A criptosporidiose já foi descrita em várias espécies animais, incluindo várias espécies de aves. É considerada uma das principais infecções por protozoários em aves das ordens Anseriformes, Charadriformes, Columbiformes, Galliformes, Passeriformes, Psittaciformes e Struthioniformes. Três espécies de Cryptosporidium infectam aves: Cryptosporidium baileyi, Cryptosporidium galli e Cryptosporidium meleagridis, além de vários genótipos distintos geneticamente, como os genótipos I, II, III, IV e V de aves. Cryptosporidium galli e Cryptosporidium genótipo III de aves estão relacionados com infecções crônicas no proventrículo, de forma semelhante à infecção por Cryptosporidium serpentis, em serpentes. Vários métodos de diagnóstico são utilizados para detecção do parasito, mas somente aqueles com base em biologia molecular são capazes de determinar a espécie de Cryptosporidium. O projeto teve com objetivo o desenvolvimento da PCR duplex em tempo real, tendo como alvo o gene da subunidade 18S do rRNA, por meio de ensaio TaqMan, para detecção de DNA de C.galli e Cryptosporidium genótipo III de aves, e avaliar os atributos diagnósticos da PCR duplex em tempo real quando comparada à nested PCR, utilizando 1027 amostras fecais de aves das ordens Passeriformes e Psittaciformes. A PCR duplex em tempo real apresentou positividade em 580/1027 (56,47%) para C. galli, enquanto que a nested PCR resultou em positividade para Cryptosporidium spp. em 104/1027 (10,13%) amostras. Para Cryptosporidium genótipo III de aves, houve positividade em 21/1027 (2,04%). A PCR duplex em tempo real resultou em alta especificidade analítica quando foram utilizadas amostras de DNA de outras espécies e genótipos de Cryptosporidium. A única exceção foi a amplificação de DNA de C. serpentis, com a utilização de primers e sonda para detecção de Cryptosporidium genótipo III de aves, porém, com uma baixa eficiência de amplificação. Foram identificados novos hospedeiros aviários para ambas as espécies gástricas, assim como foi possível a identificação de C. baileyi e, pela primeira vez no Brasil, de Cryptosporidium genótipo V de aves. Conclui-se que a PCR duplex em tempo real desenvolvida neste estudo é um recurso que apresenta rapidez e confiabilidade para diagnóstico de criptosporidiose gástrica em aves / Cryptosporidiosis has been described in several animal species, including many species of birds, and is considered a major protozoan infection of the orders Anseriformes, Charadriformes, Columbiformes, Galliformes, Passeriformes, Psittaciformes and Struthioniformes. Three species of Cryptosporidium are valid in birds: Cryptosporidium baileyi, Cryptosporidium meleagridis and Cryptosporidium galli; beside these species, there are several genotypes genetically distinct, as avian genotypes I, II, III, IV and V. Cryptosporidium galli and Cryptosporidium avian genotype III are related to chronic infections in proventriculus, similar to Cryptosporidium serpentis infection in snakes. Several methods are used for cryptosporidiosis diagnosis, but only those based on molecular biology are able to determine the Cryptosporidium species and genotypes. The aim of this project was the development of a duplex real-time PCR targeting 18S subunit of rRNA gene, by TaqMan assay, to detect DNA of C. galli and Cryptosporidium avian genotype III, and to evaluate the diagnostic attributes of the duplex real-time PCR compared to nested PCR, using 1027 fecal samples from birds of the orders Passeriformes and Psittaciformes. The duplex real time PCR showed positivity in 580/1027 (56.47%) for C. galli, whereas nested PCR was positive for Cryptosporidium spp. in 104/1027 (10.13%) samples. For Cryptosporidium avian genotype III, there was positivity in 21/1027 (2.04%) samples. The duplex real time PCR resulted in high analytical specificity when tested using DNA samples from other Cryptosporidium species and genotypes. The only exception was the amplification of DNA from C. serpentis with primers and probe for the detection of Cryptosporidium avian genotype III, although with lower efficiency. New avian hosts were identified for both gastric species, as well as it was possible to identify C. baileyi and, for the first time in Brazil, Cryptosporidium avian genotype V. It was concluded that the duplex real time PCR developed in this study is a fast and reliable tool for diagnosis of gastric cryptosporidiosis in birds.

