A enzima β-D- frutofuranosídeo frutohidrolase (E.C. 3.2.1.26), também conhecida como invertase, é uma hidrolase capaz de clivar o dissacarídeo sacarose, gerando mistura equimolar de glicose e frutose (‘açúcar invertido’). A aplicação deste, bem como a dos monossacarídeos de modo isolado é bastante comum na indústria alimentícia, por exemplo na manufatura de recheios de doces, além de outras aplicações, como na indústria farmacêutica. O objetivo deste trabalho foi avaliar diferentes suportes e métodos de imobilização de uma invertase de Saccharomyces cerevisiae. Os experimentos feitos com filmes de celulose, macroesferas de quitosana, e o suporte comercial Immobead não apresentaram resultados conclusivos. A imobilização covalente unipontual da invertase em mistura de nano e agregados de nanopartículas de quitosana possibilitou a obtenção dos seguintes resultados: além desse suporte ser de fácil preparação e ativação, oferecendo grande área superficial para a imobilização, o derivado imobilizado apresentou alta recuperação da atividade, sendo utilizado o protocolo que permitiu obter 74,3 % de rendimento e 61,6 % de eficiência de imobilização. A temperatura (55 ºC) e o pH ótimos de atividade (4,5), estabilidade térmica e ao armazenamento não foram modificados pós-imobilização. A afinidade da invertase pelo substrato decaiu cerca de 3 vezes, devido à reduzida acessibilidade da sacarose ao sítio ativo da enzima. Porém, o parâmetro Vmax manteve-se constante, indicando que não houve perda na máxima conversão da sacarose em seus monossacarídeos. Através da imobilização foi possível obter excelente estabilidade operacional: 59 reusos com 100 % da atividade catalítica da enzima (bateladas de 30 min, sob suave agitação, com solução de sacarose 8 %, a 55 ºC). / The enzyme β-D- fructofuranoside fructohydrolase (E.C. 3.2.1.26), also known as invertase, is one hydrolase able to cleave the sucrose disaccharide, generating an equimolar mixture of glucose and fructose (‘invert sugar’). The application of invert sugar, as well the isolated monosaccharides is very common in the food industry, for example in the manufacture of filling of sweets, besides other applications, as in the pharmaceutical industry. The objective of this work was to evaluate different supports and immobilization methods of an invertase from Saccharomyces cerevisiae. The experiments performed with cellulose films, chitosan macrospheres and the commercial support Immobead did not present conclusive results. The unipoint covalent immobilization of invertase in a mixture of chitosan nano and aggregated nanoparticles made possible to obtain the following results: besides the easy preparation and activation of this support, offering high superficial area for enzyme immobilization, the immobilized derivative presented high activity recovery, which allowed getting 74.3 % of immobilization yield and 61.6 % of immobilization efficiency. The optimal temperature (55 ºC) and pH (4.5) for activity, thermal and storage stabilities were not modified after immobilization. The enzyme affinity for its substrate decreased about 3 folds, mainly due to the reduced accessibility of sucrose to the catalytic site of the enzyme. However the parameter Vmax remained constant, indicating that there was not loss in the maximal conversion of sucrose in its monosaccharides. Through the immobilization was possible to obtain excellent operational stability: 59 reuses with 100 % of the catalytic enzyme activity (batches of 30 min, under genlte stirring, with sucrose solution 8 %, 55 ºC).

Orientador: Graciliano de Oliveira Neto / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-07-21T14:56:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Okamoto_Sayuri_M.pdf: 3523584 bytes, checksum: 596d8bebadb1a1b4f3414b56c472f3f0 (MD5) Previous issue date: 1996 / Mestrado

Orientador: Elias Basile Tambourgi / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química / Made available in DSpace on 2018-08-18T11:14:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Marques_PetrusPires_M.pdf: 1926670 bytes, checksum: c90fed5582358b0c850c13626f16e393 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A lipase é uma enzima de alto interesse comercial, com aplicabilidades diversas na indústria, desde aditivo de detergentes até ferramenta de síntese da indústria farmacêutica. O uso da enzima é limitado, no entanto, pelo alto custo de obtenção em nível de pureza adequado, de acordo com a finalidade. O objetivo desse trabalho foi imobilizar a lipase diretamente de seu extrato bruto, excluindo no processo outras proteínas, promovendo uma imobilização seletiva, atuando como extração, ou purificação de baixa resolução. A enzima foi produzida utilizando uma cepa de Burkholderia cepacia com óleo de oliva como indutor. O fermentado produzido pela bactéria foi caracterizado quanto à sua atividade lipolítica utilizando o p-npp como substrato. O extrato apresentou temperatura ótima de 50°C e pH ótimo 9,0. A enzima foi avaliada ainda quanto à sua afinidade pelo substrato utilizado, revelando um Km=18,4 mM, com uma velocidade máxima de atividade de 5,56 mM.min-1. Através