A demanda por transfusões sanguíneas tem aumentado no Brasil e o número de doações de sangue permanecem insuficientes. Há escassez de componentes de sangue para transfusão, principalmente de concentrados de células vermelhas do sangue. As células-tronco pluripotentes induzidas humanas (hiPSCs) possuem um grande potencial para se tornar uma fonte de CÉLULAS VERMELHAS DO SANGUE, pois podem se diferenciar em qualquer tipo celular, incluindo CÉLULAS VERMELHAS DO SANGUE de fenótipo específico. O objetivo deste trabalho é a geração de hiPSCs para partir de células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) de candidatos a doação de sangue que possuem fenótipo eritrocitário de baixa imunogenicidade, bem como a diferenciação eritroide das hiPSCs geradas. As amostras de sangue periférico (PB) de 11 indivíduos foram coletadas e caracterizadas quanto ao genótipo para os seguintes antígenos eritrocitários: Sistema Rh (RHCE*01/RHCE*02/RHCE*03/RHCE*04/RHCE*05), Kell (KEL*01/KEL*02), Duffy (FY*01/FY*02 and FY*02N.01), Kidd (JK*01/JK*02) e MNS (GYPB*03/GYPB*04). Outros antígenos de grupos sanguíneos distintos foram determinados por meio de fenotipagem. Duas amostras (PBMCs PB02 e PB12) foram selecionadas para a reprogramação devido ausência de múltiplos antígenos eritrocitários e, portanto, considerados de baixa imunogenicidade. Os PBMCs foram enriquecidos em eritroblastos e em seguida, as células foram transfectadas com os vetores episomais pEB-C5 e pEB-Tg e então, co-cultivados sobre fibroblastos de embriões murinos (MEFs) até o surgimento de colônias semelhantes a hiPSCs (hiPSC PB02 e hiPSC PB12). Estas colônias foram transferidas para condições de cultivo próprias e posteriormente caracterizadas quanto à sua pluripotência. A expressão dos genes de pluripotência OCT4, SOX2 e NANOG demonstrou níveis de expressão maior em comparação às linhagens não pluripotentes. As análises de imunofenotipagem por citometria de fluxo revelaram que em torno de 86% das células expressaram Nanog, 88% Oct4 e 88% Sox2. Os níveis de expressão de genes de pluripotência e marcadores foram consistentes com o estado indiferenciado encontrado em células pluripotentes conhecidas. A análise funcional para avaliação da pluripotência foi realizado pela injeção das hiPScs em camundongos imunodeficientes, demonstrando a formação de teratoma nas linhagens geradas. A metodologia para diferenciação hematopoética das hiPSCs geradas a partir dos corpos embrioides estão em progresso. O potencial de diferenciação foi confirmado durante a padronização deste processo, utilizando ensaio de formação de colônias em metilcelulose. Uma média de 10,5 colônias de precursores eritroide foram obtidas a partir de 50x103 hiPSC PB02 em diferenciação e uma colônia mista (mieloide e linfoide) a partir de 15x103 hiPSC PB12 foram obtidas. Neste trabalho foi possível gerar duas linhagens de hiPSCs com fenótipos de antígenos eritrocitários de interesse que podem ser mantidas em cultura por um longo período (26 passagens) e demonstram um potencial de diferenciação hematopoética. / The demand for blood transfusion has increased in Brazil and the number of blood donations remains insufficient. Therefore, there is a shortage of blood components for transfusion, mainly concentrates of red blood cells (RBCs). Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) have great potential to become a source of RBCs, because they can differentiate into every cellular type, including RBCs of a particular phenotype. The objective of this work was to generate hiPSC from mononuclear cells of peripheral blood (PBMCs) from blood donors who presented low immunogenic phenotype for transfusion, and erythroid differentiation of the generated hiPSCs. Peripheral blood samples from 11 individuals were collected and characterized for the following erythrocyte antigens: Rh system (RHCE*01/RHCE*02/RHCE*03/RHCE*04/RHCE*05), Kell (KEL*01/KEL*02), Duffy (FY*01/FY*02 and FY*02N.01), Kidd (JK*01/JK*02), MNS (GYPB*03/GYPB*04). Additionally, other antigens of different blood groups were determined by phenotyping. The samples PBMC PB02 and PBMC PB12 were chosen for iPS generation due to their multiple negative erythrocyte antigens. They were isolated, expanded into erythroblasts, and transfected using the reprogramming episomal vectors PEB-C5 and PEB-Tg. This population was co-cultured on mouse embryonic fibroblasts (MEFs) until the appearance of hiPSC like colonies (hiPSC PB02 and hiPSC PB12). These colonies were transferred to human embryonic stem cells (hESCs) culture conditions and characterized regarding their pluripotency. The expression of OCT4, SOX2 and NANOG pluripotency genes demonstrated that the expression of both lineages was higher in comparison with non-pluripotent lineages. Immunophenotyping performed by flow cytometry revealed that 86% of cells expressed Nanog, 88% Oct4 and 88% Sox2. Expression levels of pluripotency genes and markers were consistent with undifferentiated state found in known pluripotent cells. Functional analysis for pluripotency was achieved by the hiPSC injection in immunodeficient mice showing that both hiPSC cell lines were able to induce teratoma tumor. The hematopoietic differentiation potential was confirmed using methylcellulose assay, with an average of 10.5 erythroid colonies from 50x103 single cells and a mixed colonies of myeloid and lymphoid cells) and finally a colony composed of white cells from 15x103 PB12 hiPSC. In conclusion, it was possible to generate a hiPSC from a red blood cell phenotype that are negative for multiple antigens, and this cell line can be maintained for a long period in culture (26 passages) and show potential for hematopoietic differentiation.

