Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Introduction: Stem cell therapy has been applied as coadjutant or treatment for some diseases or disorders. A range of sources of pluripotent cells have been investigated as placental, umbilical cord, teeth pulp, fat. However pluripotent cell behavior submitted to a concomitant physiological disorder as diabetes has been no fully understood. Methods: We aimed to evaluate proliferative potential, and the characterization of stem cells markers for potential cell differentiation, mitochondrial activity, cell cycle and apoptosis in samples of stem cells from yolk sacs obtained from rats in 15 and 20 gd in normal and hyperglycemic conditions using flow cytometry to analyze cell cycle stages, mitochondrial membrane potential, expression of Stro-1, CD90, Nanog, Oct 3/4, CD117, CD115, CD 44, CD34, VEGF-R1, COX-2, MCP-1, INF-₢ R1, L 1 and phosphorylated Caspase-3. Results: In diabetic groups we observed high levels of mitochondrial inactivity, intensively decreasing in G2/M phase, over expression of caspase, decreased expression of adhesion formation markers such as CD 44, CD 34, and NANOG. Increased pluripotency CD 90 receptor, VEGF-R1, TNF-R1, IL-1, COX-2, Caspese. Discussion: In the last period of gestation diabetes might be associated to permeability deregulation, mitochondrial integrity, cytochrome c release, reduction in the cell cycle progression, apoptosis activation and proliferative capacity decreasing. Conclusion: Diabetes seems to play a negative influence on yolk sac cell behavior in the last period of gestation. / Introdução: A terapia com células-tronco tem sido aplicada como coadjuvante no tratamento para algumas doenças ou distúrbios. Uma variedade de células pluripotentes têm sido investigadas essas células podem ser encontradas na placenta, cordão umbilical, polpa de dentes. No entanto o comportamento de células pluripotentes submetido a um distúrbio fisiológico concomitante como diabetes não foi totalmente compreendido. Métodos: O objetivo foi avaliar o potencial de proliferação, e a caracterização de marcadores de células-tronco para diferenciação potencial celular, atividade mitocondrial, ciclo celular e apoptose das células-tronco do saco vitelino obtidos de ratas em 15 e 20 gd em condições normais e hiperglicêmicos usando a citometria de fluxo para analisar as fases do ciclo celular, o potencial da membrana mitocondrial, a expressão de Stro-1, CD90, Nanog, Out 3/4, CD117, CD115, CD 44, CD34, de VEGF-R1, a COX-2, a MCP-1, IFN-₢ R1, L 1 e a caspase-3. Resultados: Nos grupos diabéticos observou-se elevados níveis de inatividade mitocondrial, diminuindo intensamente em fase G2 / M, sobre a expressão de caspase, diminuição da expressão dos marcadores formadores de adesão como CD 44, CD 34, e NANOG. Aumento da Pluripotencia dos receptores CD 90, VEGF-R1, TNF-R1, IL-1, COX-2, Caspese Discussão: No último período de diabetes gestacional pode estar associado à desregulamentação permeabilidade, integridade mitocondrial, liberação de citocromo c, redução da progressão do ciclo celular, ativação da apoptose e diminuição da capacidade proliferativa. Conclusão: Diabetes parece ter uma influência negativa sobre o comportamento das células do saco vitelino nos último período de gestação.

Orientadores: Vera Lucia Gil da Silva Lopes, Iscia Lopes Cendes / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-12T17:53:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Freitas_ErikaCristinaLopesBurronede_D.pdf: 4235837 bytes, checksum: 014a02ceef9fbd93a09deb49df5f0a37 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: A Síndrome Blefaroqueilodôntica (BCD) e os Defeitos de Linha Média Facial com Hipertelorismo (DLMFH) são defeitos craniofaciais raros. Por esse motivo, os estudos de grandes casuísticas têm sido limitados. Contribuição científica significativa neste assunto tem sido dada por nosso grupo, que delineou características clínicas e diretrizes para seguimento de longo prazo e evidenciou achados neuroradiológicos em ambas as anomalias. Embasado nesses achados preliminares e evidências recentes da literatura pertinente, foi possível estabelecer uma estratégia inicial para investigação etiológica da BCD e dos DLMFH, sendo os objetivos desse projeto: investigar a etiologia da BCD nos indivíduos afetados pela síndrome, por meio de estudo dos genes candidatos IRF6, P63, OSR2, TBX10, FOXE1, SHH, FGF8 e PAX3; pesquisar, nos indivíduos com DLMFH, a presença de mutações nos genes candidatos SHH, FGF8 e PAX3; identificar, em ambas as malformações, possíveis alterações cromossômicas; e, por último, associar os achados clínicos detectados nas investigações anteriores aos possíveis achados moleculares. Foram utilizadas técnicas de sequenciamento direto, array-CGH, genotipagem automática e hibridação in situ por fluorescência. Não foi possível relacionar nenhuma mutação pontual nos genes estudados associadas às malformações em questão, pois não foram encontradas alterações gênicas patogênicas. Entretanto foram detectadas em pacientes com DLFMH três aberrações cromossômicas em regiões distintas do genoma, tratando-se de um caso de duplicação no cromossomo 6 (paciente DLMFH7), um caso com deleção no cromossomo 9 e duplicação no cromossomo 20 (paciente DLMFH10) e um caso de deleção no cromossomo 2 (paciente DLMFH1). Nesse último, o gene PAX3 encontrava-se dentro da região deletada, confirmando a hipótese inicial de que alguns genes de desenvolvimento estão envolvidos na etiologia dos DLMFH. Conclui-se, portanto, que em indivíduos com DLMFH, a técnica de array-CGH pode ser útil para detecção de aberrações cromossômicas diversas e o aconselhamento genético deve ser individualizado / Abstract: The Blepharocheilodontic Syndrome (BCD) and Midline Facial Defects with Ocular Hypertelorism (MFDH) are rare craniofacial anomalies. Considering the rarity of these two groups of congenital defects, studies with large casuistry have been limited. Our group has significantly contributed to the scientific knowledge about both anomalies, delineating clinical characteristics, evidencing neurological findings and designing protocols for long term follow-up. Based in these preliminary findings and recent evidences of pertinent literature, it was possible to determine an initial etiologic investigation strategy for the BCD and the MFDH. The objectives of this project are to investigate the etiology of the BCD in affected