Submitted by Cláudia Bueno (claudiamoura18@gmail.com) on 2015-12-04T13:26:54Z No. of bitstreams: 2 Tese - Renato Carrer Filho - 2014.pdf: 2054236 bytes, checksum: 3f27769d51475d87f621d5e241854928 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-12-07T11:08:24Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Renato Carrer Filho - 2014.pdf: 2054236 bytes, checksum: 3f27769d51475d87f621d5e241854928 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-12-07T11:08:24Z (GMT). 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Among the most troubling diseases stands the vascular wilt caused by Fusarium oxysporum f. spp. lycopersici. The difficulty of controlling this disease comes from the intrinsic characteristics of the pathogen, such as high adaptability to the underground environment while associated with the host and the production of resistance structures that remain viable in the soil for a long time. Genetic resistance stands out as the main tool in the control of this pathogen, which requires a continuous accession characterization program and the identification of sources of resistance, ensuring the introgression of 'I' genes that express resistance to physiologic races of the pathogen. Coupled with genetic resistance, the use of microorganisms as antagonists and their introduction in the pathogen´s microhabitat has become a promising alternative in the context of the management of root diseases of tomato, highlighting the colonizing bacteria from the rhizosphere of plants, termed rhizobacteria, as the main biocontrol agents. This study aimed to identify resistant tomato accessions to three physiological races of Fusarium oxysporum f. spp. lycopersici, by morphological and molecular methods, as well as detect multiple sources of resistance from the germplasm bank of EMBRAPA CNPH. The assay consisted of an evaluation of 28 varieties, 3 hybrids, 32 strains and 19 wild accessions, totaling 82 accessions. The susceptibility or resistance was confirmed by visualization of DNA bands on an agarose gel generated by specific molecular markers capable of amplifying regions of the target genes I-1, I-2 and I-3, expressing resistance to classes 1, 2 and 3 of F. oxysporum f. spp. lycopersici, respectively. To enhance the durability of this resistance, 10 rhizobacteria of the Bacillus genus were tested as biocontrol agents of wilt in greenhouse assays. In parallel, in vitro root colonization, antibiosis and detection of potential biocontrol genes involved in the tests were conducted. All Bacillus isolates showed variable levels of control of the pathogen in vitro, while the UFG-07 (Bacillus subtilis) and UFG-10 (Bacillus circulans) isolates have excelled in disease suppression in the greenhouse, which reinforces the hypothesis of substances acting as an antimicrobial control. / O tomateiro é uma solanácea que se tornou bastante proeminente no século passado, não só pelo agradável paladar, mas também por ser uma rica fonte de aminoácidos, ácidos orgânicos, vitaminas, como também pela grande concentração de substâncias benéficas, entre elas o licopeno. Para atender à crescente demanda pelo tomate, vários programas de melhoramento visando o aumento da produção, produtividade, qualidade dos frutos, como a diminuição de metabólitos secundários, foram empreendidas. Ao se procederem os cruzamentos visando melhorar as características agronômicas da cultura, genes que conferiam rusticidade e, consequentemente, resistência às doenças, foram provavelmente perdidos, favorecendo o aumento do ataque de pragas e doenças na cultura do tomateiro. Dentre as doenças mais preocupantes destaca-se a murcha vascular causada pelo fungo Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici. A dificuldade de controle desta doença advém de características intrínsecas do patógeno, como alta adaptabilidade ao ambiente subterrâneo em associação com o hospedeiro e pela produção de estruturas de resistência que ficam viáveis no solo por um longo tempo. A resistência genética destaca-se como a principal ferramenta no controle deste fitopatógeno, o que requer um programa contínuo de caracterização de acessos e de identificação de fontes de resistência, garantindo a introgressão de genes ‘I’ que expressam resistência as raças fisiológicas do patógeno. Aliado a resistência genética, o uso de microrganismos como agentes antagonistas e sua introdução no microhabitat do patógeno, tem-se tornado como alternativa promissora no contexto do manejo de doenças radiculares do tomateiro, com destaque para as bactérias colonizadoras da rizosfera de plantas, denominadas rizobacterias, como os principais agentes de biocontrole. O objetivo deste trabalho visou identificar acessos de tomateiro resistentes às 3 raças fisiológicas de Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici, pelos métodos morfológico e molecular, assim como detectar fontes de resistência múltipla no banco de germoplasma da EMBRAPA CNPH. O ensaio consistiu na avaliação de 28 variedades, 3 híbridos, 32 linhagens e 19 acessos selvagens, totalizando 82 acessos. A resistência ou suscetibilidade foi corroborada pela visualização de bandas de DNA em gel de agarose, ao utilizar-se de marcadores moleculares específicos para amplificar das regiões alvo, gene I-1, I-2 e I-3 que expressam resistência à raça 1, 2 e 3 de Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici, respectivamente. Visando maior durabilidade da resistência, 10 rizobacterias do gênero Bacillus foram testadas como agentes de biocontrole da murcha do tomateiro, em casa de vegetação. Paralelamente foram conduzidos, in vitro, antibiose e detecção de possíveis genes envolvidos no biocontrole. Isolados de Bacillus apresentaram controle variável do patógeno in vitro, enquanto que os isolados UFG-07 (Bacillus subtilis) e UFG-10 (Bacillus circulans) se destacaram na supressão da doença em casa de vegetação.