dos dados da cinética foi possível calcular a energia de ativação da enzima em 38 kJ.mol-1.K-1. O extrato enzimático foi utilizado em procedimento de imobilização utilizando alginato de sódio em solução. As já documentadas interações entre o alginato e lipases permitiram realizar um processo de imobilização seletiva por precipitação com cloreto de cálcio. Foram estudadas, com o auxílio de planejamento estatístico de experimentos, as seguintes variáveis atuantes no processo: pH e concentração da solução de alginato, concentração da solução de cloreto de cálcio, tamanho das esferas produzidas e relação volume alginato/volume solução enzimática. As melhores condições encontradas para o processo foram concentração de alginato de 2%, pH da solução 3,68 e concentração de cloreto de cálcio 200mM, com uma relação de 40% de volume alginato/60% solução enzimática, produzindo esferas de 2 mm de diâmetro. Com essas condições obteve-se uma taxa de imobilização de 168,07%, que representa uma concentração da proteína alvo em 1,68 vezes, e recuperação superior a 99% em um procedimento de etapa única / Abstract: Lipase is an enzyme of high commercial value, with several applications in industry, from detergent additive to pharmaceutical synthesis tool. Nevertheless, the lipase use is limited by the high cost of its production in the necessary purity grade according to its use. The objective of this work was to entrap lipase directly from its crude extract excluding contaminant proteins in the process, promoting a selective entrapment, acting as a pre-purification or extraction. The enzyme was produced using a strain of Burkholderia cepacia and olive oil as inducer. The crude extract was characterized according to its lipolytic activity using p-npp as substrate. The crude extract presented optimal temperature of 50 °C and optimal pH of 9.0. Lipase was also evaluated according to its affinity for the substrate, revealing a Km of 18.4 mM and maximum velocity of 5.56 mM.min-1. From the data obtained it was also possible to calculate the activation energy of the enzyme: 38 kJ.mol-1.K-1. This crude extract was used in the immobilization procedure using sodium alginate solution. The already published data about the affinity of lipases and alginate allowed a performance of a selective entrapment by precipitation with calcium chloride. Using statistical design of experiments the following variables were studied in the process: concentration and pH of alginate solution, concentration of calcium chloride solution, diameter of the produced beads and relation alginate volume/enzyme solution volume. The best conditions found were: alginate concentration 2% at pH 3.68, 200 mM calcium chloride concentration and a relation 40% alginate solution volume/60% enzyme solution, producing 2 mm diameter beads. In these conditions, it was possible to obtain a immobilization yield of 168.07%, which represents a concentration of 1.68 times of the target protein and an enzyme recovery superior to 99% in a single step procedure / Mestrado / Sistemas de Processos Quimicos e Informatica / Mestre em Engenharia Química

Orientador: Eleni Gomes / Banca: Maricy Raquel Lindenbah Bonfá / Banca: Heizir Ferreira de Castro / Banca: Adriana Aguiar Mendes / Banca: Tatiane Lembo / Resumo: As lipases apresentam atividades catalíticas específicas as quais permitem seu uso em diferentes setores da indústria, como de alimentos, tratamento de águas residuais, cosméticos, farmacêuticos e biocombutíveis. A imobilização dessas enzimas torna mais eficiente sua aplicação uma vez que preserva suas propriedades bioquímicas nas condições reacionais e facilita recuperação e reutilização. O objetivo deste trabalho foi caracterizar a lipase bruta produzida pelo fungo Acremonium-like ROG 2.1.9, purificá-la parcialmente e imobilizá-la em diferentes matrizes, incluindo resíduos agro-industriais, e sua utilização na produção de biodiesel por transesterificação enzimática. A enzima apresentou maior atividade a pH 7,0 e a 45°C e estabilidade na presença de n-hexano e metanol, com 92% e 40% de atividade residual, respectivamente, após 24 horas em presença daqueles compostos. A lipase mostrou ainda, especificidade por ácidos graxos de cadeia média como p-nitrofenil decanoato (C10:0), seguido de p-nitrofenil palmitato (C16:0). A enzima foi purificada parcialmente por precipitação fracionada com sulfato de amônio, com maior rendimento obtido na faixa entre 30-50% de saturação do sal. Após ser parcialmente purificada, a lipase foi imobilizada por adsorção em bagaço de cana e sabugo de milho não ativados, por meio de interação hidrofóbica em Sepabeads C18, Lewatit 105 e Lewatit 1600, por interação iônica em PEI-agarose, MANAE-sabugo de milho e MANAE-bagaço de cana e por ligação covalente... / Abstract: Lipases have specific catalytic activities which allow its use in different industry sectors such as food, waste water treatment, cosmetics, pharmaceuticals and biofuel. The efficiency, preservation of the biochemical properties, recovery and reuse of the activity of theses enzymes are increased by immobilization on an inert support.The objective