individuals through IRF6, P63, OSR2, TBX10, FOXE1, SHH, FGF8 and PAX3 candidate genes study; to search MFDH patients for mutations in the SHH, FGF8 and PAX3 candidate genes; to identify, in both syndromes, possible chromosomal anomalies; and finally, to associate the detected clinical findings in previous investigations to the molecular results. The direct sequencing, array-CGH, automatic genotyping and FISH were the molecular techniques used in this study. It was not possible to relate any punctual mutation in the studied genes associated to the syndromes investigated since none pathogenetic alteration was found. Although, chromosomal anomalies in different locations of the genome were detected in three MFDH patients, a chromosome 6 duplication (in patient MFDH7), a chromosome 9 deletion and chromosome 20 duplication (in patient MFDH10), and a chromosome 2 deletion (in patient MFDH1). In the latter case, the PAX3 gene was inside the deleted region, supporting the initial hypothesis that some development genes are involved in the MFDH etiology. Therefore, it can be concluded that in MFDH patients, the array-CGH investigation can be useful to detect a wide range of chromosomal anomalies and the genetic counseling must be individualized / Doutorado / Ciencias Biomedicas / Doutor em Ciências Médicas

Submitted by JÚLIO HEBER SILVA (julioheber@yahoo.com.br) on 2017-12-13T18:53:37Z No. of bitstreams: 2 Tese - Natalia do Carmo Silva - 2017.pdf: 2078936 bytes, checksum: a9911e8e1a6da63e31e4fb86a1dbf785 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-12-14T10:19:33Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Natalia do Carmo Silva - 2017.pdf: 2078936 bytes, checksum: a9911e8e1a6da63e31e4fb86a1dbf785 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-12-14T10:19:33Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese - Natalia do Carmo Silva - 2017.pdf: 2078936 bytes, checksum: a9911e8e1a6da63e31e4fb86a1dbf785 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2017-12-08 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The objective of this study was to evaluate the addition of antioxidants in different cryopreservation diluents on bovine semen quality after thawing and the in vitro production of embryos. First, the effects of adding different concentrations of glutathione (1.5 and 2.5 mM) and melatonin (0.5 and 1.0 mM) in egg yolk semen cryopreservation diluents (Bovimix®) and soy lecithin (Andromed®) were evaluated. The results showed that the addition of the antioxidant glutathione did not improve the maintenance of sperm characteristics of bovine semen. Melatonin had a negative effect on the spermatic parameters evaluated. The diluent Andromed® obtained better parameters of spermatic kinetics when compared with the diluent Bovimix®. However, in relation to the membrane integrity analyzes of the Bovimix® diluent showed better performance in the maintenance of these parameters. The effect of the cryopreservation diluents and the addition of glutathione in the vitro production of bovine embryos (PIVE) was then evaluated. The rate of cleavage, blastocyst rate and hatching were evaluated eight and nine days after IVF, as well as the correlation between sperm characteristics and PIVE. The diluent Andromed® provided a better cleavage rate, with no effect of the addition of glutathione in it. However, the addition of 2.5 mM glutathione in the Bovimix® diluent improved the cleavage rate. There was a significant correlation of high and low magnitude between some sperm characteristics with the rate of cleavage. It was concluded that glutathione did not improve sperm viability. Melatonin worsened the maintenance of sperm characteristics. Andromed® diluent was more efficient in the in vitro production of bovine embryos with no glutathione effect observed in this diluent. The addition of 2.5 mM glutathione in the egg yolk Bovimix® diluent gave a higher cleavage rate. In vitro evaluation of semen quality is not the best method to predict the fertilizer potential of the same in PIVE, because only significant low to moderate magnitude correlations were observed between some parameters of semen quality and fertilization rate. / Objetivou-se avaliar a adição de antioxidantes em diferentes diluentes de criopreservação sobre a qualidade do sêmen bovino pós-descongelação e a produção in vitro de embriões. Primeiramente, avaliou-se os efeitos da adição de diferentes concentrações de glutationa (1,5 e 2,5 mM) e melatonina (0,5 e 1,0 mM) em diluentes de criopreservação de sêmen à base de gema de ovo (Bovimix®) e lecitina de soja (Andromed®). Os resultados demonstraram que a adição do antioxidante glutationa não melhorou a manutenção das características espermáticas do sêmen bovino. A melatonina reduziu a qualidade das características espermáticas avaliadas. O diluente Andromed® obteve melhores variáveis de cinética espermática quando comparado com o diluente Bovimix®. No entanto, com relação às análises de integridade de membrana o diluente Bovimix® demonstrou melhor desempenho na manutenção dessas variáveis. Posteriormente, avaliou-se o efeito dos diluentes de criopreservação e a adição de glutationa sobre a produção in vitro de embriões bovinos (PIVE). Avaliou-se a taxa de clivagem, taxa de blastocisto e eclosão oito e nove dias após a fertilização (FIV), assim como a correlação entre as características espermáticas e as taxas de desenvolvimento embrionário. O diluente Andromed® proporcionou melhor taxa de clivagem, sem a necessidade da adição de glutationa no mesmo. Entretanto, a adição de 2,5 mM de glutationa no diluente Bovimix® melhorou a taxa de clivagem. Houve correlação significativa de alta e baixa magnitude entre algumas características espermáticas com a taxa de clivagem. Conclui-se que a glutationa não melhorou a viabilidade espermática. A melatonina reduziu a manutenção das características espermáticas. O diluente Andromed® foi mais eficiente na produção in vitro de embriões bovinos não sendo observado efeito da glutationa neste diluente. A adição de glutationa na concentração de 2,5 mM no diluente Bovimix®, à base de gema de ovo, proporcionou maior taxa de clivagem. A avaliação in vitro da qualidade do sêmen não é o melhor método para predizer o potencial fertilizante do mesmo na PIVE, pois só foram observadas correlações significativas de baixa a moderada magnitude entre algumas características de qualidade do sêmen e a taxa de fertilização.

