Introdução: Durante as últimas décadas, a utilização de métodos moleculares como Hibridizacão in situ por fluorescência (FISH) e Hibridização Genômica Comparativa (array-CGH) mudou dramaticamente a perspectiva em relação à detecção de rearranjos genômicos submicroscópicos. O número de doenças identificadas como causada por microdeleções/microduplicações cromossômicas aumentou rapidamente, trazendo um papel crucial para a citogenética no diagnóstico destas condições. Objetivo: O objetivo deste estudo foi identificar e caracterizar microdeleções cromossômicas associadas a síndromes de malformações em um laboratório de citogenética de referência de um hospital público do sul do Brasil. Métodos: Estudo retrospectivo e prospectivo, em uma série consecutiva de amostras. O estudo foi baseado em registros hospitalares e laboratoriais de amostras de uma coorte de pacientes com suspeita clínica de microdeleção cromossômica. Foram selecionadas amostras de indivíduos em que o diagnóstico clínico proposto incluia uma suspeita de rearranjo nos cromossomos 4p16.3, 5p15.2, 5q35, 7q11.23, 8q24.12, 15q11-q12, 16p13.3, 17p13.3, 17p11. 2,2 e 22q11 que foram analisados por hibridização in situ por fluorescência (FISH). Em 11 amostras com microdeleções, hibridização genômica comparativa (array-CGH) foi realizada. Resultados: Um total de 504 amostras foram avaliadas, sendo as suspeitas mais comuns a deleção 22q11.2 (29,5%), a síndrome de Prader-Willi (21,6%), a síndrome de Williams-Beuren (15%) e da síndrome de Angelman (13 %). Em 120 deles (23,8%) desequilíbrios cromossómicas relacionadas com o diagnóstico clínico foram encontrados. A del7q11.23 foi a alteração mais frequente (8,5%) detectada, seguida por del22q11.2 (5,3%) e del15q11-q12 (4,5%). Conclusões: Nossos achados reforçam à estratégia de que um teste de citogenética molecular sensível associada com uma avaliação clínico qualificado são cruciais para a detecção e caracterização precisa de deleções cromossômicas submicroscópicas. Além disso, nosso estudo enfatiza a necessidade de educação continuada para o desenvolvimento e utilização de novas tecnologias para o diagnóstico citogenético, as quais, em nossa experiência, puderam ser introduzidas com sucesso em um hospital público do sul do Brasil. / Background: During the past decades, the widespread use of FISH and microarray-based technologies dramatically changed our perspective regarding detection of submicroscopic genomic rearrangements. The number of diseases identified as caused by chromosomal microdeletions/microduplications increased quickly, bringing a new and crucial role for cytogenetics in the diagnosis of these conditions. Objective: The purpose of this study was to identify and chraracterize chromosomal microdeletions associated with malformation syndromes in a reference cytogenetics laboratory from a public hospital of Southern Brazil. Methods: Using retrospective and prospective approaches, we evaluated a consecutive series of samples. The study was based in hospital and laboratorial records of samples from a cohort of subjects with clinical suspicion of a chromosomal microdeletion. We selected samples from subjects in whom a clinical diagnosis was proposed, which included deletion of chromosomes 4p16.3, 5p15.2, 5q35, 7q11.23, 8q24.12, 15q11-q12, 16p13.3, 17p13.3, 17p11.2,2 and 22q11 identified by fluorescence in situ hybridization (FISH) analysis. In 11 samples with microdeletions, array-based comparative genomic hybridization (array-CGH) was performed. Results: A total of 504 samples were evaluated, being the most common suspicions the 22q11.2 deletion (29.5%), the Prader-Willi syndrome (21.6%), the Williams-Beuren syndrome (15%) and the Angelman syndrome (13%). In 120 of them (23.8%) chromosomal imbalances related to the clinical diagnosis were found. The deletion 7q11.23 was the most frequently finding (8.5%), followed by del22q11.2 (5.3%) and del15q11-q12 (4.5%). Conclusions: Our findings provide support to the idea that a sensitive molecular cytogenetic test associated with a qualified clinical evaluation are crucial for the detection and precise characterization of submiscroscopic chromosome deletions. Additionally, our study emphasizes the need of continuing 6 education for the improvement of the cytogenetic diagnosis technology, which was successfully introduced in a public hospital of Southern Brazil.

