is increasing in the developing countries, and it is very important to study the role of obesity in the immune response to pathogens, especially infectious diseases such as maiaria. Obesity is characterized by a iow-grade, systemic, chronic infiammation and it is believed that the complicated manifestations of maiaria, as severe maiaria, can be the result of an exaggerated inflammatory response caused by sequestration of infected erythrocytes to endothelial vesseis of vital organs such as brain and lung. So infiammation in obesity may alter the course of infection of Plasmodium berguei ANKA, parasites that cause cerebral maiaria in mice. In this work, we investigated the influence of obesity on the immune response to infection by Plasmodium berguei ANKA. For this, mate C57BL/6 mice aged 4 to 6 weeks were used, fed by a high fat diet with 60% of kilocalories from lipid, for 12 weeks. After this period the animais were infected with the strain ANKA of Plasmodium berguei. There was an increase in body weight as well as the perigonadal fat in animais fed with the high fat diet, without increasing the food intake, from the second week of dieting. The resistance to the deveiopment of severe maiaria was observed in the obese animais, beside of control the parasitemia, oniy those animais survived the infection for 25 days post challenge, without any clinicai symptoms of the disease, unlike infected non obese, who died after eight days of infection. Differences were observed in the cell profile of infected obese animais compared to infected controls, suggesting that prior infiammation in obese animais may have infiuenced the course of infection. Thus, the resuits indicate that changes in the immune response of obese mice can protect against the deveiopment of severe maiaria.

Submitted by Geandra Rodrigues (geandrar@gmail.com) on 2018-03-27T10:38:01Z No. of bitstreams: 0 / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2018-03-27T14:00:10Z (GMT) No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2018-03-27T14:00:10Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2018-03-01 / A microbiota vaginal é um ecossistema formado por bactérias aeróbias e anaeróbias, que vivem em equilíbrio dinâmico. Fatores como imunidade e variações hormonais podem provocar a perda do equilíbrio, ocasionando a proliferação de patógenos oportunistas. A vaginose bacteriana (VB) é uma doença de etiologia polimicrobiana, podendo ocorrer em associação com outros microrganismos, tais como o Papilomavirus humano (HPV). O HPV é mais prevalente na população feminina sexualmente ativa, sendo fator de risco para o desenvolvimento do câncer cervical. O objetivo do trabalho foi avaliar a diversidade microbiana do ecossistema vaginal de mulheres com e sem atipias celulares cervicais e relacionar com HPV. Fluido vaginal e raspado da cérvice uterina foram coletados (n= 33 sem lesão e n=41 com lesão) e DNA viral e bacteriano foi extraído. Lâminas foram coradas pelo método de Gram, a fim de estabelecer o escore de Nugent para avaliação da VB. Reação de PCR para genotipagem do HPV foi realizado. PCR-DGGE foi realizado para avaliação da estrutura da comunidade bacteriana. A média de idade das mulheres foi de 36 anos; compreendendo 87% (sem lesão) e 92% (com lesão). A análise do escore de Nugent revelou que 51% das mulheres com lesão não apresentavam VB e 29% eram portadoras de VB. O exame de Papanicolaou mostrou que 31% das mulheres apresentavam lesão com células escamosas atípicas de significado indeterminado (ASC-US), seguida de lesão epitelial escamosa de baixo grau (LSIL) e lesão epitelial escamosa de alto grau (HSIL), ambas com 26%, e 14% das mulheres apresentaram lesão com células escamosas atípicas que não permitem excluir lesão de alto grau (ASC-H). HPV foi detectado em 91% das pacientes, sendo identificados 5 tipos do grupo de alto risco oncogênico (16, 18, 31, 52 e 58). O HPV 16 foi o mais frequente (85%), seguido do HPV 18 (68%). No grupo sem lesão a prevalência da concomitância de HPV 16 e 18 foi de 58% e no grupo com lesão foi de 60%. Na faixa etária de 18 a 30 anos, 43% das mulheres apresentaram HPV 16, e 35% apresentaram coinfecção por HPV 16 e 18. A associação entre a genotipagem e o exame de Papanicolaou mostrou que 40% das pacientes ASC-US e 20% ASC-H apresentaram monoinfecção por HPV 16. Das mulheres com HPV 16 e coinfecção por HPV 16 e 18, VB foi encontrada em 25% das mulheres. Na análise do agrupamento obtido por PCR-DGGE observa-se, com algumas exceções, que os perfis de mulheres com as mesmas condições de saúde (normal, intermediário e com vaginose bacteriana) tenderam a se agrupar, embora em grupos separados. Na análise do agrupamento em relação às atipias, não foi observada a formação de um padrão. Dada a complexidade do ecossistema vaginal, sugere-se a necessidade de técnicas com maior poder de resolução para o entendimento da relação entre o HPV, microbiota vaginal e lesões celulares cervicais. / The vaginal microbiota is a complex ecosystem formed by aerobic and anaerobic bacteria, which live in dynamic equilibrium. Factors such as immunity and hormonal variations can cause loss of balance, leading to the proliferation of opportunistic pathogens and resulting in diseases. Bacterial vaginosis (BV) is a polymicrobial disease, and may occur in association with other microorganisms, such as Human Papillomavirus (HPV). HPV is the most prevalent in the female sexually active population, being a risk factor for the development of cervical intraepithelial lesions, which may progress to cervical