Doctor en Ciencias de la Ingeniería, Mención Ingeniería Química y Biotecnología / Streptomyces leeuwenhoekii C34 es un actinomiceto aislado del desierto de Atacama, Chile, productor de los antibióticos chaxamicinas A a D y chaxalactinas A a C. El objetivo de este trabajo fue identificar los genes involucrados en la biosíntesis de chaxamicinas y chaxalactinas y producir chaxamicinas en un huésped heterólogo. Capítulo Uno detalla procedimientos de crecimiento y modificación genética de S. leeu- wenhoekii C34. La temperatura óptima para producción de chaxamicinas en medio líquido fue 30 °C, y la que permitió alcanzar altos niveles de esporulación en medio sólido fue 37 °C. S. leeuwenhoekii C34 fue sensible a tioestreptona, apramicina, higromicina B y kanamicina, mientras que no a ácido nalidíxico, antibióticos usados para seleccionar bac- terias genéticamente modificadas. Un vector sensible a temperatura (pGM1190) y otro con un sistema de integración del fago C31 (pSET152) fueron exitosamente transferi- dos a S. leeuwenhoekii C34 por conjugación con una cepa que no metila ADN, E. coli ET12567/pUZ8002. Suplementación del medio de conjugación con 120 mM MgCl2 ó 60 mM CaCl2, incrementó la frecuencia de conjugación de forma significativa, comparado con el control sin adición de sales. En este trabajo se demostró que S. leeuwenhoekii C34 incorpora ADN foráneo no metilado. Capítulo Dos describe la identificación y expresión heteróloga de los genes de biosín- tesis de chaxamicinas. El genoma de S. leeuwenhoekii C34 fue secuenciado de novo combinando tecnologías de secuenciación Illumina y PacBio. Un grupo de 27 genes (80,2 kb, locus 1.210.347 1.290.550), codifica enzimas para la biosíntesis de chaxam- icinas. pIJ12853 contenía un inserto del genoma de S. leeuwenhoekii C34 de 145 kb que incluye el segmento de 80,2 kb, el que fue transferido a una cepa que no produce chaxamicinas, S. coelicolor M1152, resultando en la producción de chaxamicinas A D, confirmando que los genes presentes en pIJ12853 codifican para la ruta de biosíntesis de chaxamicinas. Genes del huésped heterólogo podrían estar involucrados en biosíntesis y/o exporte de estas moléculas. La deleción del gen AHBA sintasa (cxmK) en S. leeu- wenhoekii C34, dio origen a la cepa M1653 que pierde su capacidad de producir chax- amicinas. Para demostrar que la interrupción en la producción de chaxamicinas fue sólo debido a su incapacidad de producir AHBA, un cultivo líquido de M1653 suplementado con AHBA comercial permitió restablecer la producción de chaxamicinas. Esto es una prueba más de que el los genes de biosíntesis de chaxamicinas fueron identificados. Capítulo Tres describe la identificación bioinformática de los genes de biosíntesis de chaxalactinas. Una secuencia de 80,7 kb (locus 7.146.903 7.227.608) contenía genes codificantes de 5 subunidades de una policétido sintasa, cuya arquitectura de dominios coincidía con la predicha para biosíntesis de chaxalactina A. Un gen que codifica una citocromo P450 sería responsable de la hidroxilación C-14 de chaxalactina A que da ori- gen a chaxalactina B. Dos genes codificantes de O-metiltransferasas estarían involucra- dos en una O-metilación C-13 de chaxalactina B, que da origen a chaxalactina C.