Cana-de-açúcar é uma planta agrícola com grande importância econômica para o Brasil. Os cultivares modernos de cana-de-açúcar apresentam uma alta complexidade genômica, devido ao seu genoma ser poliploide e com número cromossômico variando entre 100-120. As plantas de cana-de-açúcar estão sujeitas ao ataque de diversos tipos de patógenos, e sua tolerância depende da ação de genes de resistência. Estes podem desencadear uma cascata de reações ou interagir diretamente com uma molécula efetora, resultando em tolerância por parte da planta à presença do patógeno. O genoma dos cultivares moderno apresentam inúmeros elementos de transposição posicionados em diferentes regiões do genoma. Devido a essa abundância, os elementos de transposição estão sendo usados como marcadores moleculares, por exemplo, RBIP (Retrotransposon-Based Insertion Polymorphism), que identifica polimorfismos baseado na inserção de elementos do tipo retrotransposons. Esta técnica é capaz de diferenciar a presença e a ausência de um elemento de transposição em uma determinada região do genoma. Para a aplicação em organismos poliploides foi desenvolvida a técnica RBIP-qPCR, permitindo dosar a presença e ausência de um elemento de transposição em um organismo poliploide. Sendo assim este trabalho tem como objetivo aplicar a técnica de RBIP-qPCR em elementos de transposição alocados adjacentes a genes de resistência a fim de, posteriormente, verificar a existência de associação entre genes de resistência e elementos de transposição. Para isso foram analisadas três famílias de genes de resistência, I2C-2, Xa21 e Pti1. Foram realizadas análises de composição genômica de cada uma das regiões, genômica comparativa entre as variedades de R570 e SP80-3280 para a região genômica que contém o gene I2C-2, além de uma análise de expressão de genes e elementos de transposição vizinhos neste loco. A partir destes estudos foi possível selecionar um elemento de transposição, scDEL 5.1, para aplicar a técnica de RBIP-qPCR. Os resultados das análises de reconhecimento do ambiente genômico determinou a escolha de um elemento para aplicação da técnica. Verificamos que na ausência de scDEL 5.1 a metodologia RBIPqPCR foi eficaz em todos os genomas testados. As análises de presença de scDEL 5.1 no loco revelaram que elementos com elevado número de cópias no genoma não são adequados para a aplicação da metodologia. / Sugarcane is an agricultural plant with great economic importance for Brazil. The modern cultivars of sugarcane present a high genomic complexity, due to their genome being polyploid and with chromosome number varying between 100-120. Sugarcane plants are targets of several types of pathogens, and their tolerance depends on the action of resistance genes. These can trigger a cascade of reactions or interact directly with an effector molecule, resulting in tolerance by the plant to the presence of the pathogen. The genome of modern cultivars presents several transposable elements allocated in different regions of the genome. Due to this abundance, transposable elements are being used as molecular markers, such as RBIP (Retrotransposon-Based Insertion Polymorphism), which identifies polymorphisms based on the insertion of retrotransposon. This technique is able to differentiate the presence and absence of a transposable element in a particular region of the genome. For the application in polyploid organisms the RBIP-qPCR technique was developed, allowing measuring the presence and absence of a transposable element in a polyploid organism. Therefore, the objective of this work is to apply the RBIP-qPCR technique to on a transposable element localized adjacent to resistance genes in order to, latterly, verify the existence of association between resistance genes and transposable elements. For this, three families of resistance genes, I2C-2, Xa21 and Pti1 were analyzed. Genomic composition analyzes of each region, comparative genomics between the R570 and SP80-3280 varieties for the genomic region containing the I2C-2 gene, as well as an analysis of genes and elements expression neighbors at this locus were performed. From these studies it was possible to select a transposition element, scDEL 5.1, to apply the RBIP-qPCR technique. The results of the genomic environment recognition analysis determined the choice the transposable element for the application of the technique. We verified that in the absence of scDEL 5.1 the RBIP-qPCR methodology was effective in all genomes tested. Analysis of the presence of scDEL 5.1 in the locus revealed that elements with high copy number in the genome are not suitable for the application of the methodology.

