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Embriotocixidade do MeHg sobre a organização estrutural e ultraestrutural do mesencéfalo e cerebelo de Gallus domesticusAlbuquerque, Cláudia Almeida Coelho de January 2016 (has links)
Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento, Florianópolis, 2016. / Made available in DSpace on 2017-05-23T04:12:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1
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Previous issue date: 2016 / A neurotoxicidade do metilmercúrio (MeHg) em indivíduos adultos é relativamente conhecida, contudo são escassos os trabalhos que analisam os estudos sobre a ação desse metal em duas estruturas do SNC durante o desenvolvimento. Este trabalho teve como objetivo
relacionar os efeitos do MeHg sobre a organização estrutural e ultraestrutural do mesencéfalo e cerebelo, bem como identificar sua ação nos processos de proliferação e diferenciação celular, utilizando como modelo experimental embriões de Gallus domesticus. Os embriões foram tratados in ovo no 3° dia de incubação (E3) com uma única dose de metilmercúrio (MeHg) (0,1 µg diluído em 50 µL de salina) e analisados no 10° dia de incubação (E10). Os embriões do grupo controle foram tratados somente com 50 µL de solução salina.As análises morfológicas e morfométricas do mesencéfalo e cerebelo foram realizadas a partir de secções histológicas coradas com HE. A quantificação e imunolocalização de proteínas relacionados ao ciclo celular (ciclina E; p21 e p53), diferenciação celular (NeuN; TubulinaIII e GFAP), proliferação celular (fosfohistona H3) e dano ao DNA(?PH2Ax), bem como relacionados a dinâmica mitocondrial (Drp-1 eMfn-1) foram obtidos a partir de técnicas de imuno-histoquímica e citometria de fluxo. Foram realizados ensaios de detecção do MeHg através do espectrofotômetro de absorção atômica e análises por microscopia eletrônica de transmissão, para investigar alterações ultraestruturais. Os resultados mostraram deposição de Hg no mesencéfalo e cerebelo. A exposição ao MeHg provocou aumento da expressão da p21 no mesencéfalo e p53 no cerebelo, e significativa redução da expressão da ciclina E e de fosfohistona H3, sugerindo parada no ciclo celular e da proliferação celular. No grupo tratado foram observadas alterações ultraestruturais, sendo as mais evidentes nas mitocôndrias das células do mesencéfalo e principalmente do cerebelo. Os insultos ao ciclo e a estrutura celular alteraram os processos de diferenciação, provocando uma diminuição no número das células das linhagens neural e glial. Este estudo revelou que os insultos do MeHg no cerebelo foram mais severos do que no mesencéfalo, demonstrando que a toxicodinâmica do MeHg é dependente do período do desenvolvimento, podendo comprometer funções importantes para a sobrevivência do embrião.<br> / Abstract : Neurotoxicity of Methylmercury (MeHg) has been studied for years, but their relationship with the development of two CNS structures (midbrain and cerebellum) is highly unusual. This study aimed to analyze the effects of MeHg in the structural and ultrastructural organization and its influence on the processes of proliferation, differentiation and cell cycle of the midbrain and cerebellum of Gallus domesticus embryos. The embryos were treated in ovo on the 3rd day of incubation (E3) with a single dose of methylmercury (MeHg) (0.1ug in 50 uL of diluted saline) and analyzed on the 10th day of incubation (E10). The control group embryos were treated only with 50 uL saline solution. The morphological and morphometric analysis of the midbrain and cerebellum sections were taken from histological sections stained with hematoxylin-eosin. The quantification and immunolocalization of proteins related to cell cycle (Cyclin E, p21and p53), cell differentiation (NeuN; tubulin III and GFAP), cell proliferation (phosphohistone H3) and DNA damage (yPH2Ax) and related mitochondrial dynamics (Drp-1 and Mfn-1) were obtained from immunohistochemistry and flow cytometry techniques. Metal detection assays were conducted using the atomic absorption spectrophotometer and analysis by transmission electron microscopy to investigate ultrastructural changes. The results showed deposition of Hg in the midbrain and cerebellum. Exposure to MeHg caused increased p21 expression in the midbrain and p53 in the cerebellum, and significant reduction in the expression of cyclin E and phosphohistone H3, suggesting cell cycle arrest and cell proliferation. Ultrastructural changes were observed, being more evident in the mitochondria of cells of the midbrain and especially of cerebellum. The insults to the cycle and the cellular structure altered the processes of differentiation, causing a decrease in the number of cells of neural and glial lineages. This study revealed that MeHg insults in the cerebellum were more severe than in the midbrain, demonstrating that the toxicology of MeHg is dependent on the developmental period and could compromise functions important for the survival of the embryo.