cancer. The aim of this study was to evaluate the microbial diversity of the vaginal ecosystem of women with cervical cellular atypias and carrying HPV. Vaginal fluid and scraped uterine cervix were collected (n = 33 without lesion and n = 41 with lesion) and viral and bacterial DNA was extracted. Glass slides were stained by the Gram method in order to establish the Nugent score for BV evaluation. PCR reaction for HPV genotyping was performed. DGGE-PCR was performed to assess the structure of the bacterial community. The mean age of the women was 36 years; comprising 87% (without lesion) and 92% (with lesion). Analysis of the Nugent score revealed that 51% of the women with lesion did not present BV and 29% had BV. Pap smear test showed that 31% of the women had atypical squamous cells of undetermined significance (ASC-US), 26% had low grade squamous epithelial lesion (LSIL), 26% had high grade squamous epithelial lesion (HSIL) and 14% had with atypical squamous cells that do not allow the exclusion of high-grade lesion (ASC-H). HPV was detected in 91% of the patients, being identified 5 types of the high risk group (16, 18, 31, 52 and 58). HPV 16 was the most frequent (85%), followed by HPV 18 (68%). In the non-lesion group, the prevalence of HPV 16 and 18 concomitance was 58% and in the lesion group it was 60%. In the 18-30 age group, 43% of the women had HPV 16, and 35% had coinfection by HPV 16 and 18. The association between genotyping and the Pap smear showed that 40% of ASC- US patients and 20% ASC-H showed monoinfection by HPV 16. Besides, out of women with HPV 16 and coinfection by HPV 16 and 18, BV was found in 25%. In the analysis of the grouping obtained by PCR-DGGE it is observed with some exceptions, that the profiles of women with the same health conditions (healthy, intermediate and with bacterial vaginosis) tended to group, although in separate groups. Analysis of the cluster in relation to the atypia did not observe the formation of a pattern. Given the complexity of the vaginal ecosystem, it is suggested the need for higher resolution power techniques for understanding the relationship between HPV, vaginal microbiota and cervical cellular lesions.

Submitted by Geandra Rodrigues (geandrar@gmail.com) on 2018-07-12T15:38:23Z No. of bitstreams: 0 / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2018-07-16T17:43:46Z (GMT) No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2018-07-16T17:43:46Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2016-01-15 / A esquistossomose é uma doença parasitária causada por vermes do gênero Schistosoma e afeta principalmente comunidades sem acesso adequado a água potável e condições de saneamento adequadas. O praziquantel é o fármaco indicado para o tratamento desta parasitose e não há vacina disponível. As NTPDases são uma família de proteínas que catalisam a hidrólise de nucleosídeos di e tri fosfatados, sendo amplamente distribuídas nos organismos. Duas isoformas de NTPDases (SmATPDase1 e SmATPDase2) foram descritas em Schistosoma mansoni. Sugerese que a SmATPDase1 regule a concentração extracelular de nucleosídeos di e tri fosfatados, influenciando diretamente em eventos trombóticos e ativação de células do sistema imune. Dessa maneira, a inibição da ATP-difosfohidrolase por fármacos ou anticorpos torna-se uma estratégia interessante no combate a esquistossomose. Intensa resposta do tipo Th2, elevação dos níveis de IgE e das citocinas IL-4, IL-5 e IL-13 são características marcantes em infecções helmínticas e alergias. Acredita-se que esta semelhança se deve ao fato que a resposta alérgica tenha surgido inicialmente para conter parasitos, hipótese reforçada pela imunoreatividade cruzada descrita entre proteínas presentes em parasitos e alérgenos. Acreditamos que a isoforma SmATPDAse1 seja um dos principais antígenos indutores de anticorpos IgE (imunoglobulinas com função protetora) durante a esquistossomose mansônica. Neste trabalho, por análise in silico identificamos potenciais epitopos de IgE na estrutura linear da SmATPDase1. Destas sequências, três peptídeos foram sintetizados por fase sólida e utilizados em ensaios de ELISA e de imunização. Em ensaios de ELISA, observou-se a capacidade destes peptídeos ligarem anticorpos IgE e IgG4 em soros de pacientes com esquistossomose, assim como IgE e IgG1 nos soros de animais experimentalmente infectados. Por ELISA, não foi possível observar diferença significativa na produção de anticorpos IgE e IgG1 após a imunização de camundongos com os peptídeos. No entanto, os soros imunes foram capazes de identificar a isoforma 1 da NTPDase de S. mansoni em ensaios de western blots. A identidade da proteína reconhecida foi confirmada por espectrometria de massas. Os resultados dão suporte a hipótese de que estes peptídeos sintetizados correspondam a epitopos ligadores e indutores de IgE presentes na SmATPDase1. Dessa maneira, tais peptídeos podem ser explorados como ferramentas de estudos das NTPDases, por meio da produção de anticorpos contra eles, ou até mesmo no desenvolvimento de imunoterapias em doenças alérgicas, auto-imunes e na própria esquistossomose. / Schistosomiasis is a neglected disease caused by blood flukes (trematode worms) of the genus Schistosoma. This disease affects mostly communities without proper access to safe drinking water and adequate sanitation. Praziquantel is the only drug available for this infection and vaccines are currently unavailable at the market. The NTPDases are a family of proteins that catalyze the hydrolysis of nucleoside di and tri