A tuberculose é uma doença infectocontagiosa causada por bactérias do complexo Mycobacterium tuberculosis (MTBC) que afeta humanos e/ou animais. Membros desse complexo evoluíram clonalmente e possuem grande similaridade genômica, diferenciando-se por polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) e regiões de diferença (RDs). Dentre os patógenos da tuberculose em animais, Mycobacterium bovis, causador da tuberculose bovina, é o membro do MTBC de maior importância global. Desta maneira, o presente estudo tem por objetivo o sequenciamento, a anotação e a análise da estirpe brasileira SP38 de M. bovis, seguido da genômica comparativa desse com outros genomas de M. bovis depositados no GenBank. Mycobacterium bovis SP38 apresenta um genoma tradicional de micobactéria tuberculosa, sendo esse único, circular com 4.347.646 pb, alto conteúdo de GC (65,6%) e 4.216 genes, incluindo 154 pseudogenes, 3 genes de rRNA (RNA ribossomal), 45 de tRNA (RNA transportador), 2 de ncRNA (RNA não codificante), 1 tmRNA (RNA transferência-mensageiro) e 4.011 sequências de DNA codificante (CDSs) (NZ_CP015773.1). Dentre as CDSs, a maioria (2.805 - 69,93%) foi anotado com função e 1.206 (30,07%) como hipotéticos. Para a genômica comparativa, os 31 genomas completos ou em drafts de M. bovis depositados no GenBank, 32 genomas de Mycobacterium bovis BCG e 23 genomas de Mycobacterium tuberculosis foram selecionados. Análises in silico dos padrões de RD resultaram na exclusão de três genomas anotados equivocadamente como M. bovis virulentos. A análise de genes ortólogos sugere que M. bovis está sob processo de decay genômico. A quantificação de sítios polimórficos indica uma maior variabilidade genética em números totais (8.335 em M. tuberculosis, 3.448 em M. bovis virulentos, e 1.088 em M. bovis BCGs) e comparações par-a-par (p ≤0,05) de M. tuberculosis em relação a M. bovis virulentos e BCGs, indicando uma maior pressão evolutiva sob M. tuberculosis, contrastando com o fato de que M. bovis é capaz de infectar um maior número de espécies hospedeiras que M. tuberculosis. A maioria desses sítios polimórficos estão localizados em CDSs hipotéticos (31,7% - 51,3%), sendo associados a família gênica PE/PPE, e apresentam uma proporção de mutações não sinônimas crescentes pela ordem M. bovis BCG, M. bovis virulentos e M. tuberculosis (48,90%, 51,92% e 59,52%, respectivamente). Essa menor proporção de mutações não sinônimas e a categorização funcional dissimilar entre CDSs contendo sítios polimórficos, indica que M. bovis BCG está sujeito a diferentes pressões seletivas quando comparado a M. bovis virulentos e M. tuberculosis. Por fim, a análise filogenética baseada em sítios polimórficos indica agrupamentos filogenéticos de M. bovis suportados pela classificação dos Complexos Clonais (CCs) e não por hospedeiros de origem dos isolados, confirmando que sítios polimórficos podem ser utilizados para classificação filogenética de linhagens genéticas desta espécie bacteriana. Além do mais, 2/28 (7,14%) genomas de M. bovis não puderam ser classificados nos CCs atualmente descritos, sugerindo a existência de complexos ainda não determinados. Este estudo representa o primeiro genoma de uma estirpe nacional de M. bovis a ser completamente sequenciado e a primeira análise de genômica comparativa de genomas desta espécie bacteriana. / Tuberculosis is an infectious disease caused by bacteria of the Mycobacterium tuberculosisComplex (MTBC) that affects human beings and/or animals. Members of this complex clonally evolved and have high genomic similarity, differentiated by single nucleotide polymorphisms (SNPs) and regions of difference (RDs). Among the animal tuberculosis pathogens, Mycobacterium bovis, the causative agent of bovine tuberculosis, is the MTBC member of greatest global importance. Therefore, the aim of the present study is to sequence, assemble and annotate the genome of the Brazilian strain SP38 of M. bovis, followed by the comparative genomics with other M. bovis genomes available in GenBank. Mycobacterium bovis SP38 has a traditional mycobacteria genome. It has a single and circular chromosome with 4,347,646 bp, high GC content (65.6%), and 4,216 genes, including 