Estudia diversos aspectos relacionados a factores de riesgo, reservorios domésticos y silvestres, su impacto en salud pública y el rol del médico veterinario en la importancia del control de la enfermedad de chagas llamada también Tripanosomiasis americana o enfermedad de Chagas-Mazza. El nombre con que se conoce la enfermedad es en reconocimiento a quien la identificó por primera vez, Carlos Chagas a comienzos del siglo XX. Esta infección se halla presente en Centro y Suramérica, desde la zona del norte de Argentina hasta el sur de Estados Unidos. De acuerdo con la Organización Mundial de la Salud (OMS), existirían alrededor de 24 millones de personas infectadas en el continente (Atías, 1991; Gurgel-Goncalves et al., 2004; Merck, 2000). Bajo estas circunstancias esta enfermedad es uno de los principales problemas de salud pública en diversos países latinoamericanos (Rodrigues Roque et al., 2005). Es causada por el protozoario flagelado Trypanosoma cruzi de la familia Trypanosomatidae, cuyo ciclo evolutivo es complejo y sufre varias transformaciones tanto en el hospedador vertebrado como en el vector. Los principales vectores son insectos hematófagos de la familia de los Triatominos que pertenecen principalmente a tres géneros: Triatoma, Panstrongylus y Rhodnius (Atías, 1991; Smyth, 1965). El reservorio del parásito lo constituyen los animales mamíferos, incluyendo al hombre, en quien la infección puede ser congénita o adquirida y afectar en grado variable, diversos órganos y sistemas, especialmente el corazón y el tubo digestivo (Acha y Szyfres, 1999). La importancia de la enfermedad de Chagas en salud pública radica sobre todo en la frecuencia de cardiopatías que produce en los enfermos crónicos. En algunas regiones, la enfermedad es la causa más frecuente de miocarditis e incluso de muerte (Rodríguez-Morales, 2005; Fontes Rezendea et al., 2006). / Trabajo de suficiencia profesional

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La enfermedad de Chagas congénita es causada por el parásito hemoflagelado Trypanosoma cruzi que alcanza al feto atravesando la barrera placentaria. Durante la invasión tisular T. cruzi induce destrucción de la matriz extracelular (MEC) mediante secreción de proteasas como Cruzipaína (Cz) e inducción de la expresión y activación de proteasas propias del tejido como las metaloproteinasas de la matriz (MMPs). La posible participación de estas proteasas en placenta humana durante la transmisión congénita no ha sido estudiada. Se analizó la expresión y actividad de las MMP 2 y 9 durante la infección ex vivo de vellosidades coriónicas placentarias humanas con el parásito. Se determinó la participación de estas MMPs y de Cz en la degradación de moléculas glicosiladas y del colágeno tipo I del tejido conectivo fetal. Adicionalmente se evaluó el efecto de inhibidores para ambos tipos de proteasas tanto sobre los efectos tisulares de la invasión parasitaria como sobre su infectividad. Se obtuvieron tripomastigotes de la cepa Dm28c a partir de células Vero infectadas y placentas de término de madres sanas. Se incubaron trozos de tejido placentario (0,5 cm3) durante 24 horas en presencia y ausencia de 105 y 106 tripomastigotes y en presencia y ausencia de inhibidores para Cz (E-64) y para MMP (doxiciclina). La infección placentaria se comprobó mediante detección del parásito por PCR. Las MMP se analizaron mediante Western Blot, Inmunohistoquímica y Zimografía. Las modificaciones estructurales de colágeno I se determinaron histoquímicamente mediante la tinción de picro rojo sirio y las alteraciones de moléculas glicosiladas mediante tinción de ácido periódico de Schiff. La expresión y activación de las MMPs depende de la cantidad de parásitos usados. La inhibición de la actividad proteolítica de Cz y las MMP previene la destrucción de colágeno tipo I y alteraciones de moléculas glicosiladas inducida por T. cruzi. La inhibición de la actividad de las proteasas no previene la infección ex vivo del parásito. Se concluye que tanto proteasas parasitarias así como propias del tejido a infectar constituyen parte de los mecanismos de infección tisular de T. cruzi / Proyectos Bicentenario Anillo 112 y FONDECYT 11080166