Publicación a texto completo no autorizada por el autor / Analiza el grado de diversidad genética de 24 aislados de B. melitensis obtenidas a partir de las muestras clínicas de pacientes mediante la aplicación de la técnica HOOF-Prints, mediante el análisis del número variable de repeticiones en tándem de 8 loci, un método rápido, de bajo costo y que permite determinar la diversidad alélica de la población siendo el locus 7 el más polimórfico (D = 0.8). / Tesis

Ramnolipídeos (RLs) e polihidroxialcanoatos (PHAs) produzidos por Pseudomonas aeruginosa são compostos biodegradáveis e que podem ser obtidos a partir de matérias-primas renováveis. Com o objetivo de elucidar aspectos metabólicos e regulatórios da produção de RLs e PHAs, mutantes de P. aeruginosa LFM634 afetados na síntese desses compostos foram obtidos utilizando um transposon (ISlacZ/hah). Dentre 61 mutantes caracterizados, foram detectados vários super-produtores de RLs e/ou PHAs, bem como alguns nos quais nenhum RL foi detectado. Dois mutantes (p09-13 e p12-39) apresentaram capacidade reduzida de inserir ramnose em RLs e de direcionar intermediários da biossíntese de ácidos graxos para a síntese de RLs ou PHAs. O mutante p09-13 está afetado no gene crc, sugerindo um importante papel deste regulador global no processo de síntese de RLs e PHAs. / Rhamnolipids (RLs) and polyhydroxyalkanoates (PHAs) produced by Pseudomonas aeruginosa are biodegradable compounds and can be obtained from renewable raw materials. Aiming to elucidate metabolic and regulatory issues involved in the RLs and PHAs production, P. aeruginosa LFM634 mutants affected in their biosynthesis were obtained using a transposon (ISlacZ/hah). Out of 61mutants characterized, it was detected several overproducing RLs and/or PHA, as well as some in which no RLs was detected. Two mutants (p09-13 and p12-39) presented reduced capability of inserting rhamnose in RLs and of channeling intermediates from fatty acid biosynthesis to the synthesis of RLs and PHAs. The mutant p09-13 is affected on crc gene, suggesting an important role of this global regulator on the process of RLs and PHA synthesis.

A bactéria Escherichia coli é encontrada em diversos habitats e deve estar preparada para sobreviver e crescer em condições desfavoráveis. A adaptação da bactéria a diferentes condições obriga-a a controlar a expressão de genes de forma eficiente. Uma das formas primárias de controle de expressão gênica é a competição entre os diversos fatores sigma pela ligação ao cerne da RNA polimerase. <font face=\"Symbol\">d70 é o fator sigma mais abundante e participa da transcrição da maioria dos genes de E. coli, enquanto que <font face=\"Symbol\">dS é o segundo em importância e reconhece promotores de genes relacionados à resposta geral ao estresse. O gene rpoS, que codifica para <font face=\"Symbol\">dS é altamente polimórfico, e adquiri mutações frequentemente. A mutação pontual C<font face=\"Symbol\">&#174;T na posição 97 da ORF de rpoS, resulta em um códon de parada TAG (âmbar). Um Shine-Dalgarno alternativo e um códon de início de tradução na posição 157 dá início a uma proteína RpoS truncada, que é parcialmente funcional. Uma das situações de estresse na qual <font face=\"Symbol\">dS é ativado corresponde à privação de fosfato inorgânico. Porém, na limitação deste nutriente ocorre também a ativação do regulon PHO, cujos genes são predominantemente transcritos por <font face=\"Symbol\">d70. Neste trabalho, o efeito da versão truncada de RpoS sobre a expressão de genes dependentes de <font face=\"Symbol\">d70 (lacZ, phoA e pstS) e de genes dependentes de <font face=\"Symbol\">dS (osmY e proU) foi testado. Foram também realizados ensaios de estresse oxidativo, osmótico e pelo frio. O perfil de atividade parcial descrito para RpoSam pôde ser observado em alguns casos, porém em outros o comportamento deste alelo se assemelhou ao do mutante rpoS nulo. Paralelamente, foi testada também uma cepa de E. coli que carrega a mutação âmbar em rpoS, mas esta é suprimida, resultando na expressão de uma proteína RpoS normal. A proteína RpoS truncada não pôde ser visualizada em immunoblots, provavelmente porque esta é traduzida de forma pouco eficiente a partir do Shine-Dalgarno alternativo. Com o objetivo de incrementar a detecção de RpoS em ensaios de imuno-detecção, foi inserida por recombinação