phosphates and are widely distributed in the organisms. In Schistosoma mansoni, two isoforms of NTPDases (SmATPDase1 and SmATPDase2) were described and might play important role in the parasite physiology. The SmATPase1 controls extracellular concentration of nucleoside di and tri phosphates, regulating blood clotting and immune system cells activation. In addition, this isoform might be one of the major IgE (a protective immunoglobulin) inducing antigen in the course of schistosomiasis infection. Thus, the inhibition of ATP-diphosphohydrolase by drugs or antibodies is an interesting strategy to target schistosomiasis. Intense Th2 response and high levels of IgE and cytokines IL-4, IL-5 and IL-13 are characteristic of helminth infections and allergies. It is suggested that this similarity is not only by chance, but it is due the fact that the allergic response started as a form of counter parasites - hypothesis supported by cross reactivity between proteins from parasites and allergens. In this work, we identified potential IgE epitopes in the linear structure of SmATPDase1 by in silico analysis. Three peptides were synthesized by solid phase and used in ELISA and immunization assays. The ELISA assays showed the capacity of these peptides to bind IgE and IgG4 antibodies in human serum and IgE and IgG1 in infected animals. However, no significant difference was found in the production of IgE and IgG1 after animal immunization with these molecules. Nevertheless, these immune sera were capable of identifying the SmATPDase1 in western blot assays and the identity of the enzyme was confirmed by mass spectrometry. These findings support the hypothesis that these peptides correspond to IgE epitopes. Furthermore, some results also suggest that these peptides are capable of binding natural antibodies that target self-proteins and are homologues to the investigated peptides. Thus, these peptides might be explored as tools for the study of NTPDases, through the production of antibodies against these epitopes, or as immunotherapeutics for treatment of allergies, auto-immune diseases and schistosomiasis.

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_michel_quevedo_fagundes.pdf: 823551 bytes, checksum: 36c28ca5bd55c0c0403915db568e103e (MD5) Previous issue date: 2012-02-29 / Leptospirosis is considered a global problem regarding both veterinary medicine and public health. In Brazil, the disease has greater impact in vulnerable populations, living in slums of great cities, where high morbidity and mortality occur. This situation requires the establishment of new intervention policies in order to reduce cases. Available vaccines to prevent the disease in humans and animals are notoriously underachieving, producing short term, serovar specific protection and collateral effects. New strategies are being employed to develop novel vaccines against leptospirosis, such as the characterization of recombinant proteins, construction of DNA vaccines, and use of alternative adjuvants. Surface exposed proteins LipL32, LigB, and LigA are highly conserved and found only in pathogenic serovars, therefore these were selected to be used in this study. LigA and LipL32 genes were cloned into the pVAX eukaryote expression vector to be used as DNA vaccines. rLigBNI and rLipL32 were assessed as subunit recombinant antigens using propolis as a co-adjuvant. Hamsters were immunized and the response was assessed through qPCR, ELISA, and lethal challenge. DNA vaccine containing the LipL32 gene, and the subunit rLigBNI vaccine had the highest results in the immune-stimulation assays. Furthermore, these imunogens were able to significantly protect animals against lethal challenge, demonstrating their potential for leptospirosis vaccine development. / A leptospirose é considerada um problema global para a saúde pública e veterinária. No Brasil, a enfermidade possui maior impacto em populações vulneráveis, as quais estão distribuídas nas favelas das grandes cidades, onde tradicionalmente ocorre elevada morbidade e mortalidade. Desta forma, torna-se necessário o estabelecimento de novas efetivas de intervenção para a redução dos casos. As vacinas disponíveis para a prevenção da enfermidade em humanos e animais são comprovadamente limitadas, já que induzem imunidade pouco duradoura e sorovar-específica, além de provocarem efeitos colaterais. Novas estratégias para o desenvolvimento de uma vacina contra a leptospirose têm sido empregadas, como a caracterização de proteínas recombinantes, a construção de vacinas de DNA e o teste de novos adjuvantes para modulação da resposta imune. Neste contexto, as proteínas de membrana externa LipL32, LigB e LigA foram selecionadas para este trabalho, pois são conservadas e encontradas somente entre sorovares patogênicos de Leptospira. Assim, os genes lipL32 e ligA foram clonados no vetor de expressão em eucariotos pVAX para a obtenção de vacinas de DNA, e as proteínas rLigBNI e rLipL32 foram testadas utilizando o própolis como co-adjuvante na forma de vacinas de subunidade. Após a produção das vacinas, hamsters foram vacinados e a resposta imune foi avaliada através de ELISA, qPCR e desafio. Dentre as preparações testadas, a resposta imune teve níveis mais elevados e significativos para a vacina de DNA contendo o gene lipL32 e para a vacina de subunidade de LigBNI. Além disso, estas vacinas foram capazes de proteger significativamente os animais contra o desafio homólogo, mostrando o potencial destas formulações para o desenvolvimento de uma vacina recombinante para a leptospirose.

