Orientador: Prof. Dr. Daniel Carneiro Carrettiero / Tese (doutorado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Neurociência e Cognição, 2015. / A doenca de Alzheimer (AD) e a mais diagnosticada de todas as demencias e afeta aproximadamente 12,5% das pessoas com idade superior a 65 anos. A doenca piora progressivamente, causando um alarmante declinio na funcao cognitiva e eventualmente a morte. Duas caracteristicas histopatologicas da doenca sao presenca das placas do peptideo beta-amiloide (AB) e emaranhados neurofibrilares da proteina tau hyperphosphorilada. A hipotese amiloide da AD propoe que o beta-amiloide (AB) induz a fosforilacao da tau, resultando na formacao de agregados toxicos, perda da funcao neuronal e morte neuronal. Curiosamente, em neuronios nao-diferenciados AB e neuroprotetora em vez de neurotoxica. Em neuronios diferenciados, a neurotoxicidade de AB e dependente da expressao da proteina tau. A co-chaperona BAG2 foi identificada como capaz de estimular a degradacao da proteina tau fosforilada, sugerindo que pode reverter a eventual agregacao de tau hiperfosforilada citotoxica. A relevancia da BAG2 nos processos neurotoxicos induzidos pela AB, dentro de um contexto de maturac.o neuronal, nao foi anteriormente pesquisada e representa uma interessante hipotese no quanto possa ajudar a elucidar os mecanismos celular-moleculares responsaveis pela patologia da doenca de Alzheimer. O objetivo deste estudo foi caracterizar a funcao e regulacao de BAG2 no contexto da morte celular induzida por AB em neuronios nao-diferenciados e diferenciados. A expressao de BAG2 em celulas SH-SY5Y foi analisada sob condicoes de nao-diferenciacao e diferenciacao. O BAG2 foi superexpressada em celulas SH-SY5Y nao-diferenciadas, que foram depois tratadas 15 com o peptido AB. A morte celular foi avaliada por exclusao de azul de tripano. A regiao do promotor de BAG2 foi analisada para avaliar a frequencia e distribuicao de sitios-alvo de varios fatores de transcricao para identificar fatores que regulam a expressao do BAG2. Os niveis de expressao de BAG2 foram determinados utilizando RT-PCR. Nos mostramos que a expressao de BAG2 aumenta com a diferenciacao das celulas SH-SY5Y. AB e neurotrofico para as celulas SH-SY5Y nao-diferenciadas, porem e neurotoxica de celulas diferenciadas. A superexpressao da co-chaperona BAG2 foi suficiente para causar uma mudanca na sinalizacao de AB de neurotrofico para neurotoxico em celulas nao-diferenciadas. A superexpressao de BAG2, na ausencia de AB, nao teve efeito na morte celular ou no grau de diferenciacao em celulas SH-SY5Y nao-diferenciadas. Em seguida analisamos a regiao do promotor de BAG2 e descobrimos uma prevalencia de sitios do NF .kB, os quais co-localizavam com o sitio de iniciacao da transcricao do BAG2. O tratamento das celulas, tanto com ativadores e inibidor do NF-kB, revelou que o BAG2 e reprimido pela atividade do NF- kB. Em conjunto, estes dados sugerem que a ausencia de BAG2 em celulas nao-diferenciadas e suficiente para lhes conferir resistencia a morte induzida por AB. Assim, sugerimos que a inducao da expressao de BAG2 atraves da interrupcao ou alteracao de sinalizacao de NF-kB pode criar um ambiente celular em neuronios maduros que e sensivel, em vez de resistente, a morte celular induzida por AB. / Alzheimer¿s disease (AD) remains the most-diagnosed of all dementias, affecting approximately 12.5% of persons over 65 years of age. The disease progressively worsens causing an alarming decline in cognitive function, often culminating in death. Two histopathological hallmarks of Alzheimer¿s disease are beta-amyloid (AB) peptide plaques and neurofibrillary tangles of hyperphosphorylated tau protein. According to the amyloid hypothesis of AD, AB induces tau phosphorylation which results in the formation of toxic protein aggregates, loss of neuron function, and neuronal death. Interestingly, AB has been shown to be neurotrophic rather than neurotoxic to neural precursors in animal and cell culture models, and the neurotoxicity of AB in differentiated neurons has been found to be dependent upon tau protein expression. The co-chaperone BAG2 has recently been shown to stimulate the degradation of accumulated phosphorylated tau protein, suggesting that it may abrogate aggregation of tau into cytotoxic neurofibrillary tangles. The relevance of BAG2 to AB-induced neurotoxicity within the context of neuron maturation is not presently understood, and may help to further elucidate the cell-molecular mechanisms responsible for Alzheimer¿s disease pathology. The aim of this study was to characterize the function and regulation of BAG2 within AB-induced cell death in undifferentiated and differentiated neurons. BAG2 expression in SH-SY5Y cells was analyzed under undifferentiated and differentiated conditions. BAG2 was overexpressed in undifferentiated SH-SY5Y cells, which were then treated with AB peptide. 13 Cell death was evaluated by Trypan blue exclusion. The BAG2 promoter region was analyzed for the frequency and distribution of various transcription factor regulatory motifs to identify BAG2-regulating factors. BAG2 expression levels were determined using RT-PCR. We show that BAG2 expression increases on differentiation of SH-SY5Y cells. AB is neurotrophic to undifferentiated SH-SY5Y cells, while it is neurotoxic to differentiated cells. Overexpression of the co-chaperone BAG2 was sufficient to cause a switch in AB signaling from neurotrophic to neurotoxic in undifferentiated cells. BAG2 overexpression, in the absence of AB, had no effect on cell death or degree of differentiation in undifferentiated SH-SY5Y cells. We next analyzed to putative BAG2 promoter region and discovered a preponderance of NF-kB binding motifs that co-localized to the BAG2 transcription start site. Treatment of cells with NF-kB activators and inhibitor reagents revealed that BAG2 is repressed by NF-kB signaling. Together, these data suggest that the absence of BAG2 in undifferentiated cells is sufficient to render them refractive to AB-induced death. We thus suggest that the expression of BAG2 expression via the disruption or modification of NF-kB signaling may create a cellular environment in mature neurons that is sensitive rather than resistant to AB-induced cell death.