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / O cajueiro (Anacardium occidentale) no nordeste brasileiro caracterizando-se como uma das mais importantes fontes de emprego e renda das populaÃÃes. O lanÃamento de clones de cajueiro tipo anÃo-precoce aumentou a produtividade e qualidade das castanhas e pendÃculos, permitindo uma exploraÃÃo comercial mais vantajosa aos produtores, porem a uniformidade genÃtica deixou os pomares mais vulnerÃveis. A resinose hoje à considerada a principal doenÃa do cajueiro no semiÃrido nordestino. Esse estudo teve por objetivo avaliar a reaÃÃo de genÃtipos de cajueiro do tipo comum à resinose sob condiÃÃes de elevada incidÃncia no semiÃrido. Vinte clones de cajueiro-comum previamente selecionados pelo programa de melhoramento genÃtico da Embrapa AgroindÃstria Tropical foram usados no estudo e dessa forma foi possÃvel concluir que hà fontes de resistÃncia para uso em programas de melhoramento. Os clones CNPAT 06, CNPAT 08, CNPAT 11, CNPAT 12 e CNPAT 13 se apresentara como os mais resistentes a resinose, enquanto que os clones CNPAT 07, CNPAT 09, CNPAT 14, COMUM 05 e COMUM 31 forma os que obtiveram maiores notas de severidade de resinose. Outro importante resultado obtido foi que os clones CNPAT 08, CNPAT 11 e CNPAT 15 apresentaram capacidade de recuperaÃÃo da resinose. Por fim, sugere-se que com a avaliaÃÃo da incidÃncia à possÃvel estimar a severidade de resinose em pomares de cajueiro. / The cashew nut (Anacardium occidentale) represents a social and economic tradition in Brazilian northeastern as one of the most important source of income and labor for its people. The releasing of early-dwarf clones contributed to increase yield and nut and apple quality, allowing gain in profit by small growers, in spite of increase genetic vulnerability of orchards. Cashew gummosis is presently the most important disease of this species in semi-arid regions of northeast. This study aimed to evaluate reactions of common selected clones of cashew to gummosis under high disease pressure of semi-arid region. Twenty clones selected by the cashew breeding program of Embrapa AgroindÃstria Tropical were evaluated for three consecutive years. Clones named CNPAT 06, CNPAT 08, CNPAT 11, CNPAT 12 and CNPAT 13 attained the highest levels of resistance, while CNPAT 07, CNPAT 09, CNPAT 14, COMUM 05 and COMUM 31 otherwise were the most susceptible ones. It was also found that clones CNPAT 08, CNPAT 11 and CNPAT 15 are able to heal gummosis cankers, which points to a new kind of resistance to be considered. Finally, it was shown that monitoring gummosis incidence it is possible to estimate disease severity.

Submitted by Cássia Santos (cassia.bcufg@gmail.com) on 2017-03-24T12:53:45Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Geisiane Alves Rocha - 2017.pdf: 2262501 bytes, checksum: 07907cdfd4fccd850c41b5d258f6f6a5 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-03-24T13:02:10Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Geisiane Alves Rocha - 2017.pdf: 2262501 bytes, checksum: 07907cdfd4fccd850c41b5d258f6f6a5 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-24T13:02:10Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Geisiane Alves Rocha - 2017.pdf: 2262501 bytes, checksum: 07907cdfd4fccd850c41b5d258f6f6a5 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2017-02-20 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / To understand how new viruses arise in agriculture, the interface zones between native systems and cultivated areas become an interesting object of study. The small number of studies focused on the detection of viruses, mainly with RNA genomes, in cerrado tree species in the interface zones is due to the difficulty of extracting quality nucleic acids for the necessary analysis. In the case of DNA viruses, such as begomovirus, to date there have been no reports on tree species in this type of vegetation. Begomovirus are among the main pathogens in different cultures in Brazil. However, in soybeans, one of the main crops in the country, these viruses are not among the most important pathogens for the culture, however, it is of great importance to identify different hosts of these viruses and in which environments they occur to know their diversity. The objective of this study was to detect and identify begomovirus in cerrado native trees and cultivated soybean plants near native vegetation areas, as well as to establish an efficient RNA extraction protocol for cerrado species in order to facilitate future related research with these plants. For begomovirus detection, samples of 30 tree species were collected from two areas of cerrado, in soybean the sampling was carried out in three areas of the Escola de Agronomia da Universidade Federal de Goiás - Regional Goiânia - planted with different cultivars. For all samples, DNA extraction was performed using a modified CTAB method and the detection was done by means of PCR using primers PAL1v1978 and PAR1c496. For the extraction of RNA, four methods were tested for Xylopia aromatica and Piper arboreum: TRIzol® reagent (method 1), TRIzol® reagent with modifications (method 2) and two methods using CTAB buffer (methods 3 and 4) that present differences in buffers composition in each method. The one that presented the best results was tested to obtain purified RNA of five cerrado tree species. Method 4 was chosen because of its best absorbance ratio (A260 / A280) when compared to the other methods. The RT-PCR of the RNA extracted from five species of cerrado areas showed good results after RNA extraction performed by method 4, qualifying this method as appropriate to obtain quality RNA for the molecular analysis of cerrado species. In the detection of begomovirus in 30 tree species of the cerrado, only Cardiopetalum calophyllum was positive. This is the first report of begomovirus in Brazilian cerrado tree species. The presence of two begomovirus species, Sida micrantha mosaic virus (SimMV) and Tomato severe rugose virus (ToSRV), were detected in one of the areas in the soybean sampled in the areas of the Escola de Agronomia. The ToSRV species was not previously reported in soybean and presents great potential to become an important pathogen for this crop and also for uncultivated plants, since this virus causes great losses in other crops, mainly tomato, and it has been demonstrated that its host range has increased in recent years. / Para se entender como novos vírus surgem na agricultura, as zonas de interface entre os sistemas nativos e as áreas cultivadas tornam-se um interessante objeto de estudo. O pequeno número de estudos focados na detecção de vírus, principalmente de RNA, em espécies arbóreas do cerrado nas zonas de interface é devido à dificuldade de extração de ácidos nucleicos de qualidade para análises necessárias. No caso dos vírus de DNA, como os begomovírus, até o momento não haviam relatos