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_silvana_beutinger_marchioro.pdf: 842737 bytes, checksum: 032d940f684cacf69ead32db6268d1cc (MD5) Previous issue date: 2013-06-27 / Mycoplasma hyopneumoniae (M. hyopneumoniae) is the causative agent of enzootic pneumonia (EP) in pigs, a chronic respiratory disease characterized by low mortality and high morbidity, responsible by significant economic losses in the pig industry worldwide. M. hyopneumoniae infection can be controlled by optimizing management practices and housing conditions, as well as with the use of antibiotics and vaccination. Commercial vaccines consist of adjuvanted inactivated whole cell preparations, and are frequently used worldwide in countries with an intensive pig production. The currently available vaccines are beneficial from an economic point of view, but they do not provide a sustainable control of the disease. They cannot prevent colonization of M. hyopneumoniae in the respiratory tract, and do not significantly reduce the transmission of the pathogen. Also, little is known about the exact mechanisms of the partial protection they induce. In this context, the general aims of this thesis were to assess the mode of the action of an existing commercial vaccine on the one hand and to develop and evaluate a new recombinant vaccine against M. hyopneumoniae on the other hand, looking for more effective strategies for disease control. For development of the recombinant vaccine a chimeric protein was developed and evaluated. This protein was based on proteins known to play a role in the adhesion and that were able to induce an immune response and a partial protection against M. hyopneumoniae infection when evaluated individually. From the studies described in this thesis, it can be concluded that intramuscular vaccination with an adjuvanted bacterin is able to stimulate both systemic and local immune responses, and that the new recombinant vaccine developed against EP might be promises strategies to control the disease. / Mycoplasma hyopneumoniae (M. hyopneumoniae) é o agente etiológico da pneumonia enzoótica (EP) suína, uma doença crônica de baixa mortalidade e alta morbidade, responsável por perdas econômicas significativas na cadeia suinícola em todo o mundo. A infecção por M. hyopneumoniae pode ser controlada pela otimização das práticas de manejo e das condições de alojamento, bem como com o uso de antibióticos e vacinação. Vacinas comerciais consistem em preparações de células inteiras inativadas do agente, fornecidas com adjuvante, e são frequentemente utilizadas em todo o mundo. As vacinas disponíveis atualmente são benéficas do ponto de vista econômico, mas elas não fornecem um controle sustentável da doença. Elas não previnem a colonização do M. hyopneumoniae no trato respiratório, e não reduzem significativamente a transmissão do agente patogênico. Além disso, pouco se sabe sobre os mecanismos exatos envolvidos na proteção que elas induzem. Desta forma, os objetivos gerais desta tese foram avaliar o modo de ação de uma vacina comercial existente e desenvolver e avaliar uma nova vacina recombinante contra M. hyopneumoniae, buscando estratégias mais eficazes para o controle da doença. Para o desenvolvimento desta vacina recombinante uma proteína quimérica foi produzida, baseada em proteínas envolvidas na adesão do agente e que foram capazes de induzir uma resposta imune e uma proteção parcial contra a infecção por M. hyopneumoniae quando avaliadas individualmente, e avaliada seu potencial protetor em teste de infecção experimental de suínos. A partir dos estudos descritos nesta tese, pode-se concluir que a vacinação intramuscular com uma bacterina comercial é capaz de estimular tanto uma resposta imune sistêmica quanto local, e que a nova vacina recombinante desenvolvida contra a EP pode ser considerada uma estratégia promissora para o controle da doença.

