Du fait de l’apparition de microorganismes pathogènes ayant une résistance aux antibiotiques actuels, la recherche de nouvelles molécules bioactives possédant une application médicale est devenue une préoccupation mondiale. Saccharothrix algeriensis, une bactérie filamenteuse de l’ordre des actinomycètes a montré une étonnante capacité à produire des molécules bioactives qui appartiennent aux dithiolopyrrolones, ayant de remarquables propriétés à la fois antibiotiques et anticancéreuses. Lors de ce projet de thèse, l’identification du cluster de gènes de la voie de biosynthèse des dithiolopyrrolones chez Sa. algeriensis est envisagée. Suite au séquençage du génome de Sa. algeriensis, une approche génomique ou « genome mining » est suivie, cette approche a révélé un cluster thi potentiellement responsable de la voie de biosynthèse des dithiolopyrrolones chez Sa. algeriensis. Ce cluster contient 12 gènes, dont 8 gènes de biosynthèse, 3 gènes régulateurs et un gène transporteur. Les analyses in silico des gènes ont montré que la cystéine est le substrat d’une NRPS. Les analyses transcriptionelles ont montré que les trois gènes clés codent pour une NRPS, une thiorédoxine et une thioestérase qui pourraient être impliquées dans la biosynthèse des dithiolopyrrolones. Deux gènes actA et actB codant pour des acyltransférases putatives ont été identifiés. Les analyses transcriptionelles suggèrent qu’actA et actB pourraient être responsables de l’acylation de la pyrrothine. Finalement, la caractérisation de deux activités enzymatiques, acétyltransférase et benzoyltransférase, présentes dans l’extrait brut de Sa. algeriensis, ont permis de déterminer les paramètres optimaux (pH et T °C) de la réaction enzymatique. Enfin, les paramètres cinétiques de ces activités ont des valeurs complètements différentes, ce qui confirme la présence d’au moins deux activités différentes chez Sa. algeriensis. / Due to the emergence in the last decades of new and old infectious diseases to existing antibiotics, the research for new bioactive molecules which possess medical applications become a global occupation. Saccharothrix algeriensis, filamentous bacteria of actinomycetes order showed a surprising ability to produce bioactive molecules belongs to dithiolopyrrolones with remarkable properties of both antibiotics and anticancer. In this thesis, the identification of dithiolopyrrolones biosynthetic gene cluster in Sa. algeriensis was investigated. Through S. algeriensis genome sequencing, a genomics approach "genome mining" was followed, this approach has revealed a potentially thi cluster responsible for dithiolopyrrolones biosynthesis pathway in Sa algeriensis. This cluster contains 12 genes, including 8 biosynthesis genes, three regulatory genes and one transporter gene. The in silico analysis of this cluster showed that the cysteine is the substrate of the NRPS. The transcriptional analyzes showed that the three key genes which encode for NRPS, thioredoxin and thioesterase could be involved in dithiolopyrrolone biosyntheses. Two genes, actA and actB, encode for two putative acyltransferases were identified, the transcriptional analyzes suggests that these genes may be responsible for the acylation of pyrrothine core. The characterizations of two activities, acetyltransferase and benzoyltransferase, in the crude extract of Sa. algeriensis led the determination of the optimal parameters (pH and T °C) to detect these activities. Moreover, the effect of temperature and pH on these activities was determined. Finally, the kinetic parameters of these activities showed different values, which confirm the presence of, at least, two activities in Sa. algeriensis.

Un mini-transposon qui permet une mutagénèse stable et non marquée a été modifié pour permettre l’expression de gènes chez les mycoplasmes. Cet outil a tout d’abord été utilisé pour le développement de mycoplasmes fluorescents. Pour ce faire, les protéines mCherry, mKO2 et mNeonGreen ont été insérées dans le chromosome de deux espèces de mycoplasmes phylogénétiquement distants : Mycoplasma mycoides subsp. mycoides (Mmm) et Mycoplasma bovis (M. bovis). Cette insertion a permis l’observation sans précédent de colonies fluorescentes vertes et rouges chez les deux espèces et ce, sans toxicité apparente. De plus, des niveaux de fluorescence équivalents ont été quantifiés par cytométrie en flux chez les deux espèces, ce qui suggère que l’outil développé peut être largement utilisé chez les mycoplasmes. Ces mycoplasmes fluorescents ont ensuite été utilisés pour effectuer des études d’adhésion, d’invasion et de persistance de ces deux espèces de mycoplasmes avec différents types cellulaires bovins. Ces analyses ont confirmé que M. bovis présente de meilleures capacités d’adhésion et prolifération au support de culture, ainsi qu’aux cellules embryonnaires épithéliales qu’il envahi. Il présente aussi une meilleure résistance à la l’élimination par les macrophages. Néanmoins, Mmm a aussi été détecté à l’intérieur des macrophages après 72 heures d’infection, et ce, même à des MOI faibles et en présence de concentrations bactériostatiques d’antibiotique. Ensuite, le système d’expression a été utilisé pour tester la possibilité d’utiliser les mycoplasmes en tant que vecteurs vaccinaux. Le gène de la protéine H du virus de la peste des