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Avaliação dos efeitos de um inibidor do tipo Kunitz (Amblyomin-X) em culturas celulares de carcinoma renal / Effects of a Kunitz-type inhibitor (Amblyomin-X) on cell cultures of renal carcinomaAkagi, Erica Mie [UNIFESP] 27 October 2011 (has links) (PDF)
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Previous issue date: 2011-10-27 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O carcinoma de células renais (CCR) representa atualmente uma patologia de grande interesse clínico. Sua incidência vem aumentando, especialmente os achados acidentais, que hoje representam 50% dos casos novos diagnosticados (23). Por tratar-se de patologia altamente resistente à quimioterapia e radioterapia, seu potencial de cura encontra-se no tratamento cirúrgico, quando em estádios iniciais, órgano-confinados (62). Inúmeros ensaios clínicos foram propostos para tratar tumores localmente avançados ou metastáticos, mas os resultados inconsistentes encontrados na literatura sejam com quimioterapia, imunoterapia, hormonioterapia ou radioterapia demonstram que a pesquisa clínica deverá progredir em outras direções (22). Foi produzida, em nosso laboratório, uma proteína recombinante oriunda de uma biblioteca de cDNA das glândulas salivares do carrapato Amblyomma cajennense, denominada Amblyomin-X, capaz de inibir o fator Xa de coagulação e de induzir a citotoxicidade em diferentes linhagens de células tumorais (24). Neste trabalho foram avaliados os efeitos do Amblyomin-X em culturas de adenocarcinoma de células renais murinas (Renca) e carcinoma de células renais humanas (Caki-1) com diferentes concentrações deste composto. Analisamos a morfologia e viabilidade celular, ciclo celular e o tipo de morte celular induzido pelo tratamento com a proteína. E também foi avaliado o potencial de inibição da atividade proteassômica frente ao tratamento com Amblyomin-X. Os resultados mostraram que as linhagens Caki-1 e Renca são sensíveis ao Amblyomin-X, o qual induz modificações nas características morfológicas e viabilidade celular após 24 e 48 horas de tratamento. Observamos também que houve morte dose e tempo-dependente, modulação das fases G0/G1 e diminuição das fases S e G2/M do ciclo celular e que em altas concentrações de Amblyomin-X, devido ao seu efeito citotóxico, diminui todas as fases do ciclo celular. Em células Caki-1 ocorreu decréscimo dos níveis de Interleucina-6. Os resultados descritos neste trabalho sugerem que o Amblyomin-X induz citotoxidade em células Renca através do mecanismo de Apoptose. Um dos possíveis alvos do Amblyomin-X é o sistema ubiquitina-proteassomo, visto que foi observada a inibição da atividade catalítica do proteassomo do tipo quimiotripsina em células tratadas com Amblyomin-X. / The renal cell carcinoma (RCC) is currently a disease of great clinical interest. Its incidence is increasing, especially the incidental findings, which now represent 50% of new cases diagnosed. Because it is highly resistant to disease chemotherapy and radiotherapy, their potential to cure is the surgical treatment, while in the early stages, organo-confined. Numerous clinical trials have been proposed to treat locally advanced or metastatic tumors, but results are inconsistent in the literature with chemotherapy, immunotherapy, hormone therapy or radiotherapy have shown that clinical research should progress in other directions. It was produced in our laboratory, a recombinant protein originating from a cDNA library of the salivary glands of Amblyomma cajennense called amblyomin-X, capable of inhibiting factor Xa coagulation and induce cytotoxicity in different tumor cell lines. This study evaluated the effects of Amblyomin-X in cultured murine renal cell adenocarcinoma (Renca) and human renal cell carcinoma (Caki-1) at different concentrations (0.15 to 1.5 ƒÝM) of this compound. We analyze the morphology and cell viability, cell cycle and the type of cell death induced by treatment with the protein. It also evaluated the potential of proteasome inhibition of the activity front in dealing with Amblyomin-X. Then determine that the strains Caki-1 and Renca are sensitive to Amblyomin-X, which induces changes in morphology and cell viability after 24 and 48 hours of treatment with Amblyomin-X. We also observed that death was dose-dependent and time-dependent, inducing a decrease in all phases of the cell cycle and decreased levels of IL-6. The results described herein suggest that the Amblyomin-X induces cytotoxicity in Renca cells through the mechanism of apoptosis. One of the possible targets of Amblyomin-X is the ubiquitin-proteasome system, as was also observed inhibition of catalytic activity of the proteasome chymotrypsin type. / FAPESP: 08/52338-7 / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações
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Componentes do ciclo celular ao longo da gênese do melanoma e seus possíveis reguladores / Cell cycle components along melanoma genesis and their possible regulatorsCruz, Adriana Taveira da [UNIFESP] 25 August 2010 (has links) (PDF)