of this study was to purify partially and characterize the lipase transesterification produced by Acremonium-like ROG 2.1.9, and to immobilize it on different matrices, including agro industrial waste. The enzyme showed the highest activity at pH 7.0 and at 45 °C and stability in the presence of n-hexane and methanol (92% and 40%, respectively), for 24 hours. The lipase also showed specificity for meddium-chain fatty acids, as p-nitrophenyl decanoate (C10: 0), followed by p-nitrophenyl palmitate (C16: 0). The enzyme was partially purified by fractional precipitation with ammonium sulfate, with higher yield in the range of 30-50% salt saturation. The partially purified lipase was immobilized by adsorption on sugarcane bagasse and on corn cob, through hydrophobic interaction on Sepabeads C18, Lewatit 105 and Lewatit 1600; by ionic interaction on PEI-agarose, MANAE-corn cobs and MANAE- cane bagasse and by multipoint covalent bond on Glyoxyl-cob corn and Glyoxyl-cane bagasse. The immobilization by ionic interaction on MANAE-cob afforded an increase of 100% in the activity of enzyme. The Lip-MANAE-cob derivative showed higher ionic strength, LipMANAE-bagasse was more stable thermally (45 °C) and Lip-PEI-agarose derivative was the most stable in ethanol (30% v / v). The activity of the MANAE-cob and MANAE-bagasse derivatives increased in the presence of ethanol, n-hexane and DMSO and in the presence of surfactants CTAB and Triton X-100. Based on the results, it was conclude that the use of agro-industrial waste (bagasse and corn cob) ... / Mestre

Fruto-oligossacarídeos (FOS) são fibras prebióticas com poder adoçante considerável, sendo um produto de alto valor para a indústria de alimentos. Açúcar invertido é o produto da hidrólise da sacarose possuindo maior poder adoçante, menor susceptibilidade à cristalização e maior higroscopicidade com relação à sacarose, sendo de grande interesse industrial. Ambos produtos podem ser produzidos por reações enzimáticas, utilizando β-frutosiltransferase e β- frutofuranosidase respectivamente, no entanto processos enzimáticos costumam ser caros devido ao alto custo e baixa estabilidade de enzimas. Esses fatores podem ser contornados com a imobilização da enzima, permitindo a reutilização e por vezes aumentando a estabilidade. No presente trabalho a enzima β-frutosiltransferase proveniente de um extrato comercial de Aspergillus aculeatus (Viscozyme L) foi parcialmente purificada, com resina de troca iônica, imobilizada covalentemente em esferas de quitosana e utilizada na produção de FOS. O processo de purificação aumentou a atividade específica em 6 vezes. A estabilidade do biocatalisador imobilizado foi avaliada em 50 bateladas para produção de FOS, foi observado cerca de 55 % de rendimento em cada batelada, sem perda de atividade detectada após as utilizações. Após esse experimento foi testada a utilização das esferas em reatores contínuos com leito fixo e fluidizado, com rendimentos de 59 % e 54 % respectivamente. A produção de açúcar invertido foi feita utilizando a enzima Maxinvert L (β-frutofuranosidase de Saccharomyces cerevisiae) que foi imobilizada, da mesma forma, em esferas de quitosana e sua utilização foi testada em reatores de leito fixo e fluidizado com rendimentos de 98 % e 94 % respectivamente. Os reatores de leito fixo possuem potencial para estudos envolvendo aplicações industriais tanto para produção de FOS quanto para produção de Açúcar Invertido. / Fructooligosaccharides (FOS) are prebiotic fibre with sweetening power, being a highvalue product for the food industry. Invert sugar is the product of sucrose hydrolysis; it has a higher sweetening power, it is less susceptible to crystallization and has a higher hygroscopicity than regular sugar. Finding many uses in food industry processes. Both products can be obtained by enzymatic reactions using β-fructosyltransferase and β- fructofuranosidase, respectively. However, enzymatic processes are often costly because of high enzymatic cost and lack of operational stability. These drawbacks can be overcome by immobilization of enzyme, enabling reuses and usually increasing its stability. In the present work, β-fructofuranosidase from a commercial preparation from Aspergillus aculeatus (Viscozyme L) was partially purified, covalently immobilized on chitosan spheres and used for FOS production. Partial purification resulted in a 6-fold increase in specific activity. Operational stability of biocatalyst was evaluated along 50 batches, resulting in around 55 % yield on each batch and no loss of activity after batches. The immobilized biocatalyst was also used for FOS production in packed bed and fluidized bed reactors with yields of 59 % and 54 % respectively. Invert sugar production was carried out using Maxinvert L (β- fructofuranosidase from Saccharomyces cerevisiae) immobilized, by the same method, on chitosan spheres. Its application on packed bed and fluidized bed reactors was evaluated resulting in yields of 98 % and 94 % respectively. The packed bed reactors presented potential for further studies aiming industrial applications for FOS and Invert Sugar production.