O objetivo deste trabalho foi avaliar a influência das características química e de rugosidade da superfície de titânio sobre a adesão, proliferação e diferenciação de células semelhantes aos osteoblastos de rato (Osteo-1), cultivados em meio de cultura adicionado de BMP-7. MATERIAL E MÉTODO: Células Osteo-1 foram cultivadas sobre discos de titânio com superfícies:1) lisa, 2) jateada por areia de grânulos grandes e atacada por ácido (SLA) e 3) rugosa SLA e quimicamente modificada e hidrofílica (SLAactive) na presença ou ausência de 20ng/ml de rhBMP- 7 no meio de cultura. A adesão e viabilidade das células Osteo-1 foram analisadas após 24 horas de contato com as superfícies em estudo. A diferenciação celular foi avaliada através da análise do conteúdo de proteína total (PT), conteúdo de colágeno, atividade de fosfatase alcalina (ALPase), em 7, 14 e 21 dias, e da formação de matriz mineralizada, em 21 dias. Os resultados foram comparados pela análise de variância (ANOVA) e teste de Tukey. RESULTADOS: A adesão (p=0.3485) e a viabilidade (p=0.5516) celular, o conteúdo de colágeno (p=0.1165) e a formação de matriz mineralizada (p=0.5319) não foram afetados pelas diferentes superfícies ou pela adição de rhBMP-7 ao meio. Células Osteo-1 cultivadas sobre superfície SLA apresentaram um aumento significativo no conteúdo de proteína total aos 21 dias. A relação atividade de ALPase/PT (p=0.0000) foi afetada pelos tratamento e tempo. CONCLUSÃO: Os resultados sugerem que a adição de rhBMP- 7 ao meio de cultura não promoveu efeito sobre a adesão, proliferação e diferenciação de células semelhantes a osteoblastos nas diferentes superfícies testadas. Todas as superfícies de titânio testadas permitiram uma completa expressão do fenótipo de osteoblasto como a mineralização da matriz pela célula Osteo-1. / The aim of the present study was to assess the influence of the chemical characteristics and roughness of titanium surfaces on the attachment, proliferation and differentiation of osteoblast-like cells cultured in medium supplemented with bone morphogenetic protein-7 (BMP-7). METHODS: Osteo-1 cells were grown on titanium discs presenting the following surfaces: 1) machined surface, 2) coarse gritblasted and acid-etched (SLA), and 3) modified SLA (SLAactive) in the absence or presence of 20 ng/ml rhBMP-7 in culture medium. The attachment and viability of osteo-1 cells were evaluated after 24 h. Cell differentiation was evaluated by analysis of total protein content (TP), collagen content and alkaline phosphatase (ALPase) activity at 7, 14 and 21 days and of mineralized matrix formation at 21 days. The results were compared by analysis of variance (ANOVA) and Tukey\'s test. RESULTS: Cell attachment (p=0.3485), cell viability (p=0.5516), collagen content (p=0.1165) and mineralized matrix formation (p=0.5319) were not affected by the different surfaces or by the addition of rhBMP-7 to the medium. Osteo-1 cells cultured on SLA surface presented a significant increase in TP at 21 days. The ALPase/TP ratio (p=0.0000) was affected by treatment and time. CONCLUSION: The results suggest that the addition of rhBMP-7 to the culture medium did not promote any effect on the adhesion, proliferation or differentiation of osteoblast-like cells grown on the different surfaces tested. All titanium surfaces analyzed permitted the complete expression of the osteoblast phenotype such as matrix mineralization by osteo-1 cells.

The use of stem cells is a promising therapeutic approach for tissue engineering by their ability to boost tissue regeneration, and to model in vitro human genetics disorders since it provides continuous supplies of cells with differentiation potential. Our study has been focused in the identification of molecules or mechanisms that could contribute to a better osteogenesis in mesenchymal stem cells (MSC). To achieve our goals we have explored the osteopontential differences of stem cells from different sources. In this regard, we have observed that MSCs from human exfoliated deciduous teeth (SHED) presented higher in vitro osteogenic differentiation potential (OD) as compared to MSCs derived from human adipose tissue (hASCs). Through microarray analysis and cell sorting, we have shown that IGF2 and CD105 expression levels contribute to these osteopontential cell differences, that is, higher IGF2 expression levels and lower CD105 expression levels were associated with the increased osteogenic potential of SHED as compared to hASCs. The molecular mechanisms associated with the diferent expression levels of IGF2 and CD105 in these cells were also investigated. Despite the advantages of adult MSCs they can exhibit drawbacks such as restricted self-renewal and limited cell amounts. Induced Pluripotent Stem Cells (iPSC) technology has emerged as an alternative cell source, as they provide more homogeneous cellular populations with prolonged self-renewal and higher plasticity. We verified that the OD of MSC-like iPSC differs from MSCs and it depends on the iPSCs originating cellular source. Comparative in vitro osteogenesis analysis showed higher osteogenic potential in MSC-like cells derived from iPS-SHED when compared with MSC-like cells from iPS-FIB and SHED. iPSCs can be also used as a tool to model genetic disorders. We have thus proposed to verify if it could be possible to in vitro model Treacher-Collins syndrome, a condition with deficient craniofacial bone development. We have compared the effects of pathogenic mutations in TCOF1 gene in cell proliferation, differentiation potential between MSCs, dermal fibroblasts, neural-crest like and MSC-like cells differentiated from iPSCs.TCS cells showed changes in cell properties anddysregulated expression of chondrogenesis markers during osteogenic and chondrogenic differentiation. In summary, the comparative analysis of stem cells of different sources allow us to identify markers that may facilitate osteogenesis and that it is possible to establish an in vitro model to Treacher-Collins syndrome / O uso de células-tronco trata-se de uma abordagem terapêutica promissora para a engenharia de tecidos, devido à sua capacidade na regeneração de tecidos, e para modelamento in vitro de distúrbios genéticos humanos, uma vez que fornece um abastecimento contínuo de células com potencial de diferenciação. Nosso estudo se propos a identificar moléculas e mecanismos que contribuem na otimização da osteogênese de células-tronco mesenquimais (MSCs). Para atingir nossos objetivos exploramos as diferenças no potencial osteogênico (PO) de MSCs de diferentes fontes. Observamos que MSCs de polpa de dente decíduo humano (SHED) apresentaram maior PO em comparação com as MSC derivadas de tecido