Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 402071 bytes, checksum: f514861e3699db83508ed828b9260676 (MD5) Previous issue date: 2009-02-17 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The fermentative metabolism of lactose in Kluyveromyces marxianus UFV-3 was compared to the Kluyveromyces lactis JA6 under aerobic and hypoxia through the analysis of kinetics of growth, consumption of substrate, production of ethanol and formation of biomass, depending on the concentration of lactose. It was determinated the gene expression and activity of key enzymes of metabolism of lactose under aerobic and hypoxia. In fermentations carried out under aerobic and hypoxia in lactose concentrations of 0.25 to 64 mM, K. marxianus UFV-3 showed higher specific growth rate and higher concentration of biomass after 24 hours of cultivation, for K. lactis JA6. In fermentations with 64 mM lactose under aerobic and hypoxia K. marxianus UFV-3 showed higher yield to ethanol by K. lactis JA6, demonstrating that high concentrations of substrate metabolism favors fermentation in K. marxianus UFV-3. Under aerobic K. marxianus UFV-3 has more activity of pyruvate dehydrogenase that K. lactis JA6, justifying the formation of higher biomass and higher growth rate observed in K. marxianus UFV-3. Under hypoxia the highest activities of pyruvate decarboxylase and β- galactosidase of K. marxianus UFV-3 in relation to K. lactis JA6 seem to be the factors that contribute to the increased formation of ethanol in K. marxianus UFV-3 when compared to K. lactis JA6. In hypoxia K. marxianus showed higher expression of genes that encode enzymes β-galactosidase, pyruvate decarboxylase and the Leilor pathway for when compared to aerobic. Indicating that these genes are important for the metabolism of lactose in hypoxia. Already in K. lactis JA6 none of these genes showed increased expression in hypoxia. It appears the higher expression of genes encoding key enzymes of metabolism of lactose as the major enzymatic activity is responsible for fermentation potential of K. marxianus UFV-3. / O metabolismo fermentativo de lactose em Kluyveromyces marxianus UFV-3 foi comparado ao de Kluyveromyces lactis JA6 em aerobiose e hipoxia por meio da análise de cinéticas de crescimento, consumo de substrato, produção de etanol e formação de biomassa, em função da concentração de lactose. Determinou-se ainda a expressão gênica e atividade de enzimas-chave do metabolismo de lactose em aerobiose e hipoxia. Nas fermentações conduzidas em aerobiose e hipoxia em concentrações de lactose de 0,25 a 64 mM, K. marxianus UFV-3 apresentou maior velocidade específica de crescimento e maior concentração de biomassa após 24 horas de cultivo, em relação a K. lactis JA6. Nas fermentações com 64 mM de lactose em aerobiose e hipoxia K. marxianus UFV-3 mostrou maior rendimento de etanol por lactose que K. lactis JA6, demonstrando que alta concentração de substrato favorece metabolismo fermentativo em K. marxianus UFV-3. Sob aerobiose K. marxianus UFV-3 possui maior atividade de piruvato desidrogenase que K. lactis JA6, justificando a maior formação de biomassa e maior velocidade de crescimento verificada em K. marxianus UFV-3 em aerobiose. Sob hipoxia as maiores atividades de β-galactosidase e de piruvato descarboxilase de K. marxianus UFV-3 em relação à K. lactis JA6 parecem ser os fatores que contribuem para a maior formação de etanol de K. marxianus UFV-3 quando comparado a K. lactis JA6. Em hipoxia K. marxianus apresentou maior expressão de genes que codificam enzimas para a via de Leilor, para a enzima β-gal e piruvato descarboxilase quando comparado à aerobiose. Indicando que estes genes são importantes para o metabolismo de lactose em hipoxia. Já em K. lactis JA6 nenhum destes genes apresentou expressão aumentada em hipoxia. Tanto a maior expressão de genes que codificam enzimas chaves do metabolismo de lactose quanto à maior atividade enzimática parecem ser os responsáveis pela capacidade fermentativa de K. marxianus UFV-3.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 700292 bytes, checksum: f54866bb9d53611e8feef9c8d9a5b216 (MD5) Previous issue date: 2009-07-24 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The sulphate reducing bacteria (SRB) are considered the principal group of microorganisms involved in the formation of biofilms and biocorrosion of pipelines. The prevention and the control of the growth of that bacterial group have been accomplished mainly by the use of biocide or bacteriostatic agents, as well as for the use of metabolic inhibitors. In this work the effect of mixtures was evaluated containing the biosurfactant rhamnolipid, the inhibitor metabolic molybdate of sodium and the biocide tetrakis (hydroxymethyl) phosphonium sulfate (THPS) about the metabolic activity of Desulfotomaculum nigrificans as well as about your adhesion to coupons of stainless steel AISI 304. The effect of the mixtures about the metabolic activity was evaluated by the estimate of viable cells and for the determination of residual sulphate in the medium of culture. The evaluation of the adhesion to coupons of stainless steel was accomplished by the direct count to the epifluorescence microscope. The experimental planning was accomplished according to Central Design Compost Rotational (DCCR) and the Methodology of Surface of Answer (MSR) was used to analyze the experimental design. There was not significant difference among the effects caused by the three compounds in the cellular viability in 6 and 18 hours after the addition of the compounds to the culture of D. nigrificans. All the appraised compounds were capable to inhibit the