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:22Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-03-17Bitstream added on 2014-06-13T19:43:01Z : No. of bitstreams: 1 penteado_fcl_dr_arafcf.pdf: 1008387 bytes, checksum: 40b22d48514b2c755f67d69d9ae8cff6 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / Alguns trabalhos realizados recentemente relatam que as células-tronco mesenquimais (CTM) podem ser induzidas à aquisição de marcadores hepatocíticos pelo transplante em modelos animais de dano hepático, ou pelo cultivo in vitro com fatores de crescimento e citocinas. O presente trabalho teve por objetivo avaliar o comportamento das CTM frente à indução da diferenciação hepatocítica. As CTM foram isoladas da medula óssea de quatro doadores saudáveis, caracterizadas e submetidas ao protocolo de indução à diferenciação hepatocítica in vitro e in vivo. As células induzidas in vitro apresentaram mudanças na sua morfologia, mostrando a morfologia semelhante à do hepatócito, porém, o perfil imunofenotípico não foi modificado. As células induzidas também não apresentaram o aumento dos transcritos de albumina, citoqueratina 18 e citoqueratina 19 quando analisadas por RT-PCR em tempo real, e não alteraram a expressão de albumina, citoqueratina 18 e alfafetoproteína como demonstrado por imunofluorescência. Quando analisadas in vivo, as CTM demonstraram o potencial migratório para o tecido hepático danificado de camundongos imunodeficientes. Em conjunto, os resultados sugerem que as CTM da medula óssea não são capazes de se diferenciar em hepatócitos quando estimuladas in vitro pela metodologia utilizado neste trabalho, mas são capazes de migrar para o tecido hepático danificado in vivo, o que sugere o seu papel no reparo do fígado. A contribuição para o reparo pode estar associada com o efeito parácrino dessas células. / Some recently works have been reported that mesenchymal stem cells (MSC) can be induced to the acquisition of hepatocytic markers for the transplant in animal models of liver damage, or for the in vitro culture with growth factors and cytokines. The present work aim is to evaluate the behavior of the MSC in front of the induction of the hepatocytic differentiation. The MSC was isolated from the bone morrow of 4 normal donators, characterized and submitted to the protocol of in vitro and in vivo induction of hepatocytic differentiation. The in vitro induced cells showed morphology changes acquiring hepatocytes-like morphology. However, the immunophenotypic profile of those cells was not modified. The induced cells did not present increase of the albumin, cytokeratin 18 and cytokeratin 19 transcripts, when analyzed by real time RTPCR. The expression of albumin, cytokeratin 18 and alpha foetoprotein was also not modified as demonstrated by immunofluorescence. In vivo, the MSC have demonstrated the migratory potential for the damaged liver of immunodeficient mice. Together, the results suggest that the bone morrow MSC are not capable of in vitro hepatocytic differentiating according to the approach in this work, but are capable to homming into damaged hepatic tissue in vivo. This migration capacity suggests their role in the repair mechanisms.

Orientador : Profª. Drª. Rosana Nogueira de Morais / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 19/12/2016 / Inclui referências : f. 64-72;80-91 / Área de concentração : Fisiologia / Resumo: Durante o período embrionário a ação dos androgênios tem papel determinante na diferenciação sexual, no desenvolvimento dos órgãos sexuais masculinos e, naturalmente, produzem efeitos masculinizantes no cérebro. A baixa razão 2D:4D, obtida pela divisão do comprimento do segundo dedo (indicador) pelo quarto dedo (anelar), é apontada como indicador de androgenização pré-natal e associada com desempenho esportivo em muitas modalidades. Nós analisamos a associação da medida da razão 2D:4D com desempenho esportivo, caracteristicas fisicas, psicológicas e hormonais. Foram três estudos apresentados no formato de artigo. No estudo 1 analisanos a medida da razão 2D:4D direta (diretamente na mão do sujeito) e a medida indireta (em imagens da mão por escâner) de 114 homens e 90 mulheres e, adicionalmente, realizamos uma revisão de literatura minuciosa para comparar nossos dados. Demonstramos que há um efeito direcional no qual a medida direta da razão 2D:4D tende a ser maior que a medida indireta, ou seja, a medida indireta superestima o grau de androgenização pré-natal. No estudo 2, avaliamos, a produção de força muscular, liberação de testosterona, cortisol, agressividade e estabilidade emocional em 89 homens adultos, quando expostos a um vídeo contendo imagens de agressão no esporte (situação desafiadora) comparando com os mesmos em situação controle. Foi demostrado que a situação desafiadora modula um aumento de força muscular, de agressividade e de concentração de testosterona e ainda diminui a estabilidade emocional. A maior produção de força na situação de desafio, foi associada por regressão múltipla com baixa razão 2D:4D e a maior controle emocional. No estudo 3, avaliamos a razão 2D:4D de 64 tenistas infanto-juvenis do sexo masculino e observamos que a menor razão 2D:4D foi associada em 35% com melhor desempenho tenístico, em 20% com maior produção de força muscular, em 9% com maior potência muscular de membros inferiores e em 7% com maior índice de autoconfiança. Não encontramos associação da razão 2D:4D com concentrações hormonais, apenas confirmamos o resultado do estudo 2, no qual ocorre um aumento de testosterona em 13% quando os sujeitos foram submetidos aos desafios dos testes físicos. Por fim, indicamos que há associação da razão 2D:4D e desempenho no tênis, porém estudos em mulheres e mais aspectos necessitam ser investigados para entender melhor qual componentes explicam a relação da androgenização pré-natal e desempenho no tênis. Mesmo assim, apresentamos dados suficientes para sugerimos que a medida da razão 2D:4D pode auxiliar treinadores, como medida adicional, na avaliação física de jovens atletas. Palavras-chave: Diferenciação sexual, Razão do dedo, 2D:4D, medida direta e indireta, força estatística, testosterona, agressão, força de preensão manual. 