adiposo humano (hASCs). Através de análise de microarray de expressão e cell sorting, demonstramos que os níveis de expressão de IGF2 e CD105 contribuem para as diferenças do PO, onde a maior expressão de IGF2 e menor expressão de CD105 estão associadas a maior PO em SHED quando comparado as hASCs. Também investigamos os mecanismos moleculares associados aos diferentes níveis de expressão de IGF2 E CD105 em ambas as fontes celulares. Apesar das vantagens, as MSCs podem apresentar pontos negativos como restrita auto-renovação e menor quantidade de células. Células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) surgem como uma fonte celular alternativa, proporcionando populações celulares homogêneas com auto-renovação prolongada e maior plasticidade. O PO de MSC-like iPSC difere de MSCs, e este potencial é dependente da fonte celular em que as iPSCs são obtidas. Análise comparativa de PO in vitro demonstrou maior osteogênse em células MSC-like derivadas de iPS-SHED quando comparada as células MSC-like de iPSCs-fibroblastos e SHED. iPSCs também podem ser utilizadas como ferramenta para investigar doenças genéticas humanas. Propomos a modelagem in vitro da síndrome de Treacher-Collins (TSC), doença que acomete as estruturas craniofaciais durante o desenvolvimento ósseo. Comparamos os efeitos de mutações patogênicas no gene TCOF1 na proliferação celular, potencial de diferenciação entre MSCs, fibroblastos dérmicos, neural-crest like e células MSC-like diferenciadas de iPSCs. Células de pacientes TCS exibiram alterações em propriedades celulares e na expressão de marcadores osteogênicos e condrogênicos. Em resumo, a análise comparativa de células-tronco de diferentes fontes permitiu a identificação de marcadores e mecanismos que podem facilitar a osteogênese e tambem demonstramos que é possível modelar in vitro a síndrome de Treacher-Collins

Submitted by Angela Maria de Oliveira (amolivei@uepg.br) on 2019-02-06T18:43:55Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) Rubens Gomes Junior.pdf: 1292894 bytes, checksum: a7cb84fdd6de57c93b761eeb2199e77d (MD5) / Made available in DSpace on 2019-02-06T18:43:55Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) Rubens Gomes Junior.pdf: 1292894 bytes, checksum: a7cb84fdd6de57c93b761eeb2199e77d (MD5) Previous issue date: 2018-10-18 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A Disintegrin and Metalloprotease (ADAM) é uma família de proteínas transmembranas capaz de mediar adesão celular, assim como clivagem de moléculas da superfície celular. ADAM23 é um membro desta família predominantemente expressa no sistema nervoso durante o desenvolvimento até a fase adulta. Camundongos nocautes para o gene adam23 desenvolvem problemas neurológicos como tremor e ataxia e morrem logo após o nascimento, sugerindo que esta proteína possui papel fundamental no desenvolvimento e manutenção do sistema nervoso. Sendo assim, a análise do padrão de expressão da proteína ADAM23 no processo de diferenciação pode contribuir no entendimento do seu papel biológico no contexto do desenvolvimento do sistema nervoso. Primeiramente foi avaliado se as linhagens celulares de neuroblastoma (SHSY-5Y e Neuro2a), feocromocitoma (PC-12) e glioblastoma (T98G) expressavam ADAM23. Em todas as linhagens foi possível observar a proteína ADAM23. Para avaliar se a expressão de ADAM23 era alterada em eventos de diferenciação, as linhagens celulares de neuroblastoma e feocromocitoma foram usadas como modelos de diferenciação neuronal. Em PC-12 não houve alteração na expressão de ADAM23 quando as células foram tratadas com fator neurotrófico derivado de encéfalo. A linhagem celular de neuroblastoma humano, SHSY-5Y, também não apresentou alteração na expressão da proteína de interesse quando tratada com all-trans ácido retinóico. Os ensaios utilizando o neuroblastoma murino, Neuro2a, não mostraram alteração na expressão de ADAM23 nos grupos tratados com all-trans ácido retinóico ou all-trans retinal. Entretanto, nesta linhagem houve aumento da forma não processada de ADAM23 (100 kDa) nos grupos em que o soro fetal bovino foi reduzido a 1%, independente do tratamento ácido retinóico e do retinal. Ainda foi investigado um possível papel protetor de ADAM23 frente ao estresse oxidativo causado por peroxido de hidrogênio em diferentes concentrações e tempos em Neuro2a, mas nenhuma alteração na expressão foi observada. Estes dados sugerem que ADAM23 pode estar envolvida no processo de diferenciação neuronal em Neuro2a desencadeado pela redução do soro fetal bovino, entretanto mais estudos são necessários para elucidar este mecanismo. / A Disintegrin and Metalloprotease (ADAM) is a family of transmembrane proteins able to mediate cell adhesion, as well as cleavage of cell surface molecules. ADAM23 is a member of this family predominantly expressed in nervous system during development until adulthood. Mice knockouts for adam23 gene develop neurological problems, such as tremor and ataxia and die soon after birth, suggesting that protein plays a key role in development and maintenance of nervous system. Therefore, evaluation of expression profile of ADAM23 protein in the differentiation process may contribute to understanding of its biological role in context of the development of nervous system. First, it was evaluated whether cell lines of neuroblastoma (SHSY-5Y and Neuro2a), pheochromocytoma (PC-12) and glioblastoma (T98G) expressed ADAM23. In all lineages it was possible to observe the ADAM23 protein. To assess whether ADAM23 expression was altered in differentiation events, neuroblastoma and pheochromocytoma cell lines were used as models of neuronal differentiation. PC-12 cells showed no change in ADAM23 expression when they were treated with brain-derived neurotrophic factor. The human neuroblastoma cell line, SHSY-5Y, also showed no change in the expression of the protein of interest when they were treated with all-trans retinoic acid. Assays using murine neuroblastoma, Neuro2a, showed no change in ADAM23 expression on groups treated with all-trans retinoic acid or all-trans retinal. However, in this lineage presented an increase of the unprocessed form of ADAM23 (100 kDa) on group, which the fetal bovine serum was reduced to 1%, independent of retinoic acid or retinal treatment. A possible protective role of ADAM23 against oxidative stress caused by hydrogen peroxide at different concentrations and times in Neuro2a was still investigated, but no change in expression was observed. These data suggest that ADAM23 may be involved in the neuronal differentiation process in Neuro2a triggered by the reduction of fetal bovine serum, however more studies are needed to elucidate this mechanism.