growth of D. nigrificans in anaerobic medium Baars to 55 ºC. The data of concentration of residual sulphate confirmed the effect of inhibition of the compounds also tested about the metabolic activity of that bacterium. Among the appraised compounds, the biosurfactant rhamnolipid was what presented larger effect of inhibitation in the adhesion of D. nigrificans to coupons of stainless steel, when cultivated in medium Baars to 55 ºC. It was the only compounds with effect significant statistics appeared in the times of 24, 48 and 96 hours of treatment evaluated. The Methodology of Surface of Answer revealed that the largest inhibition of the adhesion happens when the biosurfactant is added in concentrations from 1,0 to 1,6 times the value of your concentration critical micelar. The results suggest the potential of application of the biosurfactant rhamnolipid in the control of the adhesion and, eventually, of the biocorrosion caused by D. nigrificans. / As bactérias redutoras de sulfato (BRS) são consideradas o principal grupo de microrganismos envolvidos na formação de biofilmes e biocorrosão de oleodutos. A prevenção e o controle do crescimento desse grupo bacteriano têm sido realizados principalmente pela utilização de agentes biocidas ou bacteriostáticos, bem como pelo uso de inibidores metabólicos. Neste trabalho foi avaliado o efeito de misturas contendo o biossurfactante ramnolipídeo, o inibidor metabólico molibdato de sódio e o biocida sulfato de tetrakis (hidroximetil)fosfônio (THPS) sobre a atividade metabólica de Desulfotomaculum nigrificans, bem como sobre a sua adesão a cupons de aço inoxidável AISI 304. O efeito das misturas sobre a atividade metabólica foi avaliado pela estimativa de células viáveis e pela determinação de sulfato residual no meio de cultura. A avaliação da adesão a cupons de aço inoxidável foi realizada pela contagem direta em microscópio de epifluorescência. O planejamento experimental foi realizado segundo o Delineamento Composto Central Rotacional (DCCR) e a Metodologia de Superfície de Resposta (MSR) foi utilizada para se analisar o delineamento experimental. Não houve diferença significativa entre os efeitos causados pelos três compostos na viabilidade celular em 6 e 18 horas após a adição dos compostos à cultura de D. nigrificans. Todos os compostos avaliados foram capazes de inibir o crescimento de D. nigrificans em meio Baars anaeróbio a 55 ºC. Os dados de concentração de sulfato residual confirmaram o efeito inibitório dos compostos testados também sobre a atividade metabólica dessa bactéria. Dentre os compostos avaliados, o biossurfactante ramnolipídeo foi o que apresentou maior efeito inibitório na adesão de D. nigrificans a cupons de aço inoxidável, quando cultivada em meio Baars a 55 ºC. Ele foi o único composto com efeito estatisticamente significativo nos tempos de 24, 48 e 96 horas de tratamento avaliados. A Metodologia de Superfície de Resposta revelou que a maior inibição da adesão ocorre quando o biossurfactante é adicionado em concentrações de 1,0 a 1,6 vezes o valor da sua concentração micelar crítica. Os resultados sugerem o potencial de aplicação do biossurfactante ramnolipídeo no controle da adesão e, eventualmente, da biocorrosão causada por D. nigrificans.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 528396 bytes, checksum: 2b516aa2ea3ea48bfb173971c8b65f4c (MD5) Previous issue date: 2010-08-18 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The low germination percentages of P. microcarpus basidiospores represents a major drawback for obtaining monokaryotic strains for quantitative genetic studies on the mycorrhizal associations, the use of spores in mutagenesis experiments aiming at the identification of genes important to the symbiosis, and the use of these propagules as inoculants in forest nurseries. The characterization of the mRNA present within the fungal basidiospores may provide information on the level of preparedness of the spores to germinate and sustain initial hyphal growth. The aim of this work was to characterize the mRNA present in the basidiospores of the ectomycorrhizal fungus P. microcarpus after basidiosporogenesis. Total RNA was extracted from the mature basidiospores and mycelium and mRNA was used for cDNA synthesis. An analysis of the presence of 14 gene transcripts involved in lipid metabolism, glycogen mobilization, trehalose mobilization, nitrogen assimilation, glycolysis, pentose phosphate pathway and glucan degradation using cDNA from the fungal basidiospores and dikaryotic mycelium was done. qPCR analysis was performed to compare the amount of transcripts of the genes d15fa, ntrh, and ag13 which code respectively, for Δ15 fatty acid desaturase, neutral α-trehalase, and α-1,3-glucosidase in the dikaryotic mycelium and basidiospores. The 14 transcripts studied were present both in the dikaryotic mycelium and in the basidiospores, indicating a preparedness of these propagules to initiate and sustain germination. qPCR analysis indicated a higher amount of transcripts of genes the d15fa, ntrh, and ag13 inside the basidiospores when compared to the dikaryotic mycelium. These results suggest a higher need for enzymes involved in the synthesis of unsaturated fatty acids, trehalose mobilization, and glucan degradation during basidiospore germination. A cDNA library was constructed from basidiospore mRNAs and 288 clones were sequenced. One hundred and nineteen sequences were obtained, resulting in a total of 12 ESTs (expressed sequence tags). The amino acid sequence deduced from the EST corresponding to clone 277 showed significant similarity to a protein involved in respiratory metabolism