Introdução: Alterações no ambiente fetal conferem um risco aumentado para doenças crônicas como obesidade, doença cardiovascular, hipertensão arterial e diabetes tipo 2. As evidências sugerem que a restrição de crescimento intrauterino (RCIU) pode programar de forma persistente as preferências alimentares, e acredita-se que esse tipo de alteração comportamental, pode explicar, pelo menos em parte, o aumento do risco para essas doenças em indivíduos que sofreram RCIU. Portanto, torna-se importante entender os fatores associados e mecanismos envolvidos nesse comportamento. O objetivo deste trabalho foi investigar o efeito da RCIU no comportamento alimentar em animais e humanos, assim como os possíveis mecanismos envolvidos na sua programação. Métodos: Ratas Sprague Dawley prenhes foram randomizadas para o grupo controle (Adlib), que recebeu dieta padrão ad libitum ou grupo restrição 50% (FR), que recebeu 50% do consumo habitual de genitoras alimentadas ad libitum. As dietas foram oferecidas a partir do dia 10 de gestação até o dia 21 de lactação. Em até 24h após o nascimento, foi realizada a adoção cruzada formando os grupos: Adlib_Adlib, FR_Adlib, FR_FR, Adlib_FR. O consumo de ração padrão foi comparado entre todos os grupos. A preferência alimentar, a preferência condicionada por lugar induzida por alimento palatável, assim como a fosforilação da enzima tirosina hidroxilase e os níveis de receptores D2 no núcleo acumbens foram comparados entre os grupos de interesse (Adlib_Adlib e FR_Adlib). Nos humanos, 75 jovens, classificados quanto à RCIU, participaram de avaliação antropométrica, bioquímica e de comportamento alimentar (teste de escolha alimentar, no qual todos recebiam um valor monetário para compra de um lanche, e Dutch Eating Behaviour Questionnaire, DEBQ). Dados de neuroimagem funcional em repouso entre regiões relacionadas à recompensa de 28 indivíduos foram processados e analisados, de um total de 43 exames realizados. Resultados: No estudo experimental, viu-se que o consumo de ração padrão não foi diferente entre os grupos. Ratos restritos apresentaram preferência pela dieta palatável, mas menor condicionamento de preferência ao lugar associado ao alimento palatável. A fosforilação da tirosina hidroxilase no núcleo acumbens foi maior nestes animais no estado basal, mas após exposição ao doce essa diferença entre os grupos permaneceu apenas nos machos. A RCIU também se associou a menores níveis de receptores D2 no núcleo acumbens. No estudo clínico, encontrou-se que a menor razão de crescimento fetal (indicativo de maior RCIU) e alto índice de massa corporal predizem um estilo alimentar restritivo visto pelo DEBQ. Pessoas nascidas com RCIU também usaram menor quantidade do um recurso financeiro oferecido no teste de escolha alimentar após um período de jejum. Os dados de neuroimagem funcional sugerem que os indivíduos restritos apresentam um padrão de conectividade em repouso alterado entre o córtex orbito-frontal, o estriado ventral/dorsal e a amígdala. Conclusão: A RCIU esteve associada com preferência por alimentos palatáveis e alterações no sistema dopaminérgico no estudo experimental e alterações da conectividade em repouso entre áreas do sistema mesocorticolímbico no estudo clínico. As alterações observadas no sistema dopaminérgico dos animais restritos indicam que esse sistema estaria envolvido na programação da preferência alimentar nesses indivíduos. Além disso, o padrão de conectividade em repouso observado nos indivíduos restritos sugere que alterações em determinadas regiões do sistema de recompensa poderiam estar associadas com mudanças no comportamento alimentar. As alterações neurocomportamentais observadas confirmam a existência de programação fetal do comportamento alimentar pela RCIU, apontando modificações persistentes no sistema de recompensa do cérebro, o que pode ser visto como um fator de risco para o desenvolvimento de obesidade e suas comorbidades. / Introduction: Fetal environment changes can lead to adaptations that are associated with increased risk for obesity, cardiovascular disease, hypertension and diabetes in adult life. Evidence suggests that intrauterine growth restriction (IUGR) can persistently program the subject’s preference for palatable foods. It is believed that feeding behavior alterations can explain, at least in part, the increased risk for chronic diseases in IUGR individuals. Therefore, it becomes important to understand the factors and mechanisms involved in this behavior. The aim of this study was to explore how IUGR affects feeding behavior of animals and humans, as well as to verify the potential mechanisms related to this behavioral programming. Methods: Time-mated pregnant Sprague-Dawley rats were randomly allocated to Control (receiving standard chow ad libitum) or 50% food restricted (FR), receiving 50% of the ad libitum-fed dam’s habitual intake. These diets were provided from day 10 of pregnancy throughout day 21 of lactation. Within 24 hours after birth, pups were crossfostered, forming four groups: Adlib_Adlib, FR_Adlib, FR_FR, Adlib_FR. Standard chow consumption was compared between all groups. Food preference, conditioned place preference to a palatable diet, and the nucleus accumbens tyrosine hydroxylase phosphorylation and D2 receptor levels were analyzed focusing on two groups of interest (Adlib_Adlib and FR_Adlib). In humans, 75 youths were classified regarding IUGR and had anthropometric data, biochemical data, and feeding behavior (food choice task, in which everyone received a monetary value to purchase a snack, and Dutch Eating Behaviour Questionnaire) assessed. Forty three neuroimaging exams were performed and resting state functional connectivity between brain regions related to