alélica uma etiqueta SPA altamente imunogênica na porção C-terminal da proteína. / Escherichia coli can be found in many different habitats and has to be prepared to survive and grow under unfavorable conditions. Bacteria adaptation to different growth conditions requires an efficient control of gene expression. One of the primary forms of gene expression control is the competition between different sigma factors for the binding to the core RNA polymerase. <font face=\"Symbol\">d70 is the most abundant sigma factor and participates in the transcription of most E. coli genes. <font face=\"Symbol\">dS is the second one in importance and recognizes promoters of genes related to the general stress response. The rpoS gene, which encodes <font face=\"Symbol\">dS, is highly polymorphic and acquires mutations very often. The transition C<font face=\"Symbol\">&#174;T at position 97 in the rpoS ORF results in a stop codon TAG (amber). Due to the presence of an alternative Shine-Dalgarno and a translation initiation codon at position 157 a truncated RpoS protein that is partially functional is translated. One of the stress situations that <font face=\"Symbol\">dS is activated is the starvation for inorganic phosphate. Phosphate limitation also triggers the activation of the PHO regulon, whose genes are predominantly transcribed by <font face=\"Symbol\">d70. In the present study, the effect of the truncated version of RpoS on the expression of <font face=\"Symbol\">d70 dependent genes (lacZ, phoA e pstS) and <font face=\"Symbol\">dS dependent genes (osmY e proU) was tested. Bacteria were also assayed for sensitivity to oxidative, osmotic and cold stress. The profile of partial activity described for the truncated RpoS could be observed in some cases, while in others the behavior of this allele resembled the rpoS null mutant. In parallel, an E. coli strain which suppresses the amber mutation in RpoS, resulting in the expression of a normal protein was also tested. A band correponding to the truncated RpoS could not be detected in immunoblots probably due to inefficient translation from the alternative Shine-Dalgarno. To improve the detection of RpoS, a highly immunogenic SPA tag was inserted in the C-terminal region of the protein.

Caulobacter crescentus pertence ao grupo das proteobactérias e apresenta a característica distinta de diferenciação celular a cada divisão. Este trabalho visou desvendar os mecanismos de reparo de DNA em C. crescentus. Identificamos 44 genes pertecentes ao regulon SOS através da construção de um mutante para o repressor deste, LexA. Caracterizamos funcionalmente alguns dos genes do regulon, como CC_2272 (que codifica uma proteína da família das endonucleases III) e CC_2433. A cepa deficiente em LexA apresentou morfologia filamentosa, e por esse motivo, buscamos também desvendar quais seriam os fatores genéticos responsáveis por esta morfologia. Investigamos também os processos de controle do ciclo celular após a introdução de danos na molécula de DNA pela luz UVC, em mutantes deficientes para diferentes vias de reparo. Estes experimentos nos mostraram que as células procariontes possuem mecanismos para acoplar a progressão do ciclo celular a integridade do material genético. Este trabalho abre novas e excitantes possibilidades no campo da biologia bacteriana. / Caulobacter crescentus belongs to the proteobacteria group and exhibts the distinctive feature of cellular differentiation after each division. This work aimed to reveal the DNA repair mechanisms in C. crescentus. We have identified 44 genes belonging to the SOS regulon through the construction of a mutant strain to its repressor. We have functionally characterized some of its genes, like CC_2272 (that encodes an endonuclease III family protein) and CC_2433. The lexA strain showed filamentous morphology, e because of that, we have tried to discover which the genetic factors responsible for this morphology were. We have also investigated the cell cycle control processes after the introduction of damages in the DNA by the UVC light, in mutant strains deficient in different repair pathways. These experiments showed us that prokaryotic cells possess mechanisms to couple the cell cycle progression to the integrity of the genetic material. This work opens new and exciting possibilities in the field of bacterial biology.