Tesis para optar al grado de Magíster en Química área de Especialización Tópicos en Química Medicinal y Memoria para optar al Título de Química / El estrés oxidativo es causado por un desequilibrio entre la producción de especies reactivas de oxígeno (radicales libres) y una disminución en los antioxidantes. Con el tiempo, este desajuste en el equilibrio entre radicales libres y antioxidantes puede provocar daño a moléculas biológicas como lípidos, proteínas y ácidos nucleídos. La degeneración biomolecular, seguido de la iniciación y propagación de reacciones oxidativas, provoca el envejecimiento acelerado y muchas enfermedades crónicas, incluyendo enfermedades neurodegenerativas, cáncer y enfermedades cardiovasculares. Es por esta razón, que el estudio y desarrollo de nuevos compuestos antioxidantes es un tema de gran interés con el objetivo de generar nuevas y mejores moléculas con capacidad antioxidante. Por otro lado, la Tripanosomiasis americana, también llamada enfermedad de Chagas, es una enfermedad parasitaria causada por el protozoo flagelado Trypanosoma cruzi. Esta enfermedad se encontraba limitada a América del Sur, América Central y partes de América del Norte (México y sur de Estados Unidos); sin embargo, en la última década la enfermedad se ha propagado a otras áreas no endémicas, presentando un problema emergente de salud pública de importancia global. El tratamiento actual se limita a dos fármacos; nifurtimox y benznidazol. Estos compuestos nitroheterocíclicos se consideran alejados de lo óptimo, debido a que causan múltiples efectos secundarios y presentan una eficacia limitada, especialmente en pacientes con la forma crónica de la enfermedad. En consecuencia, es necesario y urgente el desarrollo de nuevos fármacos menos tóxicos y más eficaces. De acuerdo a lo expuesto anteriormente, en esta tesis se estudiaron nuevos compuestos hidroxilados de cumarinas, con el fin de evaluar su capacidad antioxidante y su actividad tripanocida. A través de voltametría cíclica, se evidenció que los derivados cumarínicos que presentan grupos catecoles y los que poseen un grupo hidroxilo en el anillo cumarínico tienen menores potenciales de oxidación que las cumarinas con grupo resorcinol en su estructura. La generación de radicales libres producto de la oxidación de estos compuestos fue comprobada a través de resonancia de espín electrónico (REE). Todos los derivados presentaron mayor capacidad antioxidante frente a radicales peroxilos (ROO●) que el estándar Trolox. Siendo los derivados JLG15B, JLG5B y JLG14B los que presentaron mayor índice ORAC, con valores de 5,47, 5,38 y 5,30, respectivamente. Por el contrario, los derivados que poseen grupo catecol en la posiciones 7 y 8 del anillo cumarínico presentaron los índices ORAC más bajos. En los estudios de actividad tripanocida el derivado JLG3B resultó ser el más activo contra las dos formas del T. cruzi, presentando una mayor actividad en epimastigotes que nifurtimox y actividad moderada contra tripomastigotes. Además, al evaluar la citotoxicidad en células RAW, se obtuvo un IC50 de 68,85± 0,65 μM, mostrando de esta manera una citotoxicidad moderada. Por otra parte, la detección de radicales a través de REE en medio epimastigote demostró que estos compuestos podrían actuar por medio de la generación de estrés oxidativo. Mediante la realización de esta tesis se encontraron derivados hidroxilados cumarínicos que presentan gran capacidad antioxidante y actividad tripanocida moderada, los cuales nos servirán como base y punto de partida para el diseño racional de nuevos fármacos que tengan como finalidad curar o prevenir diversas patologías que afectan a un gran número de personas / Oxidative stress is caused by an imbalance between the production of reactive oxygen species (free radicals) and a decrease in antioxidant. Over time, this imbalance in the equilibrium between free radicals and antioxidants can cause damage to biological molecules such as lipids, proteins and nucleic acids. The biomolecular degeneration, followed by the initiation and propagation of oxidative reactions, causes accelerated aging and many