Submitted by Mariana Dornelles Vargas (marianadv) on 2015-05-27T17:39:36Z No. of bitstreams: 1 diferenciacao_duas.pdf: 29275258 bytes, checksum: bba68627654b4e018b6a91d23cbb1afd (MD5) / Made available in DSpace on 2015-05-27T17:39:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 diferenciacao_duas.pdf: 29275258 bytes, checksum: bba68627654b4e018b6a91d23cbb1afd (MD5) Previous issue date: 2013 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / CNPQ – Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / De acordo com a descrição original, os espécimes-tipo de Geoplana ladislavii Graff, 1899 caracterizam-se por apresentar dorso de coloração verde. Ao ser redescrita, Froehlich, 1959 considerou que exemplares de coloração marrom-esverdeado também seriam representantes dessa espécie. Em diversas formações florestais do Rio Grande do Sul, tem sido registrada a ocorrência de espécimes de dorso marrom ou marrom-esverdeado (Geoplana sp.) em simpatria com espécimes de Geoplana ladislavii Graff, 1899, tanto em áreas de mata quanto em áreas ajardinadas com diversos graus de antropização. No presente estudo, realizam-se análises morfológicas e moleculares das duas espécies visando verificar ou não a coespecificidade. Foram analisados exemplares procedentes de áreas de floresta ombrófila mista, floresta estacional semidecidual e floresta estacional decidual e de áreas ajardinadas de diversos municípios do sul do Brasil. Para identificação, realizou-se inicialmente a análise da morfologia externa, em vida e após fixação, registrando forma e tamanho corpóreos, padrão de coloração, distribuição dos olhos e localização da boca e do gonóporo. Após processamento histológico, analisou-se a morfologia interna em fragmentos do corpo correspondentes à região anterior, à região pré-faríngea, à faringe e ao aparelho copulador. Dois exemplares de cada morfoespécie foram submetidos às reações de Alcian Blue-PAS, azul de Bromofenol, DMAB e Ninhydrin-Schiff, para análise histoquímica das células secretoras. A extração de DNA foi realizada pelo método não-fenólico e proteinase K. A hipótese de relacionamento filogenético foi recuperada utilizando-se o gene mitocondrial citocromo oxidase subunidade I (COI) e a região do gene nuclear do espaçador transcrito interno 1 (ITS-1), amplificadas por PCR com primers específicos. Na epiderme da região anterior e da região pré-faringea de ambas espécies desembocam células com secreções protéicas e glicoprotéicas, além de células com glicoconjugados neutros em Geoplana sp. e células com glicosaminoglicanas em G. ladislavii. O bordo glandular de Geoplana sp. é conspícuo, constituído por três tipos de células secretoras: eritrófilas com secreção protéica, cianófilas com secreção glicoprotéica e xantófilas com secreção protéica. Geoplana ladislavii apresenta o bordo glandular pouco conspícuo, constituído por células eritrófilas com secreção protéica e cianófilas com glicosaminoglicanas. Ambas apresentam faringe cilíndrica, com glândulas cianófilas, eritrófilas e xantófilas/eritrófilas, além de um quarto tipo (células cianófilas com secreção protéica) em G. ladislavii. O tipo de secreção produzido pelas células cianófilas e xantófilas e/ou eritrófilas das glândulas faringeais se diferencia nas duas morfoespécies, apresentando proteína básica ou glicoproteína. A vesícula prostática é tubular com porção ental bifurcada, sendo intrabulbar em Geoplana sp. e extrabulbar em G. ladislavii. Ambas apresentam secreção protéica desembocando na vesícula prostática. A papila penial é oblíqua, projetada ventralmente a partir do teto e da parede anterior do átrio masculino, nas quais desembocam células com secreção protéica, glicoprotéica e com glicosaminoglicanas. Geoplana ladislavii se diferencia de Geoplana sp. por apresentar grande quantidade de células cianófilas desembocando próximo à inserção ventral da papila penial. Quanto ao átrio feminino, G. ladislavii apresenta secreções protéicas, enquanto Geoplana sp., secreções glicoprotéicas. Em relação às glândulas da casca, ambas as espécies possuem células eritrófilas, com secreção glicoproteica em G. ladislavii e secreção proteica em Geoplana sp. As análises moleculares indicam que Geoplana sp. representa um grupo taxonômico próximo de Geoplana ladislavii, mas independente desta. Assim, as análises morfológicas e moleculares indicam que Geoplana sp. e G. ladislavii são espécies distintas. / According to its original description, the type-specimens of Geoplana ladislavii Graff, 1899 are characterized by having a green-colored dorsum. When redescribed, specimens with greenish-brown color were also considered members of this species. In several forest formations in Rio Grande do Sul, specimens with brown or greenish- brown dorsum have been registered occurring sympatrically with specimens of Geoplana ladislavii Graff, 1899, both in forest and gardened areas with several degrees of human impact. In this study, morphological and molecular analyses of both morphospecies were conducted in order to verify if they belong or not to the same species. The specimens analyzed were collected in areas of mixed ombrophilous forest, seasonal semideciduous forest and seasonal deciduous forest, as well as from gardened areas from several municipalities in southern Brazil. The identification was conducted initially by analysis of external morphology, observing shape and size of the body, color pattern, eyes distribution and position of the mouth and the gonopore. After histological processing, the internal morphology was analyzed in body fragments corresponding to the anterior, pre-pharyngeal, pharyngeal and copulatory apparatus regions. Two specimens of each morphospecies were submitted to reactions of Alcian Blue-PAS, bromophenol blue, DMAB and Ninhydrin-Schiff for histochemical analyses of the secretory cells. The DNA extraction was conducted by the non-phenolic method and proteinase K. The hypothesis of phylogenetic relationship was recovered using the mitochondrial gene cytochrome c oxidase subunit I (COI) and the region of the nuclear gene of the internal transcribed spacer 1 (ITS-1), amplified by PCR with specific primers. Glands with protein and glycoprotein secretions