and may be important during the germination process. Other ESTs showed significant identity to unknown ESTs deposited in the NCBI database. These ESTs may code for proteins that are specific of the basidiospores of P. microcarpus. However, to confirm this hypothesis, other clones must be sequenced to better characterize the cDNA library. / As baixas percentagens de germinação dos basidiósporos do fungo ectomicorrízico Pisolithus microcarpus dificultam a obtenção de estirpes monocarióticas, material para estudos de genética quantitativa da associação micorrízica, inviabilizam a utilização de esporos em experimentos de mutagênese visando à identificação de genes importantes para a simbiose, além de dificultar a utilização desses propágulos como inoculantes em viveiros florestais. A caracterização do mRNA presente no interior desses basidiósporos poderá fornecer informações sobre o nível de preparação que têm para iniciar o processo de germinação e sustentar o crescimento inicial das hifas. O objetivo deste trabalho foi o de caracterizar os mRNA presentes nos basidiósporos do fungo ectomicorrízico P. microcarpus após a basidiosporogênese. O RNA total foi extraído de basidiósporos maduros e micélio, procedendo posteriormente a obtenção mRNA para a síntese de cDNA. Determinou-se a presença de transcritos de 14 genes envolvidos no metabolismo de lipídeos, na mobilização de glicogênio, na mobilização de trealose, na assimilação de nitrogênio, na via glicolítica, na via das pentoses fosfato e na degradação de glicanas. A análise por qPCR foi realizada visando comparar a quantidade de transcritos dos genes d15fa, ntrh e ag13 que codificam respectivamente as enzimas ácido graxo-Δ15 desaturase, α- trealase neutra e 1,3-α-glicosidase, nos basidiósporos e no micélio dicariótico. Os 14 x transcritos avaliados foram encontrados tanto no micélio dicariótico quanto nos basidiósporos, sugerindo a preparação desses propágulos para iniciar e sustentar o processo de germinação. A análise por qPCR indicou maior quantidade de transcritos dos genes d15fa, ntrh e ag13 no interior dos basidiósporos quando comparado ao micélio dicariótico. Esse resultado sugere a participação de enzimas responsáveis pela síntese de ácidos graxos insaturados, mobilização de trealose e degradação de glicanas durante o processo de germinação. Uma biblioteca de cDNA foi construída a partir dos fragmentos de cDNA dos basidiósporos, sendo caracterizada por meio do sequenciamento de 288 clones. Foram obtidas 119 sequências que, ao serem agrupadas, resultaram em 12 ESTs (expressed sequence tags). A sequência de aminoácidos deduzida da EST referente ao clone 277 apresentou similaridade significativa com proteína envolvida no metabolismo respiratório, podendo ser importante durante o processo de germinação. Outras ESTs apresentaram identidade significativa com ESTs depositadas no banco de dados do NCBI ainda não identificadas. Alternativamente, sugere-se que essas ESTs possam ser codificadoras de proteínas específicas dos basidiósporos de P. microcarpus, importantes para a etapa de germinação desses propágulos.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 01 - Capa_Abstract.pdf: 87328 bytes, checksum: a7d0b37a2134cc647e2ff3372fd82fa4 (MD5) Previous issue date: 2011-07-29 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The low reactivity of Brazilian rock phosphates (RPs) is the most significant obstacle for the direct application of these minerals in the soil since they are frequently incapable of releasing sufficient phosphorus (P) to the plants. The use of phosphatesolubilizing fungi has been considered as a sustainable, low-cost technology, capable of increasing the efficiency of RPs and allowing their direct use by farmers. The objective of this work was to select fungal isolate capable of solubilizing non-reactive RPs and to study the influence of cultivation conditions on phosphate solubilization in liquid medium and in a solid state fermentation (SSF) system with sugarcane bagasse as substrate. Aspergillus niger FS1 presented the highest ability to solubilize Araxá, Catalão, and Patos de Minas RPs, solubilizing 33 %, 25 %, and 38 %, respectively, after 7 days of incubation in liquid medium. Thus, A niger FS1 and Patos de Minas RP were selected for the next experiments. The influence of two carbon sources, glucose and sucrose, and of two nitrogen sources, ammonium sulfate and sodium nitrate, on Patos de Minas solubilization in a SSF system was also tested. The highest values for soluble P were obtained in the presence of glucose or sucrose in the absence of the nitrogen sources tested. The addition of either glucose or sucrose to the SSF system, in the absence of N sources, led to an average solubilization of Patos de Minas RP of 85 %. The isolate FS1 was also shown to oxidize elemental sulfur (S°) in the culture medium at 1% (w/v) resulting in a S-SO4 2- concentration of 294 mg L-1. The influence of sucrose, ethanol, and S° on RP solubilization was subsequently tested. RP solubilization was influenced only by the sucrose concentrations. Soluble P increased as the sucrose concentrations increased up to 7.3 g L-1 leading to an estimate of 95 % solubilization after 15 days of incubation. The solubilization efficiency per gram of biomass (EPB) increased as the mineral nutrient concentrations were decreased in the Czapeck culture medium. After seven days of incubation, EPB obtained in the medium without minerals was approximately five times higher than that obtained with the original concentration of mineral nutrients in the Czapeck medium. The fungal response to the nutritional stress was also studied by