Orientador: Ana Maria Aparecida Guaraldo / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-10T21:54:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Britto_MariaHelenaSeabraSoaresde_D.pdf: 1915996 bytes, checksum: 263b368c6fc66874e6b4cc046dda0817 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: O gênero Cryptosporidium compreende atualmente 16 espécies, que já foram encontradas parasitando mais de 150 espécies animais, incluindo o homem, no qual já foram referidas infecções causadas por sete delas. O Cryptosporidium parvum é o mais estudado porque é responsabilizado pelo caráter zoonótico da infecção. A espécie responsável pelo caráter antroponótico da criptosporidiose é o Cryptosporidium hominis. Embora já tenha sido descoberto há cem anos e mesmo com o avanço da genômica e biologia molecular, ainda existem muitas dúvidas sobre sua taxonomia, biologia e relação com seus variados hospedeiros. Dados na literatura apontam para a necessidade urgente da definição de modelos experimentais para cultivo de linhagens do parasito ¿in vivo¿ e ¿in vitro¿. As pesquisas ¿in vivo¿ esbarram na dificuldade da utilização de grande número de animais certificados do ponto de vista genético e sanitário e mantidos em ambientes controlados. Por outro lado, os métodos de cultivo ¿in vitro¿ têm-se mostrado de difícil reprodutibilidade, pois a grande variabilidade de linhagens celulares, com diferentes origens, cultivadas em diferentes meios, em condições ambientais diversas, tornam bastante controversos os resultados obtidos nessa área. Neste trabalho apresentamos o cultivo de uma cepa de origem humana de Cryptosporidium sp, de um único paciente portador de HIV/aids, com criptosporidiose, denominada de MMC/Uni, mantida pela infecção por tubagem intra-gástrica de 105 oocistos em camundongos neonatos livres de patógenos específicos (SPF) de linhagens, heterogênicas e isogênicas imunocompetentes e imunodeficientes , mantidos durante todo o experimento em isolador de PVC flexível. Oocistos da cepa MMC/Uni de Cryptosporidium sp foram purificados mediante gradiente de sacarose. Após excistação, foram cultivados em monocamadas da linhagem celular MDBK (Madin-Darby Bovine Kidney). A presença de merontes foi constatada após 90 horas de cultivo. A cepa MMC/Uni de Cryptosporidium sp, de origem humana, permaneceu infectante após 16 meses, sob refrigeração a 4°C, em solução de Dicromato de Potássio a 2,5% e manteve a infectividade de camundongos após 10 meses de congelamento em DMSO a - 70ºC / Abstract: Cryptosporidium covers actually 16 species, that have been found infecting more then 150 animal species, including humans, in wich have already been reported infections caused by seven of them. Cryptosporidium parvum is the most studied, due to be responsible by the zoonotic character of the infection. The specie responsible by the anthroponotic character of the criptosporidiosis is Cryptosporidium hominis. Although it has been discovered a hundred years ago, and even with the advances in genomics and molecular biology, still persists many doubts about its taxonomy, biology and the relations with its many different hosts. Data in literature point toward the urgent need in the definition of experimental models to cultivate strains of the parasite ¿in vivo¿ and ¿in vitro¿. The research ¿in vivo¿ faces the difficulty in the use of a great number of certificated animals, in the point of genetic and sanitary view, kept in controlled environment. In the other hand, ¿in vitro¿ culture methods have shown to be of difficult reproductibility, for the great variability of the cellular strains, with different origins, kept in different breeding media, in diverse environmental conditions, turn out of great controversy the results found in this area. Here we present a strain of Cryptosporidium sp, from human origin, taken from an unique HIV/aids patient with criptosporidiosis, named as MMC/Uni, kept by a intragastric tubage infection of 105 oocysts in Specific Pathogen-Free (SPF) neonates from outbred and inbred immunocompetent or immunodeficient mice strains, kept during the entire experiment in an isolator of flexible PVC. Oocists of MMC/Uni strain of Cryptosporidium sp were purified by sucrose gradient. After excistation, they were cultivated in MDBK (Madin-Darby Bovine Kidney) cells monolayers. The presence of meronts was observed after 90 hours of cultivation. The strain MMC/Uni of Cryptosporidium sp, from human origin, remained infectant after 16 months, under refrigeration at 4°C, in a 2.5% solution of Potassium Dichromate, and maintened infectiveness in mouse, after 10 months of freezing in DMSO at -70ºC / Doutorado / Doutor em Parasitologia