reward of 28 individuals were processed and analyzed. Results: In the experimental study, standard chow consumption was not different between groups. IUGR adult rats had increased preference for palatable food, but showed less conditioned place preference to a palatable diet compared to controls. At baseline, the accumbal tyrosine hydroxylase phosphorylation was increased in IUGR rats compared to controls. After sweet food exposure, the difference between groups remained only in males. Accumbal D2 receptors levels were decreased in IUGR rats. In the clinical study, it was found that low birth weight ratio (indicative of higher IUGR) and high body mass index predict a restrained eating style as seen by the DEBQ. IUGR individuals used a smaller quantity of a financial resource offered in the food choice task after a fasting period. Resting state functional connectivity data suggest that IUGR individuals had an altered pattern of connectivity between the orbitofrontal cortex, the ventral/dorsal striatum and the amygdala. Conclusion: IUGR was associated with a preference for palatable foods and alterations in the dopaminergic system in the experimental study, as well as changes in the resting state functional connectivity between regions of the mesocorticolimbic pathway in the clinical study. Alterations in the mesolimbic dopaminergic system observed in IUGR rats indicate an important role in the programming of food preferences. Moreover, the IUGR pattern of brain connectivity observed suggests that alterations in certain regions involved in reward processing and evaluation could be associated with changes in eating behavior. Neurobehavioral changes observed confirmed the existence of a fetal programming of feeding behavior associated with IUGR, pointing out to persistent modifications in the brain reward system, which can be seen as a risk factor for the development of obesity and its comorbidities.

Até o momento a literatura não determinou qual o melhor estadio de maturação (imaturo ou maduro) para que o oocito mantenha sua competência para o desenvolvimento reprodutivo após a criopreservação. O objetivo deste estudo foi determinar em qual estadio meiótico (imaturo -VG (vesícula germinativa) ou maduro- MII (metáfase II)) o oócito é menos susceptível ao dano na criopreservação, utilizando modelo experimental bovino. Foram utilizados ovários de vacas abatidas em matadouro, após a aspiração dos folículos, os oócitos imaturos (VG) foram selecionados para a maturação in vitro e vitrificação, e foram divididos em três grupos: 1) oócitos maturados in vitro e não submetidos à vitrificação (CONTROLE); 2) oócitos vitrificados imaturos (VG), descongelados e submetidos à maturação in vitro (CRIO-MIV); 3) oócitos maturados in vitro (MII), vitrificados e descongelados (MIV-CRIO). Os oócitos foram avaliados quanto a: a)maturação nuclear pela técnica de orceína acética; b) integridade da zona pelúcida (ZP) através de microscopia de polarização; c) viabilidade oocitária pela técnica de DEAD-LIVE; d) desenvolvimento embrionário (taxa de clivagem, produção e eclosão de blastocistos) através da fertilização in vitro (FIV) e ativação partenogenética (AT). Não houve diferença na capacidade de maturação nuclear entre os oócitos frescos e descongelados no grupo CRIO-MIV (p=0,23). Em relação à zona pelúcida a totalidade dos oócitos (100%) nos três grupos apresentou leitura de zona pelúcida positiva, não havendo correlação com evolução embrionária posterior. Na análise de viabilidade celular pelo DEAD-LIVE verificou-se que houve redução da viabilidade do grupo MIV-CRIO (27%) quando comparado com controle (84%) (p<0,0001). Na análise do potencial de desenvolvimento embrionário o grupo controle apresentou melhores taxas de clivagem após FIV (80%) e AT (58%), do que os grupos CRIO-MIV (28%; p<0,0001; 28%; p=0,0002, respectivamente) e MIV-CRIO (26%; p<0,0001; 22%, p<0,0001,respectivamente). As taxas de formação de blastocisto e eclosão após FIV nos grupos CRIO-MIV, MIV-CRIO e após AT no grupo MIV-CRIO foram nulas. Houve a produção e eclosão de apenas um blastocisto no grupo CRIO-MIV após AT. No modelo experimental utilizado, o procedimento de vitrificação comprometeu parcialmente a viabilidade dos oócitos medida pela técnica de DEAD- LIVE e completamente o desenvolvimento embrionário subseqüente, independente do estadio de maturação meiótica (VG ou MII) durante a criopreservação. No entanto, oócitos vitrificados em estadio de VG e submetidos à MIV foram meioticamente competentes e progrediram até o estadio de MII, sugerindo que o dano não compromete a capacidade de maturação nuclear do oócito. Este estudo não conseguiu determinar qual o melhor estadio meiótico oocitário para criopreservação, já que os dois estadios meióticos (VG e MII) se mostraram igualmente prejudicados pela criopreservação em relação à capacidade reprodutiva. / Until the present literature has not achieved a consensus regarding the best maturation stage for oocyte to maintain their reproductive capacity after cryopreservation. The aim of this study was to determine, using an experimental bovine model, in which stage of development (VG stage, immature, or MII stage, post-maturation in vitro) the oocyte is less susceptible to damage during cryopreservation. Immature oocytes (VG) from the ovaries of slaughtered cows were selected for in vitro maturation or vitrification and divided into three groups. The first group (CONTROL) consisted of immature oocytes, matured in vitro without vitrification; the second group (CRYO-IVM) consisted of vitrified immature oocytes thawed and submitted to in vitro maturation; and the third group (IVM-CRYO) consisted of matured in vitro oocytes submitted to vitrification and thawing. The oocytes were