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Previous issue date: 2010-08-25 / A epigenética estuda mecanismos reguladores da atividade e herança gênica que independem de modificações na seqüência de nucleotídeos do DNA. Os principais eventos epigenéticos são: metilação do DNA e modificações pós traducionais em histonas. miRNAs correspondem a moléculas de RNAs bem pequenas que se associam a mRNA alvos promovendo a desestabilização ou degradação dos mesmos. É estimado que mais de 30% de todos os mRNAs sejam regulados por miRNAs. Desta forma, os miRNAs representam componentes essenciais em diversos processos biológicos, tais como proliferação celular, apoptose e resposta ao estresse. Tanto alterações nos mecanismos epigenéticos quanto modificações no perfil de expressão de miRNAs pode modificar a expressão dos componentes do ciclo celular. Alguns estudos sugerem que o câncer é uma doença do ciclo celular. Neste contexto, o objetivo do presente estudo foi determinar a contribuição dos componentes do ciclo celular na gênese do melanoma e seus possíveis reguladores. Para tal, foi utilizado um modelo murino de gênese do melanoma, no qual várias linhagens celulares foram obtidas após submeter melanócitos melan-a a ciclos sequenciais de bloqueio de ancoragem. Alterações significativas foram identificadas na expressão dos componentes do ciclo celular, p53, p21, ciclina D1 e Cdk4 durante o processo de transformação maligna dos melanócitos. Foi verificada perda da expressão da p53 ao mesmo tempo em que foi observado aumento na expressão de p21 na linhagem de melanoma agressivo. Observaram-se também alterações na expressão de Dnmt1 durante a gênese do melanoma. Ensaios de imunoprecipitação de proteínas mostraram que p53 interage com Dnmt1 somente nos melanócitos melan-a. Vinte e cinco miRNAs foram encontrados diferencialmente expressos ao longo do processo de transformação de melanócitos e os miRNAs 138, 340 5p, 678 e 330 foram reconhecidos como possíveis reguladores de p53, ciclina D1 e Cdk4 e p21, respectivamente. Estes dados sugerem a contribuição da maquinaria epigenética e dos miRNAs na regulação do ciclo celular e demonstram a importância do equilíbrio destas vias para manutenção do um fenótipo celular. Alterações nos componentes do ciclo celular estão envolvidas com transformação maligna de melanócitos melan-a e os eventos epigenética podem contribuir com estas alterações. Os alvos terapêuticos que visam os componentes da maquinaria epigenética podem representar úteis intervenções contra o câncer. Além disso, a proteína p53 interage com um dos principais componentes das máquinas epigenética, Dnmt1, indicando que p53 pode regular essa enzima e contribuir para a manutenção do padrão de metilação do DNA. Os miRNAs identificados também representam moléculas envolvidas na gênese do melanoma e, por isso, são fortes candidatos no desenvolvimento de novas terapias. / Epigenetic studies regulatory mechanisms of the activity and inheritance in gene expression that is independent of modifications in the nucleotide sequence. The main epigenetic events are: DNA methylation and histone pos-translational modifications. miRNAs are non-coding RNAs that bind to mRNA targets and disturb their stability and/or translation, thus acting in the post-transcriptional regulation. It is estimated that over 30% of mRNAs are regulated by miRNAs and therefore these molecules are considered essential in the processing of many biological responses, such as cell proliferation, apoptosis and stress responsiveness. Changes in the epigenetic machinery like modifications in miRNA expression profile can modify the expression of cell cycle components. Some studies suggest that cancer is also a disease of cell cycle. In this regard the aim of the present study was identify the contribution of cell cycle components in melanoma genesis and their possible regulators. For that it was used a murine model of melanoma genesis in which several cell lineages were obtained after submitting melan-a melanocytes to sequential cycles of anchorage blockade. Significant alterations were identified in expression of the cell cycle components, p53, p21, cyclin D1 and cdk4 along melanocyte malignant transformation. It was observed loss of p53 expression in the same time that was observed an increase in expression of p21 in the aggressive melanoma lineages. It was also observed alterations in the expression of dnmt1 during the genesis of melanoma. Protein immunoprecipitation assays showed that p53 interact with dnmt1 only in melan-a melanocytes. Twenty five miRNAs were found differentially expressed along the process of malignant transformation and the miRNAs 138, 340-5p, 678 and 330 were recognized as possible regulators of p53, cyclin D1, Cdk4 and p21, respectively. These data show the contribution of epigenetic and miRNA machinery in the regulation of cell cycle and the importance of the equilibrium of these pathways in maintenance of cell phenotype. Cell cycle components imbalance are involved in malignant transformation of melan-a melanocytes and epigenetic machinery might contribute to these alterations. The therapeutic targets that focus on epigenetic machinery could be useful interventions against cancer. Besides that, the p53 protein interacts with one of the major components of the epigenetic machinery, dnmt1. This indicates that the components of cell cycle may regulate this enzyme and contribute for the maintenance of DNA methylation pattern. The miRNAs identified also represent strong candidates in the contribution of melanoma genesis. They may be useful as therapeutic targets on interventions against cancer. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações
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Toxicidade do metilmercúrio (MeHg) sobre a organização das camadas da medula espinhal de embriões de Gallus domesticusFerreira, Fabiana de Fátima January 2015 (has links)
Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento, Florianópolis, 2015. / Made available in DSpace on 2016-10-19T13:18:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1