transferring the fungal biomass to a new medium containing minerals (original Czapeck) and to another without minerals. The biomass produced in the absence of minerals was lower than that produced in the original Czapeck. However, the EPB obtained under the first condition was higher than in the second. Thus, the higher EPB observed in the medium without minerals compensated the lower biomass obtained. From the 2nd day after biomass transfer, the estimated soluble P was the same in both media and, at the end of five days of incubation, the estimated solubilized P corresponded to 76 %. / A baixa reatividade dos fosfatos naturais (FNs) brasileiros é o maior obstáculo à aplicação direta desses minérios ao solo, pois frequentemente são incapazes de disponibilizar quantidades suficientes de fósforo (P) para as plantas. A utilização de fungos solubilizadores de fosfatos tem sido vista como biotecnologia sustentável e de baixo custo, capaz de incrementar a eficiência dos FNs, possibilitando o aproveitamento direto dessas fontes de P pelos agricultores. O objetivo deste trabalho foi selecionar isolado fúngico capaz de solubilizar FNs não reativos e estudar a influência das condições de cultivo sobre o processo de solubilização em meio líquido e em sistema de fermentação em estado sólido (FES) tendo bagaço de cana-de-açúcar como substrato. Dos 13 isolados fúngicos avaliados quanto ao potencial de solubilização dos fosfatos de Araxá, de Catalão e de Patos de Minas em meio líquido, Aspergillus niger FS1 apresentou o melhor desempenho, solubilizando aproximadamente 33 % do FN de Araxá, 25 % do FN de Catalão e 38 % do FN de Patos de Minas após sete dias de incubação. Dessa forma, o isolado A. niger FS1 e o FN de Patos de Minas foram selecionados para os demais experimentos. Avaliou-se a influência de duas fontes de carbono, glicose e sacarose, e de duas fontes nitrogenadas, sulfato de amônio e nitrato de sódio, sobre a solubilização do FN em sistema de FES. Os maiores valores de P solúvel foram obtidos na presença de glicose ou de sacarose combinada com a ausência de fonte de nitrogênio. A adição de glicose ou de sacarose ao sistema de FES, na ausência de fonte nitrogenada propiciou, em média, 85 % de solubilização do FN de Patos de Minas por A. niger FS1. Constatou-se que o isolado FS1 foi capaz de gerar íons SO4 2- a partir da oxidação de enxofre elementar (S°). O meio de cultura suplementado com S° a 1 % (m/v) e inoculado com o fungo apresentou concentração de 294 mg L-1 de S-SO4 2-. Avaliou-se a influência da sacarose, do etanol e do S° sobre a solubilização do FN em sistema de FES. A solubilização foi influenciada somente pelas concentrações do açúcar. O P solúvel aumentou em função do aumento da concentração de sacarose até 7,23 g L-1, obtendo-se a estimativa de 95 % de solubilização do FN ao final de um período de 15 dias de incubação. A eficiência de solubilização de P por grama de biomassa (EPB) aumentou em função da diminuição da dose de nutrientes minerais no meio Czapek. Após sete dias de incubação, a EPB obtida no meio sem minerais foi, aproximadamente, cinco vezes superior à EPB alcançada no meio com a concentração original de minerais do meio Czapek. A resposta fúngica ao estresse nutricional foi também estudada pela transferência de determinada biomassa para meio com minerais (meio Czapek original) e para meio sem minerais. A biomassa produzida na ausência de minerais foi inferior à produzida em meio Czapek original. No entanto, a EPB obtida na primeira condição foi superior. Assim, a maior EPB observada no meio sem minerais compensou a menor biomassa obtida nessa condição. A partir do segundo dia após a transferência da biomassa, o P solúvel estimado foi o mesmo nos dois meios e, ao final do período de cinco dias de incubação, estima-se que tenha ocorrido aproximadamente 76 % de solubilização do FN.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 6286736 bytes, checksum: e354da66e718cf4d321aafb79e0de30c (MD5) Previous issue date: 2011-09-02 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Bacteria belonging to the genus Bacillus have physiological plasticity regarding to the conditions of temperature, pH and salinity of the environments in where they are found, such as: water, soil, polluted environments, among others. Under the environmental aspect, these bacteria have the capacity to produce biosurfactants which put them as potential microorganisms for the application of Microbial Enhanced Oil Recovery (MEOR).Technologies economically viable and of growing acceptance, like MEOR, can receive additional informations from the molecular tools about the microbial behavior. In this context, the fluorescence in situ hybridization technique (FISH) is an important tool for detection of microorganisms present in different samples. This technique allows the detection of microorganisms without the need of cultivation. Oligonucleotide probes complementary to the rRNA can be designed with specificities that range from the species level to the domains level. The aims of this work was to apply the FISH technique to detect bacteria of the genus Bacillus and establish the best combination of parameters which combines specificity and good fluorescence signal intensity of the probes utilized. In this way, it was utilized a specific probe for the genus Bacillus (BAC07) and a universal probe for the Domain Bacteria (EUB338). The in silico analysis revealed that the target sequence of probe BAC07 is found predominantly in bacteria of the genus Bacillus, however the possibility of hybridization of probe BAC07 with another member of class Bacilli was not discarded. The parameters analyzed