open through the epidermis of anterior and pre-pharyngeal regions of both morphos species, as well as glands secreting neutral mucopolysaccharides in Geoplana sp. and glycosaminoglycans in G. ladislavii. Geoplana sp. has a conspicuous glandular border consisting of three types of secretory cells: erythrophil with protein, cyanophil with glycoprotein and xanthophil with proteic secretions. G. ladislavii has a less conspicuous glandular border constituting of erythrophil glands with protein and cyanophil glands with glycosaminoglycan secretions. Both morphospecies have a cylindrical pharynx with cyanophil, erythrophil and anthophil/erythrophil glands, as well as a fourth type (cyanophil cells with protein secretion) in G. ladislavii. The secretion type from cyanophil and xanthophil and/or erythrophil cells in pharyngeal glands is different between the two morphospecies, showing basic protein or glycoprotein. The prostatic vesicle is tubular with a forked ental portion, being intrabulbar in Geoplana sp. and extrabulbar in G. ladislavii. Both morphospecies show glands with proteic secretion opening into the prostatic vesicle. The penis papilla is oblique, projecting ventrally from the roof and anterior wall of the male atrium and having cells with protein, glycoprotein and glycosaminoglycan secretions. G. ladislavii is differentiated from Geoplana sp. by having a large amount of cyanophil cells ending close to the ventral insertion of the penis papilla. In the female atrium, G. ladislavii has proteic secretions while Geoplana sp. has glycoproteic secretions. Both morphospecies have shell glands with erythrophil cells, constituting glycoproteic secretions in G. ladislavii and proteic secretions in Geoplana sp. Molecular analyses indicate that Geoplana sp. constitutes a taxonomic group close to Geoplana ladislavii, but independent from it. Thus, morphological and molecular analyses indicate that Geoplana sp. and G. ladislavii are distinct species.

Submitted by Fabricia Fialho Reginato (fabriciar) on 2015-07-23T00:27:16Z No. of bitstreams: 1 MariaBrasil.pdf: 872957 bytes, checksum: 1b3b71e61cc6340d3b0221de8eb9f3a8 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-07-23T00:27:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 MariaBrasil.pdf: 872957 bytes, checksum: 1b3b71e61cc6340d3b0221de8eb9f3a8 (MD5) Previous issue date: 2012-12-30 / Nenhuma / O presente estudo tem como principal objeto de investigação e análise o consumo das mulheres de uma fração da “alta classe” do Rio Grande do Sul como forma de obtenção de prestígio e conseqüente fornecedor de símbolos de distinção. A tese parte da hipótese de que o consumo distintivo das mulheres pertencentes a uma fração da “alta classe” gaúcha é, em sua maioria, de bens imateriais que, agregados ao estilo de vida, incorporam um capital social e cultural inimitável, e não de bens conspícuos ou de luxo. A pesquisa compreendeu trabalho de campo, com a aplicação de questionários a 32 (trinta e duas mulheres) de uma fração da “alta classe” gaúcha, e após 6 (seis) entrevistas em profundidade, a fim de identificar quais os bens constituem veículos de interação e proporcionam fatores ou indicadores de distinção social, de que forma é realizada a escolha e classificação destes bens de consumo em detrimento de outros. Apresenta inicialmente o referencial teórico-metodológico para o desenvolvimento do estudo, conceitos como os de luxo, habitus de classe e de gosto articulando às estratégias da obtenção do prestígio e da distinção social. Em um segundo momento, o estudo traz uma análise do processo de acumulação de riqueza da “alta classe” rural gaúcha e suas transformações diante do processo de industrialização que fez emergir uma nova “alta classe”. Ainda neste capítulo problematizamos o discurso do senso comum e difundido pela mídia em relação ao consumo da “alta classe” a partir da exposição dos dados obtidos na pesquisa de campo. O estudo permitiu-nos concluir que o consumo de bens imateriais ou simbólicos é a principal estratégia de distinção social das mulheres da “alta classe” gaúcha, e que o padrão de consumo material que no discurso do senso comum, seria distintivo, a investigação demonstrou que para o grupo estudado não é elemento forte. / The present study has had as the main object of investigation and analysis the consumption of women from a fraction of the high-class of Rio Grande do Sul State as a way of obtaining some prestige and some consequential supplier of distinction symbols. The thesis is from the hypothesis that women’s distinctive consumption that belong to this fraction of “gaúcha” high-class is, in the most, referring to non-material possessions which based on their lifestyle, have been incorporated into social and cultural capital and no referring to luxury possessions. The research has been based on fieldwork with some questionnaires applied to 32 women from this fraction of “gaúcha” high-class and subsequently six interviews in order to identify what possessions are considered interactional resources and what ones provide some factors or indicators of social distinction, besides how the choice and the classifications of these consumptions possessions are made in relation to the others. Firstly it has been presented the theoretical-methodological framework for the development of that study, the concepts about luxury, habitus class and taste linking to some strategies of obtaining prestige and social distinction. Secondly the study has brought some analysis out about the process of amassing wealth of the “gaúcha” rural high-class and its transformations against industrialization process from that high-class has been emerged. In this chapter we have discussed about the common sense speech that has been spread by the media in relation to the high-class’ consumption through the exposition of research data. From this study we have concluded that the consumption of non-material or symbolic possessions is the main strategy of social distinction of “gaúcha” high-class women and that the standard of material consumption which in the common sense speech would be distinctive, the investigation has demonstrated it is not a strong element for the studied group.