Made available in DSpace on 2014-06-12T23:01:24Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo8552_1.pdf: 533604 bytes, checksum: a260b9f76c8b82b2713fa5d4b3ad9d38 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2006 / A água doce é um recurso natural finito, cuja qualidade vem decaindo devido ao aumento da população e à deficiência de políticas públicas voltadas para a sua preservação. A rota de transmissão ambiental para protozoários e helmintos é particularmente significativa e envolve a água, o solo e o alimento. A partir da década de 1980, acrescentou-se a preocupação quanto à ocorrência de protozoários patogênicos tais como Cryptosporidium spp. e Giardia spp., em resposta ao crescente número de surtos envolvendo um grande número de pessoas, estando relacionados ao consumo de água e à ineficiência do tratamento aplicado na remoção de cistos e oocistos nas Estações de Tratamento de Água (ETA). No Brasil foi instituído a partir de 2003 o Sistema de Informação de Vigilância da Qualidade da Água de Consumo Humano (SISAGUA), instrumento de coleta de análises de dados a ser desenvolvido em âmbito nacional pelas áreas de vigilância ambiental em saúde, visando à garantia da qualidade da água distribuída à população. O presente estudo teve como objetivo detectar a presença de enteroparasitas, com ênfase em Cryptosporidium spp. em amostras de água consumida por parte da população do Distrito Sanitário VI, na cidade do Recife. As amostras foram coletadas em pontos considerados como início, meio e fim da rede de distribuição. A metodologia de sedimentação espontânea foi utilizada para pesquisa de enteroparasitas e outros organismos. Para a detecção de Cryptosporidium spp., utilizouse o método de concentração de oocistos através de membrana filtrante, seguido da identificação e contagem de estruturas álcool-ácido resistentes através da coloração histoquímica de Kinyoun. Como ensaios confirmatórios para Cryptosporidium spp., foram utilizadas as metodologias de Ensaio Imunoenzimático e Imunofluorescência Direta. Os parâmetros físico-químicos e microbiológicos foram avaliados de acordo com os padrões da Portaria nº 518/04/MS. Em 95,56% (86/90) das amostras de água, analisadas neste estudo foram encontrados organismos como: oocistos Cryptosporidium spp. (15,55%), cistos de Giardia spp. (3,85%), além de ovos de helmintos (47,78%), larvas de nematóides (28,78%) e organismos do zooplâncton (84,44%). Conclui-se que existe vulnerabilidade nos processos de tratamento da água para consumo humano, principalmente na etapa da filtração, que deveria ser eficiente na remoção física de partículas, com especial atenção aos organismos patogênicos e que a qualidade da água está comprometida desde a saída da ETA até o ponto de consumo. Torna-se necessário intensificar a vigilância em saúde ambiental relacionada à qualidade da água para consumo humano, garantindo que a água não ofereça riscos a saúde da população

Cryptosporidium é um coccídeo que acomete peixes, répteis, anfíbios, aves e mamíferos. O papel dos animais na dinâmica de transmissão deste agente ao homem é pouco conhecido e a ocorrência na população animal é motivo de preocupação para a saúde pública, devido ao potencial zoonótico. O objetivo deste estudo foi obter informações de natureza epidemiológica pela caracterização genotípica de isolados de gatos, cães e bovinos do Estado de São Paulo e avaliar a diversidade nucleotídica das seqüências obtidas. Foi realizada a extração de DNA dos oocistos e a amplificação destes pela reação em cadeia da polimerase (Nested PCR) utilizando primers específicos para a amplificação de fragmentos do gene codificador da subunidade 18S do RNA ribossômico e posterior sequenciamento. Através do exame de fezes de 106 amostras de felinos, 119 de caninos e 123 de