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Previous issue date: 2015 / Os efeitos neurotóxicos do metilmercúrio (MeHg) são bem conhecidos, mas informações mais detalhadas sobre a sua ação durante o desenvolvimento embrionário ainda são escassas. Este estudo teve como objetivo caracterizar os efeitos do MeHg sobre a organização ultraestrutural e sobre os mecanismos celulares e moleculares envolvidos no desenvolvimento das camadas da medula espinhal, utilizando embriões de Gallus domesticus como modelo. No terceiro dia embrionário (E3), os embriões foram tratados in ovo com uma única dose de cloreto de metilmercúrio (ClMeHg) (0,1 µg diluído em 50 µL de salina) e avaliados no décimo dia embrionário (E10). As análises morfológicas e morfométricas da medula espinhal foram realizadas a partir de secções histológicas coradas com HE. A localização e quantificação dos marcadores relacionados ao ciclo celular e dano ao DNA foram obtidos a partir de técnicas de imunohistoquímica e citometria de fluxo. Adicionalmente, foram realizados o ensaio de TUNEL, para a identificação de células em apoptose e análise por microscopia eletrônica de transmissão, para investigar possíveis danos ultraestruturais. Nossos resultados mostraram significativa deposição de mercúrio nas três camadas da medula espinhal, as quais apresentaram alteração na expressão de marcadores relacionados ao controle do ciclo celular, proliferação e morte celular. O aumentado número de células ?H2A.X-positivas observado na camada de manto indica dano ao DNA, o qual pode ser a causa do aumento na expressão de p21 e consequente retenção do ciclo celular na fase G1. A exposição ao MeHg também causou alterações nos componentes subcelulares das células da medula espinhal, principalmente nas mitocôndrias que apresentaram edemas e rupturas de membranas, além do aparecimento de formas mitocondriais incomuns cup-like (em cálice) e donut-like (em anel). Esses danos podem estar associados com o aumento da morte celular na camada do manto, a qual parece ser mais afetada após a exposição ao MeHg. A redução da proliferação associada a aumento da morte celular, mostraram que uma única dose de MeHg foi capaz de perturbar mecanismos celulares essenciais causando redução na espessura das camadas da medula espinhal. Do ponto de vista toxicológico, estes resultados são importantes porque mostram que a exposição ao MeHg, in ovo, altera a medula espinhal em desenvolvimento e pode levar a possíveis comprometimentos neuromotores na vida pós-natal.<br> / Abstract : The neurotoxic effects of methylmercury (MeHg) are well known, but more detailed information on its action during embryonic development are still scarce. This study aimed to characterize the effects of MeHg on the ultrastructural organization and on the molecular and cellular mechanisms involved in the development of spinal cord layers, using Gallus domesticus embryos as a model. At third embryonic day (E3), the embryos were treated in ovo with a single dose of methylmercury chloride (ClMeHg) (0.1 µg diluted in 50 µL saline) and evaluated at the tenth embryonic day (E10). The morphological and morphometric analyses of the spinal cord were taken from histological sections stained with HE. The localization and quantification of the cell cycle related and DNA damage markers were performed by immunohistochemistry and flow cytometry techniques. Additionally, TUNEL assay was used to apoptosis identification and transmission electron microscopy was conducted to investigate ultrastructural damage. Our results showed significant mercury deposition in the three spinal cord layers, which had alterations in expression of markers related to cell cycle control, proliferation and cell death. The increased number of ?H2A.X-positive cells observed in the mantle layer indicates DNA damage, which may be the cause of the p21 expression increased and consequent cell cycle arrest in G1 phase. The MeHg exposure also caused changes on subcellular components of spinal cord cells, mainly in mitochondria that showed swelling and membrane disruptions, beyond the appearance of unusual cup-like and donut-like shapes. These damage may be associated with increased cell death in the mantle layer, which appears to be the most affected layer after the MeHg exposure. The decreased cell proliferation associated to the increased cell death showed that a single dose of MeHg was able to disrupt essential cellular mechanisms, causing reduction in thickness of the spinal cord layers. From a toxicological point of view, these results are important because showed that in ovo MeHg exposure changes the developing spinal cord and can leads to potential neuromotor impairments in the postnatal life.
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Análise ultraestrutural e imunocitoquímica da espermatogênese e nucleologênese de morcegosBeguelini, Mateus Rodrigues [UNESP] 24 February 2012 (has links) (PDF)
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Previous issue date: 2012-02-24Bitstream added on 2014-06-13T20:23:17Z : No. of bitstreams: 1
beguelini_mr_dr_sjrp.pdf: 10547972 bytes, checksum: 5fe07f81786d89dcc58fd9087fe7965c (MD5) / Embora o processo de reprodução tenha sido objeto de estudo em muitos mamíferos, relativamente pouca atenção tem sido dada a esse estudo em morcegos, apesar dessa ser uma grande e diversa classe de organismos, que apresenta diferentes estratégias reprodutivas para ajustar esses animais às várias condições ecológicas e comportamentais as quais estão submetidos. Da mesma forma, em geral todas as observações sobre o ciclo nucleolar foram feitas a partir da análise de células mitóticas. Assim, o intuito do presente estudo foi analisar características reprodutivas e do ciclo nucleolar meiótico de espécies de morcegos Neotropicais. No epitélio seminífero, três tipos de espermatogônias foram reconhecidos: Ad, Ap e B. Essas após entrarem em meiose, passam por duas divisões celulares e formam espermátides haplóides, que sofrem diferenciação, compactando seu DNA, alongando seu núcleo e formando o