154 pseudogenes, 3 rRNA genes (ribosomal RNA), 45 tRNA (transfer RNA), 2 ncRNA (non-coding RNA), 1 tmRNA (transfer-messenger RNA), and 4,011 coding DNA sequences (CDSs) (NZ_CP015773.1). The majority of CDSs (2,805 - 69,93%) was annotated with function and 1,206 (30,07%) are hypothetical. For the comparative genomics analyses, the 31 genomes (complete and drafts) of M. bovis available in GenBank, 32 Mycobacterium bovis BCG and, 23 of Mycobacterium tuberculosis were chosen. In silico analysis of the RDs patterns resulted in the exclusion of three genomes, mistakenly annotated as virulent M. bovis. Orthologous gene analysis suggests that strains of M. bovis are under genomic decay. The quantification of polymorphic sites indicates the greater variability in absolute numbers (8,335 in M. tuberculosis, 3,448 in virulent M. bovis, and 1,088 in M. bovis BCG) and in pairwise comparisons (p≤0,05) of M. tuberculosis compared to virulent M. bovis and M. bovis BCG, suggesting that M. tuberculosis is under high evolutionary pressure. This is in contrast to the fact that M. bovis is capable of infecting a higher number of host species than M. tuberculosis. Most of these polymorphic sites are located in hypothetical CDSs (31.7% - 52.3%), being associated with PE/PPE family, and demonstrating a nonsynonymous mutations proportion of the following increasing order: M. bovis BCG, virulent M. bovis and M. tuberculosis (48.90%, 51.92% and 59.52%, respectively). This lower proportion of nonsynonymous mutations and the dissimilar functional categorization of CDSs with polymorphic sites indicates that M. bovis BCG is subjected to different selective pressure when compared to virulent M. bovis and M. tuberculosis. Finally, the phylogenetic analysis based on polymorphic sites indicates that the phylogenetic grouping of M. bovis is supported by Clonal Complexes (CCs), and not by the host of M. bovis isolates, confirming that polymorphic sites can be used for phylogenetic classification of genetic lineages of this bacterial species. Furthermore, 2/28 (7.14%) genomes of M. bovis could not be classified in the currently described CCs, suggesting the existence of complexes yet to be determined. This study represents the first genome of a Brazilian strain of M. bovis to be completely sequenced and the first comparative genomic analysis of the genomes of this bacterial species.

Submitted by Cássio da Cruz Nogueira (cassionogueirakk@gmail.com) on 2017-08-30T12:00:55Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_AlteracoesGenomicasQuantitativas.pdf: 6280298 bytes, checksum: b16a105099c01920d2f9f9a43d028192 (MD5) / Approved for entry into archive by Irvana Coutinho (irvana@ufpa.br) on 2017-08-30T14:59:52Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_AlteracoesGenomicasQuantitativas.pdf: 6280298 bytes, checksum: b16a105099c01920d2f9f9a43d028192 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-30T14:59:52Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_AlteracoesGenomicasQuantitativas.pdf: 6280298 bytes, checksum: b16a105099c01920d2f9f9a43d028192 (MD5) Previous issue date: 2016-05-31 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / O câncer gástrico é o quinto tipo tumoral mais frequente e a terceira maior causa de morte por câncer no mundo. A despeito do progresso no tratamento do câncer gástrico avançado, o prognóstico do paciente permanece muito ruim, principalmente em decorrência do diagnóstico tardio. Esse paradigma implica a necessidade de pesquisar e identificar biomarcadores moleculares para o diagnóstico precoce, bem como para o monitoramento da doença, contribuindo ainda para o desenenvolvimento de novas abordagens terapêuticas. Desta forma, o presente estudo objetivou investigar alterações no número de cópias de DNA no adenocarcnoma gástrico através da técnica de Hibridização Genômica Comparativa em array (aCGH) e selecionar genes para a validação em um maior número de amostras, utilizando PCR em tempo real, no intuito de encontrar potenciais biomarcadores moleculares para esse tipo tumoral. Através dos resultados do aCGH, foram identificadas 22 alterações nunca correlacionadas com a carcinogênese gástrica, bem como