for the application of the FISH technique and evaluation of the specificity of probe BAC07 were: cell fixation method, formamide concentration added to the hybridization buffer and pretreatment of cells with lysozyme. The combination of parameters that ensured the best signal for the probe EUB338 was: cells fixed in paraformaldehyde solution 4%, hybridization buffer containing 35% formamide, without pretreatment with lysozyme; the best conditions for the probe BAC07 were: cells fixed in paraformaldehyde solution 4%, hybridization buffer containing 40% formamide, without pretreatment with lysozyme. A specific detection of bacteria of the genus Bacillus was achieved by probe BAC07. However, the fluorescence signal intensity was very weak when in comparison to the signal of probe EUB338, thereby, for the utilization of probe BAC07 for detection of Bacillus in environmental samples, an enhanced signal is required. / Bactérias pertencentes ao gênero Bacillus possuem grande plasticidade fisiológica no que se refere às condições de temperatura, pH e salinidade dos ambientes nos quais são encontradas, como: água, solo, ambientes poluídos, entre outros. Sob o aspecto ambiental, possuem a capacidade de produção de biossurfactantes que as colocam como micro-organismos potenciais para aplicação na Recuperação Avançada de Petróleo Melhorada por Micro-organismos (MEOR). Tecnologias economicamente viáveis e de crescente aceitação, como a MEOR, podem receber informações adicionais das ferramentas moleculares acerca do comportamento microbiano. Neste contexto, a técnica de hibridização fluorescente in situ (FISH) apresenta-se como uma importante ferramenta para detecção de microorganismos presentes em diferentes amostras. Trata-se de uma técnica que permite a detecção de micro-organismos sem a necessidade prévia de cultivo. Sondas de oligonucleotídeos complementares ao RNAr podem ser elaboradas com especificidade que varia desde o nível de espécie até o nível de Domínio. Este trabalho teve como objetivos aplicar a técnica de FISH para detectar bactérias do gênero Bacillus e estabelecer a melhor combinação de parâmetros que aliassem especificidade à emissão de um adequado sinal de fluorescência das sondas utilizadas. Desta forma, foram utilizadas uma sonda específica para o gênero Bacillus (BAC07) e uma sonda universal para o Domínio Bacteria (EUB338). A análise in silico revelou que a sequência-alvo da sonda BAC07 é encontrada predominantemente em bactérias do gênero Bacillus, porém não foi descartada a possibilidade de hibridização da sonda BAC07 com outros membros da classe Bacilli. Para aplicação da técnica de FISH e avaliação experimental da especificidade da sonda BAC07, os parâmetros avaliados foram: o método de fixação das células, a concentração de formamida adicionada ao tampão de xi hibridização e o pré-tratamento das células com lisozima. A combinação de parâmetros que garantiu o melhor sinal para a sonda EUB338 foi: células fixadas em solução de paraformaldeído 4%, tampão de hibridização com 35% de formamida, sem pré-tratamento com lisozima; as melhores condições para a sonda BAC07 foram: a fixação das células em solução de paraformaldeído 4%, tampão de hibridização com 40% de formamida e sem pré-tratamento com lisozima. Conseguiu-se uma detecção específica de bactérias do gênero Bacillus pela sonda BAC07. No entanto, o sinal de fluorescência foi muito fraco quando comparado ao sinal da sonda EUB338, de modo que, para utilização da sonda BAC07 para detecção específica de Bacillus em amostras ambientais, o estabelecimento de condições que promovam a intensificação do sinal é requerido.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 822133 bytes, checksum: e079e0bf0b7042a8b0741f41174d4120 (MD5) Previous issue date: 2006-05-10 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The physiological and technological parameters important to the development of Direct Vat Set culture of Lactobacillus delbrueckii UFV H2b20 cultivated in Minas Frescal cheese whey were studied. Greater fermentative activity on cheese whey was observed at 40ºC and therefore all bacterial growth experiments were performed at this temperature. Heat shock, 50ºC for 30 minutes, or acid stress, cheese whey with pH 3.5 for 30 minutes, did not affect growth of L. delbrueckii UFV H2b20 on cheese whey. The survival of heat or acid pre-treated cells was assessed after dehydration by lyophilization and spray-drying. Cell survival to either dehydration processes was not affected by acid pre-treatment, whereas heat shock had a deleterious effect on survival. The addition of protective substances (6% mannitol, 1,25% sorbitol, 1,25% monosodium glutamate and mixture of 6% sucrose and 4% trehalose) to cheese whey in which the cells were submitted to lyophilization did not improve cell survival to dehydratation and storage at -80ºC for two months. Cell survival was greater when lyophilization was performed on cheese whey alone. Acid pre-treated cells on cheese whey, pH 3.5 adjusted with HCl, without any further addition, retained higher viable counts after lyophilization and subsequent -80ºC storage. Cell activity recovery in 10% reconstituted skimmed milk was not affected by either heat shock or acid pre-treatment when cells were lyophilized in cheese whey with no additional substances. Spray-dried cultures submitted to acid stress demonstrate recovery comparable to active cells which were not subjected to any condition that could result in cell injury. Those cultures exhibit a high activity even after two months storage at - 20ºC. The hereby presented results demonstrate that the probiotic culture produced in stabilized