bovinos foi observada positividade em três (2,8%), 15 (12,6%) e 21 (17,1%), respectivamente. Nas amostras positivas de bovinos a análise morfológica revelou 16 (76,2%) como Cryptosporidium tipo parvum e cinco (23,8%) como Cryptosporidium andersoni. Para a análise genotípica amostras anteriormente obtidas, foram associadas, sendo analisadas sete amostras de gatos, nove de cães e nove de bovinos. Das sete amostras de gatos a análise genotípica revelou, em todas, Cryptosporidium felis, sendo estas as primeiras caracterizações genotípicas de isolados de felinos domésticos no Brasil. Nas nove amostras de cães seqüenciadas revelou-se identidade genotípica compatível com Cryptosporidium canis em todas as amostras, sugerindo que esta espécie está conservada no Estado de São Paulo. A análise genotípica das amostras de bovinos revelou Cryptosporidium parvum Eire I em duas amostras, Cryptosporidium parvum genótipo bovino em seis amostras e Cryptosporidium bovis em outra amostra sendo, esta última espécie, não zoonótica, e não relacionada a sintomas clínicos e sendo descrita pela primeira vez no Brasil. / Cryptosporidium is a coccidia which contaminates fish, reptiles, amphibians, birds and mammals. The animals role in the transmission dynamics of this protozoa to man is not well known and its occurrence in the animal population is a cause for concern to public health due to its zoonotic potential. The objective of this study was to obtain information of epidemiological nature by genotypic characterization of isolates from dogs, cats and bovine from the State of São Paulo and to evaluate nucleotidic diversity of the existing sequences. The extraction of DNA from oocysts was carried out and the amplification was made by the polymerase chain reaction (Nested PCR) using specific primers for the amplification of fragments from the code gene of subunit 18S of ribosomal RNA and post sequencing. Through a feces examination, in 106 cat samples, 119 dog samples and 123 bovine samples, positivity was observed in three (2.8%), 15 (12.6%) and 21 (17.1%), respectively. In the positive bovine samples the morphologic analysis revealed 16 (76.2%) as Cryptosporidium type parvum and five (23.8%) as Cryptosporidium andersoni. For the purpose of genotypic analyses, previously obtained samples, were associated, with analyses of seven cat samples, nine dog samples and nine bovine samples. From the seven cat samples the genotypic analyses, revealed Cryptosporidium felis in all. These were the first genotypic characterizations of Cryptosporidium from domestic felines in Brazil. In nine sequenced samples from dogs, genotypic identities compatible with Cryptosporidium canis, were revealed in all samples, suggesting that this species is conserved in State of São Paulo. The genotypic analysis in bovines revealed Cryptosporidium parvum Eire I in two samples, Cryptosporidium parvum bovine genotype in six samples and Cryptosporidium bovis in another sample, the last one being a non zoonotic species, not related to clinical symptoms and described for the first time in Brazil.

O protozoário parasita Cryptosporidium parvum tem sido reconhecido como um importante patógeno emergente. Para estudos moleculares, a maioria das técnicas para extração do DNA requer o uso de kits importados para concentrar, romper a parede muito resistente do oocisto e purificar o DNA das matrizes das amostras. O objetivo do estudo foi desenvolver um método simples e rápido, baseado na reação em cadeia pela polimerase (PCR) para detectar Cryptosporidium em fezes preservadas. Oocistos foram concentrados das amostras fecais pela flutuação em gradiente de sacarose. Dos oocistos purificados foi extraído o DNA genômico através de incubação em tampão de lise contendo 70 mM -mercaptoetanol, digerido com proteinase K e extraído com fenol-clorofórmio-álcool isoamílico. A padronização foi iniciada com a PCR única para detectar Cryptosporidium spp usando um par de primer genérico (AWA). Para identificar C. parvum foi realizada a PCR única com o par de primer especifico (LAX). Para aumentar a sensibilidade do método, foi testada a nested-PCR, usando o primer externo XIA. Foram analisadas 39 amostras de DNA do bezerro padrão, 52 amostras de 17 pacientes e 45 