petits ruminants, utilisé avec succès dans des vaccins recombinants, a été inséré dans un mycoplasme caprin comme preuve de concept d’un vaccin multivalent. Cependant, malgré la détection d’ARNm spécifique, l’expression de la protéine virale n’a pas été mise en évidence, et ce, malgré le recours à une technique très sensible de détection par spectrométrie de masse. La preuve de concept n’a donc pas pu être réalisée. Pour conclure, les systèmes d’expression de gènes de fluorescences développés dans ces travaux sont bien adaptés aux études d’interaction hôte-pathogène et offrent une multitude de perspectives pour l’analyses fonctionnelle chez les mycoplasmes in vitro et in vivo.. / A mini-transposon affording unmarked, stable mutagenesis in mycoplasmas was modified to allow gene expression. This tool was first used for the development of fluorescence expression for stable and innocuous whole mycoplasma cell labelling. For this purpose, the fluorescent proteins GFP2, mCherry, mKO2 and mNeonGreen were introduced as chromosomal tags in the phylogenetically distant species Mycoplasma mycoides subsp. mycoides (Mmm) and Mycoplasma bovis (M. bovis), resulting in the unprecedented observation of red and green fluorescent mycoplasma colonies in the two species, with no apparent cytotoxicity. Equivalent fluorescence expression levels were quantified by flow cytometry in both species, suggesting that these tools can be broadly applied in mycoplasmas. These fluorescent mycoplasmas were then used to compare the adhesion, invasion and persistence of the two species in different bovine cells. They notably confirmed that M. bovis shows a higher adhesion and proliferation capacity to the inert culture surface and higher adhesion to embryonic lung epithelial cells, which it invades. It also shows an increased resistance to elimination by macrophages. However, fluorescent Mmm were also detected inside the phagocytes 72h post-infection, even at a low MOI. Finally, the expression vector was used to assess the possible use of mycoplasmas as vaccine vectors. For this purpose, we introduced the H gene of the “peste des petits ruminants” virus, already used in effective recombinant vaccines, in a caprine mycoplasma as proof-of-concept of a mycoplasma-based multivalent vaccine. However, despite the detection of specific mRNA, the expression of the viral protein could not be evidenced using a highly a sensitive peptide detection technique by mass spectrometry, so this prove of concept could not be delivered. Still, the fluorescence expression tools developed in this study are suitable for host-pathogen interaction studies and offer innumerable perspectives for the functional analysis of mycoplasmas both in vitro and in vivo.

Nous avons étudié la présence de bactéries lactiques capables de produire des bactériocines dans des fromages traditionnels Slovènes. Dans cinq échantillons de Tolminc (fromage au lait de vache) et quatre échantillons de Kraški ovčji sir (fromage au lait de brebis), nous avons recherché la présence de 19 gènes de bactériocines par PCR. L'ADN a été extrait directement à partir des fromages ainsi qu'à partir de consortia microbiens de ces fromages isolés sur gélose CATC, Rogosa et M17. Nous avons utilisé des tests par diffusion sur gélose pour déterminer l'activité antimicrobienne des consortia sur différentes bactéries indicatrices. L'activité anti-staphylococcique a aussi été déterminée in situ dans du lait et du fromage. L'avantage compétitif des souches productrices de bactériocines a été évalué en effectuant des repiquages successifs des consortia dans du lait. Lors de ces essais, nous avons suivi la présence de différents déterminants génétiques de bactériocines ainsi que l'activité antimicrobienne des consortia. Ces mêmes propriétés ont aussi été déterminées pour des souches individuelles productrices de bactériocines, qui ont été isolées du consortium initial ou de consortia obtenus après propagation dans le lait. La mise en évidence de gènes de bactériocines par PCR dépendait de l'efficacité d'extraction de l'ADN. L'extraction de l'ADN total était plus efficace lorsque l'homogénéisation du fromage était réalisée avec une solution de citrate de sodium. Dans l'ADN issu des fromages et consortia microbiens, nous avons détecté plusieurs gènes de bactériocines. Leur nombre diminuait lors de la propagation dans le lait, ce qui indique un faible avantage compétitif des souches productrices de bactériocines. Les résultats n'ont montré un avantage compétitif que pour des souches comportant des déterminants génétiques de la cytolysine. Nous n'avons détecté une production de bactériocines dans les fromages que lorsque qu'une culture pure d'une souche productrice de nisine A a été ajoutée. La différence entre la détection de déterminants génétiques de bactériocines et l'activité antimicrobienne montre la complexité qui relie ces deux propriétés.En raison des limitations concernant les tests par diffusion sur gélose pour détecter l'expression des gènes in situ, nous avons mis en place une méthode moléculaire basée sur la reverse transcription et la PCR en temps réel. Cette méthode sera très utile pour de futures études concernant le rôle des bactériocines dans les fromages. / We examined the presence of lactic acid bacteria (LAB) able to produce different bacteriocins