Minas Frescal cheese whey, pre-treated at pH 3.5, and spray-dried have desirable viability and activity characteristics, and its use can be recommended for the elaboration of milk fermented products containing L. delbrueckii UFV H2b20 cells. / Os parâmetros fisiológicos e tecnológicos de importância para o desenvolvimento de sistema DVS para Lactobacillus delbrueckii UFVH2b20 em soro de queijo Minas Frescal estabilizado foram estudados. A maior atividade fermentativa das células do L. delbrueckii UFV H2b20 em soro de queijo ocorreu a 40ºC. Por essa razão, essa temperatura de incubação foi adotada para a condução dos experimentos. Foi observado que a aplicação de choque térmico, 50ºC por 30 minutos, ou choque ácido, pH 3,5 por 30 minutos, a 40ºC, às células de L. delbrueckii UFV H2b20 não afetaram seu crescimento. Foi avaliado ainda se a aplicação de tais pré-tratamentos afetava a sobrevivência aos processos de desidratação das células por liofilização e spray-drying. Foi observado que o choque ácido não afetou a sobrevivência de L. delbrueckii UFV H2b20 aos dois processos de desidratação avaliados. Por outro lado, o choque térmico teve efeito deletério sobre a sobrevivência das células submetidas aos mesmos processos de desidratação. Para as culturas liofilizadas, foi avaliado se a adição de diferentes soluções protetoras (manitol 6%, sorbitol 1,25%, glutamato monossódico 1,25% e mistura das soluções de sacarose 6% e trealose 4%) exercia efeito sobre a sobrevivência de L. delbrueckii UFV H2b20 à liofilização, bem como durante o período de estocagem das células desidratadas a -80ºC por 2 meses. A sobrevivência das células ao processo de liofilização foi maior quando não se adicionaram substâncias crioprotetoras ao soro de queijo. Maior viabilidade durante o armazenamento a -80ºC foi observada quando as células foram pré-tratadas em soro de queijo pH 3,5, ajustado com HCl e sem a adição de outras substâncias antes da liofilização. Observou-se que os choques térmico ou ácido não afetaram a recuperação imediata em leite desnatado reconstituído a 10% das culturas liofilizadas que não sofreram adição de substâncias protetoras. Nas culturas desidratadas por spray-drying, observou-se que as células de L. delbrueckii UFV H2b20, previamente submetidas ao choque ácido, lograram crescimento comparável ao obtido pelas células ativas que não foram submetidas a qualquer condição que possa causar injúria. Essas culturas permaneceram com elevado número de células, mesmo após 2 meses de estocagem a -20°C. Os resultados obtidos levam à conclusão de que a cultura starter probiótica produzida em soro de queijo Minas Frescal estabilizado, desidratada por spray-drying e previamente submetida ao choque ácido, demonstrou características de viabilidade e atividade mais promissoras, e seu uso pode ser recomendado para a elaboração de produtos lácteos fermentados contendo células do L. delbrueckii UFV H2b20.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:52:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 609136 bytes, checksum: bfac4beb809c8b3d58b49895dc0cc2d1 (MD5) Previous issue date: 2007-03-09 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The high affinity interaction streptavidin-biotin provides an excellent system for industrial enzyme separation or immobilization involving a fused streptavidin-enzyme and a biotinylated support. In order to produce proteins with affinity to biotin, we have modified the commercial K. lactis system, pKLAC1 (New England Biolabs), a LAC4 promoter-driven integration vector for protein expression, with the gene coding streptavidin. The codifying sequence for biotin binding domain of streptavidin (cStp) was amplified by PCR from pSTP4, purified and subcloned to the pCR2.1TOPO (Invitrogen). The fragment has revealed 100% identity with streptavidin gene according to Gene Bank and it was inserted into Xho I / Bgl II pKLAC1 in frame with mating-α-factor signal peptide. The pKLAC1/cStp cut by Ahd I enzyme was used to transform the strains K. lactis MW 98.8C and CB S2359. The transformants selected in Yeast Carbon Base (YCB) containing 5 mM acetamide and confirmed by PCR were mitotically stable. A high cell biomass (OD 600 = 18), obtained in shake-flask 50 mL YPD medium, was centrifuged and transferred to an induction medium, containing 2% of lactose. The cell free medium was qualitatively analyzed for streptavidin and proteins by SDS PAGE. The samples were collected in each 24 hours during 6 days of bath culture. The biotin binding activity of streptavidin in the culture supernatant was determined by HABA test. The medium YPL and YNB with 0,5% of yeast extract have exhibited the best yields for streptavidin extracellular protein production. / A forte interação da proteína estreptavidina pela molécula de biotina constitui um excelente sistema para a separação e/ou imobilização de proteínas e de enzimas de interesse industrial. Com a intenção de produzir proteínas com propriedades de adsorção biosseletiva, nós temos modificado a seqüência do plasmídeo pKLAC1 pela inserção do domínio de afinidade da estreptavidina pela biotina. Utilizando a técnica da Reação da Polimerase em cadeia (PCR), a seqüência de cerca de 355pb foi amplificada a partir do vetor pSTP4 que contém toda seqüência de nucleotídeos referente à proteína estreptavidina. O Fragmento amplificado apresentou 100% de identidade com a seqüência de nucleotídeos da proteína estreptavidina depositada no Gene Bank. O fragmento foi inserido no vetor pKLAC1 nos sítios Xho I e Bgl II em fase com a seqüência do peptídeo sinal do mating-α-factor. O plasmídeo pKLAC1/cStp foi linearizado com enzima Ahd I e