em espécies arbóreas nesse tipo de vegetação. Os begomovírus estão entre os principais patógenos em diferentes culturas no Brasil, entretanto em soja, uma das principais culturas do país, esses vírus não estão entre os patógenos mais importantes para cultura, porém, é de grande importância identificar diferentes hospedeiras desses vírus e em que ambientes ocorrem para conhecer sua diversidade. Assim, o objetivo geral do trabalho foi detectar e identificar begomovírus em espécies arbóreas nativas do cerrado e em plantas de soja cultivadas próximas a áreas de vegetação nativa e também estabelecer protocolo de extração de RNA eficiente para espécies do cerrado com intuito de facilitar pesquisas futuras relacionadas com essas plantas. Para detecção de begomovírus, amostras de 30 espécies arbóreas foram coletadas de duas áreas de cerrado, em soja a amostragem foi realizada em três áreas da Escola de Agronomia da Universidade Federal de Goiás – Regional Goiânia – plantadas com diferentes cultivares. Para todas as amostras foi realizada a extração de DNA através de um método CTAB (Brometo de cetil trimetil amônio) modificado e a detecção foi feita por meio de PCR (Reação em cadeia da polimerase) utilizando os primers PAL1v1978 e PAR1c496. Para extração de RNA foram testados quatro métodos a partir de folhas de Xylopia aromatica e Piper arboreum: reagente TRIzol® (método 1), reagente TRIzol® com modificações (método 2) e dois métodos utilizando tampão CTAB (métodos 3 e 4) que possuem diferenças nos tampões utilizados em cada método. O que apresentou os melhores resultados foi testado para a obtenção de RNA purificado de cinco espécies arbóreas de cerrado. O método 4 foi escolhido devido aos seus melhores resultados na razão de absorbância (A260 / A280) quando comparado aos outros métodos. A RT-PCR do RNA extraído de cinco espécies de áreas de cerrado mostrou bons resultados após a extração de RNA realizada pelo método 4, qualificando este método como apropriado para obtenção de RNA de qualidade para análise molecular de espécies do cerrado. Na detecção de begomovírus em 30 espécies arbóreas do cerrado, apenas Cardiopetalum calophyllum foi positiva. Este é o primeiro relato de begomovírus em espécie arbórea do cerrado brasileiro. Na soja, as plantas sintomáticas amostradas nas áreas da Escola de Agronomia foram positivas, sendo que em uma das áreas foi detectada a presença de duas espécies de begomovírus: Sida micrantha mosaic virus (SimMV) e Tomato severe rugose virus (ToSRV). A espécie ToSRV não foi relatada anteriormente em soja e apresenta grande potencial para se tornar um importante patógeno para essa cultura e também para plantas não cultivadas, já que esse vírus causa grandes perdas em outras culturas, principalmente tomateiro, e tem sido demonstrado que sua gama de hospedeiras tem aumentado nos últimos anos.

Made available in DSpace on 2017-07-10T18:01:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Eliete Moura de Souza Hurmann.pdf: 819870 bytes, checksum: 4302d144fe2194c2bcd5c074b31e3635 (MD5) Previous issue date: 2016-01-08 / Fundação Araucária / Trichoderma spp. is a promising antagonist, the development and use of products based on this organism gives us the opportunity not only to reduce health risks, but also costs and environmental damage. This work aimed to analyze the efficiency of Trichoderma viride extracts and Trichoderma stromaticum against some microorganisms of interest in clinical medicine, agriculture and fish farming. Among them Colletotrichum musae, banana anthracnose causes, Saprolegnia, which affects fish eggs and some bacteria that cause harm to human health. The dichlorometane extracts were tested at various concentrations, and as positive control a commercial antimicrobial. Inhibition of the pathogen was verified directly by paired cultivation technique. The antimicrobial activity of the extracts was evaluated by disk diffusion and the determination of minimum inhibitory concentration (MIC) by microdilution test broth. In situ tests were done in the fruit inoculating the pathogenic fungus and treated with the extracts and the sensory analysis where it was determined the acceptance of the product. In cultivation paired the Trichoderma spp. inhibited the growth of pathogens being 0.05% significance level. In the disk diffusion test results were positive, and for E. coli and Aeromonas hydrophila gave the best results. MIC against microorganisms of the extracts ranged from 50% to 3,125%. Given the results presented, it is concluded that the extracts were effective in in vitro inhibition of the microorganisms as well as their application in the fruits did not alter the organoleptic characteristics. / O Trichoderma spp. é um antagonista promissor, o desenvolvimento e uso de produtos à base deste microrganismo nos oferece a oportunidade, não apenas de reduzir os riscos da saúde, mas também custos e danos ambientais. Assim, este trabalho teve por objetivo analisar a eficiência dos extratos de Trichoderma viride e Trichoderma stromaticum contra alguns microrganismos de interesse na clínica médica, agricultura e piscicultura. Dentre eles o Colletotrichum musae, causador da antracnose da banana, Saprolegnia, que acomete ovas de peixes e algumas bactérias que causam danos à saúde humana. Os extratos diclorometânicos foram testados em várias concentrações, tendo como controle positivo um antimicrobiano comercial. A inibição do patógeno foi verificada, de forma direta pela técnica de cultivo pareado. A atividade antimicrobiana dos extratos foi avaliada por disco-difusão e pela determinação da concentração inibitória mínima (MIC) por teste de microdiluição em caldo. Foram feitos testes in situ no fruto inoculando o fungo patogênico e tratados com os extratos e a análise sensorial onde foi determinada a aceitação do produto. No cultivo pareado os Trichoderma spp. inibiram o crescimento dos patógenos sendo 0,05% de significância. No teste de disco-difusão os resultados foram positivos, sendo que para Aeromonas hydrophila e E. coli obteve-se os melhores resultados. O MIC (concentração inibitória mínima)dos extratos contra os microrganismos variou de 50% a 3,125 %. Diante dos resultados apresentados, evidenciou-se que, os extratos foram eficientes na inibição in vitrodos microrganismos testados, bem como sua aplicação nos frutos não alterou as características organolépticas dos mesmos.