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_andrea_silva_rezende.pdf: 962700 bytes, checksum: df4059413746b2684f76e1ecfa28b49b (MD5) Previous issue date: 2013-08-23 / The caseous lymphadenitis (CLA) is a disease that affects mainly small ruminants and is caused by the bacteria Corynebacterium pseudotuberculosis. In Brazil the clinical prevalence CLA is 30%. The control measures are vaccination and diagnosis of infected animals. Currently, commercial vaccines are not completely effective, the same occur with the methods of diagnosis, because the medical signs are not immediately detectable. By sequencing and additional proteomic analysis, several targets were identified, including cp1002_0369 gene, which codifies a secreted protein which is probably described as a potentially antigenic phosphoesterase, that can subsequently be used in the development of recombinant vaccines and development of diagnostic tests. This protein was used as recombinant and it was tested as subunit vaccine and as a DNA vaccine and also to develop a diagnostic test based on ELISA. For this, the cp1002_0369 gene was cloned in the eukaryotic expression vector pTARGET and in a vector of expression in prokaryotes pAE. The recombinant protein CP0369 was purified and evaluated as a recombinant vaccine associated with both of the adjuvants xanthan and aluminum hydroxide and then measured in an indirect ELISA with sheep serum. The immunoprotective potential was assessed in a murine model by challenge with 104 CFU of strain Mic-6 of C. pseudotuberculosis in 9 vaccinal groups. The vaccine formulation that increased the survival rate of animals after challenge was the group containing the recombinant protein (rCP0369 + aluminum hydroxide). The ELISA for diagnostic of CL was evaluated by ROC analysis of 182 sera and showed a sensitivity and specificity of 90% and 75.6%, respectively. The format of ELISA assay (ELISA-rCP0369) can be used in the diagnosis of LC sheep herds with a good sensitivity index. However, new vaccine strategies employing the CP0369 protein will be evaluated to improve the effectiveness of the vaccine. / A linfadenite Caseosa (LC) é uma doença que acomete principalmente pequenos ruminantes sendo causada pela bactéria Corynebacterium pseudotuberculosis. No Brasil a prevalência clínica da LC é de 30%. As medidas de controle são a vacinação e o diagnóstico dos animais infectados. As vacinas disponíveis comercialmente não são totalmente eficazes, o mesmo ocorre com os métodos de diagnóstico, pois os sinais clínicos não são perceptíveis de imediato. Através de sequenciamento e da análise proteômica complementar foram identificados vários alvos, dentre eles o gene cp1002_0369, que codifica para uma proteína secretada sendo esta descrita provavelmente como uma fosfoesterase, potencialmente antigênica, a qual pode vir a ser utilizada no desenvolvimento de vacinas recombinantes e no desenvolvimento de testes de diagnóstico. Esta proteína foi utilizada na forma recombinante como vacina de subunidade e como vacina de DNA e também para o desenvolvimento de um teste de diagnóstico baseado em ELISA. Para isso o gene cp1002_0369 foi clonado no vetor de expressão em eucariotos pTARGET e de expressão em procariotos pAE. A proteína CP0369 recombinante foi purificada e avaliada como vacina recombinante associada aos adjuvantes xantana e hidróxido de alumínio e em um ELISA indireto com soros de ovinos. O potencial imunoprotetor foi avaliado em modelo murino através de desafio com a 104 UFC da cepa Mic6 de C. pseudotuberculosis em 9 grupos vacinais. A formulação vacinal que aumentou a taxa de sobrevida dos animais após o desafio foi o grupo contendo a proteína recombinante (rCP0369 + hidróxido de alumínio). O ELISA para diagnóstico de LC foi avaliado através da análise ROC em um total de 182 soros revelou uma sensibilidade e a especificidade de 90% e 75,6%, respectivamente. O formato de ELISA (ELISA-rCP0369) pode ser utilizado no diagnóstico de LC em rebanhos ovinos com bom índice de sensibilidade. No entanto, novas estratégias vacinas empregando a proteína CP0369 serão avaliadas para melhorar a eficácia da vacina.

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_nubia_seyffert.pdf: 4325642 bytes, checksum: 2836f7bcdef6a962ef1e00c38936c413 (MD5) Previous issue date: 2007-02-05 / Leptospiral immunoglobulin-like (Lig)proteins are exposed on membrane surface of pathogenic Leptospira and may play a role in host cell attachment and invasion during infection.A pair of Ligs,named LigA and LigB,with identical and non-identical polypeptide regions has recently been identified.The two proteins elicit a strong humoral immune response during acute host infection and have been suggested as targets for development of vaccines and diagnostic tests for leptospirosis.This study reports the production and characterization of monoclonal antibodies (Mabs)against recombinant non-identical fragments of LigA (rLigANI)and LigB (rLigBNI).The recombinant fragments were used for mice immunization and screening hybridomas by indirect ELISA.Four Mabs obtained against rLigANI and six Mabs obtained against rLigBNI were isotyped and evaluated regarding their potential for use in studies of immunoprotection and diagnostic test development.The Mabs were of the IgM (1),Ig 2b (3)and Ig 1 (6)isotypes and reacted with the native proteins from a pathogenic strain of Leptospira i terroga s serovar Copenhageni L1 130 in an indirect ELISA and immunofluorescence.Mabs affinity constants felt between 4x10 7 M -1 and 2x10 8 M -1 ,and epitope mapping by additive ELISA has shown that each Mab either react with the same epitope in the recombinant molecule or cause steric hindrance. Tissue sections from kidneys of hamsters experimentally infected with leptospires and probed with the Mabs reacted positively by immunohistochemistry.These findings suggest that the Mabs obtained can be useful for the studies of immunoprotection and development of diagnostic tests. / As proteínas leptospiral immu oglobuli -like (Lig)estão expostas na superfície da membrana das leptospiras patogênicas e podem estar envolvidas no ataque e penetração às células do hospedeiro durante a infecção.Recentemente,foi identificado um par de Ligs,nomeadas LigA e LigB,com regiões polipeptídicas idênticas e não-idênticas.As duas proteínas estimulam uma resposta humoral forte durante a infecção aguda no hospedeiro e têm sido sugeridas como alvos para o desenvolvimento de vacinas e testes diagnósticos para leptospirose.Este estudo relata a produção e caracterização de anticorpos monoclonais (Mabs)contra fragmentos recombinantes não idênticos de LigA (rLigANI)e LigB (rLigBNI).Os fragmentos recombinantes foram utilizados para a imunização dos camundongos e triagem dos hibridomas por ELISA indireto.Quatro Mabs obtidos contra rLigANI e 6 Mabs contra rLigBNI foram isotipados e avaliados quanto ao seu potencial para uso em estudos de imunoproteção e desenvolvimento de testes diagnósticos.Os Mabs foram dos isotipos IgM (1),Ig 2b (3)and Ig 1 (6)e reagiram com as proteínas nativas de Leptospira i terroga s sorovar Copenhageni cepa L1 130 em ELISA indireto e imunofluorescência.A constante de afinidade dos Mabs manteve-se entre 4x10 7 M -1 and 2x10 8 M -1 ,e o mapeamento de epitopos por ELISA de aditividade demonstrou que cada Mab reage com o mesmo epitopo na molécula recombinante ou causa um impedimento espacial (steric hi dra ce ).Finalmente,os Mabs reagiram positivamente em testes imuno-histoquímicos de seções do tecido renal de hamsters experimentalmente infectados com leptospiras.Esses dados sugerem que os Mabs obtidos podem ser usados para estudos de imunoproteção e desenvolvimento de testes de diagnóstico de leptospirose.