amostras de 14 animais. Os resultados foram: 54,28% de positividade na PCR AWA, e 71,42% na nested-PCR XIA/AWA, 67,74% na PCR LAX e 44,44% na nested-PCR XIA/LAX das amostras do bezerro. A positividade geral nas amostras de pacientes e de animais foi: 34,48% pela PCR and 54,83% pela nested-PCR para Cryptosporidium spp e 16,00% pela PCR e 50,00% pela nested-PCR para C. parvum. O emprego do corante Vistra Green melhorou significativamente a visualização do gel. Os resultados mostram que este método simples e de baixo custo pode ser melhorado para aplicação na rotina do laboratório. / The protozoan parasite Cryptosporidium parvum has become recognised as important emerging human pathogens. For molecular studies, most of the techniques to extract genomic DNA require the use of imported kits to concentrate, rupture the very resistant oocyst wall, and purify the DNA from the samples matrix. The aim of this study was to develop a simple and rapid method based on polymerase chain reaction (PCR) to detect Cryptosporidium in preserved faeces. Oocysts were concentrated from faecal specimens by flotation on sucrose gradient. Genomic DNA was prepared from purified oocysts by adding a lysis buffer containing 70 mM -mercaptoethanol, digested with proteinase K and extracted with phenol-chlorophorm-isoamyl. The standardization was started by performing a one step PCR to detect Cryptosporidium spp using a generic set of primer (AWA). To detect C. parvum a one step PCR was assayed using the specific primer (LAX). To increase the sensitivity of the method, were tested nested-PCR assays, using an outer primer (XIA). Thirty nine DNA samples were analysed from the standard calf, 52 samples from 17 patients and 45 samples from 14 animals. The results were: 54.28% positive samples by single PCR AWA, 71.42% by nested-PCR, 67.74% by single PCR LAX and 44.44% by nested-PCR for the standard calf. The overall positivity for human and animal samples were: 34.48% by single PCR and 54.83% by nested-PCR for Cryptosporidium spp and 16.00% by single PCR and 50.00% by nested-PCR for C. parvum. Using Vistra Green for staining agarose gel, yielded the visualisation of the amplicons. These results show that this simple and cheap method could be improved to be used on the routine laboratory work.

L'objectif de ce travail a consisté à (i) déterminer l'occurrence et (ii) à étudier le comportement de différents micro-organismes pathogènes pour l'Homme reconnus comme responsables d'épidémies d'origine hydrique dans des ressources (eaux de surface et eaux de nappes) et des eaux traitées de plusieurs collectivités situées le long de la Moselle. Trois agents microbiologiques aux propriétés morphologiques et intrinsèques très différentes ont été étudiés: des bactéries (C. jejuni et C. coli), des virus entériques (adénovirus humains dont les adénovirus entériques), des parasites (C. parvum, C. hominis, C. meleagridis). Après avoir mis en place différentes méthodologies permettant leur détection, leur quantification et la révélation de leur viabilité et/ou leur infectiosité, nous avons montré que l'eau de la Moselle était largement contaminée par ces pathogènes à des concentrations variables selon la période de l'année. Ainsi par exemple, il a été retrouvé des bactéries C. jejuni plus fréquemment en été que pendant la période hivernale alors que l'inverse a été observé pour les adénovirus humains. Les résultats d'occurrence au niveau des nappes alluviales étudiées ont montré que malgré une protection liée à la filtration naturelle de l'eau, elles pouvaient être contaminées par des campylobacters viables et des adénovirus entériques. Concernant les eaux traitées, plusieurs signatures génomiques liées à ces deux derniers agents (bactérien et viral) ont été révélées par des outils de biologie moléculaire sans qu'un risque en lien avec la viabilité et l'infectiosité puisse être établi. Dans ces eaux, les expérimentations d'inactivation ont clairement montré la grande sensibilité de ces deux agents au traitement chloré mais pas celle des parasites Cryptosporidium qui s'avèrent être les pathogènes les plus résistants quel que soit le milieu ou la température d'incubation / The aim of this study was (i) to determine the occurrence