A leprose dos citros é uma doença de grande importância econômica aos citricultores, devido aos prejuízos por ela causados. A doença provoca lesões localizadas nos ramos, frutos e folhas e pode causar grandes perdas aos pomares não tratados. A leprose dos citros possui etiologia viral sendo o vírus denominado Citrus leprosis virus (CiLV). Atualmente, atribuí-se a leprose dois tipos de vírus que causam sintomas morfológicos e citopatológicos distintos: o tipo nuclear (CiLV-N) e o tipo citoplasmático (CiLV-C). O presente trabalho teve como objetivo investigar as alterações anatômicas e comparar o perfil protéico entre as lesões causadas pelos dois tipos de vírus em laranjeira-doce [Citrus sinensis (L.) Osbeck]. Para as análises anatômicas foram coletadas amostras de tecidos sadios e de tecidos lesionados. As amostras foram fotografadas e em seguida fixadas em solução de Karnovsky, desidratadas em série etílica, infiltradas em resina hidroxi-etil-metacrilato (Leica Historesin), seccionadas em micrótomo rotativo a 5-7 µm de espessura, coradas com azul de Toluidina para as análises histológicas usuais. Também foram realizados testes histoquímicos para fenóis, compostos pécticos, proteína e lipídios. A captura de imagens digitais dos materiais preparados em lâminas foi realizada em microscópio equipado com câmera de vídeo. Para a análise do perfil protéico as amostras coletadas foram imediatamente criofixadas em nitrogênio líquido e armazenadas em refrigerador a - 80ºC para posterior extração protéica. As proteínas extraídas foram quantificadas e depois separadas por eletroforese em gel de policrilamida. As lesões foliares se iniciaram como pontuações necróticas, envolvidas por halos cloróticos que limitam o crescimento da lesão. Nos ramos, ocorreram dois tipos de lesões com fendas. As lesões de ramos e de folhas provenientes do campo com sintomas de CiLV-C apresentaram similaridades com as amostras inoculadas. No caso das lesões foliares causadas pelo CiLV-N observa-se a presença de três regiões distintas: o centro necrótico, o halo intermediário e o halo clorótico. As lesões nos frutos de ambos os tipos de leprose eram distintas. Ductos traumáticos gomosos foram observados nos ramos infectados pelo CiLV-C e nos feixes vasculares de folhas e frutos infectados pelo CiLV-N. Quanto ao perfil protéico, verificou-se um aumento na concentração protéica nos tecidos infectados, em especial, nas lesões causadas pelo CiLV-N. Foi possível observar que havia um padrão anatômico e histoquímico nas lesões causadas pela leprose em laranjeira doce independente do tipo de vírus, pois em todas as lesões foi verificada hipertrofia e hiperplasia celular, plasmólise, a redução de grãos de amido, o acúmulo de compostos lipídicos nas células da área necrosada e a presença de um halo, ao redor dessa área, constituído de células que acumulam proteínas. / The citrus leprosis of citrus has been considered a disease of great economic importance to citrus producers due to the damage that it causes. The disease is responsible for lesions found in the twigs, leaves and fruits, and it may cause great losses to the untreated orchards. The citrus leprosis has viral etiology being the virus called Citrus leprosis virus (CiLV). Currently, there are two types of virus attributed to leprosis that cause different morphological and cythopatological symptoms: the nuclear (CiLV-N) and cytoplasmic type (CiLV-C). This study aimed to investigate the anatomical changes and to compare the proteic profile between the injuries caused by two types of virus in sweet orange [Citrus sinensis (L.) Osbeck]. For anatomical analyses healthy tissue and different lesions were photographed and then fixed in Karnovsky solution, dehydrated in a graded ethylic series, embedded in hidroxy-ethyl methacrylate resin (Leica Historesin), sectioned (5 ?m thick), stained and mounted in synthetic resin. The digital images were capture in a microscope with video camera. For the analysis of protein profiles the samples were collected and immediately cryofixed in liquid nitrogen and stored in the refrigerated - 80 ° C. The proteins were extracted, quantified and then separated by gel electrophoresis of polyacrylamide gel. Foliar lesions began as necrotic spots surrounded by a yellow halo that inhibited the lesion expansion. The twigs presented two different lesions: depressed ones and pustules with ruptures. The collected-field lesions of leaves and twigs showed that symptoms of CiLV-C had a certain similarity with the inoculated samples. In the case of foliar lesions caused by CiLV-N there was the presence of three different regions: the necrotic center, the intermediate halo and chlorotic halo. The fruit lesions caused by both types of leprosis virus were different. Ductos traumáticos gomosos foram observados nos ramos infectados pelo CiLV-C e nos feixes vasculares de folhas e frutos infectados pelo CiLV-N. Gummous traumatic ducts in twigs infected by CiLV-C and in the vascular bundles of fruit and leaves infected with CiLV-N were observed. In the proteic profile, there was an increase in protein concentration in the infected tissues especially for injuries caused by CiLV-N. It was possible to observe that there was an anatomical and histochemical pattern in the lesions caused by leprosis in sweet orange independently of the type of virus, therefore in all the injuries was verified hyperplasia, hypertrophy, cell plasmolisis, the reduction of starch grains, the accumulation of lipids compounds in the cells of the necrotic areas and the presence of a halo, surrounding that area, constituted by cells that accumulate proteins.