Os eventos celulares e extracelulares que ocorrem durante o processo de osseointegração do titânio (Ti) são influenciados pelas propriedades físicas e químicas de sua superfície. Modificações bioquímicas de topografias complexas de Ti permitem o desenvolvimento de novas superfícies de implantes funcionalizadas com moléculas bioativas, visando a promover a osteogênese de contato e a osseointegração. O objetivo do presente estudo foi avaliar os efeitos, sobre a osteogênese in vitro, da funcionalização de microtopografia de Ti com concentrações distintas de peptídeo sintético análogo a uma seqüência de amino-ácidos do colágeno tipo I, relacionada a adesão e diferenciação celulares. Células osteogênicas primárias derivadas de calvárias de ratos foram plaqueadas sobre superfícies de Ti: 1) usinada e lixada (Usinado); 2) com microtopografia (Plus); 3) Plus com recobrimento de hidroxiapatita (Plus+HA); 4) Plus+HA, com baixa concentração de P-15 (P-15 low); 5) Plus+HA, com alta concentração de P-15 (P-15 high). Por períodos de até 21 dias, foram avaliados: morfologia celular e estágios de adesão e espraiamento celulares; viabilidade celular, proporção de células no ciclo celular e número total de células; imunolocalização de proteínas da matriz extracelular não-colágena; expressão de marcadores do fenótipo osteoblástico por reação em cadeia da polimerase em tempo real (Real-time PCR); atividade de fosfatase alcalina (ALP); proporção de células em apoptose e formação de matriz mineralizada. Avaliaram-se, também, os aspectos topográficos das superfícies, por microscopia eletrônica de varredura (MEV) de alta resolução, e o molhamento de superfície, pelo método da gota séssil. As superfícies Plus modificadas apresentavam camada superficial constituída por agregados de material acicular, os quais eram menos evidentes em P-15 high. Todas as superfícies eram hidrofóbicas, sendo que a funcionalização com P-15 proporcionava tendência à hidrofilicidade em equilíbrio. Após 4 h, observou-se que as superfícies com microtopografia apresentavam menor proporção de células nos estágios 3 e 4 de espraiamento quando comparadas com o Usinado (p<0,05). A viabilidade celular por MTT demonstrou valores maiores para as superfícies Plus modificadas aos 3 dias (p<0,05). Em 1 dia, acúmulos extracelulares de osteopontina (OPN) foram evidentes apenas sobre Plus+HA, P-15 low e P-15 high, com maior extensão em 3 dias. Em 7 dias, áreas imunomarcadas para sialoproteína óssea (BSP) eram menos extensas sobre Plus e Plus+HA. Para os grupos com microtopografia, foram observados valores de RNAm: menores para RUNX2 em 7 dias em comparação ao Usinado; para fosfatase alcalina (ALP), maiores em 10 se comparados a 7 dias; menores para BSP e maiores para OPN em 7 e 10 dias, quando comparados ao Usinado. Em 10 dias, observou-se redução significante (p<0,05) na atividade de ALP nas superfícies com microtopografia em comparação ao Usinado. Aos 14 dias, formações nodulares típicas de matriz mineralizada, marcadas para BSP em sua periferia, foram observadas apenas nos grupos Usinado e Plus. No entanto, a quantificação do vermelho de Alizarina (ARS) revelou valores maiores para as culturas sobre superfícies Plus modificadas em 14 e 21 dias (p<0,05). Concluiu-se que a microtopografia de Ti Plus, nanoestruturada com HA para funcionalização de P-15, altera o processo de aquisição do fenótipo osteogênico in vitro, resultando no aumento da formação de matriz calcificada, em padrão predominantemente diferente ao de típicas formações nodulares observadas sobre superfícies planas na microescala. / Surface functionalization of metallic surfaces with bioactive molecules has been developed aiming to promote specific cellular response at biomaterial-tissue interface. The present study evaluated the effects of surface functionalization of a microstructured titanium (Ti) surface with a synthetic peptide (P-15) analogue of the cell-binding domain of collagen I on key parameters of the progression of the osteogenic phenotype in vitro. Calvaria-derived osteogenic cells were plated on Ti disks: i) Machined; ii) with microtopography (Plus); iii) Plus with hydroxyapatite coating (Plus+HA); iv) Plus+HA with a low concentration of P-15 (P-15 low); v) Plus+HA with a high concentration of P-15 (P-15 high). High resolution SEM analysis showed that Plus exhibited a complex microtopography. In addition, a superficial layer of nano-sized needle-shaped HA was noticed for all modified Plus surfaces, although less apparent for P-15 high. Whereas all surfaces were hydrophobic at time zero, biofunctionalization showed a tendency to hydrophilicity at equilibrium. At 4 hours, Plus and modified Plus surfaces exhibited a lower proportion of spread osteogenic cells. At day 3, cells were less spread on the microtopographies, showing long cytoplasmic extensions. Epifluorescence revealed a large extracellular OPN accumulation for modified Plus surfaces. Although at day 3 cell viability was higher for modified Plus surfaces, at day 7 no major differences were detected among groups. Real time PCR showed for Plus and modified Plus surfaces: i) lower levels for RUNX2 at day 7 and for BSP at days 7 and 10, and higher OPN levels at days 7 and 10 compared with Machined; ii) higher ALP levels at day 10 compared with day 7. At day 10, Plus and modified Plus surfaces showed lower ALP activity compared with Machined. At days 14 and 21, higher proportions of Alizarin red stained areas were detected for cultures grown on modified Plus surfaces. The modification of Ti Plus surface by means of HA coating and functionalization with peptide P-15 alters the osteogenic potential of osteoblastic cell cultures, leading to an enhancement in mineralized matrix formation.