foi utilizado para a transformação das linhagens de K. lactis MW 98.8C e CBS 2359. Os transformantes selecionados em meio YCB (Yeast Carbon Base) contendo 5 mM de acetamida como única fonte de nitrogênio e confirmados por PCR foram mitoticamente estáveis. A alta biomassa celular (DO600 = 18) obtida em erlenmeyer de 250 mL contendo 50 mL de meio YPD foi centrifugada e transferida para meio de indução contendo 2% (p/v) de lactose. O sobrenadante das culturas foi analisado qualitativamente para estreptavidina pela técnica de SDS PAGE. As proteínas totais foram determinadas pelo método de BRADFORD utilizando BSA (Albumina Bovina Sérica) como padrão. As amostras foram coletadas a cada 24 horas durante 6 horas de cultivo sob regime de batelada. A atividade da proteína estreptavidina presente no sobrenadante das culturas recombinantes foi determinada pelo teste do reagente HABA. Os meios YPL e YNB contendo 0,5% de extrato de levedura exibiram os melhores resultados quanto à produção extracelular de estreptavidina ativa e de proteínas totais.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:52:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 296265 bytes, checksum: fff0d31dcfb787cbad09aea84f7e3bac (MD5) Previous issue date: 2003-07-21 / Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Growth kinetics and metabolism of isolated yeast UFV-3 from intestinal microbiota of newly born pigs, was studied in the perspective of its use as probiótic. Main culture conditions were suggested in medium YPD. Temperature and pH were inestigated respectively in the range of 28 45 ºC and 3.8 5.5. The yeast UFV-3 has shown optimal growth at pH of 4.7 and temperature of 40 ºC. Growth kinetics was evaluated in three aeration levels: aerobe, microaerobe and anaerobe. The cellular yield was 0.03 g.mmol-1, 0.02g.mmol-1 and 0.01g.mmol-1 in aerobe, microaerobe and anaerobe respectively. Effects of the aeration levels on the oxide-reductive metabolism were analyzed by the ethanol, glycerol and organic acids production. Ethanol final concentration reached 120 mmol.L-1, 174 mmol.L-1, and 101 mmol.L-1 respectively for aerobe, microaerobe and anaerobe conditions. Production yield coefficient for conversion of glucose into ethanol were 1.1 mmol.mmol-1, 1.6 mmol.mmol-1, and 1.7 mmol.mmol-1 respectively for aerobe, microaerobe and anaerobe conditions. Glycerol was produced in concentrations of 11 mmol.L-1 and 10 mmol.L-1 and 7 mmol.L-1 in aerobe, microaerobe and anaerobe respectively. Production yield coefficient for conversion of glucose into glycerol were 0.10 mmol.mmol-1, 0.09 mmol.mmol-1 and 0.11 mmol.mmol-1 respectively for aerobe, microaerobe and anaerobe conditions. Metabolites as propionic, lactic and succinic acids were detected in trace concentrations. Acetic acid was not detected in none of the studied aeration levels. / A cinética de crescimento e metabolismo da levedura UFV-3 isolada da microbiota intestinal de leitões recém-nascidos foi estudada na perspectiva de sua utilização como probiótico. As principais condições de cultivo foram sugeridas em meio YPD. Temperatura e pH foram investigados na faixa de 28 45 ºC e 3.8 5.5. A levedura UFV-3 apresentou pH ótimo de crescimento de 4.7 e temperatura de 40 ºC. A cinética de crescimento foi avaliada em três níveis de aeração: aerobiose, microaerobiose e anaerobiose. O coeficiente de rendimento celular foi de 0.03 g.mmol-1, 0.02g.mmol-1 e 0.01g.mmol-1 nas condições de aerobiose, microaerobiose e anaerobiose respectivamente. Os efeitos dos níveis de aeração no metabolismo oxido-redutivo foram analisados pela produção de etanol, glicerol e ácidos orgânicos. A concentração final de etanol alcançou 120 mmol.L-1, 174,03 mmol.L-1 e 101 mmol.L-1 para as condições de aerobiose, microaerobiose e anaerobiose respectivamente. O coeficiente de rendimento de produto da conversão de glicose em etanol foram 1.1 mmol.mmol-1, 1.6 mmol.mmol-1 e 1.7 mmol.mmol-1 para as respectivas condições de aerobiose, microaerobiose e anaerobiose. Glicerol foi produzido em concentrações de 11 mmol.L-1, 10mmol.L-1 e 7 mmol.L-1 nas condições de aerobiose, microaerobiose e anaerobiose respectivamente. O coeficiente de rendimento de produto da conversão de glicose em glicerol foram 0.10 mmol.mmol-1, 0.09 mmol.mmol-1 e 0.11 mmol.mmol-1 para as respectivas condições de aerobiose, microaerobiose e anaerobiose. Traços de concentrações de metabólitos como ácido propiônico, acido lático, e acido succínico foram detectados. Ácido acético não foi detectado em nenhum dos níveis de aeração estudados.

Made available in DSpace on 2014-12-17T14:02:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 FrancileneMSR.pdf: 883736 bytes, checksum: 9ff46764b05c435a2c7a5daee094527a (MD5) Previous issue date: 2006-12-15 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior / The species psaroniocompsa incrustata (Lutz, 1910) was studied in relation to its abundance in different and seasonal periods, the physico-chemical of the breending ground and the fauna predation added to the immature of the species. The study was developed during eight months, from April to July, 2005 (rainy season) and from October, 2005 to January, 2006 (drought season), in one natural breending ground situated in the Pium river, that is part of the hydrographical basin of the Pirangi river in Rio Grande do Norte. The immature of Simuliidae were collected manually in vegetal substrate. At the same place, it was made one sampling of the associated fauna using Suber collectors and the measurement of the environment variants. It was also made one analysis of the stomach content of possible enemies of the simul?deos, to observe the