Orientadores: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira, Jorge Mauricio Costa Mondego / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-12T09:29:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Franco_SulamitadeFreitas_M.pdf: 9729318 bytes, checksum: 0c17aa7d5f8dfd63cbc8d23f9259fc83 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Moniliophthora perniciosa é um fitopatógeno de grande importância econômica no Brasil, em especial na região do sul da Bahia, por causar a doença do cacaueiro conhecida como Vassoura de Bruxa. Esse fungo possui um ciclo de vida hemibiotrófico, apresentando duas fases distintas: a primeira biotrófica/parasítica e a segunda saprotrófica/necrotrófica. O banco de dados gerados pelo projeto genoma Vassoura de Bruxa vem sendo estudado com o intuito de desvendar as vias metabólicas utilizadas pelo patógeno na colonização do cacaueiro. Curiosamente, foi verificada a expressão de um gene similar a taumatina pelo fungo. As taumatinas de plantas são expressas durante a resposta hipersensitiva (HR) em interações planta-patógeno, sendo classificadas como PR-5 (pathogenesis related protein). Taumatinas possuem atividade antifúngica e são capazes de clivar ß-glucanas. Uma nova função foi descrita para uma taumatina de trigo: a de inibição de xilanase. Recentemente, as taumatinas vêm sendo estudadas também em nematódeos, artrópodos e fungos. O trabalho aqui descrito visou à clonagem do gene de M. perniciosa similar a taumatinas MpTLP1 e a expressão da proteína recombinante MpTLP1, bem como o estudo da expressão desse gene durante o desenvolvimento de M. perniciosa. Análises de Northern blot mostram que esse gene é induzido quando o fungo é incubado com extrato de cacau e ácido salicílico. Dados de Real time PCR mostram que esse gene é mais expresso na fase biotrófica do fungo. Esses resultados sugerem a participação de MpTLP1 na interação planta-patógeno. MpTLP1 foi expressa em E.coli e renaturada a partir de corpos de inclusão. A proteína renaturada não apresentou atividades antifúngica e ß-glucanolítica. Esses resultados podem ser atribuídos a sua renaturação ineficiente, ou pelas suas diferenças estruturais com relação a outras TLPs com atividade antifúngica e ß-glucanolítica. Algumas características de MpTLP1 podem indicar que essa proteína possa ser um inibidor de xilanase ou de outras enzimas que clivam parede celular. / Abstract: Moniliophthora perniciosa is a phytopatogen that has economical importance in Brazil, particularly in the south of Bahia, because this fungus causes the disease in cacao known as Witches' Broom disease. This fungus is a hemibiotrofic pathogen that has two distinct stages: a biotrophic (or parasitic) and a necrotrophic (or saprotrophic). The database generated by the Witches' Broom genome project has been studied in order to unravel the metabolic pathways used by the pathogen during the colonization of cacao. Curiously, it was detected the expression of a gene similar to thaumatins in M. perniciosa. Plant thaumatins are expressed during hypersensitive responde (HR) in plant pathogen interactions, being classified as PR-5 (pathogenicity related protein class-5). Thaumatins have antifungal and ß-glucanolitic activities. Recently, a new wheat thaumatin-like protein was described as a xylanase inhibitor. Thaumatins from nematodes, arthropods and fungi have also been characterized. This work aimed the cloning of the M. perniciosa thaumatin like-gene MpTLP1, the expression of the recombinant protein MpTLP1, as well as at the characterization of its gene expression during the development of M. perniciosa. Northern blot analysis shows that MpTLP1 expression is induced when the fungus is incubated with cacao extract and salicylic acid. Real time-PCR data show that MpTLP1 is more expressed in the biotrophic stage of the fungus. These results suggest the participation of MpTLP1 in plant-pathogen interaction. MpTLP1 was expressed in E. coli and refolded from inclusion bodies. The refolded protein did not have antifungal or ß- glucanolytic activity. These results can be attributed to an inefficient refolding or to structural differences in relation to other TLPs that have antifungal and ß- glucanolytic activity. Some MpTLP1 features may indicate that this protein inhibits xylanases or other enzymes that cleave cell walls. / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-24T13:53:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ReisJunior_Osvaldo_M.pdf: 4891818 bytes, checksum: f9d97822f44db63385219e9c927eaf29 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: As tecnologias de sequenciamento de segunda geração geram um grande número de sequências em um curto espaço de tempo e com baixo custo. O sequenciamento em larga escala de cDNA, conhecido como RNA-seq, tem permitido análises precisas de transcriptomas inteiros sem a necessidade de conhecimento prévio sobre sequências genômicas, conforme exigido pela tecnologia de microarranjos. No entanto, existem muitas discussões sobre os métodos utilizados para o alinhamento de reads, identificação de genes diferencialmente expressos e montagem de transcriptomas. Desde 2000, o Laboratório de Genômica e Expressão (LGE), tem estudado a doença da vassoura-de-bruxa do cacaueiro (Theobroma cacao), que é causada pelo fungo basidiomiceto Moniliophthora perniciosa. Recentemente, 54 bibliotecas RNA-seq da interação planta-patógeno foram sequenciadas pelo nosso grupo, a fim de ajudar na elucidação da complexa biologia da doença. Desta forma, este trabalho tem como objetivo gerar informações sobre o perfil de transcrição do M. perniciosa e do T. cacao durante a doença vassoura-de-bruxa. Os resultados estão divididos em três seções principais, sendo que