O transtorno bipolar (TB) é caracterizado como um grave transtorno psiquiátrico, que apresenta curso crônico com notável prejuízo cognitivo e funcional nos pacientes. Nesta tese, através de duas revisões avaliamos as alterações de marcadores periféricos de estresse oxidativo, neurotrofinas e inflamação presentes em pacientes com TB e discutimos o envolvimento destes na toxicidade sistêmica, bem como uma possível associação destas alterações com as disfunções cognitivas e funcionais apresentadas pelos pacientes ao longo do transtorno. Neste sentido, muitos estudos têm sido realizados buscando compreender a fisiopatologia do TB, no entanto, para o estabelecimento de um modelo in vitro é necessário ter um modelo celular adequado e um desafio que possa mimetizar a fisiopatologia da doença. Neste contexto, não há na literatura, até o momento, um modelo adequado que compreenda toda a complexidade dos sintomas do TB, por isso o objetivo geral desta tese consistiu na caracterização gênica do modelo in vitro de diferenciação celular da linhagem de neuroblastoma humano SH-SY5Y, induzido por ácido retinóico, e a busca por um modelo experimental para a avaliação da toxicidade sistêmica apresentada pelos pacientes com TB. O modelo de diferenciação foi avaliado através da técnica de microarranjo, onde verificamos que nas células diferenciadas há maior expressão de processos biológicos envolvidos no desenvolvimento neuronal, enquanto nas células indiferenciadas observamos maior expressão de processos biológicos relacionados a proliferação e manutenção celular. Ainda, genes relacionados a função sináptica e a síntese dopaminérgica estavam mais expressos nas células diferenciadas. Estes achados contribuem para a validação de um modelo de origem humana, de fácil manuseio e que apresenta perfil neuronal; auxiliando assim no estudo de doenças que acometem o sistema nervoso central, dentre elas o TB. Para avaliar o perfil de toxicidade no soro de pacientes bipolares, tratamos as células SH-SY5Y diferenciadas com soro de pacientes com TB, tanto em estágio inicial quanto avançado do transtorno. Como resultado, verificamos que o soro dos pacientes em estágio avançado apresenta maior toxicidade quando comparado ao soro de indivíduos controles por causar uma diminuição da viabilidade celular e uma diminuição na densidade de neuritos. Analisados em conjunto, os achados desta tese apontam para um novo modelo in vitro para analisar a fisiopatologia do TB, bem como o efeito de medicações e vias metabólicas envolvidas. Além disso, corroboram com dados prévios da literatura de que perifericamente os pacientes apresentam um índice de toxicidade relevante quando comparado a indivíduos controles e que este índice estaria relacionado a progressão do transtorno. / Bipolar disorder (BD) is characterized as a serious psychiatric disorder that presents chronic course with remarkable cognitive and functional impairment. In this thesis, we analyzed in two reviews the changes in peripheral markers of oxidative stress, neurotrophins and inflammation, discussing their involvement in systemic toxicity, as well as a possible association of these changes with the cognitive and functional impairment presented by BD patients throughout the disorder. In this sense, many studies have been performed seeking to understand the pathophysiology of this illness. Moreover, research on BD and drug development is hampered by the lack of suitable in vitro models. To counteract this, many attempts to explore patient-derived samples have been undertaken, resulting in partial reproduction of disease aspects. However, still does not exist in the literature a suitable model to understand the complexity of the BD symptoms. Therefore, the aims of this thesis was to evaluate the differential gene expression of the cell differentiation model of human neuroblastoma cell line SH-SY5Y, induced by retinoic acid, and the search for an experimental model for the evaluation of systemic toxicity in patients with BD. The differentiation model was assessed by microarray analysis and we found that the differentiated cells had increased expression of biological processes involved in neuronal development, while undifferentiated cells showed higher expression of biological processes related to cellular proliferation and maintenance. Also, genes related to the synaptic function and dopaminergic synthesis were more expressed in differentiated cells. These findings contribute to the validation of a cellular model from human source, easy handling and featuring neuronal profile; thereby aiding in the study of diseases that affect the central nervous system, including BD. In order to evaluate the toxicity profile in serum of bipolar patients, differentiated SH-SY5Y cells were treated with sera of BD patients in early and late stages of the disorder. As a result, for the first time in the literature, it has been verified the potential neurotoxicity of bipolar patients serum directly in human cells with a neuronal profile and we found that the serum of patients at late stage would present higher toxicity when compared to the control sera, causing a decrease in cell viability and a reduced neurite outgrowth density. Taken together, the findings of this thesis point to a new in vitro model to analyze the pathophysiology of BD, as well as the effect of medications and metabolic pathways involved in this disorder. Moreover, corroborate previous peripherally data found in the literature where patients would have a toxicity index compared to control subjects and that this index would be related to the progression of the disorder.

Orientador: Miguel Luiz Menezes Freitas / Resumo: Este estudo teve como finalidade conhecer a diversidade genética de duas populações de Hevea brasiliensis, conservadas ex situ em Selvíria-MS e Marabá-PA, bem como estimar os parâmetros genéticos e medidas de dissimilaridade de suas progênies. Foram utilizados15 locos microssatélites para investigar a diversidade e estrutura genética e o parentesco de 18 matrizes da POP SEL e 46 da POP MAB. No ano de 2016, foi instalado em Selvíria-MS um teste de progênies a partir de sementes das referidas matrizes. As progênies foram avaliadas por meio de cinco variáveis silviculturais e oito morfológicas. A população de Selvíria apresentou número total de alelos (100) menor do que a população Marabá (179), com a média por locos de 6,7 e 11,9, respectivamente. A heterozigosidade esperada (He ), heterozigosidade observada ( Ho) e o índice de fixação (F) foram semelhantes entre populações, mas a riqueza alélica (R ) foi maior em Selvíria. A diferenciação genética entre as populações ( = 0,28) revelou que 72% da diversidade genética está distribuída dentro das populações. O coeficiente médio de coancestria dentro de ambas as populações foi positivo, mas os valores foram próximos de zero (< 0,08) e considerando indivíduos de ambas as populações, a coancestria media foi zero (-0,001). A estimativa de parâmetros genéticos utilizando o modelo linear misto univariado aditivo REML/BLUP, demonstrou que a herdabilidade individual não foi significativa para a maioria das variáveis observadas nas progên... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: This study aimed to know the diversity, genetic structure and kinship of genotypes of two populations of Hevea brasiliensis, conserved ex situ in Selvíria-MS and Marabá-PA, as well as to evaluate the genetic parameters and measures of dissimilarity of their progenies. 