2D:4D. / Abstract: Prenatal androgenization plays an important role in human brain development and influences human behaviour. Digit ratio (2D:4D), the relative lengths of the index finger (2D) and the ring finger (4D), is a putative marker for prenatal testosterone and is correlated with performance in many sports. This thesis analysed the relationship between 2D:4D ratio with sport performance and physical, psychological and endocrine characteristics. It divided in three studies, and in the first one we investigated a methodological question regarding 2D:4D measuring. We compared direct versus indirect measurement of digit ratio (114 males and 90 females). And reviewed the literature on this issue. We found that direct 2D:4D measuring tends to be larger than indirect ones, indicating that direct and indirect mean 2D:4D's should not be compared in between-population studies. On the second study, we hypothesised that correlation between 2D:4D and strength may be strongest in challenge conditions when short-term changes occur in steroid hormones. The challenge condition increased Handgrip strength (HGS), and elicited modest changes in testosterone (T), physical aggression and emotional stability. HGS correlated negatively with left hand 2D:4D. In a multiple regression, left hand 2D:4D was negatively related to HGS and emotional stability was positively related to HGS. In the control condition HGS was not correlated with 2D:4D. Our conclusions were that 2D:4D is a negative correlate of strength in challenge situations and this finding may in part explain associations between 2D:4D and sports performance. In the third study, we assessed 64 male junior tennis players and found that low 2D:4D ratios were associated in 35% with better tennis performance, in 20% with higher HGS, in 9% with explosive muscular strength and in 7% with best self-confidence. There was no relationship between 2D:4D ratios and steroid hormones, although, as we found on study two there was a T increase in 13% after the physical tests challenge. Finally, we suggest that there are associations with 2D:4D ratios and junior tennis performance, however, studies in female junior tennis players and other sports-related variables are still needed. We suggest that 2D:4D ratios could help sports coaches as an additional measure on young athlete assessments. Key words: Sexual Differentiation, Digit Ratio, 2D:4D; direct vs indirect measurement; Tennis; Testosterone; Aggression; Hand-grip Strength

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:33:26Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-02-15Bitstream added on 2014-06-13T20:48:11Z : No. of bitstreams: 1 ribeiro_sam_dr_jabo.pdf: 714385 bytes, checksum: 8dea9f3890502c7e3fa86484716ab25e (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A Salmonella Pullorum (SP) é muito semelhante à Salmonella Gallinarum (SG), agentes da Pulorose e Tifo aviário, respectivamente, sendo responsáveis por perdas econômicas no setor avícola. São salmonelas de composição antigênica similar e a distinção de ambas tem sido baseada em provas bioquímicas. Entretanto, este procedimento é laborioso e o surgimento de estirpes com comportamento bioquímico atípico tem estimulado a procura por outros métodos de diagnóstico, como os testes moleculares. No presente estudo, analisou-se o método descrito na literatura envolvendo o gene rfbS em conjunto com testes desenvolvidos com base nos genes speC e speF. O gene rfbS codifica a enzima que atua na parede celular de bactérias e tem sido utilizado para diferenciar SP e SG. Com o propósito de padronizar a PCR para ser utilizada na rotina laboratorial, empregou-se dois métodos de extração de DNA e diferentes concentrações de reagentes. Entretanto, tendo em vista a dificuldade de padronização encontrada desde o início, foi concomitantemente desenvolvida a PCR para os genes speC e speF. Estes dois últimos estão relacionados com a produção da enzima ornitina-descarboxilase, a qual é ativa em SP e inativa em SG. Após testes inicias, foi possível padronizar a PCR do gene speC com posterior utilização da técnica de tratamento enzimático com a enzima de restrição Eco RI. Tanto para o gene rfbS quanto para os genes speC e speF, os resultados encontrados permitiram a diferenciação de 13 amostras de SP e 20 de SG isoladas no Brasil e duas cepas ATCC. Sendo assim, as ações sanitárias e a tomada de decisão no campo podem ser conduzidas de maneira rápida e segura. / Salmonella Pullorum (SP) is very similar to Salmonella Gallinarum (SG). They are respectively agents of Pulorosis and Avian Typhoid, both diseases responsible for economic losses to poultry production. Due to the fact that both salmonellas have similar antigenic composition, their differentiation has been based in biochemical tests. However, this fact that this kind of procedure is very troublesome and the occurence of strains showing atypical behavior have stimulated the search for others diagnostic methods, such as molecular tests. In the present study, a method described in the literature using gene rfbS was analyzed together with tests developed based on genes speC and speF. Gene rfbS encodes an enzyme that acts on the cell wall of bacteria and has been used in the differentiation between SP and SG. In order to standardize the PCR procedure to be used in laboratory routine, two methods for DNA extraction were used, as well as different concentrations of the reagents. However, due to the difficulty in the standardization observed from the beginning of the study, a PCR procedure was developed for genes speC and speF. These genes are related to the production of the enzyme ornithine-descarboxilase, active in SP and inactive in SG. After the initial tests, PCR of gene speC was standardized, and later on it was coupled with the enzymatic treatment with restriction enzyme Eco RI. Results obtained for gene rfbS as well as for genes speC and speF enabled differentiation of 13 SP and 20 SG strains isolated in Brazil and two strains ATCC. So, the sanitary actions and the decisions in the livestock can to be conduced with safety and rapidity.