na primeira apresentamos uma análise de alinhamento e expressão gênica nas condições e tecidos amostrados. Na segunda, analisamos o estágio inicial da doença, conhecido como vassoura-verde, onde através da análise de expressão diferencial identificamos genes relacionados aos mecanismos de interação entre o cacaueiro e o fungo M. perniciosa. Na ultima seção, desenvolvemos uma estratégia para identificar sequências de possíveis RNAs não codificantes longos (lncRNA) e aplicamos esta estratégia no fungo M. perniciosa. De uma maneira geral estes dados apresentam um importante avanço no estudo desta doença e poderão ser utilizados em trabalhos futuro / Abstract: Next-generation sequencing technologies generate large numbers of sequences in a short time and at low cost. The high-throughput sequencing of cDNA, known as RNA-seq, has allowed precise analyses of entire transcriptomes without the need of previous knowledge on genomic sequences, as required by microarrays. However, there are many discussions about the methods used for read alignment, identification of differentially expressed genes and assembly of transcriptomes. Since 2000, the Genomics and Expression Laboratory (LGE), has been studying the Witches' Broom Disease (WBD) of cacao (Theobroma cacao), which is caused by the basidiomycete fungus Moniliophthora perniciosa. Recently, 54 RNA-seq libraries of this plant-pathogen interaction were sequenced by our group in order to help in the elucidation of the complex biology of the disease. Thus, this work aims to generate information about the transcription profile of M. perniciosa and T. cacao during the Witches' Broom Disease (WBD). The results are divided into three main sections, the first is an analysis of alignment and gene expression under the conditions and sampled tissues. In the second section, we analyze the initial stage of the disease, known as green broom, where through differential expression analysis we could identify genes related to mechanisms of interaction between cacao and the fungus M. perniciosa. In the last section, we developed a strategy to identify possible sequences of long noncoding RNAs (lncRNA) and applied this strategy in the fungus M. perniciosa. In general these data present an important advance in the study of this disease and may be used in future work / Mestrado / Bioinformatica / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Orientadores: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira, Jorge Maurício Costa Mondego / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-25T03:53:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Franco_SulamitadeFreitas_D.pdf: 3383952 bytes, checksum: e4041edb080f1a645fcbd6eacdc51378 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A cultura do cacau é de grande importância econômica em países produtores da semente e produtores de chocolate, e move um mercado que alcança hoje ao redor de U$ 50 bilhões. As doenças fúngicas são um fator importante na redução de produção de cacau. No Brasil, o principal responsável pela perda na produção é o basidiomiceto Moniliophthora perniciosa, agente etiológico da doença conhecida como vassoura de bruxa, que arrasou a produção brasileira na década de 90. A doença tem como característica a não elicitação de resposta hipersensitiva (HR), o que permite a colonização de tecidos vegetais pelo fungo. HR é uma resposta que desencadeia a indução da expressão de proteínas denominadas PRs (pahtogenesis related), que agem contra patógenos. Entre as PRs encontram-se as PR5, conhecidas como taumatinas. Análise do genoma de M. perniciosa resultou na anotação de 13 genes que codificam proteínas Taumatina- like (MpTLPs). Apesar de serem bem descritas como proteínas antifúngicas em plantas, estudos em fungos basidiomicetos apontam seu envolvimento no remodelamento celular durante a formação cogumelos. M. perniciosa é a espécie de fungo com o maior número de TLPs descritos até o momento, tendo 6 deles organizados em clusters, indicando eventos de duplicação. Análise filogenética revelou uma maior quantidade de TLPs em basidiomicetos, quando comparado a ascomicetos, indicando sua participação na formação de cogumelos. No geral, MpTLPs são transcritas durante a fase de vassoura seca da doença, onde o galho seco está sujeito a infecção de fungos oportunistas, indicado a contribuição dessas proteínas no combate contra esses fungos, além de poder estar participando no desenvolvimento de sua parede para formação de basidiocarpo e na degradação da parede celular da planta. Além das MpTLPs, análise de transcriptoma revelou um total de 35 MpCSEPs (Proteínas Candidatas a Efetores de Patogenicidade Secretados pelo fungo) com valor de RPKM >50 foram identificadas em plantas de cacau infectadas. Esses genes são expressos preferencialmente na fase inicial da doença (Vassoura verde), onde encontramos o fungo ainda em fase biotrófica. Em geral, esses genes codificam proteínas pequenas e ricas em cisteínas que são características típicas de efetores de virulência (AVRs), podendo ser uma evidência de que esses genes codificam potenciais efetores. Após triagem, 16 desses genes foram escolhidos para a caracterização estrutural. Destes, sete foram clonados para expressão de proteína heteróloga, o que resultou ao final do estudo a cristalização de 2 proteínas (MpCSEP 5 e MpCSEP 14). Os cristais obtidos até o momento foram testados em linha de luz MX1 e MX2, mas não apresentou difração e os processos de refinamento dos cristais deverão ser continuados. As proteínas obtidas nesse estudo poderão ser utilizadas em testes enzimáticos em trabalhos futuros, para sua completa caracterização estrutural e funcional / Abstract: The cocoa cultivation have great economic importance in