predation of the associated fauna. It was collected 7.713 samples, all from de species P. Incrustata, it was observed a bigger abundance in the drought season, and the entomologic fauna associated totalizing 20.1314 species, distributed in the kinds: Diptera, Ephemeroptera, Odonata, Trichoptera, e Hemiptera, with a bigger representativity of Dipteros. The analysis of the stomach content of the species from the families Libellulidae and Hydropsychidae showed the presence of the simul?deos in only 4% of the material analysed, therefore it was not confirmed the presence of one efficient biological control of the simul?deos in this breending ground / A esp?cie Psaroniocompsa incrustata (Lutz, 1910) foi estudada quanto a abund?ncia em per?odos sazonais diferentes, a f?sico-qu?mica do criadouro e a preda??o da fauna associada sobre os imaturos desta esp?cie. O estudo foi realizado durante oito meses, abril ? julho de 2005 (esta??o de chuvas) e outubro/2005 ? janeiro/2006 (esta??o de seca), em um criadouro natural localizado no rio Pium, pertencente a Bacia Hidrogr?fica do rio Pirangi, no Rio Grande do Norte. Os imaturos de Simuliidae foram coletados manualmente em substrato vegetal. Nesse mesmo local, foi realizada a amostragem da fauna associada utilizando-se coletor do tipo Surber, e as medi??es das vari?veis ambientais. Para observar a preda??o da fauna associada, foi realizada a an?lise do conte?do estomacal de poss?veis inimigos naturais dos simul?deos. A coleta dos imaturos resultou em 7.713 exemplares, todos da esp?cie P. incrustata, sendo a sua maior abund?ncia observada na estac?o de seca, e a entomofauna associada, totalizou 20.314 esp?cimes, distribu?dos nas Ordens: Diptera, Ephemeroptera, Odonata, Trichoptera e Hemiptera, com maior representatividade dos d?pteros. A an?lise do conte?do estomacal dos esp?cimes das fam?lias Libellulidae e Hydropsychidae revelou a presen?a de simul?deos em apenas 4% do material examinado, n?o sendo constatado a realiza??o de um eficiente controle biol?gico por parte destes, sobre os simul?deos, nesse criadouro

Leishmaniasis is a disease that affects humans since ancient times. In the last 20 years an increased number of cases and expansion of the geographic occurrence of leishmaniasis has taken place. In Brazil, the disease is currently found in all states, especially in the North and Northeast regions, with different epidemiological profiles. In vitro studies have shown that the hormone |Insulin-Like Growth Factor| (IGF-I) enhances Leishmania infection in macrophage in vitro and, exacerbates Leishmania infection in vivo in experimental models, treatment with IGF-1. Individuals with a natural mutation of the receptor of growth hormone-releasing hormone (GHRH) and consequent deficiency of growth hormone (GH) and IGF-I have been described in Itabianinha, Sergipe, called Isolated deficiency of growth hormone (DIGH). This mutation affects the growth weight and height, but the immune response of these individuals has not been evaluated. To better understand the role of IGF-1 in susceptibility to Leishmania infection, the purpose of this work was to study the behavior of leishmania infection in vitro in human macrophages from these individuals with IGF-1 deficiency. Leishmania amazonensis infection was compared in monocytes-derived from peripheral blood from two groups of individuals: 1) Individuals affected with homozygous deficiency of GHRH/GH/IGF-I (dwarf phenotype) (n =8), 2) Homozygous controls without this mutation (normal phenotype) (n =7). The number of infected macrophages and the parasitic load/100 macrophages was compared between these groups. These data confirm the data from experimental model that of IGF-I interferes in Leishmania-macrophage interaction, increasing the parasitic load of this infection. / A leishmaniose é uma doença que acomete o homem desde tempos remotos. Um aumento do número de casos e ampliação de sua ocorrência geográfica tem ocorrido nos últimos 20 anos. No Brasil é encontrada atualmente em todos os estados, em especial nas regiões Norte e Nordeste, sob diferentes perfis epidemiológicos. Estudos in vitro mostraram que o peptídeo Insulin-Like Growth Factor type I (IGF-I), principal mediador das ações do hormônio de crescimento (GH), aumenta a infecção de macrófagos por Leishmania. Em modelos experimentais, o tratamento com IGF-I agrava a infecção por Leishmania. Em Itabaianinha, no nordeste do Brasil, foi descrito uma grande coorte de indivíduos homozigotos para a mutação c.57+1G>A (MUT/MUT) no receptor do hormônio liberador do hormônio de crescimento (GHRH), causando um nanismo acentuado devido à deficiência isolada do hormônio de crescimento (DIGH), com concentrações séricas vitalícias muito baixas de GH e IGF-I. O propósito deste trabalho foi avaliar, in vitro, o papel do IGF-I na susceptibilidade à infecção por Leishmania, de macrófagos humanos dos indivíduos com DIGH. O comportamento da infecção in vitro com Leishmania amazonensis foi comparado em macrófagos derivados do sangue periférico de dois grupos de indivíduos: indivíduos MUT/MUT (n= 8), e indivíduos controles homozigóticos normais, N/N (n=7). O número de macrófagos infectados/100 macrófagos e a carga parasitária destes macrófagos (número de amastigotas /100 macrófagos) foram comparados entre estes grupos. Os macrófagos dos indivíduos com DIGH são mais resistentes à infecção com promastigotas de Leishmania amazonensis que os dos N/N e não parecem responder ao estímulo in vitro com IGF-I. Estes resultados comprovam em células humanas, os achados em camundongos que mostram que o IGF-I agrava a infecção na interação macrófago-Leishmania amazonensis.