and (ii) to study the behavior of different microorganisms known to cause human waterborne outbreaks in raw waters (surface water and groundwater) and treated water of several reservoirs along the Moselle river. Three pathogens were studied: bacteria (C. jejuni and C. coli), enteric viruses (human adenoviruses which enteric adenoviruses), parasites (C. parvum, C. hominis, C. meleagridis). Because of these micro-organisms have different properties such as size, various methodologies were used for their detection, quantification and viability and/or infectivity. In the study of occurrence we showed that the Moselle river was heavily contaminated by these pathogens in varying concentrations depending on time of the year. For example it was found bacteria C. jejuni more frequently in summer than during winter while the reverse was observed for human adenoviruses. The results obtained in groundwater showed that despite a protection linked to the natural filtration of water, they could be contaminated with viable campylobacters and enteric adenoviruses. In the treated water, several genomic signatures associated with these two agents (bacterial and viral) were revealed by molecular biology tools without any risk related to the viability and infectivity can be established. In these waters, the inactivation experiments clearly showed the high sensitivity of these two agents to chlorination but not the parasite Cryptosporidium, which known to be the most resistant pathogens, whatever the type of water or incubation temperature

As doenças causadas por patógenos emergentes e oportunistas são uma grande preocupação para os profissionais de Saúde Pública. A criptosporidiose é uma doença cosmopolita, cujo agente etiológico é o protozoário coccídia Cryptosporidium. Este parasita emergiu como um importante patógeno de veiculação hídrica, responsável por surtos em diferentes países e atualmente é considerado um problema para indivíduos imunocomprometidos e imunocompetentes. A taxonomia do gênero, baseada em aspectos morfológicos, é de difícil realização devido ao reduzido tamanho dos oocistos e também devido à perda de suas características morfológicas, principalmente em amostras ambientais. Essa limitação estimulou a aplicação de métodos moleculares na identificação das espécies destes microrganismos. Neste estudo, amostras de águas superficiais foram submetidas à ested-PCR para detecção de Cryptosporidium. No total 30 amostras de águas de 10 pontos de coleta situados no estado de São Paulo foram analisadas. Cryptosporidium foi detectado em 30% das amostras analisadas e a genotipagem permitiu a identificação de C. hominis, C. meleagridis e C. andersoni. Embora a identificação de Cryptosporidium em amostras ambientais seja uma tarefa complexa, os métodos moleculares são essenciais para determinação de espécies, ajudando a elucidar a epidemiologia deste protozoário em nosso país. / The illnesses caused by emerging and opportunist pathogens are a great concern for Public Health professionals. Criptosporidiosis is a cosmopolitan disease, whose etiologic agent is the coccidian protozoan Cryptosporidium. This parasite has emerged as an important waterborne pathogen, responsible for outbreaks in different countries, and it is currently considered a problem for immunocompromised and immunocompetent patients. The taxonomy of the genus, based on morphologic aspects, is of difficult accomplishment due to the small size of the oocysts, and also due to loss of its characteristics, mainly in environmental samples. This limitation has estimulated the application of molecular methods for species identification of these microorganisms. In this study, superficial water samples were submitted to nested-PCR to detect the presence of Cryptosporidium. A total of 30 water samples, from 10 points located in the state of São Paulo, were analyzed. Cryptosporidium was detected in 30% of the studied samples and genotyping allowed the identification of C. hominis, C. meleagridis and C. andersoni. Although the identification of Cryptosporidium in environmental samples is a complex task, molecular methods are essential for the species determination, helping to elucidate the epidemiology of this protozoan in our country.