Made available in DSpace on 2015-08-20T17:10:03Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-03-19. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-20T17:25:56Z : No. of bitstreams: 1 000841287.pdf: 8587656 bytes, checksum: ca2f8ef9029e8a0cc94a35c1626268bf (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / No âmbito dos estudos sobre os problemas ambientais urbanos, principalmente àqueles associados ao clima - notadamente a partir da temperatura busca-se aprofundar o referencial para a identificação da gênese dos processos que desencadeiam esses problemas. É nesse contexto que a dissertação intitulada Clima e produção do espaço urbano: contribuição ao estudo da geografia do clima no contexto das cidades de São Carlos e Marília tem como objetivo analisar e identificar a ocorrência e a distribuição espacial e temporal das diferenças e semelhanças termohigrométricas entre as cidades de Marília/SP e São Carlos/SP e em seus distintos espaços intraurbanos. Para isso são consideradas as diferentes formas e estruturas urbanas decorrentes do processo de produção dos espaços. A partir da perspectiva analítica da Geografia do Clima buscou-se contribuir com as discussões sobre a complexa associação entre clima e espaço urbano, considerando que os diferentes graus de susceptibilidade urbana são aplicáveis aos diferentes graus de tecnificação empregados nos diferentes espaços. Para isso, o contexto histórico de produção das alterações no espaço urbano das cidades foi discutido e posteriormente, foram caracterizados detalhadamente os setores geográficos por meio de indicadores geoambientais, da morfologia urbana e fisiográficos. Em seguida buscou-se identificar por meio de registros termohigrométricos fixos e móveis os locais de ocorrência e a magnitude dos gradientes de temperatura e umidade relativa. Constatou-se não somente a existência de um clima urbano em São Carlos e Marília, com magnitudes superiores a 10°C e 6°C... / On the studies about urban environmental problems, mainly the ones related to climate and temperature data, it is desired to develop the benchmark of triggers that initiate environmental issues. In this context, the dissertation entitled Climate and Production of Urban Space: Contribution to the Study of Climate Geography in the Context of the Cities São Carlos and Marilia aims to analyze and identify the occurrence and spatiotemporal distribution of thermohygrometric differences and similarities between Marília/SP and São Carlos/SP and their distinct interurban spaces. To this end, different urban shapes and structures resulting of the their production are considered. From the analytic perspective of Climate Geography, we sought to contribute to the discussions about the complex associations between climate and urban space, considering that different degrees of urban susceptibility are applicable to different degrees of technification employed in the different spaces. In order to do so, the historic context of the alterations in the cities' urban spaces was discussed and afterwards, geographic sectors were throughly described by means of geoenvironmental indicators, of urban morphology and physiographics. Next, we sought to identify the places of occurrence and magnitude of the gradients of temperature and relative humidity by means of fixed and mobile thermohygrometric records. It was found not only the existence of urban climate in São Carlos and Marilia, with magnitudes above 10ºC and 6ºC...

Submitted by Simone Souza (simonecgsouza@hotmail.com) on 2017-09-19T13:23:59Z No. of bitstreams: 1 DISS_2014_Heron Fernandes Vieira Torquato.pdf: 2253066 bytes, checksum: 04567ef3aaa1fd3c33944fec7ac526d6 (MD5) / Approved for entry into archive by Jordan (jordanbiblio@gmail.com) on 2017-09-26T12:32:53Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DISS_2014_Heron Fernandes Vieira Torquato.pdf: 2253066 bytes, checksum: 04567ef3aaa1fd3c33944fec7ac526d6 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-26T12:32:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISS_2014_Heron Fernandes Vieira Torquato.pdf: 2253066 bytes, checksum: 04567ef3aaa1fd3c33944fec7ac526d6 (MD5) Previous issue date: 2014-03-24 / CAPES / Torquato, H.F.V. Avaliação da atividade e do mecanismo de ação antileucêmica da cantinona. 2014. 73 f. Dissertação apresentada à Coordenação de Programas de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Faculdade de Medicina da Universidade Federal de Mato Grosso, como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde, Área de Farmacologia. A leucemia mielóide aguda (LMA) é uma doença maligna de natureza proliferativa, em que as células leucêmicas não terminam o processo de diferenciação celular. Na terapia padrão da LMA é necessária intensa quimioterapia, a qual é acompanhada de baixas taxas de remissão, por longos períodos e toxicidade. Portanto, novas opções terapêuticas para o tratamento da leucemia são necessárias. A cantinona (Cant) representa uma subclasse de alcaloides beta-carbonílicos, isolada de plantas, especialmente das famílias Simaroubaceae e Rutaceae. São referidas atividades antiulcerogênica, antibacteriana e antifúngica para a Cant, e atividade citotóxica, antimalárica e antiviral para alguns análogos sintéticos. O objetivo desse trabalho foi investigar o potencial antitumoral e mecanismo de ação da Cant em linhagens celulares de LMA. Para tanto, a atividade citotóxica foi realizada nas linhagens Kasumi-1 e KG-1 por meio da marcação com anexina V e iodeto de propídeo após tratamento com Cant (28; 56; 113 e 227 μM) por 24 h. Verificou-se a ação do alcaloide sobre diferentes parâmetros celulares em células Kasumi-1 (45 μM), tais como integridade das membranas lisossomais e mitocondriais, ativação de caspases 3, 8 e 9, expressão de importantes proteínas