evaluated for: nuclear maturation by acetic orcein staining; integrity of the zona pellucida using a polarized microscope; cell viability by the Dead-Live technique; and embryo development (cleavage, production and hatching rate) by in vitro fertilization and parthenogenetic activation. There was no difference in capacity of nuclear maturation between fresh and thawed oocytes (p=0.23). Regarding the zona pellucida (ZP), all oocytes (100%) of all three groups (control, CRYO-IVM and IVMCRYO) presented a positive ZP reading, with no correlation with later embryo evolution. DEAD-LIVE analysis of cell viability revealed reduction of viability in the IVM-CRYO group (27%) compared to control (84%) (p<0.0001) and to the CRYO-IVM group (56%) (p=0.017), with no difference between the last two groups (p=0.055). Analysis of the potential for embryo development by means of in vitro fertilization showed that the control group presented better cleavage and blastocyst formation rates than the CRYO-IVM (p<0.0001 and p<0.0001, respectively) and the IVM-CRYO (p<0.0001 and p=0.0004, respectively) groups. Analyzing the potential for embryo development the control group presented better cleavage by means of in vitro fertilization (80%) and parthenogenetic activation (58%) than the CRYOIVM (28%; p<0,0001; 28%; p=0,0002, respectively) and the IVM-CRYO groups (26%; p<0,0001; 22%, p<0,0001,respectively) Analysis of blastocyst formation rates and hatching after FIV and AT in CRYO-IVM and IVM-CRYO groups were null. Vitrification of bovine oocytes causes great impairment of their reproductive capacity regardless of the stage of maturation at the time of freezing. However the vitrified immature oocytes submitted to IVM maintained their capacity of nuclear maturation, as they achieved MII stage. This study was not able to determine which stage was better in reducing crio damage, as both stages (VG and MII) presented equally impaired by the process.

Existe uma complexa cascata envolvendo proteínas durante o desenvolvimento embrionário inicial e reconhecimento materno, o que é muito importante para a manutenção do concepto. O objetivo deste estudo foi comparar o perfil proteômico do líquido uterino após ovulação em éguas prenhes e cíclicas. No primeiro ciclo, amostras de líquido uterino de 30 éguas cíclicas foram coletadas nos dias 7 (n=10), 10 (n=10) e 13 (n=10), constituíram o grupo Cíclica. No segundo ciclo as mesmas éguas foram cobertas por um garanhão fértil. Nos dias 7, 10 e 13 foram coletadas amostras do líquido intrauterino. Imediatamente após a coleta das amostras, o útero das éguas foi lavado, e aquelas que tiveram o embrião recuperado constituíram o grupo Prenhe. Dos 30 lavados uterinos realizados foram recuperados 6 embriões no dia 7, 6 embriões no dia 10 e 6 embriões no dia 13. Amostras das éguas que não tiveram recuperação embrionária foram descartadas de ambos os grupos. As amostras de líquido uterino foram processadas por eletroforese bidimensional seguida de matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight/time-of-flight (MALDI-TOF/TOF) espectrometria de massa para a identificação de relevantes spots proteicos. De um total de 677 spots detectados, 19 foram identificados, sendo 13 mais abundantes no grupo Prenhe e 6 no grupo Cíclica. Em conclusão éguas prenhes e cíclicas demonstraram diferenças na abundancia de proteínas. Foram identificadas proteínas relacionadas com os eventos essenciais para manutenção embrionária como: transporte de lipídios através da cápsula embrionária, mobilidade uterina, formação de ATP, angiogênese, tolerância imunológica materna, proliferação celular, processos celulares e metabolismo. As mudanças no perfil de proteínas do fluido uterino durante o desenvolvimento inicial em éguas foram relacionadas com a presença embrionária, sugerindo que estas alterações podem ser importantes para o desenvolvimento embrionário e reconhecimento materno da prenhez. / There is a complex cascade involving proteins during early embryo development and maternal recognition, which is very important for maintenance of a concept. The aim of this study was to compare proteomic profile of uterine fluid after ovulation in pregnant and cyclic mares. In the first cycle, samples of uterine fluid of 30 cyclic mares were collected on days 7 (n = 10), 10 (n = 10) and 13 (n = 10) and constituted the Cyclic group. In the second cycle, the same mares were bred to a fertile stallion. At days 7, 10 and 13 intrauterine samples were collected. Immediately after sample collection, the mares uterus were flushed, and those with embryo recovery were assigned to the Pregnant group. Of the 30 mares flushed, embryos were recovered in 6 mares from the 7th day, 6 from the 10th day and 6 from the 13th day. Samples from the mares without embryo recovery were excluded from both groups. The uterine fluid samples were processed by two-dimensional electrophoresis technique followed by matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight/time-of-flight (MALDI-TOF/TOF) mass spectrometry for the identification of relevant protein spots. From a total of 677 detected spots 19 were identified, 13 more abundant in Pregnant group and 6 in Cyclic group. In summary, pregnant and cyclic mares showed proteins with different abundance. Identified proteins were related to the transport of lipids through the embryo capsule, uterine motility, ATP generation, maternal immunological tolerance, cell proliferation, differentiation, metabolism and angiogenesis. Changes in the proteomic profile of uterine fluid during early embryo development in mares were related with the embryonic presence, suggesting that these alterations may be important for embryonic development and maternal recognition of pregnancy.