Orientador: Rubens Monti / Coorientador: Guilherme Peixoto. / Banca: Alice Yoshico Tanaka / Banca: Fernando Massarin / Resumo: A busca por inovações tecnológicas que gerem produtos de qualidade concomitantemente à redução de custos, são os principais fatores de preocupação envolvendo um processo em escala industrial. Devido à importância destes fatores, este projeto estudou a produção de açúcar invertido por meio de processo enzimático contínuo de alta taxa visando identificar condições para o aumento da taxa de produção e eficiência na conversão do substrato. Dessa forma, a enzima invertase foi imobilizada em resíduo agroindustrial de baixo custo e fácil aquisição (pó de sabugo de milho) e para fins de comparação, foi imobilizada também e um suporte universal: a agarose. Objetivo: Obtenção de açúcar invertido usando o derivado pó de sabugo de milho-glutaraldeído-invertase (SM-GLU) em reator de leito fixo. Métodos: Obtenção e caracterização cinética da enzima invertase solúvel. Posteriormente sua imobilização nos suportes SM-GLU e AG-GLU seguida de caracterização cinética dos derivados obtidos. Na etapa seguinte, foi realizado a determinação da taxa (%) de hidrólise de sacarose em condições de máxima atividade (20% de sacarose m/v em tampão acetato de sódio, 50 mM e pH 5) para os derivados em sistema descontínuo (batelada), e em reator de sistema contínuo, visando encontrar a condição de máxima eficiência. Onde foram caracterizados parâmetro de processo como eficiência de conversão, carga substrato aplicada, estabilidade e reuso do derivado enzimático. Resultados: Os derivados enzimáticos obtiveram u... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Mestre

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-10-07T12:48:01Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1416528 bytes, checksum: afeca902a468f80e36241eb75bec099b (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-07T12:48:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1416528 bytes, checksum: afeca902a468f80e36241eb75bec099b (MD5) Previous issue date: 2005-02-01 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Diversas pesquisas têm demonstrado o potencial de α-galactosidases para o processamento de produtos alimentícios à base de leguminosas. A soja, uma fonte concentrada de isoflavonas, tem sido utilizada na prevenção e tratamento de câncer e osteoporose. Além disso, o leite de soja é considerado um substituto de baixo custo para o leite de vaca, como suplemento nutritivo para crianças intolerantes à lactose. Em contrapartida, leguminosas contêm muitos fatores antinutricionais, sendo um deles os oligossacarídeos de rafinose (RO), que são os principais fatores responsáveis por distúrbios gastrintestinais relacionados com a ingestão de produtos derivados de soja. As mucosas intestinais de humanos e de animais monogástricos não possuem a enzima α-galactosidase, essencial para a hidrólise de ligações α-1,6 nos RO. Portanto, a eliminação dos RO dos produtos de soja contribui para melhorar o seu valor nutritivo. Esses galacto- oligossacarídeos são extremamente termoestáveis e, práticas tradicionais como embebição, cozimento e germinação são incapazes de eliminá-los completamente. O objetivo deste trabalho foi avaliar a hidrólise de RO presente no extrato desengordurado de soja e nos produtos de soja, melaços leve e pesado utilizando α-galactosidases extra e intracelulares purificadas de Debaryomyces hansenii, além da enzima extracelular imobilizada. Debaryomyces hansenii foi cultivada em meio mineral com extrato de levedura (MME), contendo galactose como fonte de carbono, por 36 h a 30 o C. Após este período, o meio de cultura foi centrifugado, o sobrenadante foi utilizado como fonte da enzima extracelular e as células como fonte da enzima intracelular. Os extratos enzimáticos foram submetidos à cromatografia de filtração em gel Sephadex G- 150 e posteriormente, à cromatografia de troca iônica DEAE-Sepharose, pH 5,5. As frações protéicas com atividade de α-galactosidase foram eluídas com um gradiente de NaCl de 0 a 1 M. As enzimas extra e intracelulares apresentaram fatores de purificação de 16,7 e 289 vezes, respectivamente, com um rendimento de 58 e 45 %, respectivamente. Atividades máximas das α-galactosidases extra e intracelulares foram detectadas em pH 5,0, a 60 e 55 o C, respectivamente. A enzima extracelular manteve 80 % da atividade original após pré-incubação por 3 h a 60 o C, enquanto que, a enzima intracelular manteve 85 % da atividade original por 6 h a 55 o C. Os valores da K M para ρ-NP-αGal, melibiose, estaquiose e rafinose para a enzima extracelular foram 0,30, 2,01, 9,66 e 16,0 mM, respectivamente, e para a enzima intracelular foram 0,32, 2,12, 10,8 e 32,8 mM, respectivamente. As α-galactosidases apresentaram especificidade absoluta para galactose em posição α, hidrolisando ρ-NP-αGal, estaquiose, rafinose, melibiose e os polímeros goma de alfarroba e goma guar. As α-galactosidases foram completamente inibidas por sulfato de cobre. A enzima extracelular foi completamente inibida por nitrato de prata, enquanto que, a atividade da enzima intracelular foi reduzida em 70 %. Na presença do substrato ρ-NP-αGal a enzima extracelular apresentou inibição não-competitiva por galactose (Ki 2,7 mM) e melibiose (Ki 1,2 mM). A enzima intracelular apresentou inibição do tipo acompetitiva por galactose (Ki 0,70 mM) e inibição competitiva por melibiose (Ki 0,98 mM). O N-terminal da α-galactosidase extracelular