relacionadas à sobrevivência das células (ERK 1/2 e Bcl-2). Adicionalmente, foi avaliada a capacidade da Cant (14 μM) em induzir a diferenciação mielóide em ambas linhagens celulares. Os resultados mostraram que a Cant apresentou potencial atividade antitumoral com CI50 de 38,9±1 μM para Kasumi-1 e 39,1±1 μM para KG-1. A Cant promoveu permeabilização lisossomal demonstrada pelo extravasamento do corante laranja de acridina dos lisossomos para o citosol e produziu queda em 54,6% (p<0,001) no potencial de membrana mitocondrial. A ativação das caspases 3 e 8 foram seguidas pelo aumento na fluorescência na ordem de 2,4 (p<0,01) e 2,5 (p<0,05) vezes, respectivamente, comparadas as células que não receberam tratamento e a caspase 9 (p<0,01) elevou o sinal em 2,1 vezes. A expressão proteica de ERK 1/2 e Bcl-2 foram reduzidas, sendo mais expressiva para 45 μM de Cant (43%, p< 0,01) no caso de ERK 1/2 e com 135 μM (53%, p< 0,01) para Bcl-2. Na diferenciação celular, verificou-se aumento na expressão de CD15+ e CD 11b+, na ordem de 2,5 vezes (p<0,001), nas células Kasumi-1 tratadas com 14 μM de Cant, quando comparado às células não tratadas. Contudo, em células tronco leucêmicas (CD34+CD38-Lin) houve redução na expressão destas em aproximadamente 7 vezes (p<0,001), em relação às células sem tratamento (controle). Em KG-1 tratadas com 14 μM de Cant, a expressão de CD15+ foi elevada na ordem de 2,5 vezes (p<0,001), porém nenhuma diferença foi observado para CD11b+, enquanto a expressão de células tronco leucêmicas dobrou (p<0,001). Esses dados em conjunto demonstram que a Cant apresenta atividade antitumoral em células LMA, sendo a morte celular mediada pelas ativações das vias extrínseca e intrínseca da apoptose, possivelmente, com maior contribuição da via mitocondrial, com participação importante dos lisossomos neste mecanismo. Em adição aos seus efeitos sobre a proliferação de células leucêmicas, Cant apresentou importante ação na diferenciação celular, o que a credencia como importante candidato a fármaco antitumoral na LMA, uma vez que a doença é passível de sofrer terapias baseadas na diferenciação, o que atualmente fornece melhor prognóstico ao paciente. / Torquato, H.F.V. Evaluation of the activity and mechanism of action antileukemic of canthinone. 2014. 73 f. Dissertation submitted to the Health Science Post Graduate Programs Coordination of the School of Medicine of the Federal University of Mato Grosso, as a partial requirement for the degree of Master in Health Sciences. Pharmacology Area. Acute myeloid leukemia (AML) is a malignant proliferative disease, where the leukemic cells do not complete the cell differentiation process. The standard therapy of AML includes intensive chemotherapy despite of its association with a low rate of remission afterward, it is also has been considered as long-term treatment with a significant toxicity. Therefore, a development of new therapeutic approaches might impact on treatment of AML. The canthinone (Cant) is a beta-carbonyl subclass of alkaloids isolated from plants, specifically Simaroubaceae and Rutaceae families. Certain activities such as antiulcer, antibacterial and antifungal were referred to Cant, whereas other activities [cytotoxic, antimalarial and antiviral] referred to some forms of its synthetic analogues. The aim of this study is to investigate the antitumor potential of Cant in AML cell lines. For this, the cytotoxic activity was performed in the lines Kasumi-1 and KG-1 marked by annexin V and PI after treatment with Cant (28, 56, 113 and 227 μM) for 24 h., where the action of its antitumor mechanism it action was investigated in Kasumi-1 cells (45 μM). The action of the alkaloid on different cell parameters was evaluated, such as the integrity of lysosomal and mitochondrial membranes, caspases 3, 8 and 9 activation, expression of important proteins related to cell survival (ERK1/2 and Bcl-2). In addition, we evaluated the ability of Cant (14 μM) to induce myeloid differentiation in both cell lines. The results showed that Cant has a potential antitumor activity with IC50 of 38.9 ± 1 μM for Kasumi-1 and 39.1±1 μM for KG-1. As well as a lysosomal permeabilization effect demonstrated by leakage of acridine orange dye from the lysosomes to cytosol, causing a drop of 54.6% (p< 0.001) in the mitochondrial membrane potential. The activation of caspases 3 and 8 were followed by an increase in fluorescence at 2.4 (p< 0.01) and 2.5 (p< 0.05) times respectively, compared to untreated cells, and caspase 9 (p< 0.01) increased 2.1 times the signal. The protein expression of ERK 1/2 and Bcl-2 was reduced, more expressively from 45 μM of Cant (43%, p<0.01) on ERK 1/2 and 135 μM of Cant (53 %, p<0.01) on Bcl-2. In the evaluation of cell differentiation, an increase of 2.5 times (p<0.001) noticed with the expression of CD15+ and CD 11b+ in Kasumi-1 cells treated with Cant (14 μM) compared to untreated cells. However, the results shows a decrease in the expression of leukemic stem cell markers (CD34+ CD38-Lin-) with approximately 7-fold (p <0.001) in comparison with control. In KG-1 cell line treated with Cant (14 μM), CD15+ expression rose up to 2.5 times (p<0.001). The expression of leukemic stem cells markers was doubled (p<0.001) with no difference in CD11b+. All these data has been shown, that Cant has antitumor activity in AML cells via cell death mechanism through activation of the extrinsic and intrinsic pathways of apoptosis, possibly with a greater contribution of the mitochondrial pathway with a significant lysosomal role. In addition to its effects on the proliferation of leukemic cells, Cant showed a significant action on cell differentiation, which qualifies it as a candidate for antitumor drug for AML treatment, where the disease therapy can be based on differentiation.