in traditional Slovenian cheeses. In five samples of Tolminc cheese (from cows' milk) and four samples of Kraški ovčji sir (from ewes' milk) we looked for the presence 19 LAB bacteriocins' gene determinants using PCR. The DNA analysed was extracted directly from cheese samples as well as from cultivable microbial consortia of cheese which were isolated on CATC, Rogosa and M17 agar media. We used diffusion tests to determine the antimicrobial activity of microbial consortia against different indicator bacteria. Anti-staphylococcal activity was also determined in situ in milk and cheese. Competitive advantage of bacteriocinogenic strains was examined by consecutive propagation of microbial consortia in milk. During this we followed the presence of different bacteriocin gene determinants and antimicrobial activity of microbial consortia. The same properties were also determined for individual bacteriocinogenic strains that were isolated from initial consortia and from consortia obtained after propagation in milk. The success of finding bacteriocin gene determinants with PCR depended greatly on the efficiency of DNA extraction. The extraction of total DNA was the most successful when sodium citrate was used for cheese homogenisation. In DNA of different cheeses and microbial consortia we detected a number of bacteriocin gene determinants. Their number was reduced during the process of propagation in milk, which indicates a poor competitive advantage of some bacteriocinogenic strains. The results demonstrated competitive advantage only for strains that carried gene determinants for cytolysin. We detected bacteriocin activity in cheese only when monoculture of nisin A producer was added. The discrepancy between detected bacteriocin gene determinants and antimicrobial activity shows the complexity that links these two properties. This method will be very useful in the future studies of the role of bacteriocins in cheese.

Cette thèse porte sur la modélisation, l'analyse et la réduction de modèles biologiques, notamment de réseaux de régulation génique chez la bactérie E. coli. Différentes approches mathématiques sont utilisées. Dans la 1ère partie de la thèse, on modélise, analyse et réduit avec des outils classiques un modèle de transcription-traduction de grande dimension de l'ARN polymérase (RNAP) chez E. coli. Dans la 2de partie, l'introduction d'une nouvelle méthode appelée Analyse de Processus Principaux (PPA) nous permet d'analyser des modèles de haute dimension, en les décomposant en processus biologiques dont l'activité est évaluée pendant l'évolution du système. L'exclusion des processus inactifs réduit la dynamique du modèle à ses principaux mécanismes. La méthode est appliquée à des modèles d'horloge circadienne, de toxicologie endocrine et de voie de signalisation ; on teste également sa robustesse aux variations des conditions initiales et des paramètres. Dans la 3ème partie, on présente un modèle ODE de la machinerie d'expression génique de cellules d'E. coli dont la croissance est contrôlée par un inducteur de la synthèse de RNAP. On décrit notre contribution au développement du modèle et analyse par PPA les mécanismes essentiels du réseau de régulation. Dans une dernière partie, on modélise spécifiquement la réponse de RNAP à l'ajout d'inducteur et estime les paramètres du modèle à partir de données de cellules individuelles. On discute l'importance de considérer la variabilité entre cellules pour modéliser ce processus : ainsi, la moyenne des calibrations sur chaque cellule apparaît mieux représenter les données moyennes observées que la calibration de la cellule moyenne. / This thesis deals with modeling, analysis and reduction of various biological models, with a focus on gene regulatory networks in the bacterium E. coli. Different mathematical approaches are used. In the first part of the thesis, we model, analyze and reduce, using classical tools, a high-dimensional transcription-translation model of RNA polymerase in E. coli. In the second part, we introduce a novel method called Principal Process Analysis (PPA) that allows the analysis of high-dimensional models, by decomposing them into biologically meaningful processes, whose activity or inactivity is evaluated during the time evolution of the system. Exclusion of processes that are always inactive, and inactive in one or several time windows, allows to reduce the complex dynamics of the model to its core mechanisms. The method is applied to models of circadian clock, endocrine toxicology and signaling pathway; its robustness with respect to variations of the initial conditions and parameter values is also tested. In the third part, we present an ODE model of the gene expression machinery of E. coli cells, whose growth is controlled by an external inducer acting on the synthesis of RNA polymerase. We describe our contribution to the design of the model and analyze with PPA the core mechanisms of the regulatory network. In the last part, we specifically model the response of RNA polymerase to the addition of external inducer and estimate model parameters from single-cell data. We discuss the importance of considering cell-to-cell variability for modeling this process: we show that the mean of single-cell fits represents the observed average data better than an average-cell fit.