foi determinado por seqüenciamento automático (YENGLNLVPQMGWN), apresentando similaridade com α-galactosidases de outros microrganismos. A α-galactosidase extracelular foi imobilizada em suporte insolúvel (sílica modificada) e apresentou maior estabilidade comparada à enzima livre, mantendo 94 % de sua atividade original por 16 h a 70 o C. Os resultados dos tratamentos do leite de soja a 60 o C com a α- galactosidase extracelular purificada, com as células permeabilizadas contendo a enzima intracelular e com a enzima extracelular imobilizada, por 2, 2 e 4 h, respectivamente, mostraram redução de 100 % de estaquiose. Houve 100 % de redução de rafinose, com a enzima extracelular e com as células permeabilizadas, após 2 e 4 h, respectivamente. O tratamento do leite de soja com a enzima extracelular imobilizada por 10 h, promoveu redução de 63 % de rafinose. Após tratamento com a α-galactosidase extracelular a 60 o C, os produtos melaços leve e pesado, mostraram 100 % de redução de estaquiose após 2 h de incubação e rafinose foi reduzida em 60 e 50 %, respectivamente. Portanto, observa-se que as α-galactosidases de Debaryomyces hansenii foram eficientes na redução dos RO presentes em produtos derivados de soja, sendo indicadas para a utilização industrial no processamento desses açúcares. / Several researches have demonstrated the potential of α-galactosidases in the processing of legume derived food. Soybean is a concentrated source of isoflavones, which has been used in prevention and treatment of cancer and osteoporosis. Besides, soy milk is considered a substitute for cow milk, as well as a nutritional suplement for lactose intolerant children. On the other hand, there are many antinutritional features in legume. The raffinose oligosaccharides (RO) are the main responsible for gastric and intestinal diseases related to the ingestion of soy products. The intestinal mucous membrane of men and monogastrics animals does not have the α-galactosidase enzyme, which is essential for hydrolysis of the α-1,6 linkages in the RO. Therefore, the most important factor for improvement of soy nutritional value is to eliminate the RO from soy products. These galacto- oligosaccharides are extremely thermostable and traditional practices like embebition, cooking and germination are unable to eliminate them completely. The present work aims to evaluate the hydrolysis of RO present in the fat free soybean extract and in the soybean molasses, using purified extra and intracellular α- galactosidases from Debaryomyces hansenii and the immobilized extracelular enzyme. The Debaryomyces hansenii was cultivated in mineral medium with yeast extract (MME), which contained galactose as carbon source for 36 h at 30 o C. Following the centrifugation of the culture medium, the supernatant was used as extracellular enzyme source and the cells as intracellular enzyme source. The enzymatic extracts were submitted to the chromatography of gel filtration Sephadex G-150 followed by the ion exchange chromatography DEAE- Sepharose, pH 5.5. The protein fractions with α-galactosidase activity were eluted with NaCl gradient from 0 to 1 M. The extra and intracellular enzymes presented purification factors of 16.7 and 289 times, respectively, with a recovery of 58 and 45 %, respectively. The maximum activities of the extra and intracellular α- galactosidases were detected in pH 5.0 at 60 and 55 o C, respectively. The extracellular enzyme maintained 80 % of its original activity after a pre-incubation for 3 h at 60 o C, while the intracellular enzyme maintained 85 % of its original activity for 6 h at 55 o C. The values of K M for ρ-NP-αGal, melibiose, stachyose and raffinose for the extracellular enzyme were 0.30, 2.01, 9.66 e 16.0 mM, respectively, and for the intracellular enzyme were 0.32, 2.12, 10.8 e 32.8 mM, respectively. The α-galactosidases presented absolute specificity for galactose in α position, hydrolysing ρ-NP-αGal, stachyose, raffinose, melibiose and the polymers locust bean gum and guar gum. The α-galactosidases were completely inhibited by copper sulphate. The extracellular enzyme was completely inhibited by silver nitrate, while the intracellular enzyme activity was reduced in 70 %. In the presence of substrate ρ-NP-αGal the extracellular enzyme presented a non- competitive inhibition by galactose (Ki 2.7 mM) and melibiose (Ki 1.2 mM), the intracellular enzyme showed acompetitive inhibition by galactose (Ki 0.70 mM) and competitive inhibition by melibiose (Ki extracellular α-galactosidase was 0.98 mM). The N-terminal of the determined by automatic sequencing (YENGLNLVPQMGWN), presenting some similarity with α-galactosidases of other organisms. The extracellular α-galactosidase was immobilized in insoluble support (modified silica) and presented greater stability than the free enzyme, maintaining 94 % of its original activity for 16 h at 70 o C. The results of the treatments of soy milk at 60 o C with purified extracellular α-galactosidase, permeable cells containing the intracellular enzyme and immobilized extracellular enzyme, for 2, 2 and 4 h, respectively, showed reduction of 100 % in the amount of stachyose. There was 100 % reduction in the amount of raffinose by the extracellular enzyme and by permeable cells, after 2 and 4 h, respectively. The treatment of the soy milk with the immobilized extracellular enzyme for 10 h promoted reduction of 63 % in raffinose amount. After a treatment with extracellular α-galactosidase the light and heavy molasses products showed 100 % reduction of stachyose after incubation for 2 h at 60 o C, and the raffinose was reduced to 60 and 50 %, respectively. Therefore, it can be observed that α-galactosidases of Debaryomyces hansenii were efficient in reducing the RO presents in soy derived products, and they are appropriate to industrial use in the processing of these sugars. / Dissertação importada do Alexandria