A infecção por Cryptosporidium serpentis é uma das enfermidades mais importantes em répteis e se caracteriza por infecção crônica, clínica ou subclínica, e presença de gastrite hipertrófica severa, regurgitação, perda de peso progressiva, mortalidade eventual e eliminação contínua e intermitente de oocistos em fezes. O objetivo deste estudo foi padronizar um teste imunoenzimático (ELISA) indireto para detecção de anticorpos contra C. serpentis, e acompanhar a evolução clínica, parasitológica e da resposta imune humoral em serpentes naturalmente infectadas com C. serpentis. Foram utilizadas 21 serpentes naturalmente infectadas com C. serpentis e alojadas no Instituto Butantan, São Paulo, Brasil. As análises clínica e parasitológica foram realizadas em 21 serpentes por meio do registro diário dos sinais clínicos apresentados e pesquisa mensal da eliminação fecal de oocistos, em lâminas coradas pela técnica de Kinyoun. A avaliação sorológica foi realizada mensalmente utilizando o ELISA indireto para pesquisa de anticorpos anti-C. serpentis, pelo período de 12 meses em 8 animais, 8 meses em 3 animais e 6 meses em 1 animal. O ELISA indireto foi padronizado em bloco com utilização de antígeno produzido a partir de oocistos de C. serpentis, IgY de galinha anti-gamaglobulinas de serpentes e conjugado contendo IgG de coelho anti-IgY de galinha ligada à peroxidase. Os sintomas clínicos observados foram regurgitação, inapetência alimentar e perda de peso progressiva. A análise parasitológica revelou eliminação de quantidade variável de oocistos, de forma intermitente, em todas as serpentes, com positividade de 92% (116/126). O ELISA indireto apresentou positividade em 42,9% (54/126) das amostras. Foi observada resposta imune humoral na maioria dos animais, no entanto, com presença título flutuante de anticorpos e alternância de resultados positivos e negativos, em um mesmo animal. / Infection by Cryptosporidium serpentis is one of the most important diseases in reptiles, and is characterized by chronic infection, clinical or subclinical, and the presence of severe hypertrophic gastritis, food regurgitation, progressive weight loss, mortality, and intermittent and continuous shedding of oocysts in feces. The objective of this study was to standardize an indirect enzyme immunoassay (ELISA) to detect antibodies against C. serpentis, and evaluate the clinical, parasitological and humoral immune response in snakes naturally infected with C. serpentis. Twenty one snakes naturally infected with C. serpentis and housed at the Instituto Butantan, São Paulo, Brazil, were used for accomplish clinical and parasitological analyzes of C. serpentis infection, through the daily record of clinical signs and monthly survey of fecal shedding of oocysts using Kinyoun staining technique. The serological evaluation was performed monthly using the indirect ELISA for the detection of anti-C. serpentis antibodies, for a period of 12 months in eight animals, eight months in three animals, and six months in one animal. The indirect ELISA was standardized on the basis of block titration using antigen produced from oocysts of C. serpentis, chicken IgY anti-snake gamaglobulins and a conjugate containing rabbit IgG anti-chicken IgY linked to peroxidase. Clinical symptoms consisted in food regurgitation, inappetence, and progressive weight loss. The parasitological analysis revealed intermittent fecal shedding of variable number of oocysts in all snakes, with positivity in 92% (116/126) of the samples. The indirect ELISA was positive in 42.9% (54/126) of the samples. Humoral immune response was observed in most animals, however, fluctuating antibodies levels with rotation of positive and negative results were observed in some snakes.

O presente trabalho teve como objetivo padronizar a técnica de ELISA para detecção de anticorpos IgG anti-Cryptosporidium sp para aplicação em estudos epidemiológicos da criptosporidiose em imunocompetentes. Para obtenção de antígeno, bezerros foram oralmente infectados. Os oocistos foram recuperados das fezes doanimal, com a utilização do gradiente de sacarose modificado, técnica de concentração onde se obteve o melhor rendimento. Para preparação do antígeno, os oocistos foram rompidos através de ciclos de congelamento/descongelamento e ultra-som. Soros controle positivo foram escolhidos entre o grupo de funcionários do laboratório de Parasitologia, pois apresentavam anticorpos anti-Cryptosporidium e devido as suas atividades no laboratório era um grupo mais exposto; soros controle negativo foram escolhidos entre aqueles com leituras de densidade óptica menores que 0,300 no ELISA para detecção de anticorpos anti-Cryptosporidium. Diferentes grupos de soros de indivíduos clinicamente normais (funcionários da parasitologia, doadores de sangue, pacientes que fizeram o Pré-Natal) ou outras infecções parasitárias (cisticercose, toxoplasmose, esquistossomose, Doença de Chagas, leishmaniose), foram avaliados para presença de anticorpos anti-Cryptosporidium. A alta freqüência foi observada para o grupo de pacientes com Doença de Chagas (66,6%) e baixa freqüência para o grupo de pacientes com esquistossomose e toxoplasmose (20,0%). A