diversas alterações associadas significativamente com o extravasamento da serosa e com pacientes com idade igual ou inferior a 50 anos. Levando em consideração que a maioria dos genes observados alterados nunca foram descritos como envolvidos no processo de carcinogênese gástrica, foram selecionados para validação genes cujas alterações apresentaram alguma consistência com trabalhos já publicados na literatura em outros tipos de câncer. Assim, foram investigadas por PCR em tempo real as amplificações dos genes RTEL1, B4GALT5, TRPV2 e ABCA13. Os resultados demonstraram uma frequência elevada de amplificação desses genes, porém as associações estatísticas com os dados clínicopatológicos dos genes TRPV2, com pacientes jovens, e ABCA13, com o extravasamento da serosa, observadas pelo aCGH, não foram confirmadas. Por outro lado, novas associações significativas foram observadas, tais quais a amplificação recorrente do gene RTEL1, que foi associada com idade avançada e com o tipo intestinal do adenocarcinoma gástrico; a amplificação recorrente do gene B4GALT5, que foi associada com o tipo intestinal do adenocarcinoma gástrico; a amplificação recorrente do gene TRPV2, que foi associada com metástase linfonodal; a amplificação recorrente do gene ABCA13, que foi associada com metástase linfonodal e com pacientes do gênero masculino e a co-amplificação dos genes RTEL1 e ABCA13, que foi associada com estadiamento avançado. Desta forma, o aCGH mostrou-se uma ferramenta útil para a investigação de novos genes associados com a carcinogênese. Ademais, a amplificação dos genes RTEL1, B4GALT5, TRPV2 e ABCA13 parecem ter um papel importante no desenvolvimento e na progressão do câncer gástrico, podendo ser considerados potenciais marcadores desta doença. / Gastric cancer is the fifth most frequent type of cancer and the third cause of cancer mortality worldwide. Despite progression in treatment of advanced gastric cancer, the prognosis of patients remains poor, in part due to the low rate of diagnosis during its early stages. This paradigm implies the necessity to search and identify molecular biomarkers for early gastric cancer diagnosis, as well as for disease monitoring, thus contributing to the development of new therapeutic approaches. Therefore, this study aimed at investigating copy number variations in gastric adenocarcnoma through array Comparative Genomic Hybridization (aCGH) technique and selecting genes for validation in a larger sample size by using real-time PCR, in order to find potential molecular biomarkers for this tumor type. The aCGH results demonstrated 22 gene alterations never described before as correlated with gastric carinogenesis, as well as several alterations significantly associated with serosal extravasation and patients aged less than or equal 50 years. Given that most of the genes had never been described in gastric cancer, we selected for validation four gene alterations that showed some consistency with studies published in the literature for other types of cancer. Thus, we investigated by real-time PCR the amplifications of RTEL1, B4GALT5, TRPV2 and ABCA13 genes. The results showed a high frequency of amplification of these genes, but the statistical associations with clinicopathological data of TRPV2 gene with younger patients and ABCA13, with serosal extravasation, observed by aCGH, were not confirmed. Moreover, new significant associations were demonstrated, including RTEL1 recurrent amplification associated with advanced age and intestinal type of gastric adenocarcinoma; B4GALT5 recurrent amplification associated with intestinal type of gastric adenocarcinoma; TRPV2 recurrent amplification associated with lymph node metastasis; ABCA13 recurrent amplification associated with lymph node metastasis and male patients and co-amplification of RTEL1 and ABCA13 associated with advanced staging. Therefore, the aCGH proved to be a useful tool for the investigating new genes associated with carcinogenesis. Additionally, recurrent amplification of RTEL1, B4GALT5, TRPV2 and ABCA13 seem to have an important role in the development and progression of gastric cancer and can be considered as potential biomarkers for this disease.