LIMA, Ariosvana Fernandes. Imobilização de uma β-galactosidase produzida por Kluyveromyces lactis NRRL Y-1564 cultivada em soro de leite. 2012. 100 f. : Tese (doutorado) - Universidade Federal do Ceará, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, RENORBIO, Centro de Ciências, Fortaleza-CE, 2012. / Submitted by demia Maia (demiamlm@gmail.com) on 2016-05-19T13:46:24Z No. of bitstreams: 1 2012_tese_aflima.pdf: 2295796 bytes, checksum: d8694cc32f36b9bee8f170aa68a677be (MD5) / Approved for entry into archive by demia Maia (demiamlm@gmail.com) on 2016-05-19T13:47:54Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_tese_aflima.pdf: 2295796 bytes, checksum: d8694cc32f36b9bee8f170aa68a677be (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-19T13:47:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_tese_aflima.pdf: 2295796 bytes, checksum: d8694cc32f36b9bee8f170aa68a677be (MD5) Previous issue date: 2012 / The enzymatic hydrolysis of lactose by β-galactosidase plays an important role in the processing of dairy products, such as the production of milk containing low concentrations of lactose, the prevention of crystallization in dairy products, and the use of galactosyltransferase for synthesizing galacto-oligosaccharides. In this context, this work aims to study how Kluyveromyces strains can be used to produce β-galactosidase from an agro-industrial by-product such as whey. The species studied were K. marxianus (LAMI CE 025, CCA 510, ATCC 36907) and K. lactis(NRRL Y-1564 and Y-4087). This work also aims to investigate the immobilization of the enzyme onto chitosan and determine its properties such as the optimal operating pH and temperature, the thermal stability of the enzyme, the thermal desnaturation constant, the half-life and the kinetic parameters Km and Vmax using ONPG as substrate of the enzyme β-galactosidase from Kluyveromyces lactis strain NRRL Y1564. K. marxianus LAMI CE 025 and CCA 510 did not consume lactose of the complex medium. The other strains were studied for β-galactosidase production in whey. The maximum enzymatic activity of 3.7 U/mL was achieved by K. lactis NRRL Y-1564 after 12h of fermentation at 180 rpm and 30°C, being selected as a microorganism for β-galactosidase production. The optimal pH for soluble β-gal activity was found to be 6.5 while the optimal pH for immobilized β-gal activity was found to be 7.0, while the optimal operating temperatures were 50°C and 37°C, respectively. The soluble and immobilized enzyme showed similar deactivation profiles at 40°C. For more than 200 min, both biocatalysts showed the same stability, retaining approximately 50 % of their initial activities. However, However, the immobilized enzyme showed an increased stability (8 times) at 50°C. In the lactose hydrolysis at 37°C and pH 7.0 by soluble enzyme was observed a conversion of 58.68% using a enzymatic charge of 2.0 U and 17.57% to 0.5 U. The immobilized enzyme was reused for 10 cycles, showing a good operational stability by retaining more than 74% of its initial activity. The immobilized enzyme retained 100% of its initial activity when it was stored at 4°C and pH 7.0 for a period of 93 days. The soluble β-galactosidase lost 9.4% of its initial activity when it was stored at the same conditions. According to these results, an alternative culture medium prepared by using deproteinized whey supplemented with yeast extract was efficiently used for the production of β-galactosidase through the cultivation of Kluyveromyces strains. Chitosan activated with glutaraldehyde is a suitable alternative low cost support for β-galactosidase immobilization, providing the immobilized enzyme with higher thermal, operational and storage stabilities in comparison with the soluble enzyme. / A hidrólise enzimática da lactose por β-galactosidase desempenha importante papel no processamento de produtos lácteos, sendo uma das aplicações à obtenção de leite com lactose reduzida para o consumo por indivíduos com intolerância à lactose, produção de cápsulas de enzimas para tratamento e a prevenção da cristalização em produtos lácteos. Neste contexto, este trabalho foi desenvolvido visando a seleção de cepas de Kluyveromyces produtoras da enzima β-galactosidase usando um resíduo agroindustrial, o soro de leite como meio de cultivo. Inicialmente, realizou-se a seleção de espécies de Kluyveromyces capazes de produzir β- galactosidase utilizando lactose como fonte de carbono, em meio complexo e posteriormente em soro de leite (50 g/L de lactose) desproteinado e suplementado com extrato de levedura (1 g/L). Após definir a levedura que apresentava maior produção da enzima de interesse, estudou-se a produção e a viabilidade de imobilizá-la em quitosana. Após, caracterizou-se a enzima solúvel e imobilizada, consistindo na determinação do pH e temperatura ótimos, estabilidade térmica, estimativa dos parâmetros termodinâmicos e determinação dos parâmetros cinéticos Km e Vmáx usando como substrato ONPG. As cepas de K. marxianus LAMI CE025 e CCA 510 não consumiram lactose em