chronic diseases, including neurodegenerative diseases, cancer and cardiovascular diseases. It is for this reason that the study and development of new antioxidant compounds is a subject of great interest in order to generate new and better molecules with antioxidant capacity. On the other hand, the American trypanosomiasis, also known as Chagas disease is a parasitic disease caused by the flagellate protozoan Trypanosoma cruzi. This disease was limited to South America, Central America and parts of North America (Mexico and the southern United States); however, in the last decade the disease has spread to other non-endemic areas, presenting an emerging public health problem of global importance. Current treatment is limited to two drugs; nifurtimox and benznidazole. These nitroheterocyclic compounds are considered far from optimal, because they cause multiple side effects and have limited efficacy, particularly in patients with the chronic form of the disease. Consequently, the development of new, less toxic and more effective drugs are urgently needed. According to the foregoing, in this thesis were studied new hydroxylated coumarin compounds in order to evaluate its antioxidant capacity and its trypanocidal activity. Using cyclic voltammetry, it was shown that coumarin derivatives that presents catechols groups and who possess an hydroxyl group in the coumarin ring has lower oxidation potential than coumarins with resorcinol group in her structure. The generation of free radicals from the oxidation product of these compounds was verified by electron spin resonance (ESR). All derivatives had higher antioxidant capacity against peroxyl radicals (ROO●) than the Trolox standard. JLG15B, JLG5B and JLG14B was the derivatives that showed higher ORAC index, with values of 5.47, 5.38 and 5.30, respectively. Conversely, the derivatives possessing catechol group at positions 7 and 8 of the coumarin ring showed lower ORAC rates. In studies of the trypanocidal activity, JLG3B was the most active against the two forms of T. cruzi, showing increased activity in epimastigotes that nifurtimox and moderate activity against trypomastigotes. Furthermore, in assessing cytotoxicity in RAW cells, it was obtained a IC50 of 68.85 ± 0.65 μM, thus showing a moderate cytotoxicity. Moreover, detection of radicals through ESR in epimastigote medium showed that these compounds could act through the generation of oxidative stress. By performing this thesis they found hydroxylated coumarin derivatives which have high antioxidant capacity and moderate trypanocidal activity, that will serve us as the basis and starting point for the rational design of new drugs that have as finality cured or prevented various diseases affecting a large number of people

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario. Tesis para optar al Grado de Magíster en Ciencias Animales y Veterinarias mención Patología Animal. / La enfermedad de Chagas (ECh), causada por el protozoo hemoflagelado Trypanosoma cruzi, representa un importante problema de salud pública en Latinoamérica y, debido a la globalización, en países donde no existe el vector biológico. Los criterios de curación para evaluar la eficacia terapéutica durante la etapa crónica, no han sido hasta ahora, establecidos. La PCR en Tiempo Real o PCR cuantitativa (qPCR) constituye una promisoria herramienta para monitorear la carga parasitaria en pacientes con ECh crónica, dado que éstos presentan parasitemias bajas y fluctuantes. En esta tesis, se estandarizó la reacción de qPCR mediante el sistema de detección TaqMan® para la cuantificación de T. cruzi, junto con el desarrollo de un sistema de control interno endógeno (CIE) basado en la detección del cromosoma 12 humano (X12), que permite descartar resultados falsos negativos relacionados con ausencia de ADN en las muestras evaluadas mediante qPCR debido a pérdidas durante el proceso de extracción o problemas con la reacción interna de qPCR. Se evaluó además, la condición parasitológica mediante qPCR en 44 pacientes con ECh crónica en condiciones pre y post-terapia con Nifurtimox (NFX) y se comparó con las técnicas de xenodiagnóstico (XD), PCR convencional de muestras de deyecciones de triatominos de XD (PCR-XD) y sangre venosa (PCR-S). La estandarización de la reacción de qPCR dirigida a la detección de T. cruzi tuvo como resultado una sensibilidad y especificidad del 92% y 100 %, respectivamente. Mientras que el sistema CIE basado en X12 permitió descartar resultados falsos negativos. En cuanto a la evaluación de eficacia quimioterapéutica de NFX mediante qPCR, fue posible determinar que el 86,36% del universo de individuos evaluados eliminó T. cruzi o persiste con parasitemias detectables de muy bajo nivel que no son cuantificables en el rango dinámico establecido (<1 parásito/mL). Estos resultados representan un hallazgo positivo, pues si bien la mayoría de las metodologías convencionales dan cuenta de la persistencia de T. cruzi, qPCR evidencia el real y actual nivel de parasitemia circulante, por lo que debería ser considerado el principal indicador de evaluación de eficacia quimioterapéutica en el tratamiento de la ECh crónica / Chagas disease (ChD), caused by the hemoflagellate protozoon Trypanosoma cruzi, is an important public health problem in Latin America, and due to globalization, also in countries where the biological vector does not exist. Cure criteria, to be able to evaluate the efficacy of therapy during the chronic stage, so far have not been established. Real time PCR or quantitative PCR (qPCR) is a promising tool to monitor the parasite load in patients with chronic ChD, given that these patients have low and fluctuating parasitemia. In this thesis it was standardized the qPCR reaction using the TaqMan® detection system for the quantification of T. cruzi, along with the development of an endogenous internal control (EIC) system based on the detection of human chromosome 12 (X12), which eliminates false negative results related to the absence of DNA in samples evaluated with qPCR due to losses during the extraction process or problems with the internal reaction of qPCR. Furthermore, the parasitological condition of 44 patients with chronic ChD was evaluated using this method in pre and post-therapy conditions with Nifurtimox (NFX), and compared to the techniques of xenodiagnosis (XD), conventional PCR of dejection samples of XD triatomines (PCR-XD) and venous blood (PCR-B). The standardization of the qPCR reaction directed to the detection of T. cruzi showed a sensitivity and specificity of 92% and 100%, respectively, while the EIC system based on X12 allowed discounting false negatives. In terms of the evaluation of the chemo-therapeutic efficacy of NFX, qPCR showed that 86.36% of the individuals evaluated eliminated T. cruzi or had detectable parasitemia of levels too low to be quantified in the dynamic range established (<1 parasite/mL). These results represent a positive finding, since although the majority of the conventional methods detect the persistence of T. cruzi, qPCR detects the real current level of circulating parasitemia; thus this method should be considered the principal indicator of the evaluation of the chemo-therapeutic efficacy in the treatment of chronic ChD / Financiamiento: Proyecto Fondecyt 1100768.

Tesis para optar al Grado de Magíster en Ciencias Animales y Veterinarias mención Ciencias Animales / En la actualidad, la enfermedad de Chagas (ECh), es considerada una de las “enfermedades desatendidas” más importantes del mundo y debido a sus implicancias médicas, sociales y económicas constituye uno de los principales problemas de salud pública de Latinoamérica. Se estima que 28 millones de personas de la región están expuestos a la infección y que la ECh es causa de muerte a 14.000 personas cada año, mucho más que otras parasitosis en la región, incluida malaria. La ECh causa discapacidad prematura, con un costo anual de 667.000 años de vida ajustados por discapacidad. Desde el punto de vista diagnóstico, la detección del parásito ha mejorado en forma considerable desde la aplicación de la Reacción de Polimerasa en Cadena (PCR). No obstante, la modalidad convencional (PCR Tiempo final), sólo permite detectar la presencia de ADN de Trypanosoma cruzi circulante, mientras que la