flagelo e acrossomo, num processo que, em microscopia eletrônica de transmissão, pode ser dividido em doze fases. Observamos que o processo de espermiogênese ocorre de forma semelhante em Platyrrhinus lineatus, Molossus molossus e Myotis nigricans e que os espermatozóides de P. lineatus e M. molossus apresentam semelhanças, como o formato mais alongado da cabeça, a presença do perforatorium e espessamentos nas fibras densas externas 1, 5 e 6. Por outro lado, M. nigricans apresenta a ausência de perforatorium e espessamentos nas fibras axilares 1, 5, 6 e 9. Comparando os padrões reprodutivos de Artibeus planirostris e M. nigricans, observamos que, apesar de ambos serem espécies Neotropicais, eles diferem acentuadamente em sua reprodução. Artibeus planirostris apresenta um perfil de espermatogênese ativo durante todo o ano, possivelmente apresentando um padrão poliéstrico... / Although the process of reproduction has been studied in many mammals, relatively little attention has been given to this study in bats, this large and diverse order of organisms, which presents different reproductive strategies to adjust the animals to various environmental conditions and behaviors that they are inserted. Likewise, in general all studies on the nucleolar cycle were made based on the analysis of mitotic cells. Thus, the purpose of this study was to analyze the reproductive characteristics and the nucleolar meiotic cycle of Neotropical bat species. In the seminiferous epithelium, three types of spermatogonia were recognized: Ad, Ap and B. These, after enter in meiosis, undergo two cell divisions to form haploid spermatids, which undergo differentiation, compressing their DNA, stretching its nucleus and forming the acrosome and flagellum, a process that, in transmission electron microscopy, can be divided into twelve stages. We note that the process of spermiogenesis occured similarly in Platyrrhinus lineatus, Molossus molossus and Myotis nigricans and that the spermatozoon of P. lineatus and M. molossus have similarities, as the more elongated shape of the head, the presence of perforatorium and thickening in the outer dense fibers 1, 5 and 6. On the other hand, M. nigricans did not present the perforatorium and the thickening was presented in the fibers 1, 5, 6 and 9. Comparing the reproductive patterns of Artibeus planirostris and M. nigricans, we observed that, although both are Neotropical species, they differ markedly in their reproduction. Artibeus planirostris presents an active pattern of spermatogenesis throughout the year, possibly exhibiting a polyestral bimodal pattern, with two pronounced peaks of spermatogenic production, one in September and another in February. On the other... (Complete abstract click electronic access below)
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Perda da tolerância à dessecação em sementes de tento-carolina (Adenanthera pavonina L.) durante a germinação / Loss of desiccation tolerance in germinating Adenanthera pavonina seedsSoares, Giuliana Cristina Mourão 16 February 2012 (has links)
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Previous issue date: 2012-02-16 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / On germination, orthodox seeds become intolerant of desiccation. In this condition, these seeds may be a useful model for studies of recalcitrance, in order to elucidate structural and biochemical attributes associated with desiccation sensitivity. Here, we evaluated the loss of desiccation tolerance (DT) in Adenathera pavonina germinating seeds, by following the ability of seeds to germinate after desiccation following various periods
of preimbibition. DT was progressively lost during germination, and seeds with radicle length of 1 mm did not withstand drying up to 13% of moisture content. By the rates of electrolyte leakage, it was observed that membrane system was damaged when 60-hour imbibed seeds were dried. It was also observed that dehydration decreased the activity of superoxide dismutase, however catalase, peroxidase and ascorbate peroxidase activities remained unchanged. Three groups of heat shock proteins were detected in fresh seeds, but with the progress of germination the number and intensity of its bands declined. Relative DNA content assessment was done by flow citometry. These analyses showed that the resumption of cell cycle coincided with the complete los of DT. / Ao longo da germinação, sementes ortodoxas tornam-se intolerantes a dessecação e, por isso, têm sido utilizadas em estudos que tentam elucidar as alterações bioquímicas e estruturais associadas com a sensibilidade à dessecação. O presente estudo teve como objetivo avaliar a perda da tolerância à dessecação (TD) durante a germinação de sementes ortodoxas da espécie Adenanthera pavonina, através da sobrevivência das sementes após a secagem realizada em seguida de diferentes períodos de pré-embebição. A TD foi gradativamente perdida ao longo da germinação, de modo que sementes com raiz primária com 1 mm de comprimento não sobreviveram após sua secagem até o grau de umidade inicial (13%). Pelas taxas de extravasamento de eletrólitos verificou-se que o sistema de membranas de sementes em estágio avançado de germinação (60 horas) foi comprometido após a secagem. Também foi observado que as atividades das enzimas catalase, peroxidase e peroxidase do ascorbato não foram tão prejudicadas após a secagem quanto a enzima dismutase do superóxido. Em sementes frescas foram detectadas três classes de proteínas resistentes ao calor e houve redução na intensidade de suas bandas com o avanço da germinação. O conteúdo relativo de DNA nuclear foi analisado por citometria de fluxo, e verificou-se que a retomada do ciclo celular coincidiu com a completa perda da TD.