Les populations naturelles sont confrontées à des changements environnementaux. Pour y faire face, différentes réponses ont été sélectionnées au cours de l'évolution. Parmi elles se trouvent la plasticité phénotypique et l'adaptation génétique. Etudier les liens existants entre elles est une manière de comprendre les dynamiques des populations et de prévoir leurs réponses à un environnement changeant. Dans la présente étude, je me suis attaché à étudier ces liens à plusieurs échelles (intra- et interspécifique), chez le complexe d'espèces cryptiques de la micro-algue Alexandrium minutum, et ce à la fois in vitro et in situ. En ce qui concerne la plasticité phénotypique, ces deux espèces proches montrent de profondes différences, soulignant les liens entre divergence génétique et écologique. Au niveau intraspécifique, il apparaît que face à des variations de facteurs abiotiques, les populations ajustent les niveaux d'expression de certains gènes (notamment impliqués dans des fonctions de motilité et d'interactions intercellulaires dans des environnements froids à faible salinité). D'autre part, les populations montrent de la différentiation génétique à la fois à faible échelle spatiale, au cours du temps, et lorsque la communauté change. Pour conclure, il existe une interaction directe entre divergence génétique et changements d'expression de gènes. En plus de poser de nombreuses questions quant aux capacités de réponse des populations, ces résultats soulignent comment plasticité phénotypique et changements génétique sont liés et interagissent. Ils offrent une perspective nouvelle sur les mécanismes qui sous-tendent les réponses des populations à leur environnement. / Natural populations face environmental changes. In this context, different responses were evolutionnary selected. Among them are phenotypic plasticity and genetic adaptation. Studying the links between these two types of response is a way to understand population dynamics and to predict how they may respond to a changing environment. In the present Ph.D thesis, I focused on studying these links at several scales (intra- and interspecific), in the cryptic species complex of the microalga Alexandrium minutum, both in vitro and in situ. With respect to phenotypic plasticity, these two closely related species show profound differences, highlighting the links between genetic and ecological divergence. At the intraspecific level, it appears that, when facing abiotic factors variations, populations adjust the expression levels of certain genes (notably involved in motility related functions and intercellular interactions under low-salinity and cold environments). On the other hand, populations show genetic differentiation at both small spatial scale, over time, and when the community changes. To conclude, there is a direct interaction between genetic divergence and changes in gene expression. In addition to asking many questions about the response capabilities of populations, these results highlight how phenotypic plasticity and genetic changes are linked and interact. They offer new perspectives on the mechanisms underlying population responses to their environment.

L’ARN polymérase dépendante d’ADN (RNAP) est une enzyme responsable de la polymérisation de ribonucleotides dans une séquence d'ARN complémentaire de l'ADN de matrice. La famille de RNAP a plusieurs membres, comme de protéines sous-unité unique (par exemple du bactériophage T7) ou multiple sous-unité (bactériennes et eucaryotes). Transcription de l'ARN - un événement crucial dans l'expression des gènes - varie en fonction de l'origine de RNAP. Bien que le processus de transcription est relativement bien caractérisée, de nombreux éléments restent mal compris, surtout par rapport à la dynamique de la reconnaissance de promoteur, d'évasion et de l'allongement dans une contexte de cellule où la densité moléculaire, les concentrations et les effets plus proches environs sont importants. L'objectif de cette thèse était la développement d’une méthode qui permettrait suivre la réaction RNAP in vitro en temps réel dans des conditions très contrôlées. Un axe majeur a été mis pour développer un biocapteur basé surface qui permettrait à la caractérisation des principales étapes de la réaction de transcription. Par conséquent, les interactions entre des molécules d'ADN immobilisés sur une surface du capteur et RNAP libre délivré par un système microfluidique de la surface ont été examinées. Changements de l'indice de réfraction, corrélés avec les changements de masse sur la surface ont été suivis en utilisant l'imagerie par résonance de plasmon de surface (SPRi). SPRi est une technique sensible dédiée à l'analyse des interactions entre deux ligands en temps réel. Les bases du mécanisme sont la détection de légères différences dans la réflexion de la lumière polarisée à un angle fixe qui est associé avec une variation de masse à l'interface. Les données obtenues à partir SPRi sont utilisées pour déterminer la cinétique des interactions. Géométrie d’ADN puces permet de suivre plusieurs échantillons simultanément, qui raccourcit considérablement le temps que de manipulation et améliore la qualité et la reproductibilité des résultats obtenus. Autres biocapteurs optofluidique: résonateur de microring et microscopie de fluorescence par réflexion totale interne (TIRF) ont été développés en parallèle. Nous avons biofunctionalisé