A cosmomicina D é um policetídeo aromático da família das antraciclinas com propriedades antitumorais e antimicrobianas produzida por Streptomyces olindensis. A elucidação de genes responsáveis pela síntese desta molécula foi abordada neste trabalho com as técnicas de LDGW-PCR e PCR que permitiram amplificar fragmentos gênicos envolvidos na formação da aglicona. O cluster gênico completo foi caracterizado numa região de 43,1 kb produto do seqüenciamento do genoma, onde se agruparam funcionalmente 40 ORFs em varias categorias: síntese de aglicona, reguladores, glicosiltransferases, deoxiaçúcares, resistência e com função desconhecida. Visando obter mutantes nulos para os genes cosS e cosY foram construidos os plasmídeos pCCSII e pCCYII onde a transformação da cepa selvagem com pCCSII resulto na cepa mutante SoDS, deficiente em produção de cosmomicina. As analises dos produtos obtidos da expressão de ambos os genes mostrou um efeito na redução de cosmomicina e supressão de intermediários do complexo antitumoral. / Cosmomycin D produced by Streptomyces olindensis is an aromatic polyketide of the anthracycline family with antitumor and antimicrobial properties. The amplification of genes responsible for the molecule synthesis were approached in this study by LDGW-PCR and PCR techniques, the obtained fragments showed high similarities with genes involved in aglycon core assembly. The complete gene cluster was characterized in a genome region of 43.1 kb product of genome sequencing, containing 40 ORFs grouped functionally into different categories: aglycon synthesis, regulators, glycosyltransferases, deoxisugars, resistance and unknown function. In order to obtain null mutants for cosS and cosY genes, the plasmids pCCSII pCCYII were constructed, the transformation of the wild strain with pCCSII result in SoDS mutant, deficient in production of cosmomycin. The analyses of the obtained products from the expression of both genes showed an effect in reducing cosmomycin levels and suppression of various intermediates in the antitumor complex.

Em aplicações biotecnológicas, a estabilização de informações e a expressão gênica em bactérias Gram-negativas são fundamentais. Neste trabalho, analisou-se o efeito de estabilização plasmidial promovido pelo lócus parB (hok/sok) nas bactérias E. coli, C. metallidurans e C. necator transformadas com os plasmídeos pCM2, pBBR1MCS e seus respectivos derivados contendo o lócus parB, pCM3 e pBBPAR. As bactérias transformadas com pCM2 exibiram perda plamidial acentuada após 50 gerações, e as bactérias transformadas com pCM3 e pBBPAR exibiram estabilidade próxima a 100%, após 100 gerações. Também foi avaliada a força relativa de expressão dos promotores hok e sok em relação ao promotor lac, inseridos no plasmídeo pBBEGFP. Por microscopia de fluorescência, foi observado que regulado pelos promotores sok e hok, os transformantes expressaram EGFP. Utilizando citometria de fluxo, foi observado que o promotor hok apresentou maior força de expressão nas bactérias transformantes de E. coli e C. metalliduras; já o promotor sok apresentou maior força de expressão em C. necator. / In biotechnological applications, stabilization of information and gene expression in Gram-negative bacteria are important. In this work, we analyzed the effect of plasmid stabilization promoted by locus parB (hok/sok) in the bacteria E. coli, C. metallidurans and C. necator transformed with the plasmids pCM2, pBBR1MCS, and their derivatives containing the parB locus, pCM3 and pBBPAR. The Bacteria transformed with pCM2 showed a pronounced plasmidial loss after 50 generations, and bacteria transformed with pCM3 and pBBPAR exhibited stability close to 100 % after 100 generations. We also evaluated the relative expression strength of hok and sok promoters relative to the lac promoter, inserted into plasmid pBBEGFP. For fluorescence microscopy, it was observed that regulated by hok and sok promoter, transformants expressed EGFP. Using flow cytometry, it was observed that the hok promoter showed higher expression levels in E. coli and C. metallidurans transformants; as sok promoter showed higher expression level in C. necator.