15 microsatellite loci were used to investigate the diversity and genetic structure and kinship of 18 matrices from Selvíria-MS and 46 from Marabá-PA. In the year 2016, a progeny test was installed in Selvíria-MS from seeds of said matrices. The progenies were evaluated by means of five silvicultural variables and eight morphological variables. The population of Selvíria presented a total number of alleles (100) smaller than the Marabá population (179) with the average per locos of 6,7 and 11,9 respectively. The expected heterozygosity (eH), observed heterozygosity (oH) and fixation index (F) were similar among populations, but allelic richness (R) was higher in Selvíria. Genetic differentiation among populations (Gst = 0.28) revealed that 72% of genetic diversity is distributed within populations. The mean coefficient of coancestria within both populations was positive, but values were close to zero (<0.08) and considering individuals from both populations, mean covensis was zero (-0.001). The univariate mixed linear additive model methodology REML / BLUP showed that the individual heritability parameter was not significant for most of the variables observed in the progenies. However, they presented mean herita... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

O Diabetes Mellitus tipo I (DM1) é causado pela destruição auto-imune das células &#946; pancreáticas, encontradas na porção endócrina do pâncreas, constituída pelas ilhotas pancreáticas. As células &#946; são responsáveis pela produção e liberação de insulina, um hormônio que promove a internalização da glicose pelas células. Junto com outros hormônios, a insulina é um dos principais reguladores do nível de glicose sanguinea (glicemia). Uma das terapias utilizadas para o tratamento do DM1 é o transplante de ilhotas pancreáticas. Entretanto, um dos maiores problemas em relação a esta terapia é a falta de massa celular adequada para ser infundida no paciente. Uma tentativa para solucionar este problema, é o desenvolvimento de fontes alternativas de células produtoras de insulina, como as células-tronco, que possuem a capacidade de se diferenciarem em diversos tipos de células, inclusive nas produtoras de insulina. Pax4 é um dos fatores de transcrição responsáveis pela diferenciação de células &#946; , sendo essencial para o apropriado desenvolvimento e maturação destas, constitui um bom candidato para induzir a diferenciação de células-tronco em células produtoras de insulina in vitro. Para introduzir o Pax4 nas células-tronco, sem provocar alterações no genoma das células diferenciadas, em virtude dos potenciais efeitos indesejáveis de vetores que se integram ao genoma celular, recorreu-se às proteínas contendo domínio de transdução (PTDs), que são capazes de carregar a proteína Pax4, através da membrana, diretamente para o interior das células. As PTDs são pequenas sequências peptídicas que permitem a translocação de proteínas através de membranas celulares e sua internalização em células-alvo. Uma das PTDs mais comumente estudadas é a VP22, produto do gene UL49 do Herpes Simplex vírus tipo I. Portanto, a proteína de fusão VP22.Pax4 permitiria que o Pax4 fosse inserido em células-tronco, possibilitando que este fator de transcrição ative a transcrição de certos genes que aumentariam a eficiência de diferenciação das células-tronco em células produtoras de insulina. Para tal, amplificamos e clonamos o cDNA do Pax4 a partir do RNA das células RINm5f de insulinoma murino, construímos o vetor pVP22.Pax4, o qual foi transfectado em células CHO, que passaram a produzir a proteína de fusão VP22.Pax4. Após o tratamento de células-tronco com a proteína de fusão VP22.eGFP e análise por microscopia confocal, comprovamos que a VP22 é capaz de tranduzir a proteína de fusão também neste tipo celular. Portanto, incorporamos a um dos passos do protocolo de diferenciação de células-tronco em células produtoras de insulina, utilizado em nosso laboratório, a co-cultura com células CHO produtoras de VP22.Pax4. Observamos que a introdução do Pax4 leva a formação de um número maior de agregados celulares (clusters) produtores de insulina. Concluímos, então, que a utilização da VP22 como ferramenta para internalização de proteínas em células-tronco é viável e que a adição do Pax4 pode trazer melhorias para protocolos que busquem a produção de células produtoras de insulina. / Diabetes Mellitus type 1 (DM1) is caused by an auto-imunne destruction of the pancreatic &#946; cells, found in the endocrine portion of the pancreas, known as pancreatic islets. These &#946; cells are responsible production and release of insulin, a hormone which promotes glucose internalization by cells. Along with other hormones, insulin is a major regulator of blood glucose levels (glycemia). One of the therapeutical strategies used to treat DM1 is pancreatic islet transplantation. One of the major problem related to this therapy is the lack of adequate cell mass to be infused into the pacients. An attempt to solve this problem is the development of an alternative source of insulin-producing cells by differentiation of stem cells, which display this differentiating potential. Pax4 is one of the transcription factors responsibles for &#946; cell differentiation, being essential for its proper development and maturation, therefore being a good candidate to induce stem cell differentiation into insulin producing cells in vitro. A promising alternative to avoid the alterations of the differentiated cells genome due to its undesirable effects of integrating vectors, but yet allowing the Pax4 to act in diferentiation within the cells are the proteins with a transduction domain (PTDs), which would have the ability to lead the Pax4 protein directly into the cells. The Pax4 could thus act in the nucleus and generate specific transcriptional responses. The PTDs are small peptide sequences which allow translocation of proteins across cell membranes and their internalization into target cells. One of the most commonly studied PTDs is the VP22, a product of the UL49 gene from Herpes Simplex vírus type I. Therefore, the VP22.Pax4 fusion protein would transduce Pax4 into the stem cells, thus allowing the transcription activation of certain genes by Pax4, leading to improvement in the process of stem cells differentiation into insulin-producing cells. To this end, we cloned the Pax4 cDNA from RINm5f murine insulinoma cells, constructed the pVP22.Pax4 vector and transfected this construct into CHO cells, which then produced the VP22.Pax4 fusion protein. Upon verifying that VP22 was also able to transduce proteins into stem cells, by confocal microscopy analysis, after the treatment of these cells with the fusion protein VP22.eGFP, we incorporated the fusion protein VP22.Pax4 to one of the steps of the protocol used for stem cells diferentiation into insulin producing cells in our lab, by co-culturing with CHO cells producing VP22.Pax4. We observed that the addition of Pax4 led to the formation of a higher number of insulin producing cell clusters, therefore we conclude that VP22 may be used as a tool to internalize proteins into stem cells, and that the addition of Pax4 may improves protocols seeking the production of insulin-producing cell