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PCL-1, uma ciclina multifuncional envolvida na regulação do metabolismo do glicogênio, germinação, divisão celular e na resposta ao estresse por cálcio em Neurospora crassa / PCL-1, a multifunctional cyclin involved in regulation of glycogen metabolism, germination, cell division and response to stress by calcium in Neurospora crassaCandido, Thiago de Souza [UNESP] 15 September 2016 (has links)
Submitted by THIAGO DE SOUZA CANDIDO null (thiago.s.candido@gmail.com) on 2016-09-30T14:48:19Z
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Tese Thiago de Souza Candido.pdf: 8667516 bytes, checksum: a5ceff1a03a2f39c134a0633e677f4df (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br) on 2016-10-04T14:33:04Z (GMT) No. of bitstreams: 1
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Previous issue date: 2016-09-15 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O fungo Neurospora crassa tem sido amplamente usado como um organismo modelo para os aspectos fundamentais da biologia dos eucariotos. Neste trabalho, foi investigado o papel funcional de uma ciclina de N. crassa (PCL-1), codificada pela ORF NCU08772 e ortóloga a Pcl10 de Saccharomyces cerevisiae. Na levedura, a proteína Pcl10, em conjunto com a proteína quinase dependente de ciclina Pho85, fosforila a enzima glicogênio sintase, a enzima regulatória da síntese de glicogênio. A fosforilação resulta na inativação da enzima e, portanto, em diminuição do acúmulo de glicogênio. A linhagem pcl-1 de N. crassa apresentou um atraso na germinação dos conídios e um retardo na progressão do ciclo celular quando comparado com a linhagem selvagem, sugerindo que esta ciclina pode regular o desenvolvimento e a divisão celular. Além disto, a linhagem nocauteada acumulou níveis mais elevados de glicogênio que a linhagem selvagem indicando o papel na regulação do metabolismo deste carboidrato. A fosforilação da enzima glicogênio sintase de N. crassa (GSN) foi analisada na linhagem nocaute através de análises de atividade enzimática, e os resultados mostraram que a GSN apresentou baixo índice de fosforilação, portanto alta atividade durante o crescimento, um resultado que pode explicar o alto acúmulo de glicogênio observado. Este resultado foi confirmado por análise de 2D-PAGE seguida por western blot, utilizando anticorpos anti-GSN. GSN apresentou na linhagem mutante isoformas menos fosforiladas que a enzima presente na linhagem selvagem. As proteínas recombinantes PHO85, PCL-1 foram utilizadas em ensaios de fosforilação in vitro da enzima GSN e os resultados mostraram que a enzima GSN foi fosforilada pelo complexo PHO85/PCL-1 no sítio putativo Ser636. O papel da ciclina na resposta ao cálcio foi investigado, e os resultados mostraram que a linhagem pcl-1 mostrou uma resistência ao estresse provocado por altas concentrações de cálcio quando comparada com a linhagem selvagem. Análises de expressão gênica por RT-qPCR foram realizadas e a linhagem pcl-1 mostrou estar envolvida na regulação de genes do metabolismo do cálcio. Os resultados indicam que a proteína PCL1 de N. crassa pode ser uma ciclina multifuncional e pode estar envolvida na regulação de vários processos celulares essenciais dependendo do ambiente. / The fungus Neurospora crassa has been widely used a model organism for the fundamental aspects of eukaryotes biology. This work investigated the functional role of a N. crassa cyclin (PCL-1), encoded by the ORF NCU08772, and orthologous to the Saccharomyces cerevisiae Pcl10 cyclin. In yeast, Pcl10 protein, together with the Pho85 cyclin-dependent protein kinase, phosphorylates the glycogen synthase enzyme, the regulatory enzyme in glycogen synthesis. Phosphorylation results in enzyme inactivation and therefore in decreased glycogen accumulation. The N. crassa pcl-1 strain showed a delay in conidia germination and in the progression of the cell cycle compared to the wild-type strain, suggesting that the cyclin may regulate development and cell division. Furthermore, the mutant strain accumulated higher glycogen levels than wild-type strain indicating its role in the regulation of the carbohydrate metabolism. The phosphorylation rate of the N. crassa glycogen synthase (GSN) was analyzed in the mutant strain by enzymatic activity assays, and the results showed that GSN was less phosphorylated during growth; therefore, high activity, and this result may explain the high glycogen accumulation observed in the mutant strain. This result was confirmed by 2D-PAGE gels followed by western blot using anti-GSN antibodies. The GSN isoforms presented in the mutant strain were less phosphorylated than the enzyme present in the wild-type strain. The recombinant proteins PHO85 and PCL-1 were used in in vitro phosphorylation assays of GSN enzyme, and the results showed that the enzyme was phosphorylated by the PHO85/PCL-1 complex at the putative site Ser636. The role of the cyclin in the response to calcium was investigated, and the results showed that the pcl-1 strain is more resistant than the wild-type strain to the stress caused by high calcium concentration. Gene expression analysis by RTqPCR was performed to analyze genes involved in calcium metabolism, and the pcl-1 strain showed to regulate the expression of some calcium metabolism genes. The results indicate that the N. crassa PCL1 cyclin may be multifunctional and may be involved in the regulation of several cellular processes depending on the environment. / FAPESP: 2012/08652-4
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Efeito das isoflavonas da soja daidzeína e genisteína em células MCF-7, HB4 e OVCAR-3 : estudo da citotoxicidade, indução de apoptose, cinética de proliferação celular e expressão gênica /Tsuboy, Marcela Stefanini Ferreira. January 2012 (has links)