the seed and chocolate producing countries , moving a market that presently reaches around $50 billion. Fungal diseases are the major factor in reducing cocoa production. In Brazil, the main responsible for the production loss is the basidiomycete Moniliophthora perniciosa, known as the etiological agent of witches' broom disease , which devastated the Brazilian production in the 90's disease. The disease is characterized by not eliciting a hypersensitive response (HR), which allows the plant tissue colonization by the fungus. HR is a response that triggers the induction of the expression proteins called PRs (pahtogenesis related), which act against pathogens. Among the PRs, PR5 are known as thaumatins. M. perniciosa genome analysis resulted in the annotation of 13 genes encoding proteins Thaumatin - like (MpTLPs). Despite being well described as antifungal proteins in plants, fungi basidiomycetes studies suggest its involvement in cellular remodeling during mushroom formation. M. perniciosa fungal is the species with the highest number of TLPs described so far, with 6 of them organized in clusters, indicating duplication events. Phylogenetic analysis revealed a greater number of TLPs in basidiomycetes when compared to ascomycetes, indicating their involvement in the formation of mushrooms. Overall, MpTLPs are transcribed during the dry broom disease, where the dead branch is subject to opportunistic fungal infection, indicating the contribution of these proteins in the fight against these fungi, and can be participating in the development of your wallpaper for training basidiocarp and in the cell wall degradation of the plant. Besides MpTLPs, transcriptome analysis revealed a total of 35 MpCSEPs (candidate secreted effectors of pathogenicity protein by the fungus) with RPKM value > 50 have been identified in infected cocoa plants. These genes are preferentially expressed in the early phase of the disease (Green Broom), where we found the fungus still in biotrophic phase. In general, these genes encode small and rich in cysteine that are typical characteristics of virulence effector (AVRs) proteins, which can be evidence that these genes encode potential effectors. After screening, 16 of these genes were chosen for structural characterization. Of these, seven were cloned for expression of heterologous protein, resulting at the end of the study the crystallization of 2 proteins (MpCSEP 5 and 14). The crystals obtained so far been tested in MX1 and MX2 light line, but showed no diffraction and processes of crystals refinement should continue. The proteins obtained in this study may be used in enzymatic assays in future work to its full structural and functional characterization / Doutorado / Bioquimica / Doutora em Biologia Funcional e Molecular

Made available in DSpace on 2014-06-12T18:04:34Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo6199_1.pdf: 10094196 bytes, checksum: 4aa11f8ba64139d59c8d3fd9eefe303f (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2007 / Os genes de resistência (R) respondem pela primeira interação entre planta e patógeno, sendo responsáveis pela ativação ou não de mecanismos de resistência em plantas. Este trabalho analisou genes R em sequências expressas de eucalipto, cana-de-açúcar e feijão-caupi, geradas através de bibliotecas produzidas a partir de diferentes tecidos em várias fases de desenvolvimento. Depois da análise in silico foi possível a identificação de todas as classes de genes de resistência em eucalipto, com destaque para a classe NBS-LRR (Nucleotide Binding Site; Sítio de Ligação de Nucleotídeo - Leucine Rich Repeats; Repetições Ricas em Leucina) (50% das 208 sequências candidatas que apresentaram domínios completos) e em cana-de-açúcar, com destaque para a classe KINASE (46% das 196 sequências candidatas que apresentaram domínios completos). No feijão-caupi o número de seqüências disponíveis foi escasso, observando-se maior abundância da classe NBS-LRR (80% das 38 sequências candidatas), entretanto estiveram ausentes as classes KINASE e LRR-KINASE. Observaram-se genes R em cana e eucalipto em todos os tecidos analisados, em diferentes níveis de expressão sob condições não induzidas. Quando analisados através de alinhamentos múltiplos os genes R apresentaram maior semelhança entre espécies pertencentes à mesma família, geralmente agrupando mono e dicotiledôneas em clados distintos, sugerindo que tenham surgido antes da separação entre essas classes. Os resultados do presente estudo têm potencial para colaborar com o desenvolvimento de marcadores moleculares para o melhoramento, para o entendimento da abundância e diversidade e evolução destes genes, com ênfase das espécies estudadas, bem como para identificação dos genes R em outras culturas de interesse econômico

Orientador: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-04T02:59:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fonseca_JosePedro_M.pdf: 497183 bytes, checksum: 992a81544cf97f11b6ecd399a3cf3172 (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: Transferência horizontal de genes (HGT) pode ser definida como a transmissão de genes entre diferentes grupos taxonômicos no qual o gene incorporado ao genoma do organismo receptor pode ser mantido ao longo de sucessivas gerações pelo sistema reprodutivo tradicional do receptor. HGT é reconhecida como uma das principais forças atuantes na evolução de genomas de procariotos, que têm significantes percentagens adquiridas por esse processo (1.5% a 14.5%).Em eucariotos, entretanto, o papel de HGT começou apenas recentemente a ser avaliado e geralmente é relacionado com algum cenário evolutivo específico como, por exemplo, a relação hospedeiro-patógeno. Espécies de fungos são consideradas