aplicación de PCR Tiempo Real (qPCR), modalidad cuantitativa de PCR, permite obtener información sobre la carga parasitaria de T. cruzi circulante. El objetivo de esta tesis fue cuantificar la carga de T. cruzi mediante qPCR en sangre (qPCR-S) y deyecciones de triatominos alimentados mediante XD (qPCR-XD) en 90 personas con ECh crónica, clasificados según presencia o ausencia de cardiopatía. Todos proceden de áreas endémicas de Chile y participaron en el estudio bajo Consentimiento Informado. La curva estándar de qPCR se elaboró a partir de una concentración conocida de ADN de T. cruzi, realizando diluciones seriadas (1/10) en sangre de paciente sin ECh con un rango dinámico entre 106 a 10-1 parásitos equivalentes/ml (par.eq/ml.) Todos los cálculos se estimaron considerando que cada célula de T. cruzi posee 200 fg de material genético. Se aplicó el sistema de detección TaqMan®, en un termociclador Mx3000P™ Stratagene (AgilentTecnologies, USA) con los primers satelitales cruzi 1 y cruzi 2. En los grupos de cardiópatas con XD (+) o XD (-) fue posible establecer mediante qPCR-S, que el 57.1% y el 39.5%, respectivamente, presenta cargas parasitarias entre 0.1-1 par. eq./ml. Al aplicar qPCR-XD en los mismos grupos, se observó que el 57.1% de los casos XD (+) tenía entre 1-10 par. eq./ml y el 34.21% de los casos XD (-) entre 0.01-0.1 par. eq./ml. La positividad de qPCR-S y qPCR-XD en el grupo XD (+) fue del 100%, con rangos de parasitemia diferentes, mientras que en el grupo XD (-), la positividad de qPCR-XD fue del 55.27%. En el grupo de no cardiópatas XD (+), fue posible determinar mediante qPCR-S que el 77.8% de los casos tuvieron una carga parasitaria entre 0.1-1 par. eq./ml, mientras que en los casos XD (-), el 52.8% tuvo cargas entre 0.01-0.1 par. eq./ml. En el 36.1% de los casos de este último grupo, qPCR-S no detectó T. cruzi. Al aplicar qPCR-XD en el grupo de no cardiópatas XD (+) se estableció que el 44.4% tuvo cargas parasitarias entre 10-100 par. eq./ml, mientras que en los casos XD (-) el 50% de los casos tenía entre 0.01-0.1 par.eq./ml. La positividad de qPCR-XD en XD (-) fue del 72.2%. La mediana de carga parasitaria de T. cruzi determinada mediante qPCR-S para el grupo cardiópata fue de 0.07 par.eq./ml y en el grupo de no cardiópatas de 0.02 par.eq./ml. Por otra parte, la mediana de parasitemia de T. cruzi qPCR-XD para el grupo de cardiópatas fue de 0.017 par.eq./ml y en el grupo de no cardiópatas de 0.055 par.eq./ml. La prueba de diferencias de Mann-Whitney para las medianas, no encontró diferencias entre las cargas parasitarias entre cardiópatas y no cardiópatas. / Financiamiento: proyecto Fondecyt 1120382-1161485.

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Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La enfermedad de Chagas, una zoonosis que afecta al continente Americano, es causada por el protozoo flagelado Trypanosoma cruzi y su principal vía de transmisión es vectorial, a través de insectos hematófagos de la subfamilia Triatominae. Epidemiológicamente, en Chile el vector más importante es Triatoma infestans. La saliva de artrópodos hematófagos tiene propiedades vasodilatadoras e inmunomoduladoras que favorecen la ingestión de sangre, sin daño aparente para el hospedero. Extractos de glándula salival de algunos de estos organismos inhiben la ruta clásica y alterna de activación del sistema del complemento humano. Se ha aislado en la saliva de otros artrópodos hematófagos a calreticulina (CRT), una proteína altamente pleiotrópica que está presente en todos los linajes celulares, excepto eritrocitos. En este estudio se demostró la presencia de CRT en extracto de glándula salival de T. infestans (TiCRT), usando criterios antigénicos y funcionales. Se analizó el extracto completo de glándula salival de T. infestans mediante electroforesis en gel de poliacrilamida al 10% p/v, en presencia de dodecil sulfato de sodio y β2-mercaptoetanol (SDS- PAGE). Una réplica fue sometida a electrotransferencia, donde anticuerpos heterólogos reconocieron TiCRT putativa. Funcionalmente, y de acuerdo a lo esperado, se verificó que la TiCRT putativa presente en el extracto de glándula