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_elizandra_schoenardie.pdf: 268602 bytes, checksum: 08408f44b3e993faf7cf221741aa401e (MD5) Previous issue date: 2005-06-24 / The Visceral Larva Migrans (VLM) is a zoonotic disease caused by the helminth Toxocara cannis. The precocious diagnosis of this disease in humans is very important to determinate the evolution of the clinical case and the patient's treatment. The goal of the first experiment was determinate the presence of antibodies anti-T. cannis in children from Pelotas through the Indirect Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) front to the antigen TES, as well as to define the pattern of bands recognized by the positive serums in ELISA through the "Western blotting . For this experiment 427 serums from children, with ages between one to eleven yeas old was tested, those serums was adsorved with AgSoAl and determinate that 50,6% was positive for antibodies anti-TES, showing a significant association among the positive children for antibodies anti-TES and the contact with dogs and cats. This association was also observed in the children's different age groups, but not regarding the gender of the same ones. To perform the Western Blotting , 70 serums witch give a positive result in the Indirect ELISA was been used, all serums recognize glicoproteic bands in the range between 30 and 120 kDa. Was observed a diminution in the crusade reaction with AgSoAl when the adsorved and not adsorved serums with this antigen has been test in the Western blotting , where a band of 30 kDa demonstrate to be an important glicoprotein to specific diagnosis of VLM. In the second experiment, 25 mice BALB/c were inoculated with approximately 1000 eggs containing the larvae L3. Each fifteen days blood collection was made through the reto orbital plexus until the 105 days after de animals infection. The serums was tested in the Indirect ELISA using the Antigen TES and urea 6M in order to discriminate recent and late infection, through the percentile of avidity of the IgG in the different days after the infection. A low percentile of avidity was observed to the 15 days after inoculation (between 7,25 and 27,5%). After 60 days of infection, all the animals presented avidity between 31,4 and 58%. This result suggests that in mice BALB/c, to the 60 days after infection the chronic phase of VLM is already established. / A Larva Migrans Visceral (LMV) é uma doença zoonótica que possui como principal agente etiológico o helminto Toxocara canis. O diagnóstico precoce da doença no homem é importante para estudos de evolução clínica e tratamento do paciente e os inquéritos epidemiológicos para determinar a freqüência da infecção em uma população. Por isso, o primeiro experimento teve como objetivo, determinar a presença de anticorpos anti-T. canis em crianças da região de Pelotas através de Enzyme linked immnosorbent assay (ELISA) com o antígeno de excreção e secreção de larvas de Toxocara canis (TES), bem como definir, através de Western blotting , o padrão de bandas do TES reconhecidas pelos soros positivos ao ELISA. Foram ensaiados no ELISA Indireto 427 soros de crianças de um a 12 anos de idade adsorvidos com antígeno somático de Ascaris lumbricoides e determinado que 50,6% apresentaram anticorpos anti-TES, ocorrendo uma associação significativa entre as crianças positivas e o contato com cães e gatos. Esta associação também foi observada em diferentes faixas etárias das crianças, mas não com relação ao sexo das mesmas. Setenta soros positivos no ELISA foram ensaiados no Western blotting e todos reconheceram frações proteicas entre 30 e 120 kDa. Uma diminuição da reação cruzada com o AgSoAl foi observada quando soros adsorvidos com este antígeno foram testados no Western blotting , sendo que uma fração antigênica de 30 kDa apresentou-se como uma proteína importante para o diagnóstico específico da LMV. No segundo experimento, 25 camundongos BALB/c foram inoculados com aproximadamente 1000 ovos contendo a larva infectante (L3). Colheitas quinzenais de sangue foram realizadas através do plexo retro orbital até os 105 dias pós-infecção dos animais. Os soros foram ensaiados no ELISA Indireto utilizando o antígeno TES e a uréia 6M a fim de discriminar infecção recente e tardia, através do percentual de avidez da IgG nos diferentes dias após a infecção. Um baixo percentual de avidez, característico da infecção aguda, foi observado aos 15 dias pós-inoculação (entre 7,3 e 27,5%). Após 60 dias de infecção, todos os animais apresentaram avidez entre 31,4 e 58%. Através destes resultados, sugere-se que em camundongos BALB/c, aos 60 dias pós-infecção a fase crônica da LMV já está estabelecida.