Orientador: Lúcia Regina Ribeiro / Coorientador: Mário Sérgio Mantovani / Banca: Maria Izabel Camargo Mathias / Banca: Lusânia Maria Greggi Antunes / Banca: Verônica Elisa Pimenta Vicentini / Banca: Silvana Pedroso de Goes Favoni / Resumo: Atualmente, principalmente devido aos avanços na área de Nutrigenômica, sabe-se que a dieta tem grande influência na saúde e bem estar das pessoas. Uma dieta adequada pode contribuir para a prevenção de diversas doenças crônicas, dentre elas, o câncer. Estudos epidemiológicos apontam que as populações de países asiáticos sofrem menos com estas doenças, e o alto consumo de soja (e suas isoflavonas daidzeína e genisteína) está associado a este fato. As isoflavonas da soja daidzeína e genisteína possuem grande potencial de prevenção do câncer, uma vez que muitos estudos já demonstraram que elas interferem em diversos estágios do processo de carcinogênese. A modulação da proliferação e morte celular é um dos efeitos quimiopreventivos das isoflavonas mais investigados, porém a maioria dos estudos utiliza-se de concentrações fisiologicamente irrelevantes, ou seja, concentrações que não são encontradas no organismo humano. Portanto, o objetivo do nosso estudo foi analisar os efeitos da máxima concentração fisiologicamente relevante dessas isoflavonas em células humanas in vitro. Três linhagens celulares foram utilizadas: MCF-7 (tumoral de mama), HB4a (não tumoral de mama) e OVCAR-3 (tumoral de ovário). O efeito citotóxico, a expressão gênica (CASP-3, CASP-7, BAX, BCL-xL e COX-2) e a indução de apoptose foram investigadas nas três linhagens celulares. Além disso, foi estudado o efeito das isoflavonas sobre o ciclo celular das linhagens MCF-7 e HB4a. Somente uma concentração alta de genisteína (100 μM) após 72h de tratamento induziu citotoxicidade na linhagem OVCAR-3. Ambas as isoflavonas em concentração de 10 μM não induziram apoptose nesta linhagem, e a expressão dos genes analisados não mudou significativamente frente ao tratamento com daidzeína ou genisteína. O tratamento das... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Nowadays, mainly because of Nutrigenomics advances, it is known that diet has a major influence on health and welfare of people. A proper diet can contribute to the prevention of several chronic diseases, including cancer. Epidemiological studies indicate that Asian populations suffer less from these diseases, and high intake of soy (and its isoflavones daidzein and genistein) is associated with this fact. The soy isoflavones daidzein and genistein have great potential for cancer prevention, since many studies have shown that they interfere with several stages of carcinogenesis. Modulation of cellular proliferation and death is one of the most investigated chemopreventive effects of isoflavones, but in most of the studies, physiological irrelevant concentrations are used, i.e., concentrations that are not found in human body. The objective of our study was to analyze the effects of maximal physiological relevant concentration of these isoflavones in in vitro human cell lines. Three cell lineages were used: MCF-7 (from breast carcinoma), HB4a (breast non-tumoral cell) and OVCAR-3 (from ovarian carcinoma). Cytotoxic effect, gene expression (CASP-3, CASP-7, BAX, BCL-xL and COX-2) and induction of apoptosis were investigated in all cell lines. In addition, it was studied the effect of the isoflavones on the cell cycle of MCF-7 and HB4a. Only the highest concentration of genistein (100 μM) was cytotoxic to OVCAR-3 after 72 hours of treatment of the cells. Both isoflavones at 10 μM did not induce apoptosis in this cell line and expression of the studied genes did not change in front of daidzein or genistein treatment. Daidzein treatment of HB4a cells was not cytotoxic in none of the experimental conditions. Daidzein 10 or 25 μM also was not able to induce apoptosis or to arrest cell cycle of nontumoral HB4a. Also in this lineage, concentration of 10... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor
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Análise de redes de interações entre drogas quimioterápicas usadas no tratamento de câncer gástrico : explorando proteínas e processos biológicos por meio de ferramentas de farmacologia de sistemasRosado, Joemerson Osório January 2010 (has links)
O câncer gástrico está entre as neoplasias com a mais alta mortalidade no mundo, sendo que as modalidades de tratamento envolvem a cirurgia, a quimioterapia e também a radioterapia. Na quimioterapia, o uso de drogas isoladas ou em conjunto enfrenta um dilema frequente nesta patologia: a quimiorresistência. Assim, torna-se essencial, na clínica, a necessidade de encontrar novos compostos ou alvos protéicos que sejam capazes de manter uma resposta por longos períodos de tempo de tratamento. Dessa forma, este estudo utilizou ferramentas de farmacologia de sistemas, avaliando as interações entre proteínas e pequenos compostos a partir de dados proteômicos já existentes para a espécie humana. Neste contexto, as drogas estudadas foram o 5-fluorouracil, a Capecitabina, a Oxaliplatina, o Irinotecan e o Docetaxel. Uma rede de interações entre proteínas (physical protein-protein interactions; PPPI) e proteínas-quimioterápico (physical compound-protein interaction; PCPI) foi obtida, seguida da definição de cinco sub-redes, representando os diferentes processos biológicos observados. Além disso, foram empregadas análises de centralidade para buscar os principais componentes da rede e as suas interações, denominados de gargalos (bottlenecks), os quais regulam o fluxo de informação dentro da rede. Assim, o estudo demonstrou que as drogas atualmente em uso clínico convergem para processos biológicos semelhantes, o que explicaria o desenvolvimento de quimiorresistência a médio e longo prazo. Além disso, foram identificados sete novos gargalos, que representam novos alvos de proteínas e pequenos compostos capazes de interferir no controle e na comunicação entre outros vértices na própria rede. Esses dados poderão ser utilizados no desenvolvimento de novas combinações de drogas com o objetivo de melhorar os protocolos utilizados no tratamento quimioterápico do câncer gástrico. / Gastric cancer is among the cancers with the highest mortality in the world, and treatment modalities involve surgery, chemotherapy and radiotherapy. In chemotherapy, the drugs alone or in combination face a dilemma common in this disease: the chemoresistance. Thus, it becomes essential in the clinic, the need to find new protein target or compounds that are capable of maintaining a response for long periods of treatment. Thus, this studied used tools of systems pharmacology, evaluating the interactions between proteins and small compounds from existing proteomic data for the human species. In this context, the study drugs were 5-fluorouracil, capecitabine, oxaliplatin, irinotecan and docetaxel. A network of protein interactions and protein-chemotherapy (PPPI-PCPI, respectively) was obtained, followed by the definition of five sub-networks, representing different biological processes observed. Moreover, centrality analysis were used to search the main network components and their interactions, called bottlenecks , which regulate the flow of information within the network. Thus, the study showed that the drugs currently in clinical use converge to similar biological processes, which would explain the development of chemoresistance in the medium and long term. Furthermore, we identified seven new bottlenecks that represent new target proteins and small compounds able to interfere in the control and communication between other nodes in the network itself. These data could be used to develop new combinations of drugs with the aim of improving the protocols used in chemotherapy of gastric cancer.