Nausithoe aurea Silveira & Morandini, 1997 é uma espécie metagenética e dióica com fecundação externa. Os oócitos são liberados continuamente (55 dias em laboratório), porém com grandes variações no número a cada dia. No desenvolvimento embrionário a clivagem, após o estágio de 8 células, passa de holoblástica e igual para pseudoespiral. A gastrulação ocorre por ingressão multipolar e inicia-se aproximadamente 24 horas após a fecundação. A estrutura histológica geral das gônadas assemelha-se a outros Scyphozoa, onde os gonócitos proliferam a partir da gastroderme, migram e diferenciam-se na mesogléia. Na gônada masculina as células germinativas formam camadas razoavelmente distintas e constituem folículos testiculares. Na gônada feminina os oócitos surgem da zona germinativa na gastroderme e apresentam um gradiente de maturação a partir deste ponto (cortes no sentido oral-aboral). Os oócitos encontram-se livres na mesogléia da gônada, sem associação com outras células. A relação espacial entre a musculatura circular, as gônadas e o sulco coronal, é uma característica a ser usada na sistemática do gênero Nausithoe Kölliker, 1853. / Nausithoe aurea Silveira & Morandini, 1997 is a metagenetic and dioecious species with external fertilization. The oocytes are released continuously (55 days in laboratory), but with great variations in the daily number. In the embryonic development the cleavage, after the 8 cells stage, changes from holoblastic and adequal to pseudospiral. The gastrulation occurs through multipolar ingression and begin 24 hours after fertilization. The general histological structure of the gonads resembles other Scyphozoa, in which the gonocytes proliferate from the gastrodermis, migrate and differentiate in the mesoglea. In the male gonad the germ cells are arranged in distinctive layers and form follicles (cysts). In the female gonad the oocytes develop from the germinative zone in the gastrodermis and present a maturing gradient from this point on (oral-aboral sections). The oocytes are free in the gonad mesoglea, without association to any cell. The spatial relation of the coronal musculature, gonads and coronal groove, is a character to be used in the systematics of the genus Nausithoe Kölliker, 1853.

Submitted by Irvana Coutinho (irvana@ufpa.br) on 2012-06-15T12:44:21Z No. of bitstreams: 2 Dissertacao_PriscilaInfluenciaSistemaNitrergico.pdf: 1559186 bytes, checksum: e83c813e0d8f2466e4e12223998f38c3 (MD5) license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) / Approved for entry into archive by Irvana Coutinho(irvana@ufpa.br) on 2012-06-15T12:44:34Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertacao_PriscilaInfluenciaSistemaNitrergico.pdf: 1559186 bytes, checksum: e83c813e0d8f2466e4e12223998f38c3 (MD5) license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-06-15T12:44:34Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertacao_PriscilaInfluenciaSistemaNitrergico.pdf: 1559186 bytes, checksum: e83c813e0d8f2466e4e12223998f38c3 (MD5) license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Previous issue date: 2012 / CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / O Óxido Nítrico (NO-) é uma molécula de sinalização celular que regula o desenvolvimento embrionário pré-implantacional. Nós investigamos o papel do NO- no cultivo de embriões bovinos produzidos in vitro, através do uso de N-Nitro-L-Arginina Metil Ester (L-NAME), um inibidor da produção de NO-, e L-arginina (ARG), um precursor de NO-, em diferentes períodos de cultivo (ativação do genoma embrionário e compactação). Foram avaliados seus efeitos sobre as taxas de desenvolvimento, cinética do desenvolvimento, qualidade embrionária, e expressão gênica. Os embriões foram produzidos por maturação e fertilização in vitro de oócitos aspirados de ovários provenientes de abatedouro frigorífico. No experimento 1, as taxas de desenvolvimento foram avaliadas em SOFaa na presença de L-NAME em diferentes períodos: do 1º ao 4º dia de cultivo (LN1-4), do 4º ao 8º (LN4-8) e do 1º ao 8º dia de cultivo (LN1-8). A inibição foi prejudicial a partir do 4º dia de cultivo (grupos LN4-8 e LN1-8), ao reduzir as taxas de eclosão (17,3%±13,44 e 13,7%± 14,51, respectivamente, p<0,05). Entretanto, o efeito mais negativo ocorreu do 1º ao 8º dia (LN1-8) em que a taxa de blastocisto foi significativamente menor comparada ao controle (29,4%±3,72 vs 47,8%±11,34, respectivamente, p<0,05). Por isso no experimento 2, a ARG (1, 10 e 50mM) foi adicionada desde o 1º dia de cultivo. As taxas de blastocisto usando 1 e 10mM de ARG foram similares ao controle (48%±13,03 e 34,2%±3,92 vs 49,4%±4,82, respectivamente, p>0,05), mas 50mM prejudicou a taxa de desenvolvimento embrionário (10,7%±7,24, p<0,001). No experimento 3, ARG a 1mM foi adicionada do 5º ao 8º dia de cultivo. Foram observadas taxas de desenvolvimento similares ao grupo GLN (somente com glutamina). Mas comparada ao controle (sem ambos os aminoácidos), rendeu melhores taxa de eclosão (54,8%±6,9 vs 41,4%±11,47, respectivamente, p<0,05) e qualidade embrionária (84,8%±2,63 vs 52%±8,62, respectivamente, p<0,05), mas não de taxa de blastocisto (49,4%±6,5 vs 49,4%±4,8, respectivamente, p>0,05). Neste período a produção de NO- foi positivamente correlacionada com a taxa de eclosão (R²=96,4%, p<0,001) e a qualidade embrionária (R²=75,5%, p<0,05). Adicionalmente, embriões foram cultivados na presença de L-NAME e ARG simultaneamente (grupo ARG/LN), do 5º ao 8º dia de cultivo, e os transcritos de OCT-4 e INT-t foram quantificados por PCR tempo real. Foi encontrada expressão similar de OCT-4 (p>0,05), mas redução de 1,8x e 1,5x de INT-t em relação aos grupos