et caractérisé des surfaces de capteur (de verre couvert de polymère pour un résonateur de microring et la microscopie TIRF et 50 nm couche mince d’or sur des prismes de SPRi) afin d'immobiliser ADN d'une manière contrôlée, par création d’une monocouche auto-assemblée (SAM). Fonctionnalisation de polymères SU-8 concernées deux méthodes: covalent immobilisation de (bio) molécules et la conjugaison non covalente sur la base de couplage hydrophobe. Pour la fonctionnalisation de surface d’or, quatre stratégies différentes d'immobilisation des molécules ont été comparés: formation de la liaison de thiol - or, la formation des liaisons amide, interactions extrAvidin - biotine et le couplage hydrophobe. Les études de la conjugaison de l'ADN à la surface d'or fonctionnalisé ont été effectuées en ce qui concerne la spécificité et la densité d'ADN immobilisées de longueurs différentes: 50, 500 et 1000 pb. Enfin, les surfaces biofunctionalized ont été utilisées pour suivre en temps réel des réactions de transcription de deux RNAP: bactériophage T7 RNAP monomère et l'holoenzyme d'Escherichia coli RNAP. Les analyses cinétiques de la formation d’un complexe nucléoprotéine et la transcription d'ARN ont été fait par report de la densité et la longueur de l'ADN immobilisé, la position de la séquence du promoteur spécifique. Transcription de l'ARN dans l'appareil SPRi a été confirmée par la collection, la détection et l'analyse des produits ARN.L'objectif final comprends une synthèse de l'ARN contrôlée qui serait une étape intermédiaire d'enquêter en temps réel la production de protéines in vitro. / DNA-dependent RNA polymerase (RNAP) is an enzyme responsible for the polymerization of ribonucleotides into an RNA sequence complementary to the template DNA. RNAP family has several members being single subunit (e.g. T7 bacteriophage) or multi subunit (bacterial and eukaryote) proteins. RNA transcription – a crucial event in gene expression – differs depending on the RNAP origin. Although the transcription process is relatively well characterized, many elements remain poorly understood, especially with respect to the dynamics of promoter recognition, escape and elongation in a cell like context where molecular density, concentrations and nearest neighbour effects are prevalent.The goal of this thesis was to develop a robust method that would allow real time monitoring of RNAP reaction in vitro in thoroughly controlled conditions. A major axis was to develop a surface-based biosensor that would allow the characterization of the main steps of the transcription reaction. Consequently, interactions between DNA molecules immobilized on a sensor surface and free RNAP delivered through a microfluidic flow system to the surface were examined. Changes in refractive index, correlated with changes in mass at a surface were followed using surface plasmon resonance imaging (SPRi). SPRi is a sensitive technique dedicated to analysis of interactions between two ligands in real time. The mechanism bases on the detection of slight differences in the reflectivity of polarized light at a fixed angle that are associated with a mass variation at the interface. Data obtained from SPRi are used to determine the kinetics of the interactions. Microarray geometry of SPRi allows monitoring several samples simultaneously that significantly shortens manipulation time and improves a quality and reproducibility of obtained results. Other label-free optofluidic biosensors: microring resonator and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy were developed in parallel.We firstly biofunctionalized and characterized sensor surfaces (polymer coated glass for microring resonator and TIRF microscopy and 50-nm thin layer gold coatings on glass prisms for SPRi) in order to immobilize DNA strands in a controlled manner, using a self-assembled monolayer (SAM). Functionalization of photoresist polymer SU-8 concerned two methods: covalent (bio)molecule grafting and non-covalent conjugation based on hydrophobic coupling. Regarding gold surface functionalization, four different strategies of antifouling (bio)molecule immobilization were compared: thiol – gold bond formation, amide bond formation, extrAvidin – biotin interactions and hydrophobic coupling. Studies of DNA conjugation to the functionalized gold surface were performed with respect to specificity and density of immobilized DNA molecules of different lengths: 50, 500 and 1000 bp.Finally, biofunctionalized surfaces were used for real time monitoring of transcription reactions using two RNAPs: monomeric bacteriophage T7 RNAP and the holoenzyme of Escherichia coli RNAP. Kinetic analyses of nucleoprotein complex formation and RNA transcription were performed as a function of immobilized DNA density, the length of the immobilized DNA, the position of the specific promoter sequence with respect to the point of immobilization and the direction of subsequent transcription. RNA transcription in the SPRi apparatus was confirmed by collection, detection and analysis of relevant products.The future development of biosensors dedicated to in vitro gene expression will include the adaptation of the methods presented above to other optofluidic systems and further development of the technique. The final goal comprises a controlled RNA synthesis that would be an intermediate step to investigate real time in vitro protein production.