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_suselaine_de_goes_madeira.pdf: 652203 bytes, checksum: 896583af93cb2ee4488550d558cab177 (MD5) Previous issue date: 2007-12-07 / Tuberculosis, caused by Mycobacterium tuberculosis, is one of the most serious infectious illnesses in the world, being responsible for millions of deaths. Despite the use of the vaccination with M. bovis BCG, the number of new cases remains high. Immunological methods are hampered by the reaction afforded by BCG. Better diagnostic tools should allow detection and treatment of infected patients before they develop active disease. Antigens present in M. tuberculosis but absent from the vaccine strain are needed for this purpose. Therefore, this work has been developed aimed at the characterization of proteins Rv3402, Rv3404 and Rv3405, contained in RD16, missing only region M. bovis BCG Moreau, the strain vaccine used in Brazil, but present in all other strains of BCG and M. Tuberculosis. The genes rv3402, rv3404 and rv3405 were obtained by PCR from M. tuberculosis H37RV and cloned in the vector pENTR/D/Topo (Gateway System Invitrogen) and used to transform Escherichia coli TOP10F. The coding sequence for each gene was then transferred to the expression vector pDEST17, which allows the fusion of the protein with a tail of histidine, facilitating their purification. After extracted and purified, these plasmids were used to transform E. coli BL21 pLysS. The purification of the protein was performed by affinity chromatography using the ÄKTAPrime system (Amersham Biosciences). BALB/c mice were inoculated with purified proteins and serum obtained from these animals was used for characterization of the proteins by ELISA and Western blot. It was possible to demonstrate that the proteins are immunogenic and that they are expressed by M. tuberculosis. The protein contained in the RD16 and evaluated in this study, were quantified in a concentration of 0.5 mg.mL-1 for Rv3402 and Rv3404 and 0.2 mg.mL-1 for Rv3405 and were able to induce a specific and statistically significant humoral immune response in immunized mice, indicating that they can be used for the development of immunodiagnostic tests for tuberculosis, aiming to differentiate individuals vaccinated and infected with the tuberculosis bacillus. / Tuberculose, causada pela bactéria Mycobacterium tuberculosis, é uma das mais graves doenças infecciosas no mundo, sendo responsável por milhões de mortes. Apesar do uso da vacinação com M. bovis BCG, o número de novos casos continua elevado. Métodos imunológicos para diagnóstico de tuberculose são limitados devido à reação cruzada desencadeada pelo BCG. Novas ferramentas diagnósticas permitiriam a detecção e tratamento de pacientes infectados antes do desenvolvimento da doença ativa, necessitando para isso antígenos presentes em M. tuberculosis, mas ausentes na cepa vacinal. Neste sentido, esse trabalho foi desenvolvido visando à caracterização das proteínas Rv3402, Rv3404 e Rv3405, contidas na RD16, região ausente apenas M. bovis BCG Moreau, a cepa vacinal utilizada no Brasil, mas presente em todas as outras cepas de BCG e em M. tuberculosis. Os genes rv3402, rv3404 e rv3405 foram obtidos por PCR a partir de M. tuberculosis H37RV e clonados no vetor pENTR/D/Topo (Gateway System - Invitrogen) e usados para transformar Escherichia Coli Top10F. A seqüência codificadora de cada gene foi então transferida para o vetor de expressão pDEST17, o qual permite a fusão da proteína com uma cauda de histidina, facilitando a sua purificação. Depois de extraídos e purificados, esses plasmídios foram usados para transformar E. coli BL21 pLysS. A purificação das proteínas foi realizada através de cromatografia de afinidade. Camundongos BALB/c foram imunizados com as proteínas purificadas e o soro obtido destes animais foi utilizado para caracterização das proteínas por Western blot e ELISA. Foi possível demonstrar que as proteínas são imunogênicas e que são expressas por M. tuberculosis. As proteínas contidas na RD16 e avaliadas nesse estudo, foram quantificadas em uma concentração de 0,5 mg.mL-1 para Rv3402 e Rv3404 e 0,2 mg.mL-1 para Rv3405 e foram capazes de induzir uma resposta imune humoral específica e estatisticamente significativa em camundongos imunizados, indicando que podem vir a ser utilizadas para o desenvolvimento de testes de imunodiagnósticos para tuberculose, visando à diferenciação entre indivíduos vacinados e infectados com o bacilo da tuberculose.