controles ARG e GLUT (p<0,05), respectivamente. Esses dados fornecem evidências da contribuição do NO-, principalmente no período entre os estágios de mórula e blastocisto, para a melhoria da eclosão e qualidade embrionária. A produção de NO- é requerida para o desenvolvimento pré-implantacional de embriões bovinos produzidos in vitro, e pode ser mediada pela suplementação do meio de cultivo com ARG. / Nitric Oxide (NO-) is a cell signaling molecule regulating preimplantation embryo development. We have now investigated the role of NO- in culture of bovine embryos in vitro produced, using N-Nitro-L-Arginine Methyl-Ester (L-NAME), an inhibitor of NO- production, and L-arginine (ARG), a precursor for NO-, in different periods of culture (embryo genome activation and compaction). NO- effects were assessed by developmental rates, kinetics of development, embryo quality, and gene expression. Embryos were generated by in vitro maturation and fertilization of oocytes aspirated from abattoir-derived ovaries. In experiment 1, the rates of development were measured in SOFaa in the presence of L-NAME (10mM) in different periods: from day 1st to 4th (LN1-4), from 4th to 8th (LN4-8) and from day 1st to 8th (LN1-8). The NO- inhibition was detrimental from the day 4th of culture (LN4-8 and LN1-8 groups), decreasing the blastocyst hatching (17.3%±13.44 and 13.7%±14.51, respectively, p<0.05). However the most negative effect occurred from the 1st to 8th day of culture which the blastocyst rate was significantly decreased compared to control (29.4%±3.72 vs 47.8%±11.34, respectively, p<0.05). Due to, in experiment 2, ARG (1, 10 and 50mM) was additioned since the 1st day of culture. The blastocyst rates using ARG at 1 and 10mM were similar to control (48%±13.03 e 34.2%±3.92 vs 49.4%±4.82, respectively, p>0.05), but 50mM was found to impair embryo development (10.7%±7.24, p<0.001). In experiment 3, ARG at 1mM was additioned from the 5th to 8th day of culture. The development rates were similar to GLN group (with glutamine only). However, compared to control group (without both aminoacids) ARG addition yielded improved blastocyst hatching (54.8%±6.9 vs 41.4%±11.47, respectively, p<0.05) and embryo quality (84.8%±2.63 vs 52%±8.62, respectively, p<0.05), but not blastocyst rate (49.4%±6.5 vs 49.4%±4.8, respectively, p>0.05). NO- production was positively correlated with blastocyst hatching (R²=96.4%, p<0.001) and embryo quality (R²=75.5%, p<0.05). Additionally, embryos were cultured in the presence of L-NAME and ARG simultaneously (ARG/LN group), from the 5th to 8th day of culture, and OCT-4 and INT-t transcripts were measured by real time PCR. Was found a similar expression of OCT-4 (p>0.05), but a significant decrease of 1.8 and 1.5 fold of INT-t expression related to control groups ARG and Glutamine (p<0.05), respectively. These data provide evidence that NO- contributes to hatching and embryo quality improvement, especially at the period between morula and blastocyst stages. NO- production is required to preimplantational development of bovine embryos in vitro produced and can be mediated by supplementation of medium culture with ARG.

A poluição do ar é associada a diferentes patologias inclusive as que afetam o sistema nervoso central. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito do material particulado fino (PM2,5) da cidade de São Paulo nas células de Purkinje de embriões de galinha. Dose única de PM2,5 em suspensão (1,5 ou 20,0 Pg.100Pl-1) foi injetada em ovos fertilizados de galinha em E0 foram artificialmente incubados por 18 dias (E18). Análises morfométricas no cerebelo foram realizadas em material submetido à reação imuno-histoquímica com anticorpos dirigidos à calbindina (CB), ao fator neurotrófico derivado do encéfalo (BDNF) e à caspase 3 (CAS) para avaliação da densidade de células de Purkinje, de seus dendritos e da taxa de apoptose nestas células. A expressão do BDNF no cerebelo foi determinada pelo método de immunoblotting. A ocorrência de elementos traço e de peroxidação lipídica no cerebelo foi avaliada, assim como a atividade da superóxido dismutase (SOD) e da catalase. Não foram observadas diferenças no desenvolvimento geral e na taxa de mortalidade dos embriões submetidos ao PM2,5 em comparação aos controles. Embora o PM2.5 em suspensão tenha apresentado elevada quantidade de elementos traço, depleção na concentrações de elementos como Cu, Mg, Mn, Se e Zn foi observada no cerebelo dos animais. Comparados ao controle salina, animais submetidos às concentrações de PM2,5 apresentaram diminuição da densidade de células de Purkinje CB+ nos grupos PM2,5 (18% no PM2,51,5 Pg e 23% no grupo PM2,5 20,0 Pg). Aumento de 45% na densidade de dendritos das células de Purkinje no grupo exposto a PM2,5 20,0 Pg foi observado. Redução significativa na expressão de BDNF no cerebelo e também na densidade de células de Purkinje BDNF+ no grupo PM2,5 20,0 Pg foi observada em relação aos controles e ao grupo PM2,51,5 Pg. A ocorrência de células de Purkinje apoptóticas não variou entre os grupos deste estudo da mesma forma em que a peroxidação lipídica e a atividade de SOD também não variaram. Contudo, foi observada maior atividade da catalase no cerebelo dos animais expostos ao material particulado. Conclusão: O material particulado fino da cidade de São Paulo afetou o desenvolvimento embrionário das células de Purkinje no modelo empregado e promoveu a ativação de mecanismos antioxidantes. A composição elementar do material particulado da cidade de São Paulo pode estar associada à perturbação da poda dendrítica nas células de Purkinje / Air pollutants are associated to several