salival se unió específicamente al componente C1q, módulo de reconocimiento de señales de peligro de la ruta clásica del sistema del complemento humano. Más aún, el extracto de glándula salival, conteniendo TiCRT, inhibió esa ruta de activación, según lo verificado en ensayos inmunométricos. Muy probablemente, la unión de TiCRT a C1q medió una disminución en el depósito a la fase sólida de C4b. Esta es la unidad central de las convertasas de C3 y de C5 del complemento. Tomados en conjunto, estos resultados permiten proponer que el extracto de glándula salival de T. infestans contiene una molécula con peso aparente y propiedades antigénicas y funcionales compatibles con aquellas conocidas para CRT

Carta al editor. / Revisión por pares

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / En el presente trabajo, se analizó la evolución de la infección con Trypanosoma cruzi, en ratones Balb/c experimentalmente infectados con 2.000 trypomastigotes sanguíneos de la cepa Tulahuén o del clon Dm28c del parásito, evaluando no sólo prepatencia y niveles de parasitemia, sino también su correlación con el número de pseudoquistes, la magnitud del daño inflamatorio, en el tejido cardiaco y músculo esquelético y la mortalidad acumulada de los ratones infectados. Los resultados mostraron una prepatencia, similar, de 5 días en ambos grupos de ratones. En relación al nivel máximo de parasitemia, este alcanzó un máximo de 16,23 ± 2,21 x 105 parásitos/mL a los 11 día post infección, en los ratones infectados con la cepa Tulahuén, y que no fue significativamente distinto del nivel máximo de, 19,37 ± 1,78 x 105parásitos/mL, alcanzado por los ratones infectados con el clon Dm28c, a los 19 días post infección (p > 0,05). Todos los ratones sucumbieron a la infección con T. cruzi, alcanzando un 100% de mortalidad acumulada a los 19 días post infección con la cepa Tulahuén y a los 21 días en aquellos infectados con el clon Dm28c. El estudio histopatológico mostró un número similar de pseudoquistes, tanto en el tejido cardiaco, como en músculo esquelético de ambos grupos de ratones infectados con T. cruzi. No se observaron diferencias en la evolución del daño inflamatorio en músculo esquelético de todos los ratones infectados; sólo se observaron diferencias en la evolución del daño inflamatorio en el tejido cardiaco. En los ratones infectados con la cepa Tulahuén, el daño inflamatorio en el tejido cardiaco se inicia tempranamente en la primera semana post infección y alcanza su mayor severidad y magnitud a partir de la segunda semana post infección experimental. En los ratones infectados con el clon Dm28, en cambio, el aumento en el número de pseudoquistes y en la magnitud y severidad del daño cardiaco es de más lenta evolución alcanzando su mayor expresión a los 21 días post infección experimental. / Proyecto LIHBAC-001/13

Memoria para optar al Titulo Profesional de Médico Veterinario / Se infectaron ratones de la cepa ACA, machos y hembras, con 200 y 2000 trypomastigotes sanguíneos del clon Dm28c de Trypanosoma cruzi. Todos los animales se comportaron como susceptibles a la infección, independientemente del sexo y la dosis de inóculo inicial. Los animales, tanto machos como hembras, infectados con 2000 parásitos presentaron niveles de parasitemia significativamente más altos que los ratones infectados con la dosis menor. A su vez, los machos desarrollaron niveles de parasitemia más altos que las hembras, tanto al infectar con 200 como con 2000 parásitos. A pesar de comportarse todos los animales experimentales como susceptibles, el período de supervivencia fue significativamente más prolongado en los machos infectados con 200 comparado con lo ocurrido con los machos infectados con 2000 parásitos. Las hembras infectadas con 2000 sobrevivieron más tiempo que los machos infectados con la misma dosis de parásitos. No se observaron diferencias significativas en el tiempo de supervivencia, al comparar hembras infectadas con 200 y 2000 ni tampoco en el caso de machos y hembras infectadas con 200 parásitos. Al parecer, la principal característica afectada por las variables sexo y dosis de inóculo inicial es el nivel de parasitemia