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_sibele_borsuk.pdf: 16306468 bytes, checksum: 4743a54f442368d81ff802d8290c7cfc (MD5) Previous issue date: 2008-02-28 / Mycobacterium bovis BCG has the potential to be an effective live vector for multivalent vaccines. However, there are two problems regarding the utilization of recombinant BCG as vaccine. The first one is that most mycobacterial cloning vectors rely on antibiotic resistance gene as selectable marker, which is used for genetic transformation. The second one is the limited use of BCG in animals because it interferes in the tuberculosis diagnosis by tuberculin skin test, which elicits delayed type hypersensitivity to the purified protein derivative (PPD). In this work we developed and evaluated the use of auxotrophic complementation as a new selectable marker, characterized the proteins that are present in the bovine and avium PPD and developed a knockout BCG strain by homologous recombination. To test the auxotrophic complementation as selectable marker, an auxotrophic BCG strain for the amino acid leucine was constructed by knocking out the leuD gene by homologous recombination. Expression of leuD on a plasmid acted as a selectable marker in the auxotrophic M. bovis BCG leuD and M. smegmatis mc2144. The auxotrophic complementation selection was similar to selection by antibiotic resistance, but with the advantage of promoting stability of the plasmid. The new system was highly stable even during in vivo BCG growth. The identification of proteins from PPD was archived by LC-MS/MS (Liquid Chromatography/Mass Spectrometry/Mass Spectrometry). A total of 147 proteins among five PPD samples (2 bovine PPD and 3 avium PPD) were identified. The bovine PPD had a considerable higher number of proteins comparing to the avium PPD. We identifying a group of 28 proteins present only in bovine PPD and a group of five proteins deleted in M. bovis BCG vaccinal strain. These two groups are of special interest as they can be used in tests with improved specificity, and potentially able to differentiate vaccinated and infected individuals. A mutant BCG strain with the DPPD antigen deleted was constructed. The Mb0092 coding sequence was knocked out by homologous recombination. The 11 sequences flanking the target gene were cloned into a suicide vector. Double crossovers were selected using sacB. The knockout genotype was determined by PCR and by Southern blot. This mutant BCG strain can be useful in animal vaccination as it will not interfere in the tuberculosis diagnostic test, when performed using recombinant DPPD. The results show alternatives for the problems related to the use of M. bovis BCG as a recombinant vaccine. The auxotrophic complementation system was highly stable, efficient and it is suitable for expressing heterologous antigens in BCG. The identification of proteins present in PPD preparations and the mutant BCG obtained provide the possibility for the development of differential diagnostic test, thus allowing the use of BCG as vaccine also in animals. / Mycobacterium bovis BCG tem o potencial para ser um vetor efetivo para vacinas recombinantes multivalentes. No entanto, existem dois problemas quanto a sua utilização como vetor vacinal. O primeiro é a presença de genes que conferem resistência a antibióticos nos vetores utilizados para transformação genética. O segundo é a limitação de uso de BCG em animais, principalmente por comprometer o teste de tuberculina, utilizado como diagnóstico de tuberculose, o qual se baseia em reação de hipersensibilidade ao PPD (Derivado Protéico Purificado). Neste trabalho desenvolvemos e avaliamos a complementação auxotrófica como novo marcador de seleção, fizemos a caracterização das proteínas componentes de amostras de PPD aviário e bovino e desenvolvemos um mutante de BCG por recombinação homóloga. Para o uso de complementação auxotrófica como marcador de seleção, uma cepa de BCG auxotrófica para o aminoácido leucina foi construída por knockout do gene leuD por recombinação homóloga. A expressão do gene leuD em um plasmídio atuou como marcador de seleção nas cepas auxotróficas de M. bovis BCG leuD e M. smegmatis mc2144. A seleção por complementação de BCG auxotrófica se mostrou equivalente à seleção por resistência a antibiótico, com a vantagem adicional de proporcionar maior estabilidade do vetor plasmidial, já que a pressão seletiva é mantida mesmo durante multiplicação da bactéria in vivo. A identificação das proteínas que compõem o PPD foi feita por espectrometria de massa utilizando-se LCMS/ MS (cromatografia líquida associada à espectrometria de massa em tandem). Foram identificadas 147 proteínas entre 5 amostras de PPD (2 PPD bovino e 3 PPD aviário). O PPD bovino teve um número maior de proteínas comparado ao PPD aviário. Foi identificado um grupo de 28 proteínas presentes em PPD bovino, mas ausentes em PPD aviário. Além disso, 5 proteínas encontradas no PPD estão ausentes em M. bovis BCG. Estes são de 9 especial interesse, pois poderão vir a contribuir para o desenvolvimento de um teste de diagnóstico mais específico, e possivelmente capaz de diferenciar indivíduo vacinado com BCG e infectado com o bacilo da tuberculose. Um mutante de M. bovis BCG Pasteur foi construído. O gene Mb0092 (dppd) foi alvo de inativação gênica por recombinação homóloga. Seqüências que flanqueiam o gene alvo foram clonadas em um vetor suicida. Duplo crossover foi selecionado utilizando sacB. O genótipo mutante foi determinado por PCR e por Southern blot. Esta cepa poderá ser utilizada como vacina em animais, quando o diagnóstico for feito com DPPD recombinante. Os resultados obtidos apresentam alternativas para os problemas envolvidos quanto à utilização de M. bovis BCG como vacina recombinante. O sistema de seleção por complementação auxotrófica foi estável, e pode ser empregado na expressão de antígenos heterólogos em BCG. A identificação dos principais componentes protéicos do PPD e o desenvolvimento da cepa mutante de BCG possibilitam o desenvolvimento de testes diagnósticos diferencias, permitindo a utilização de BCG como vacina também em animas.