meio complexo. As demais cepas foram avaliadas quanto à produção de β-galactosidase em soro de leite. A atividade máxima de 3,7 U/mL foi obtida por K. lactis NRRL Y-1564 após 12 h de cultivo a 180 rpm e 30ºC, sendo selecionada como micro-organismo para a produção da β-galactosidase. O pH ótimo para a enzima solúvel e imobilizada foram 6,5 e 7,0, respectivamente, e temperatura ótima de 50 e 37°C para a β-galactosidase solúvel e imobilizada, respectivamente. A enzima solúvel e imobilizada mostrou perfis semelhantes de desactivação a 40 ° C. Durante mais de 200 min, ambos os biocatalisadores mostrou a mesma estabilidade, retendo cerca de 50% da sua actividade inicial. Entretanto, a 50ºC, a enzima imobilizada mostrou uma maior estabilidade térmica, sendo 8 vezes mais estável. Os parâmetros cinéticos Km e Vmáx foram 3,34 mM e 1,78 mM/min para a β-galactosidase solúvel comparado com 3,68 mM e 3,38 mM.min para a enzima imobilizada. Na hidrólise de lactose utilizando a enzima solúvel a 37ºC e pH 7,0 foi verificada uma conversão de 30,77% da lactose para a carga de 2,0 U e 9,8% usando 0,5 U. Após o 10º reciclo de uso, a enzima imobilizada reteve 74% da atividade inicial. A β-galactosidase imobilizada, estocada em tampão fosfato de potássio pH 7,0 a 4°C manteve 100% de sua atividade enzimática inicial no período de 93 dias. A β-galactosidase solúvel perdeu 9,4% de sua atividade inicial quando foi estocada nas mesmas condições. De acordo com os resultados obtidos, o soro de leite mostrou-se uma fonte de carbono alternativa para produção de β-galactosidase de K. lactis NRRL Y1564 e a quitosana ativada com glutaraldeído é um suporte alternativo adequado de baixo custo para imobilização da β-galactosidase, proporcionando a enzima imobilizada estabilidades térmicas, operacional e de armazenamento comparado com a enzima solúvel.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico, Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Alimentos, Florianópolis, 2017. / Made available in DSpace on 2017-08-15T04:11:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 347194.pdf: 2218454 bytes, checksum: f56f5cdb0571847ed43da1ed9fc4b13e (MD5) Previous issue date: 2017 / As lipases desempenham um papel muito importante nos processos tecnológicos em diversos segmentos industriais catalisando reações como hidrólise, esterificação e aminólise. A imobilização destas enzimas em suporte de baixo custo que permita aumentar sua estabilidade operacional e reutilização surge como uma grande vantagem econômica. Diante disso, esse trabalho explorou diferentes métodos de imobilização da lipase NS-40116 de Thermomyces lanuginosus em espuma flexível de poliuretano (PU) (adsorção física, ligação covalente/cruzada e aprisionamento in situ). A síntese do suporte polimérico foi realizada com poliol poliéter e tolueno diisocianato usando razão volumétrica de 5:3 (v/v). A caracterização dos imobilizados foi realizada por densidade aparente, microscopia eletrônica de varredura (MEV) e espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR). A atividade enzimática foi medida por hidrólise utilizando p-NPP (p-nitrofenil-palmitato) como substrato. Este imobilizado foi avaliado em termos de estabilidade ao pH (7,0 e 9,0), temperatura (24, 50 e 60 ºC) e solvente (etanol e metanol) por 24 horas, além de estabilidade ao armazenamento (ambiente ou refrigerado) por 30 dias e determinação dos parâmetros cinéticos (Km e Vmáx). Os resultados mostraram que após 30 dias de armazenamento o imobilizado apresentou apenas uma redução de 20% de atividade catalítica. A enzima livre e os imobilizados foram aplicados na hidrólise de óleo de soja. Os imobilizados foram avaliados em sucessivos ciclos de reuso sendo que a enzima imobilizada por aprisionamento in situ apresentou atividade catalítica acima de 50% após 5 ciclos de reuso, mostrando a eficiência do processo de imobilização.<br> / Abstract : Lipases play a very important role in the technological processes in a range of industrial process, catalyzing reactions like hydrolysis, esterification and aminolysis. Enzyme immobilization using a low-cost support that allows to increase operational stability and reutilization arises a great economic advantage. In this way, this work explored different methods of Thermomyces lanuginosus lipase NS-40116 immobilization in flexible polyurethane foam (PU) (physical adsorption, covalent/crosslinking and entrapment). The synthesis of polymer was carried out with polyol polyether and toluene diisocyanate (TDI) by using volumetric ratio of 5:3 (v/v). PU support before and after immobilization process was characterized by apparent density, scanning electron microscopy (SEM) and Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR). The enzymatic activity was measured by hydrolysis using p-NPP (p-nitrophenyl palmitate) as substrate. Also, PU support containing immobilized enzyme was evaluated in terms of stability at pH (7.0 and 9.0), temperature (24, 50 and 60 ºC) and solvent (ethanol and methanol) for 24 hours, and storage stability (ambient or refrigerated) for 30 days. The results showed that after 30 days of storage the immobilized showed only a reduction of 20% of catalytic activity. Free and immobilized enzyme were comparted in the hydrolysis of soybean oil, and immobilized enzyme by entrapment was evaluated in successive cycles of reuse showing a catalytic activity above 50% after 5 successive cycles of reuse, showing the immobilization process efficiency.