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Avaliação do potencial antagonista da interação p53-MDM2 do composto LQFM030 frente à linhagem tumoral K562 / Evaluation of the potential antagonist p53-MDM2 interaction of compound LQFM030 against tumor strain K562Ribeiro, Higor de Oliveira 12 December 2016 (has links)
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Previous issue date: 2016-12-12 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Goiás - FAPEG / The cancer encompasses a huge range of different types, requiring several therapeutic approaches for control and/or remission. An approach that has been considered quite promising is the inhibition of the formation of the MDM2/p53 complex. The formation of this complex hinders the triggering of the apoptotic process. The example of the Nutlins, inhibitors of this complex, have stood out as promising prototype drugs and are already in the clinical phase of investigation. The compound LQFM030 originated from the molecular simplification of Nutlin-1, which has already demonstrated antitumor activity against the Ehrlich Ascites Tumor model. In this work, we investigated the cytotoxic effect of compound LQFM030 against the K562 leukemic line, as well as some mechanisms of cytotoxicity. In the evaluation of cytotoxicity using the trypan blue exclusion method, we obtained an IC 50 value of 0.56 mM, similar to results obtained previously. For the other mechanics assays, IC25 (0.283 mM) of compound LQFM030 and 0.01 mM of compound Nutlin-3a were used for treatment for 24 hours. The compound Nutlin-3a was used as the standard for comparison. Morphological analyzes of K562 cells after treatment with compound LQFM030 suggest core fragmentation and chromatin condensation, indicating apoptosis triggered cell death, which was confirmed by flow cytometric analyzes. In cell cycle investigation, LQFM030 treated K562 cells demonstrated increased sub-G1 phase, phosphatidylserine exposure, decreased membrane potential, increased expression of TNF-R1 and caspase -3/7 caspase -9; However, there was a decrease in caspase -8. In turn, the treatment of leukemic cells with Nutlin-3a did not promote changes in the cell cycle, exposure of phosphatidylserine corroborating with data from the literature. In conclusion the studied compound, LQFM030, presented important biological activity with the capacity to induce death in leukemic cells by apoptotic mechanisms and interaction with MDM2 and MDX. The compound presented mechanisms in some aspects similarities to Nutlin-3a, but also showed different mechanisms evidencing its versatility in its biological performance. The discovery of new agents with multiple mechanisms is of great importance to increase the therapeutic armamentarium of cancer in a complementary way and, in addition, it can enhance the effectiveness of the treatment. / O câncer engloba uma variedade enorme de tipos diferentes, sendo necessárias diversas abordagens terapêuticas para controle e/ou remissão. Uma abordagem considerada bastante promissora é a inibição da formação do complexo MDM2/p53. A formação deste complexo dificulta o desencadeamento do processo apoptótico. Já se encontra em fase clínica de investigação um exemplo promissor inibidor deste complexo, os Nutlins. O composto LQFM030 foi originado a partir da simplificação molecular do Nutlin-1, o qual já demonstrou atividade antitumoral contra o modelo do Tumor Ascitico de Ehrlich. Neste trabalho, investigamos mecanismos de citotoxicidade do composto LQFM030 na linhagem leucêmica K562. Na avaliação da citotoxicidade utilizando o método de exclusão do azul de tripano, obtivemos um valor de IC50 de 0,56 mM, similar a resultados obtidos anteriormente. Para os demais ensaios mecanisticos, foi utilizado o IC25 (0,283 mM) do composto LQFM030 e 0,01 mM do composto Nutlin-3a, para tratamento por 24 horas. O composto Nutlin-3a foi utilizado como padrão de comparação. As análises morfológicas das células K562 após o tratamento com o composto LQFM030 demonstrou fragmentação do núcleo e a condensação da cromatina, indicando morte celular desencadeada por apoptose, onde juntamente com citometria de fluxo indicam um processo de morte celular. Na investigação do ciclo celular, as células K562 tratadas com LQFM030 demonstraram um aumento da fase sub-G1, exposição da fosfatidilserina, diminuição do potencial de membrana mitocondrial, aumento da expressão de TNF-R1, caspases -3/7 e caspase -9; contudo, houve diminuição da caspase -8. Por sua vez, o tratamento das células leucêmicas com o Nutlin-3a não promoveu alterações no ciclo celular, exposição de fosfatidilserina corroborando com dados da literatura. Em conclusão o composto estudado, LQFM030, apresentou atividade biológica importante com capacidade de induzir morte em células leucêmica por mecanismos apoptoticos e interação com MDM2 e MDMX. O composto apresentou mecanismos em alguns aspectos semelhanças ao Nutlin-3a, porém também mostrou mecanismos distintos evidenciando a sua versatilidade em sua atuação biológica. A descoberta de novos agentes com múltiplos mecanismos é de grande importância para aumentar o arsenal terapêutico de combate ao câncer de forma complementar e, podendo ainda potencializar eficácia do tratamento.
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