diseases including those related to central nervous system. The aim of this work was to evaluate the effect of urban fine particles (PM2.5) in chicken embryo Purkinje cells. A single dose of PM2.5 suspension in two different concentrations (1.5 or 20.0 Pg.100Pl-1) was injected in fresh laid fertilized eggs on E0. Control groups were performed (intact and saline groups). After 18 days of embryo incubation (E18), no differences in general abnormal development and mortality ratio were found between groups. Cerebellar morphometrical analysis for neuronal density, dendritic outgrowth and cellular apoptosis were scored in anti-CB, anti-BDNF and anti-CAS immunelabeled Purkinje cells. Measurements of trace elements, lipid peroxidation, superoxide dismutase and catalase were performed as well. PM2.5 suspensions presented high amounts of metals but the cerebellar tissue presented metal depletion. Compared to control animals (saline group) both PM2.5 doses exposed embryos showed a decreased number of Purkinje cell CB+ (ca. 18% for PM2.5 1.5 Pg and 23% for PM2.5 20.0 Pg) and increased Purkinje cell dendritic branches density in the PM2.5 20.0Pg exposed embryos (ca. 45% for PM2.5 20.0Pg). Interestingly, a significant reduction of Purkinje cell BDNF expression was observed in the PM2.5 20 Pg group embryos when compared to those of the control and PM2.5 1.5Pg groups. No alterations in the number of Purkinje cells CAS+ were observed. The lipid peroxidation and SOD activity showed similar levels in the cerebellar tissue of all experimental groups, although significant higher levels of CAT were detected in PM2.5 20 Pg group cerebella. In conclusion, urban fine particles impair the embryonic development of Purkinje cells in chick embryo model as well promote the antioxidant defense activation. PM2.5 elemental compounds may disrupt the physiological dendritic pruning of Purkinje cells

There is a growing appreciation that eukaryotic genomes are transcribed into numerous, previously undetected - and thus uncharacterized regulatory long non-coding RNAs (lncRNAs). Recent studies are primarily focused on lncRNAs transcribed from intergenic regions and enhancers, leaving antisense lncRNAs the least studied group of lncRNAs. At the same time, antisense transcription occurs in up to 74 % of human gene loci, frequently - from the opposite strand of genes encoding proteins involved in regulation of transcription. Here, we identified HIPSTAR (Heterogeneously expressed from the Intronic Plus Strand of the TFAP2A-locus RNA), a novel conserved lncRNA that is transcribed antisense to the TFAP2A gene. Unlike previously reported antisense lncRNAs, HIPSTR expression does not correlate with the expression of its antisense counterpart. Although HIPSTAR and TFAP2A are co-expressed in in vitro derived neural crest and trophoblast cells, only HIPSTAR and not TFAP2A is specifically expressed in a subset of cells within 8-cell- and morula-stage human embryos. We show that, similar to HIPSTAR, in the individual cells of developing human embryos or of stable cell lines the expression of lncRNAs is more highly heterogeneous than the expression of mRNAs. Finally, we demonstrate that HIPSTAR depletion in HEK293 and H1BP, a human embryonic stem cell line, predominantly affects the expression levels of genes involved in early organismal development and cell differentiation. Together, we show that expression of HIPSTAR and hundreds other lncRNAs is highly heterogeneous in human embryos and cell lines. We use HIPSTAR to exemplify the functional relevance of lncRNAs with heterogeneous and developmental stage-specific expression patterns. / Tem sido cada vez mais reconhecido que a transcrição dos genomas eucarióticos produz múltiplos transcritos novos, anteriormente não detectados e ainda não caracterizados, sendo que a maioria é constituida de RNAs não-codificantes longos (lncRNAs) regulatórios. Estudos recentes estão focados principalmente nos lncRNAs transcritos de regiões intergênicas e enhancers; assim, o grupo dos lncRNAs antisenso permanece o menos estudado de todos. Ao mesmo tempo, a transcrição antisenso ocorre em até 74% dos loci de genes humanos, frequentemente - a partir da fita oposta de genes que codificam proteínas envolvidas na regulação da transcrição. No presente trabalho, nós identificamos HIPSTR (Heterogeneously expressed from the Intronic Plus Strand of the TFAP2A-locus RNA), um lncRNA novo conservado que é transcrito a partir da fita antisenso do gene TFAP2A. Ao contrário do anteriormente relatado para os lncRNAs antisenso, a expressão de HIPSTR não está correlacionada com a expressão do gene da fita oposta. HIPSTR e TFAP2A são co-expressos em células da crista neural e em trofoblastos derivadas in vitro, mas somente HIPSTR e não TFAP2A está especificamente expresso num subconjunto de células de embriões humanos nos estágios de 8-células e mórula. Mostramos que, semelhante a HIPSTR, a expressão de lncRNAs é mais altamente heterogênea que a expressão de mRNAs em células individuais de embriões humanos em desenvolvimento ou em linhagens estáveis de células. Finalmente, nós demonstramos que a depleção de HIPSTAR em células HEK293 e H1BP, uma linhagem de células tronco embrionárias humanas, afeta predominantemente os níveis de genes envolvidos no início do desenvolvimento do organismo e na diferenciação de células. No conjunto, nós mostramos que a expressão de HIPSTR e de centenas de outros lncRNAs é altamente heterogênea em embriões humanos e linhagens celulares. Usamos HIPSTR para exemplificar a relevância funcional de lncRNAs com padrões de expressão heterogêneos e estágio-de-desenvolvimento específicos.