Le titane (Ti) est largement utilisé en orthopédie et médecine dentaire. Ce matériau présente d´excellentes propriétés mécaniques, est biocompatible et résiste à la corrosion. L’interaction entre les cellules et la surface d’un implant joue un rôle décisif dans l’ostéointégration. Malgré la grande variété d’études que nous trouvons dans la littérature, le comportement des cellules en contact avec des matériaux implantables comme le Ti n’est toujours pas élucidé à toutes les échelles topographiques. Notre laboratoire a développé une méthode de modification physico-chimique de la surface de métaux à intérêt médical. Cette méthode génère des surfaces nanoporeuses qui favorisent la différenciation de cellules souches, affectent le comportement cellulaire de façon différentielle, promeuvent la formation osseuse in vitro et in vivo, et qui ont une capacité antibactérienne. Afin de mieux comprendre comment cette surface influence le comportement cellulaire, nous avons étudié leur influence sur la formation et la maturation des adhésions focales (FAs, de l’anglais) et la formation des filopodes. De plus, nous avons examiné comment les caractéristiques physico-chimiques de la surface obtenue guident l’expression génique des protéines associées aux FAs et aux filopodes en utilisant différentes lignées cellulaires. Finalement, afin de mieux comprendre la biomécanique de la cellule, la force d’adhésion à la surface des filopodes a été déterminée à l’aide de la microscopie à force atomique (AFM). Des disques de Ti commercialement pur (Cp-Ti) ont été polis a fini miroir (Ti-Control), une partie des disques a été traité avec un mélange d’acide sulfurique et de peroxyde d’hydrogène pour créer une surface nanostructurée poreuse (Ti-Nano). L’influence de la nanoporosité, de la cristallinité et la mouillabilité de cette surface sur des cellules pre-ostéoblastiques de souris (MC3T3) et des bactéries a été évalué par la microscopie électronique à balayage (MEB) et par immunofluorescence (IF). Nous avons ensuite utilisé une lignée cellulaire épithéliale (CHO-K1) qui exprime la paxilline (une protéine des FAs) de type sauvage ou la paxilline avec des mutations. De plus, la force d’interaction des filopodes avec la surface a été quantifié en mesurant la force latérale nécessaire pour les déplacer avec une pointe d’AFM. Finalement, la centrifugation a été utilisée pour étudier les changements fonctionnels des cellules MC3T3. L’analyse du comportement des cellules MC3T3 sur des surfaces amorphes et cristallines n'a pas montré de différence par rapport au nombre des cellules ou la quantité des FAs. La cristallinité de la couche superficielle n’avait également aucune incidence sur l’adhésion bactérienne. Les deux lignées cellulaires utilisées ont montré une présence abondante de filopodes avec des nanoprotrusions latérales en réponse à la nanoporosité. La taille et la forme des cellules CHO-K1 ont été grandement affectées par la topographie. L’expression génique des protéines associées aux différents marqueurs des FAs et aux protrusions a été aussi significativement augmentée sur la surface nanoporeuse, quel que soit le type de cellule. Les filopodes sur Ti-Nano ont montré une plus grande résistance au détachement latéral, ce qui indique qu'ils adhèrent à la surface avec plus de force. Également, l’analyse par MEB a révélé une restructuration de la membrane cellulaire accompagnée d’un changement de la forme cellulaire après centrifugation. Parce que les mitochondries fournissent de l’énergie pour les processus cellulaires, l’organisation du réseau mitochondrial a été influencée aussi par la topographie de surface et la centrifugation. Bien qu’il ne puisse pas être exclu que la cristallinité et la mouillabilité de la surface contribuent dans une certaine mesure à déterminer le comportement des cellules, nos résultats suggèrent que les caractéristiques physiques des surfaces représentent le principal déterminant. Nous avons démontré aussi, pour la première fois, que la topographie de surface peut modifier l’interaction adhésive d’une structure subcellulaire qui est fondamentale dans la détection des caractéristiques physico-chimiques des surfaces. En conclusion, nos résultats montrent que la topographie de surface peut modifier des propriétés fondamentales dans les cellules. Dans leur ensemble, ils soulèvent la possibilité que les surfaces nanostructurées puissent être utilisées non seulement pour guider/accélérer l’intégration de biomatériaux dans des conditions normales, mais également dans des situations où l’activité cellulaire est compromise ou également pour les prothèses soumises à des charges externes, telles que les implants orthopédiques et dentaires. / Titanium (Ti) is widely used in orthopedics and dentistry. This material has excellent mechanical properties, is biocompatible and corrosion resistant. The interaction between the cells and the surface of an implant plays a key role in osseointegration. Despite the wide variety of studies found in the literature, the behavior of cells in contact with implantable materials such as Ti is not yet fully elucidated at all topographic scales. Our laboratory has developed a method for the physicochemical modification of the surface of medically relevant metals. This method generates nanoporous surfaces that promote stem cell differentiation, differentially affect cellular behavior, promote bone formation in vitro and in vivo and have antibacterial