especialmente suscetíveis a HGT por seu modo íntimo de associação com hospedeiros. Em vista disso, no presente projeto foi elaborado um protocolo para identificação de potenciais candidatos a HGT no genoma de Crinipellis perniciosa, o fungo causador da vassoura de bruxa nos cacauais. Primeiramente foi criado um banco de dados contendo todas as seqüências putativas de proteínas (ORFs) de fungos disponíveis no banco de dados do NCBI nr (03/2004). Uma montagem-rascunho de seqüências genômicas ¿shotgun¿ de C. perniciosa, num total de 17.000 contigs, foi então comparada, através de BLASTX, com esse banco de ORFs de fungos. Cerca de 5000 contigs de C. perniciosa que apresentaram similaridade com o banco de ORFs de fungos (e-value < e-5) foram eliminados, sendo considerados como contendo genes verticalmente transferidos. As demais 12.000 seqüências foram então comparadas por blastX contra nr, gerando um total de 357 ¿hits¿ com alta similaridade (e-value < e-5) com seqüências não encontradas dentro das seqüências de fungos até então depositadas.Estes 357 contigs foram então analisados pelo algoritmo BLASTP contra o NCBI-nr e destes 43 apresentaram alta similaridade com proteínas ou domínios conservados de organismos evolutivamente distantes a fungos: 16 apresentaram alta similaridade com plantas, 19 com bactérias e outros 09 com vertebrados/invertebrados. Entre os genes putativos mais interessantes destacam-se o gene ¿Thaumatin¿ (THN) e Transposase; cujas ORFs, à exceção de THN estão completas, não tem introns e apresentam sinais de endereçamento celular. Esses genes foram amplificados a partir do DNA genômico e cDNA da fase necrotrófica de C. perniciosa, confirmando assim sua presença no genoma do fungo, sendo inclusive validados através de sequenciamento. Entre os genes candidatos amplificados, Pollen e DAD não apresentaram uma amplificação consistente e análises através de BLASTN contra banco de dados de EST e do genoma do eucalipto indicaram uma possível contaminação. Um gene identificado neste trabalho cujo produto é biologicamente interessante é o gene ¿thaumatin¿ (THN), da família de genes PR-5 (¿pathogenesis-related¿), descrito como uma proteína antifúngica relacionada à patogênese e à resposta sistêmica a patógenos em plantas.Assim, o presente trabalho gerou uma lista de genes candidatos a terem a sua origem pela transferência horizontal e sua análise poderá permitir a compreensão de processos de interação patógeno hospedeiro / Abstract: Horizontal gene transfer (HGT) can be defined as the mobilization and transmission of DNA across species barriers other than through sexual transmission to the offspring (vertical descent). HGT has long been recognized as a major force affecting the evolution of prokaryotes as significant proportions of such genomes have been subjected to horizontal transfer (1.5% to 14.5%). The role of HGT in eukaryotes is still poorly demonstrated and only recently some individual cases have been reported, normally linked to some evolutive scenario such as host-pathogen interaction. It is said that fungal species are especially susceptible to HGT for their close associations with their hosts. This is especially the case for fungi with saprophytic mode of feeding that could somehow facilitate HGT. This is also the case in pathogens that share an intracellular environment with its host. We investigate here the possible role of HGT in the basidiomycete, saprophytic fungi C. perniciosa and its possible consequences to plant-pathogen interactions in the context of putative acquired HGT genes.Given the large number of sequences to examine and the expectation that only a few were horizontally transferred we created a stepwise approach based on genomic comparisons in order to reduce the number of HGT candidates through elimination of spurious HGT candidates.We first created a fungal database containing all fungal sequences available at NCBI at the time of the analysis and all fungal genomes available through the FTP site (NCBI). This fungal dataset was then compared to a draft assembly of C. perniciosa shotgun genomic sequences using BLASTX with an e-value cutoff higher than E>-5. This served to eliminate all sequences with high similarities to fungal sequences that are not considered as being subjected to HGT. Secondly, we made a second round of genomic comparison, this time against the NCBI-nr, containing all protein coding sequences and putative ORFs, through BLASTX with a cutoff BLAST e-value of e<-5. We managed to reduce our sequences from around 17.000 contigs to around 7.000 in the first round of screening and to only 357 contigs after the second round of genomic screening. Those 357 contigs were then examined for putative homologs using BLASTP against NCBI-nr and we selected 43 candidates of HGT showing high similarity to sequences of distantly related organisms, mainly plants and bacteria. We then moved on to perform Phylogenetic and Parametric analysis on those candidates to see if they confirmed HGT. Out of those 43 candidates we found a strong bias between plants and fungi, with 15 HGT candidates being proposed to have been transferred from plants to fungi. Out of those 15 plant candidates we found 6 transposons with high similarities to plants class 1 transposons, suggesting that transposons indeed might play a role in HGT. Two HGT candidates in our list (Transposase and THN) were successfully amplified through PCR and were sequenced. Further analysis suggested the presence of 6 contaminant sequences in the C. perniciosa genome from Eucalyptus through BLASTN scores against EST and eucalyptus databases including the putative genes for Pollen and DAD / Mestrado / Genetica de Microorganismos / Mestre em Genética e Biologia Molecular