CspD é uma das quatro proteínas de choque frio de Caulobacter crescentus, sendo maior que as outras CSPs por possuir dois domínios de choque frio, e tem seu papel na célula ainda desconhecido. O objetivo deste trabalho foi identificar e caracterizar os fatores in cis e in trans envolvidos na regulação da expressão do gene cspD em C. crescentus. Neste trabalho foi visto que a expressão de cspD é induzida pela carência de glicose no meio, mas não pela carência de nitrogênio. Esta indução é dependente do sinalizador ppGpp, indicando que ppGpp está envolvido na sinalização de carência de carbono. Um regulador de resposta de um sistema de dois componentes (SpdR) foi identificado como responsável pela indução em fase estacionária, sendo fosforilado pela histidina quinase cognata SpdS. Através de ensaios de EMSA e DNAseI footprinting pudemos verificar que a proteína SpdR se liga em uma sequência repetida invertida no promotor de cspD, e que essa ligação é dependente da fosforilação no resíduo de aspartato na posição 64 da proteína. Foi construído um mutante nulo do gene SpdR e este foi testado quanto à resistência a estresse oxidativo causado por H2O2 e viabilidade em fase estacionária; o mutante não apresentou diferença na resposta em relação à linhagem selvagem. / CspD is one of the four cold shock proteins of Caulobacter crescentus being larger than the other ones by possessing two cold shock domains, and its cellular role is still unknown. The aim of this work was to identify and characterize factors in cis and in trans involved in regulation of cspD expression in C. crescentus. In this work we determined that cspD expression is induced by glucose starvation but not by nitrogen starvation. This induction is dependent on the signalling molecule ppGpp, indicating that it is involved in carbon starvation signaling. A response regulator of a two-component system (SpdR) was identified as responsible for stationary phase induction, being phosphorylated by the cognate histidine kinase SpdS. EMSA and DNAseI footprinting assays showed that the SpdR protein binds to an inverted repeat at the cspD promoter, and that this binding is dependent on phosphorylation at the aspartate residue at position 64. A null spdR mutant strain was constructed and its resistance to H2O2 and stationary phase viability were determined, however the mutant showed no difference in response when compared to the wild type.

Rickettsia rickettsii é o agente etiológico da febre maculosa das Montanhas Rochosas, a mais letal dentre as riquetsioses que acometem o homem. A principal espécie de carrapato-vetor de R. rickettsii na área metropolitana da cidade de São Paulo é Amblyomma aureolatum. Quando um carrapato em jejum no solo encontra um hospedeiro vertebrado e inicia a alimentação sanguínea, R. rickettsii é exposta a uma elevação da temperatura e aos componentes da refeição sanguínea. Ambos os estímulos foram previamente associados à reativação da virulência da bactéria em carrapatos, porém, os fatores responsáveis por essa conversão do fenótipo avirulento em virulento não foram completamente elucidados até o momento. Dessa forma, o presente trabalho teve como objetivo determinar os efeitos desses dois estímulos ambientais sobre o perfil de expressão gênica dessa bactéria durante a infecção de A. aureolatum. Inicialmente, estabelecemos um sistema de propagação de riquétsias para obter material genético suficiente para a padronização dos procedimentos de preparação de amostras para os experimentos de microarranjos. Para tal, estabelecemos, pela primeira vez, a infecção de uma cepa patogênica brasileira de R. rickettsii em células embrionárias do carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus (BME26). Através da utilização de microarranjos de oligonucleotídeos customizados, analisamos os efeitos da elevação da temperatura em 10°C e da alimentação sanguínea sobre o perfil transcricional da bactéria infectando o conjunto de órgãos de fêmeas de A. aureolatum. Esse é o primeiro estudo da expressão gênica global de uma bactéria do gênero Rickettsia infectando um carrapato-vetor natural. Apesar de ambos os estímulos terem promovido um aumento da carga bacteriana, a alimentação sanguínea teve um efeito maior, também modulando cinco vezes mais genes que a elevação da temperatura. Dentre os genes induzidos, alguns codificam fatores de virulência, tais como componentes do sistema de secreção do tipo IV (T4SS), sugerindo que esse importante sistema de secreção bacteriano seja utilizado para secretar efetores durante a ingestão de sangue pelo carrapato. Através de análises in silico de domínios conservados das proteínas hipotéticas, identificamos outros componentes do T4SS de R. rickettsii ainda não descritos na literatura. A alimentação sanguínea também induziu a expressão de genes codificadores de enzimas antioxidantes, o que pode corresponder a uma tentativa de R. rickettsii de se proteger contra