capacity. To better understand how this surface influences cell behavior, we studied their influence on the formation and maturation of focal adhesions (FAs) and filopodia formation. Furthermore, we examined how the physicochemical characteristics of the resulting surface guide the gene expression of proteins associated with FAs and filopodia using different cell lines. Finally, to better understand the biomechanics of the cell, the adhesion strength of filopodia to the surface was determined using atomic force microscopy (AFM). Commercially pure Ti discs (Cp-Ti) were polished to a mirror finish (Ti-Control), some of the polished discs were treated with a mixture of sulfuric acid and hydrogen peroxide to create a nanostructured surface (Ti-Nano). The influence of nanoporosity, crystallinity and wettability of this surface on mouse pre-osteoblastic cells (MC3T3) and bacteria was evaluated by scanning electron microscopy (SEM) and immunofluorescence. Then, to evaluate the response to nanotopography, we used an epithelial cell line (CHO-K1) that expresses wild type paxillin (a protein of FAs) or paxillin with mutations. In addition, the interaction forces of the filopodia with the surface were quantified by measuring the lateral force required to displace these structures from the surface with an AFM tip. Finally, centrifugation was used to study functional changes in MC3T3 cells. Analysis of the behavior of MC3T3 cells on amorphous and crystalline surfaces showed no difference in cell number or the number of focal adhesions. The crystallinity of the surface layers also had no effect on bacterial adhesion. Both cell lines used showed abundant presence of filopodia 4 with lateral nanoprotrusions in response to nanoporosity. The size and shape of CHO-K1 cells was greatly affected by the topography. Gene expression of proteins associated with different focal adhesion markers and protrusions was also significantly increased on the nanoporous surface, regardless of cell type. Filopodia on the Ti-Nano showed greater resistance to lateral detachment force, indicating that they adhere to the surface with greater strength. Also, SEM analysis revealed a restructuring of the cell membrane accompanied by a corresponding change in cell shape after centrifugation. Because mitochondria provide energy for cell processes, the organization of the mitochondrial network was also influenced by surface topography and centrifugation. Although it cannot be excluded that surface crystallinity and wettability contribute to some extent to determining cell behavior, our results suggest that the physical characteristics of the surfaces represent the main determinant. We have also shown for the first time that surface topography can modify the adhesive interaction of a subcellular structure that is fundamental in the detection of the physicochemical characteristics of surfaces. In conclusion, our results show that surface topography can modify fundamental properties in cells. Together, they raise the possibility that nanostructured surfaces can be used not only to guide/accelerate the integration of biomaterials under normal conditions, but also in situations where cellular activity is compromised or also for prostheses under external loads, such as orthopedic and dental implants.

Les éléments transposables sont des séquences génomiques capables de se répliquer et de se déplacer dans les génomes. Leur capacité à s’insérer près des gènes et à produire des réarrangements chromosomiques par recombinaison entre copies, font des éléments transposables des agents mutagènes. Les éléments transposables sont de plus capables de modifier l’expression des gènes voisins grâce aux régions promotrices qu’ils possèdent. Les éléments transposables ont été trouvés dans la plupart des génomes dans lesquels ils ont été recherchés. Ils forment ainsi 45 % du génome de l’homme et peuvent représenter jusqu’à 90 % du génome de certaines plantes. Dans la première partie de ma thèse, je me suis penché sur les facteurs qui déterminent la distribution de ces éléments. Je me suis intéressé à un facteur particulier, qui est la fonction des gènes dans le voisinage des insertions d’éléments transposables. Dans la deuxième partie, j’ai essayé de déterminer l’impact de l’altération des modifications épigénétiques (modifications d’histones plus précisément) associées aux différents composants géniques, dont les éléments transposables, sur la variation de l’expression des gènes en condition tumorale. / Transposable elements are genomic sequences able to replicate themselves and to move within genomes. Their ability to integrate near genes and to produce chromosomal rearrangements by recombination between copies, make transposable elements mutagens. Moreover, transposable elements are able to alter the expression of neighboring genes through their promoter regions. Transposable elements form 45% of the human genome and may represent up to 90% of certain plant genomes. In the first part of my thesis, I examined the factors that determine the distribution of these elements. I have been interested in a particular factor, which is the function of the genes in the vicinity of transposable element insertions. In the second part, I determined the impact of epigenetic modifications alterations (histone modifications) in different gene components, including transposable elements, on the variation of gene expression in tumoral conditions.