Orientador: Samira Esteves Afonso Camargo / Banca: Luana Marotta Reis de Vasconcellos / Banca: Mônica Ghislaine Oliveira Alves / Banca: Cristina Pacheco Soares / Banca: Cacio de Moura Netto / Resumo: O peptídeoLL-37 (catelicidina derivada de humano), é liberado por algumas células humanas e capaz de neutralizar os tecidos com lipopolissacarídeo (LPS), além de atrair células da polpa, e induzir a angiogênese, características que o tornam um possível adjunto para a regeneração do complexo dentino-pulpar. O objetivo desse trabalho foi avaliar in vitro a biocompatibilidade do peptídeo LL-37 nas concentrações de 5 e 10 µg/mL, e sua possível atuação na diferenciação de células-tronco da polpa dentária (DPSC) para odontoblastoslike. Com esse propósito, foram avaliados: (a) a citotoxicidade, pelo teste MTT; (b) a genotoxicidade, através do ensaio do micronúcleo; (c) a produção e quantificação de óxido nítrico; (d) as fases do ciclo celular, por citometria; (e) a expressão de alguns genes associados à formação de tecido mineralizado, através do teste qRT-PCR; (f) o conteúdo de proteína total; (g) a atividade de fosfatase alcalina (ALP); e (h) a produção de sialofosfoproteína dentinária (DSPP), pelo ensaio imunoenzimático ELISA. Foi observado que as concentrações de 5 e 10 µg/mL de LL-37 não foram citotóxicas e ainda aumentaram, em geral, a viabilidade celular (p<0,05), sendo que os maiores valores de absorbância foram observados no 3° dia de contato. As concentrações testadas também não induziram genotoxicidade, após 7 dias de contato, tendo sido genotóxico apenas o grupo controle positivo (EMS) (p<0,05). Ainda, não foi observado diferença estatisticamente significativa na produção de nitrito, pelas células expostas ao LL-37 após 7 dias, em ambas as concentrações. A análise do ciclo celular, evidenciou maior porcentual de células na fase G0/G1, em todos os grupos (p<0,05). Quando estes foram comparados, foi observado maior quantidade de células na fase G0/G1 na concentração de... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract : The LL 37 peptide (human derived cathelicidin) is released by some human cells and able of neutralizing the tissues that present lipopolysaccharide (LPS), as well as, attracts pulp cells and induces angiogenesis; characteristics that makes it a possible adjunct for regeneration of the dentin-pulp complex. The aim of this study was evaluate in vitro the biocompatibility of LL-37 in the concentrations of 5 and 10 µg/mL, and its possible performance in the differentiation of dental pulp stem cells (DPSC) into odontoblasts-like cells. For this purpose, it was evaluated: (a) the cytotoxicity by MTT assay; (b) the genotoxicity by the micronucleus test; (c) the production and quantification of nitric oxide; (d) the cell cycle, by flow cytometry; (e) the expression of genes associated with the mineralization by qRT-PCR; (f) the total protein content; (g) the alkaline phosphatase activity (ALP); and (h) the production of dentine sialofosfoprotein (DSPP) by indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). It was observed that the concentrations of 5 and 10 µg/ml of LL-37 were not cytotoxic, in addition to they increased, in general, the cell viability (p<0,05). Moreover, higher absorbance values were observed on 3rd day of contact. After 7 days, the tested concentrations also did not induce genotoxicity, (p<0,05); only the positive control group (EMS) was genotoxic (p<0.05). Furthermore, there was not statistical significance in the nitrite production by the cells exposed to LL-37 for 7 days, in both concentrations. The cell cycle test showed higher percentage of cells in the phase G0/G1 in all groups (p<0.05). When they were compared, it was noticied that concentration of 10 ug/ml of LL-37 arrested the cells in G0/G1 compared to the control group (p<0.05). On the other hand, the control group, exhibited higher amount of cells in G2 and mitosis...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor

Orientador: Andreia Bufalino / Resumo: O carcinoma espinocelular (CEC) é a sexta malignidade mais comum do mundo, e na região de cabeça e pescoço representa mais de 90% das malignidades. Mesmo com os recentes avanços nos protocolos de tratamento cirúrgico, radioterápico e quimioterápico, a taxa de sobrevida de 5 anos para pacientes com carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço (CECCP) permanece reduzida. Diversos fatores podem contribuir para esse baixo índice de sobrevida e, somado a isso, ainda não existem marcadores biológicos que possam contribuir na orientação da melhor opção terapêutica dos pacientes e na previsão do seu diagnóstico. Estudos desta natureza representam uma valiosa oportunidade para esclarecer os mecanismos moleculares envolvidos na patogênese do CECCP. Dentre estes eventos moleculares, o processo da diferenciação celular é capaz de regular a expressão de genes ligados a importantes funções celulares, incluindo o controle da proliferação celular. Neste contexto, o objetivo deste estudo foi avaliar a relação de marcadores de proliferação e diferenciação celular com parâmetros clínico-patológicos de amostras de CECCP por meio da imuno-histoquimica (IQ). Diante disto, nosso estudo avaliou um total de 46 amostras de CECCP. Quanto a expressão dos marcadores de proliferação celular, avaliamos Ki-67 (n=46) e Ciclina D1 (n=46). Para os marcadores de diferenciação celular, avaliamos CD10 (n=42) e Vimentina (n=41). A expressão aumentada de Ki- 67 foi significantemente associada com pior prognóstico (p... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Squamous cell carcinoma (SCC) is the sixth most common malignancy in the world, and in the head and neck region it represents more than 90% of malignancies. Even with recent advances in surgical, radiotherapeutic and chemotherapeutic treatment protocols, the 5-year survival rate for patients with squamous cell carcinoma of the head and neck (HNSCC) remains low. Several factors may contribute to this low survival rate and, in addition, there are still no biological markers that can contribute to the orientation of the best therapeutic option of the patients and the prediction of their diagnosis. Studies of this nature represent a valuable opportunity to clarify the molecular mechanisms involved in the pathogenesis of HNSCC. Among these molecular events, the process of cell differentiation is able to regulate the expression of genes linked to important cellular functions, including the control of cell proliferation. In this context, the objective of this study was to evaluate the relationship of proliferation and cellular differentiation markers with clinical-pathological parameters of HNSCC samples by means of immunohistochemistry (IQ). In view of this, our study evaluated a total of 46 HNSCC samples. Regarding the expression of the cellular proliferation markers, we evaluated Ki-67 (n = 46) and Cyclin D1 (n = 46). For cell differentiation markers, we evaluated CD10 (n = 42) and Vimentin (n = 41). Increased Ki-67 expression was significantly associated with poorer prognosis (p... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

O Diabetes Mellitus tipo I (DM1) é causado pela destruição auto-imune das células &#946; pancreáticas, encontradas na porção endócrina do pâncreas, constituída pelas ilhotas pancreáticas. As células &#946; são responsáveis pela produção e liberação de insulina, um hormônio que promove a internalização da glicose pelas células. Junto com outros hormônios, a insulina é um dos principais reguladores do nível de glicose sanguinea (glicemia). Uma das terapias utilizadas para o tratamento do DM1 é o transplante de ilhotas pancreáticas. Entretanto, um dos maiores problemas em relação a esta terapia é a falta de massa celular adequada para ser infundida no paciente. Uma tentativa para solucionar este problema, é o desenvolvimento de fontes alternativas de células produtoras de insulina, como as células-tronco, que possuem a capacidade de se diferenciarem em diversos tipos de células, inclusive nas produtoras de insulina. Pax4 é um dos fatores de transcrição responsáveis pela diferenciação de células &#946; , sendo essencial para o apropriado desenvolvimento e maturação destas, constitui um bom candidato para induzir a diferenciação de células-tronco em células produtoras de insulina in vitro. Para introduzir o Pax4 nas células-tronco, sem provocar alterações no genoma das células diferenciadas, em virtude dos potenciais efeitos indesejáveis de vetores que se integram ao genoma celular, recorreu-se às proteínas contendo domínio de transdução (PTDs), que são capazes de carregar a proteína Pax4, através da membrana, diretamente para o interior das células. As PTDs são pequenas sequências peptídicas que permitem a translocação de proteínas através de membranas celulares e sua internalização em células-alvo. Uma das PTDs mais comumente estudadas é a VP22, produto do gene UL49 do Herpes Simplex vírus tipo I. Portanto, a proteína de fusão VP22.Pax4 permitiria que o Pax4 fosse inserido em células-tronco, possibilitando que este fator de transcrição ative a transcrição de certos genes que aumentariam a eficiência de diferenciação das células-tronco em células produtoras de insulina. Para tal, amplificamos e clonamos o cDNA do Pax4 a partir do RNA das células RINm5f de insulinoma murino, construímos o vetor pVP22.Pax4, o qual foi transfectado em células CHO, que passaram a produzir a proteína de fusão VP22.Pax4. Após o tratamento de células-tronco com a proteína de fusão VP22.eGFP e análise por microscopia confocal, comprovamos que a VP22 é capaz de tranduzir a proteína de fusão também neste tipo celular. Portanto, incorporamos a um dos passos do protocolo de diferenciação de células-tronco em células produtoras de insulina, utilizado em nosso laboratório, a co-cultura com células CHO produtoras de VP22.Pax4. Observamos que a introdução do Pax4 leva a formação de um número maior de agregados celulares (clusters) produtores de insulina. Concluímos, então, que a utilização da VP22 como ferramenta para internalização de proteínas em células-tronco é viável e que a adição do Pax4 pode trazer melhorias para protocolos que busquem a produção de células produtoras de insulina. / Diabetes Mellitus type 1 (DM1) is caused by an auto-imunne destruction of the pancreatic &#946; cells, found in the endocrine portion of the pancreas, known as pancreatic islets. These &#946; cells are responsible production and release of insulin, a hormone which promotes glucose internalization by cells. Along with other hormones, insulin is a major regulator of blood glucose levels (glycemia). One of the therapeutical strategies used to treat DM1 is pancreatic islet transplantation. One of the major problem related to this therapy is the lack of adequate cell mass to be infused into the pacients. An attempt to solve this problem is the development of an alternative source of insulin-producing cells by differentiation of stem cells, which display this differentiating potential. Pax4 is one of the transcription factors responsibles for &#946; cell differentiation, being essential for its proper development and maturation, therefore being a good candidate to induce stem cell differentiation into insulin producing cells in vitro. A promising alternative to avoid the alterations of the differentiated cells genome due to its undesirable effects of integrating vectors, but yet