os efeitos deletérios de radicais livres produzidos pelos carrapatos alimentados. Por fim, analisamos a transcrição de uma seleção de genes de R. rickettsii em glândulas salivares e intestinos de carrapatos machos e fêmeas através de RT-qPCR microfluídica. Os resultados mostraram que a elevação da temperatura e a alimentação modulam um conjunto específico de genes em cada tecido analisado, tendo sido possível definirem-se assinaturas transcricionais tecido-específicas. Os genes diferencialmente expressos identificados neste estudo devem ser caracterizados funcionalmente, podendo ser considerados como futuros alvos para o desenvolvimento de vacinas. / Rickettsia rickettsii is the causative agent of Rocky Mountain Spotted Fever, which is the most lethal spotted fever rickettsiosis that affects humans. The main tick species that transmits R. rickettsii in the metropolitan area of São Paulos city is Amblyomma aureolatum. When an infected and starving tick begins blood feeding from a vertebrate host, R. rickettsii is exposed to a temperature elevation and to components in the blood meal. These two environmental stimuli have been previously associated with the reactivation of rickettsial virulence in ticks, but the factors responsible for this phenotype conversion have not been completely elucidated. The main aim of the present work was to determine the effects of these two environmental stimuli on the R. rickettsii transcriptional profile during A. aureolatum infection. We initially established an effective system for rickettsia propagation to generate a substantial quantity of genetic material for microarray standardization. For that, for the first time, we established an in vitro infection of the virulent Brazilian R. rickettsii strain in the BME26 tick embryonic cell line from Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Using customized oligonucleotide microarrays, we analyzed the effects of a 10°C temperature elevation and a blood meal on the transcriptional profile of R. rickettsii infecting whole organs of Amblyomma aureolatum female ticks. This is the first bacterial transcriptome study of the Rickettsia genus when infecting a natural tick vector. Although both stimuli significantly increased the bacterial load, blood feeding had a greater effect, also modulating five-fold more genes than the temperature upshift. Among the genes induced by blood-feeding, some encode virulence factors, such as Type IV Secretion System (T4SS) components, suggesting that this important bacterial transport system is used to secrete effectors during the acquisition of the blood meal by the tick. Using an in silico conserved domain analysis of hypothetical proteins, we identified additional T4SS components of R. rickettsii that were never previously described. Blood-feeding also up-regulated the expression of antioxidant enzymes, which might correspond to an attempt by R. rickettsii to protect itself against the deleterious effects of free radicals produced by fed ticks. Finally, we studied the transcriptional profile of selected genes of R. rickettsii on the salivary glands and midguts of male and female ticks by microfluidic RT-qPCR. Results showed that temperature upshift and blood feeding modulate specific sets of genes in each tissue, allowing for the establishment of a tissue-specific transcriptional signature. The modulated genes identified in this study require further functional analysis and may have potential as future targets for vaccine development.

Chromobacterium violaceum tem sido muito estudada a fim de explorar seu potencial biotecnológico, especialmente, a violaceína. Este trabalho teve por objetivo estabelecer estratégias para obtenção de mutantes. Linhagens mutantes foram obtidas por transposição com o mini-Tn5 e por recombinação homóloga (mutantes vioB e ubiB). O vioB em fase estacionária demonstrou ser mais resistente a UVC e aos sais metálicos FeCl2 e CdCl2. Com H2O2 não houve uma diferença significativa entre as taxas de sobrevivência exibidas pela linhagem vioB. Análise por microscopia demonstrou maior agregação das células do mutante vioB e uma maior formação de biofilme. O mutante ubiB apresentou crescimento deficiente na presença de 0.4 mg/mL de fenol. / Chromobacterium violaceum has been extensively studied for its biotechnological potential, especially what concerns violacein. In this work we have as goal to establish strategies for obtaining mutant strains. Mutant strains were obtained by transposition using mini-Tn5 and employing homologous recombination (mutant vioB and ubiB). vioB was shown to be more resistant in stationary phase to UVC and the metallic salts FeCl2 and CdCl2. With H2O2, there was no significant difference in survival rates exhibited by vioB. Microscopy analyses demonstrated a higher cell aggregation by the vioB mutant and a higher formation of biofilm. ubiB mutant presented growth defects in presence 0.4 mg/mL phenol.