Au vu de l’impact croissant du changement climatique global et en particulier de la sécheresse sur les forêts, il est nécessaire de comprendre les mécanismes de réponse des arbres face à des variations de disponibilité en eau. Ces dernières années, des études ont montré un contrôle épigénétique et notamment par la méthylation de l’ADN de la plasticité phénotypique des plantes en réponse aux variations environnementales. Dans ce contexte, cette thèse visait à évaluer le rôle de la méthylation de l’ADN des cellules du méristème apical caulinaire dans la plasticité développementale de la tige feuillée en réponse à des variations de disponibilité en eau chez le peuplier, un arbre modèle. A cette fin, le méthylome de la chromatine non condensée dans le méristème apical caulinaire de Populus trichocarpa a été caractérisé. Ensuite, l’impact de variations de disponibilité en eau sur la méthylation de l’ADN a été étudié dans l’apex caulinaire de différents hybrides (P. × euramericana). Les loci et les réseaux de gènes affectés pour leur expression et leur méthylation ont ainsi été identifiés. Ces travaux ont montré que dans le méristème apical caulinaire, la majorité des gènes étaient dans un état non condensé de la chromatine et méthylés dans leur corps. Ils ont également mis en évidence une forte variation de la méthylation globale de l’ADN selon les génotypes et en réponse à des variations de disponibilité en eau. De plus, des corrélations ont été établies entre les niveaux de croissance des arbres et de méthylation globale de l’ADN dans l’apex caulinaire. Enfin, les variations de la méthylation de l’ADN en réponse aux variations de la disponibilité en eau s’accompagnent de variations d’expression et ont ciblé particulièrement des gènes impliqués dans la signalisation par les phytohormones ou la morphogenèse. Ainsi, les travaux effectués lors de cette thèse suggèrent un rôle de la méthylation de l’ADN dans la plasticité phénotypique en réponse à des variations de disponibilité en eau chez le peuplier via le contrôle de l’expression de réseaux de gènes dans le méristème apical caulinaire. / Predicted climate changes and particularly drought represent a major threat to forest health. Therefore, understanding mechanisms that control trees response to variations in water availability is of great interest. These last years, epigenetic marks such as DNA methylation have been involved in plant phenotypic plasticity in response to environmental stresses. In this context, this work aimed at assessing the role of shoot apical meristem cells DNA methylation in the shoot developmental plasticity towards variations in water availability in poplar, a model tree. For this purpose, the methylome of non condensed chromatin in Populus trichocarpa shoot apical meristem was characterized. Then, the impact of variations in water availability on shoot apex DNA methylation in different hybrids (P. × euramericana) was studied. Loci and gene networks affected by DNA methylation and expression changes were thus identified. This work showed that in shoot apical meristem, most of the genes was in non condensed chromatin state with DNA methylation in their body. A strong variation in DNA methylation depending on genotypes and water availability was highlighted. Moreover, correlations between trees growth and shoot apex DNA methylation levels were established. Lastly, DNA methylation changes in response to variations in water availability correlated to expression variations were identified for genomic loci and gene networks. Thus, the work performed during this thesis suggests a role for DNA methylation in poplar phenotypic plasticity in response to variations in water availability through the control of gene networks transcription in the shoot apical meristem.

La différenciation sexuelle des Isopodes dépend d'une hormone sexuelle protéique, l'hormone androgène (HA), caractéristique des Malacostracés. Cet Insulin-Like Peptide suffit à induire par sa présence la différenciation mâle de ces Crustacés. Nous avons identifié in silico le transporteur circulant de l'HA, l'IGFBP-rP1, chez de nombreuses espèces d'Isopodes ainsi qu'à l'échelle des Crustacés. De la même façon, nous avons identifié deux récepteurs transmembranaires, l'IR1 et l'IR2, issus d'une duplication de gène spécifique des Malacostracés. Les patrons d'expression de ces gènes ont été étudiés sur notre espèce modèle, Armadillidium vulgare. Av-IGFBP-rP1 et Av-IR1 sont exprimés de manière ubiquiste et tout au long du développement. Av-IR2 est aussi exprimé à chaque stade de la différenciation mais ce transcrit est quasi-spécifique des glandes androgènes et ovaires. Une approche par ARNi a confirmé l'implication de ces trois protéines dans la voie de signalisation de l'HA. En effet, l'inhibition de l'HA, Av-IGFBP-rP1 et Av-IR1 provoquent l'hypertrophie des glandes androgènes, suggérant leur implication dans une boucle de rétro-contrôle de l'HA. L'inhibition de Av-IR2 semble seulement provoquer la différenciation d'ouvertures génitales femelles. Ces phénotypes sont comparables à ceux des intersexués mâles induits par la bactérie féminisante endogène Wolbachia. Nous montrons cependant que la bactérie altère seulement l'expression de l'HA et pas celle des récepteurs. Enfin, nous avons testé l'effet du bisphénol A mais nous n'observons pas d'altération de la différenciation sexuelle des larves lors d'expositions à ce perturbateur endocrinien exogène. / Sexual differentiation in Isopods relies on a proteinaceous sex hormone called androgenic hormone (AH), specific to Malacostracans. This Insulin-Like Peptide induces male differentiation by its mere presence in these Crustaceans. We identified in silico the circulating carrier of the AH, called IGFBP-rP1, in many Isopod species, but also on the crustacean scale. Similarly, we identified two transmembrane receptors, IR1 and IR2, coming from a gene duplication specific to Malacostracans. The expression patterns of these genes were investigated in our model species, Armadillidium vulgare. Av-IGFBP-rP1 and Av-IR1 are broadly expressed in the animal and throughout development. Av-IR2 is also expressed at each developmental stage but this transcript is almost specific to androgenic glands and ovaries. An RNAi approach has confirmed the implication of these three proteins in the AH signalling pathway. Indeed, the inhibition of AH, Av-IGFBP-rP1 and Av-IR1 induces androgenic gland hypertrophy, suggesting their implication in an AH feedback loop. Av-IR2 inhibition seems to provoke the differentiation of female genital apertures only. These phenotypes are similar to those of male intersexes induced by the endogenous feminizing bacterium Wolbachia. Yet, we show that the bacterium alters the expression of the AH only and not the one of its receptors. Finally, we have tested the effect of bisphenol A but we observe no alteration of the sexual differentiation in larvae upon exposition to this exogenous endocrine disruptor.