Made available in DSpace on 2014-11-10T11:09:57Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-06-14Bitstream added on 2014-11-10T11:57:28Z : No. of bitstreams: 1 000790023.pdf: 1983228 bytes, checksum: 7f1cb9f69f9bbf6c229492b0c0c2180a (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Na biocatálise faz-se necessária a imobilização destas enzimas em suportes inertes ao meio reacional, a fim de reutilizar, estabilizar, purificar e muitas vezes melhorar a atividade enzimática, levando à uma hiperativação. O presente trabalho teve como objetivo principal utilizar técnicas de imobilização de enzimas sob diferentes suportes (iônicos, hidrofóbicos e covalentes) e aplicá-los na imobilização de distintas lipases para avaliar o efeito da imobilização na atividade, seletividade, estabilidade e purificação dessas proteínas. O Capítulo 1 do trabalho relata algumas técnicas de imobilização e pré-purificação das lipases brutas obtidas a partir do fungo Acremonium sp, no qual as enzimas pré-purificadas por ultrafiltração apresentaram maior atividade e rendimento de imobilização sob os suportes hidrofóbicos octil- e fenil-agarose. Essas enzimas imobilizadas foram hiperativadas na presença de 0,01 mol∙L-1 de NaCl e concentrações maiores desse sal causaram a diminuição da atividade enzimática. A atividade hidrolítica das lipases imobilizadas foi avaliada utilizando diferentes fontes de óleos vegetais, com maior atividade para enzima imobilizada do que a enzima solúvel em 40% dos óleos testados. No Capítulo 2 é apresentada a modificação química e caracterização da quitosana ativada com glicidol, epicloridrina e glutaraldeído para posterior aplicação como suporte para imobilização de lipases por ligação covalente, porém tal procedimento não foi possível devido à baixa área superficial do polímero (cerca de 4cm²·g-1) tanto para reagir com os agentes modificantes quanto para o carregamento proteico. A utilização da radiação do ultrassom na biotransesterificação do óleo de soja catalisada por lipases imobilizadas (TLL e L435) por interação hidrofóbica foi estudada no Capítulo 3, bem como o rendimento de produção total de ésteres dos óleos de soja, milho e girassol ... / In the biocatalysis is necessary their immobilization on inert supports for further reuse, stabilization, purification and hyperactivaction of the biocatalyst. This study aimed to immobilization of different lipases using different supports (ionic, hydrophobic and covalent) and to evaluate the activity, selectivity, stability and purification of these immobilized proteins. The chapter 1 of the work describes some techniques of immobilization and pre-purification of crude lipases from Acremonium sp by ultrafiltration showed higher activity and yield of immobilization on octyl- and phenyl-agarose. The activity of these immobilized enzymes was hyperactived by incubation at 0.01 m∙L-1 NaCl and higher concentrations of this salt was observed a decrease on the enzyme activity. The hydrolytic activity of the immobilized lipase was influenced by the vegetable oil source. In Chapter 2 we present the chemical modification and characterization of chitosan previously activated with glycidol, epichlorohydrin and glutaraldehyde for subsequent use as support for immobilization of lipases, but the low surface area of chitosan determined by BET (4 cm²∙g-1) negatively affected the immobilization process. The use of ultrasound radiation in biotransesterification of soybean oil catalyzed by immobilized lipases (TLL and L435) by hydrophobic interaction was studied in Chapter 3, and the yield of total production of esters by soybean, corn and sunflower oils. The soybean and corn oils showed highest transesterification and an increased ester production of 400 % obtained was when sonicated. The last chapter of this search presents the results obtained in the Instituto de Catálisis y Petroleoquímica de Madrid during the research stage, which focused on the improvement of the methods of immobilization of lipases and applications in the enantioselective hydrolysis and production of omega-3 from fish oil, with lipase B from Candida antarctica showing ...