especificidade do teste ELISA para Cryptosporidium foi demonstrada com significante redução nas leituras de 0.0. observada em alguns soros após absorção dos anticorpos anti-Cryptosporidium. Além disso, no grupo de pacientes Pré-Natal 14,6%, quando comparada a alta freqüência de anticorpos anti-Cryptosporidium 52,0%, indica provável ausência de reações cruzadas entre os dois antígenos. Enfim, os resultados obtidos sugerem que a técnica de ELISA pode ser uma importante metodologia para aplicação em estudos soroepidemiológicos da criptosporidiose. / The aim of the present study was to standardize an immunoenzymatic assay, ELISA, for detection of IgG antibodies to Cryptosporidium sp for use in epidemiologic studies on cryptosporidiosis. For antigen preparation, oocysts were obtained from fecal samples of orally infected calves. A modified sucrose gradient, concentration technique was used for recovered and purification of oocysts, which were ruptured by using freezethaw cycles and ultra-sonication. Positive control sera were chosen among the Parasitology workers, who presented anti-Cryptosporidium antibodies and had been exposed to this parasite, because of their activities in the laboratory; and negative control sera were chosen among the ones with optical density (O.D.) readings lower than 0,300 at ELISA for anti- Cryptosporidium antibodies. Oifferent groups of sera from clinically normal individuais (parasitology workers, blood donors, pregnant patients) or with other parasite infection (cysticercisis, toxoplasmosis, schistosomiasis, Chagas disease, leishmaniasis) were evaluated for the presence of Cryptosporidium antibodies. The higher frequency was observed for the group of patients with Chagas disease (66.6%) and the lower frequency for the group patients with schistosomiasis and toxoplasmosis (20.0%). The specificity of the Cryptosporidium-ELISA test was demonstrated when significant reduction of the 0.0. readings was observed for some serum samples after absorption of the anti-Cryptosporidium antibodies. Also, in the group of pregnant patients, the high frequency of 52.0% for anti-Cryptosporidium antibodies when compared to the low frequency of 14.6% for anti-Toxoplasma antibodies might suggest possible absence of cross reactions between these two closely related parasite antigens. The ELISA for detection of anti-Cryptosporidium antibodies, as standardized in the present work, can constitute a good toel for epidemiological studies of cryptosporidiosis.

As doenças causadas por patógenos emergentes e oportunistas são uma grande preocupação para os profissionais de Saúde Pública. A criptosporidiose é uma doença cosmopolita, cujo agente etiológico é o protozoário coccídia Cryptosporidium. Este parasita emergiu como um importante patógeno de veiculação hídrica, responsável por surtos em diferentes países e atualmente é considerado um problema para indivíduos imunocomprometidos e imunocompetentes. A taxonomia do gênero, baseada em aspectos morfológicos, é de difícil realização devido ao reduzido tamanho dos oocistos e também devido à perda de suas características morfológicas, principalmente em amostras ambientais. Essa limitação estimulou a aplicação de métodos moleculares na identificação das espécies destes microrganismos. Neste estudo, amostras de águas superficiais foram submetidas à ested-PCR para detecção de Cryptosporidium. No total 30 amostras de águas de 10 pontos de coleta situados no estado de São Paulo foram analisadas. Cryptosporidium foi detectado em 30% das amostras analisadas e a genotipagem permitiu a identificação de C. hominis, C. meleagridis e C. andersoni. Embora a identificação de Cryptosporidium em amostras ambientais seja uma tarefa complexa, os métodos moleculares são essenciais para determinação de espécies, ajudando a elucidar a epidemiologia deste protozoário em nosso país. / The illnesses caused by emerging and opportunist pathogens are a great concern for Public Health professionals. Criptosporidiosis is a cosmopolitan disease, whose etiologic agent is the coccidian protozoan Cryptosporidium. This parasite has emerged as an important waterborne pathogen, responsible for outbreaks in different countries, and it is currently considered a problem for immunocompromised and immunocompetent patients. The taxonomy of the genus, based on morphologic aspects, is of difficult accomplishment due to the small size of the oocysts, and also due to loss of its characteristics, mainly in environmental samples. This limitation has estimulated the application of molecular methods for species identification of these microorganisms. In this study, superficial water samples were submitted to nested-PCR to detect the presence of Cryptosporidium. A total of 30 water samples, from 10 points located in the state of São Paulo, were analyzed. Cryptosporidium was detected in 30% of the studied samples and genotyping allowed the identification of C. hominis, C. meleagridis and C. andersoni. Although the identification of Cryptosporidium in environmental samples is a complex task, molecular methods are essential for the species determination, helping to elucidate the epidemiology of this protozoan in our country.