allowing the Pax4 to act in diferentiation within the cells are the proteins with a transduction domain (PTDs), which would have the ability to lead the Pax4 protein directly into the cells. The Pax4 could thus act in the nucleus and generate specific transcriptional responses. The PTDs are small peptide sequences which allow translocation of proteins across cell membranes and their internalization into target cells. One of the most commonly studied PTDs is the VP22, a product of the UL49 gene from Herpes Simplex vírus type I. Therefore, the VP22.Pax4 fusion protein would transduce Pax4 into the stem cells, thus allowing the transcription activation of certain genes by Pax4, leading to improvement in the process of stem cells differentiation into insulin-producing cells. To this end, we cloned the Pax4 cDNA from RINm5f murine insulinoma cells, constructed the pVP22.Pax4 vector and transfected this construct into CHO cells, which then produced the VP22.Pax4 fusion protein. Upon verifying that VP22 was also able to transduce proteins into stem cells, by confocal microscopy analysis, after the treatment of these cells with the fusion protein VP22.eGFP, we incorporated the fusion protein VP22.Pax4 to one of the steps of the protocol used for stem cells diferentiation into insulin producing cells in our lab, by co-culturing with CHO cells producing VP22.Pax4. We observed that the addition of Pax4 led to the formation of a higher number of insulin producing cell clusters, therefore we conclude that VP22 may be used as a tool to internalize proteins into stem cells, and that the addition of Pax4 may improves protocols seeking the production of insulin-producing cell

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:00Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-05-07Bitstream added on 2014-06-13T19:49:29Z : No. of bitstreams: 1 bem_jc_me_rcla.pdf: 669449 bytes, checksum: 0288c0d763b074ddbb25c517c036ec04 (MD5) / O lambari Astyanax altiparanae Garutti e Britski (2000) vem ganhando a atenção de pesquisadores e produtores, devido a sua alta taxa de sobrevivência, rápido crescimento, fácil aceitação de alimento artificial, carne saborosa e grande procura como isca viva. As fêmeas apresentam taxas de crescimento mais elevadas do que os machos tornando sua criação mais vantajosa. O processo de diferenciação sexual pode ser controlado pela administração de hormônios sexuais, em peixes sexualmente indiferenciados, alterando o curso da diferenciação no sentido do sexo desejado. Neste trabalho, o desenvolvimento gonadal foi acompanhado nas primeiras 180 horas pós eclosão – hpe (7,5 dias pós eclosão - dpe) das larvas, na tentativa de se conhecer o momento da diferenciação sexual e/ou a melhor fase para aplicação de hormônio feminizante. Foram mantidas 1.000 larvas recémeclodidas em tanques de incubadoras sob aeração constante e temperatura ambiente. Dez exemplares foram diariamente fixados em solução Karnovsky modificada, incluídos em historesina, e corados com HE. Os resultados revelaram que as 12 hpe, o cordão gonadal já está alocado permanecendo por todo o período estudado. Durante o período inicial de aproximadamente 206ºC dias de vida da larva não observou-se, por meio de análise histológica, diferenciação sexual em A. altiparanae. Nesta fase foi possível observar, a abertura da boca que se deu às 19 hpe e a transição alimentar que ocorreu entre 43 e 60 hpe. Em um segundo estudo, a produção de lotes monossexos femininos do lambari foi avaliada, pelo método direto, utilizando o estrógeno, valerato de estradiol, na tentativa de provocar a feminização dos machos. Para isto, foram utilizadas 1.000 larvas de lambari que foram distribuídas em quatro tanques de incubadoras com temperatura média de 21.8 ± 2ºC... / The lambari Astyanax altiparanae Garutti and Britski (2000) has been getting attention of researchers and producers, due to its high rate of survival, fast growth, easy acceptance of food artificial, tasty meat and high demand as live bait. Females have higher growth rates than males making its creation more advantageous. The process of sexual differentiation can be controlled by administration of sex hormones in fish sexually undifferentiated, altering the course of differentiation towards the desired sex. In this study, the gonadal development was observed in the first 180 hours post-hatching – hph (7,5 days post-hatching - dph) of the larvae, in attempt to know the time of sexual differentiation and/or the best stage for the application of female hormone. 1.000 larvae, which were newly-hatched in tanks of incubators under constant aeration and ambient temperature, were kept. Ten specimens were daily fixed in solution Karnovsky modified, included in historesin, and stained with HE. The results showed that 12 hph, the gonadal cord is already allocated by remaining throughout the study period. During the initial period of, approximately, 206ºC-day life of the larva, it is not observed, by means of histological analysis, sexual differentiation in A. altiparanae. At this stage, it was possible to observe the opening of the mouth, which happened at 19 hph, and the food transition, which occurred between 43 and 60 hph. In a second study, the production of female monossex lots of lambari was evaluated by the direct method, using estrogen, estradiol valerate, in an attempt to cause the feminization of males. For this purpose, 1.000 lambari larvae, which had been distributed in four tanks of incubators, in an average temperature of 21.8 ± 2ºC, were used. Initially, the larvae were fed by nauplii of Artemia salina and, 72 hph, their food was replaced by a diet containing 35% crude protein... (Complete abstract click electronic access below)