Submitted by Amanda Carolina Paulino de Oliveira (amanda@posgrad.fcav.unesp.br) on 2018-07-30T23:45:45Z No. of bitstreams: 1 Dissertação final - ACPO - Versão online.pdf: 8789441 bytes, checksum: a845ac98a1435e414423acdc29c30ff5 (MD5) / Approved for entry into archive by Karina Gimenes Fernandes null (karinagi@fcav.unesp.br) on 2018-07-31T11:04:06Z (GMT) No. of bitstreams: 1 oliveira_acp_me_iabo.pdf: 8789441 bytes, checksum: a845ac98a1435e414423acdc29c30ff5 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-07-31T11:04:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 oliveira_acp_me_iabo.pdf: 8789441 bytes, checksum: a845ac98a1435e414423acdc29c30ff5 (MD5) Previous issue date: 2018-07-04 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Xanthomonas citri subsp. citri 306 (XccA) é o agente causal do cancro cítrico (CC), doença endêmica que afeta a citricultura. Durante a interação patógeno-hospedeiro o sistema de secreção tipo três (SST3) codificado pela XccA age na translocação de efetores e no estabelecimento da doença. A montagem do aparato de SST3 depende da síntese, remodelagem e degradação da parede celular bacteriana, sendo este processo realizado pela ação enzimática de transglicosilases líticas de mureína (LTs). XccA codifica diversas LTs, porém, pouco é conhecido sobre a diversidade de famílias e relação com a virulência. Dentre as LTs com provável relação com a virulência, duas ORFs parálogas presentes no cromossomo e plasmídeo pXAC64, respectivamente; são genes passageiros do TnXax1, um transposon da família Tn3, relacionado a evolução e emergência da patogenicidade nas Xanthomonadales. Portanto, este estudo objetivou elucidar o provável papel e diversidade das LTs presentes no genoma de XccA, caracterizando funcionalmente as LTs presentes em TnXax1 pela técnica de mutação sítio dirigida. Foram identificadas no genoma de XccA 13 LTs, sendo 12 pertencentes às famílias: 1A, 1B, 1C, 1D, 1F, 1G, 3A, 3B (2 cópias), 5A e 6A, e uma não classificada. A LT não classificada, é exclusiva do gênero Xanthomonas e relacionada à família 3B, porém contém um domínio adicional relacionado ao metabolismo de carboidratos. As LTs classificadas em famílias apresentam provável função relacionada com a remodelagem da parede celular para inserção de sistemas de secreção tipo 3, 4 e 6, inserção de flagelo, divisão celular, reciclagem da parede celular e degradação e controle da produção do peptidoglicano. As LTs do TnXax1 pertencem a família 3B, não são essenciais para XccA e desenvolvimento do CC, porém estão relacionadas ao aumento da virulência, diminuição da formação de biofilme, agregação e aumento na produção de goma xantana, corroborando o papel do TnXax1 como agente propagador da patogenicidade e virulência em Xanthomonadales. Em resumo, os resultados lançam novos conhecimentos frente ao papel das LTs com o metabolismo do peptidoglicano e relação com os mecanismos de transferência lateral, virulência e patogenicidade de XccA. / Xanthomonas citri subsp. citri 306 (XccA) is a causal agent of type A citrus canker (CC), one of the most devastating citriculture diseases. Type 3 Secretion Systems (T3SS) play a fundamental role in XccA pathogenicity. T3SS components are embedded in the bacterial inner and outer membrane and act as a channel for injection of effector proteins directly into the plant host cell cytosol. T3SS assembly and installation relies on bacterial cell wall synthesis, remodeling and degradation. Murein lytic transglycosylases (LT) are important in this process and are responsible for peptidoglycan cleavage and its remodeling. Information about the XccA LT arsenal is scarce: little is known about family diversity, their exact role and their connection to virulence in this bacterium. Among the LTs with probable relation to virulence, two paralogue ORFs (one in chromosome, one in pXAC64 plasmid) are passenger genes of the Tn3 family transposon TnXax1, known to play a significant role for evolution and emergence of pathogenicity in Xanthomonadales. This study addresses LT diversity in the XccA genome and examines the role of plasmid and chromosomal TnXax1 LT passenger genes using site-directed deletion mutagenesis and functional characterization. We identified 13 XccA LTs: 12 belong to families 1A, 1B, 1C, 1D (2 copies), 1F, 1G, 3A, 3B (2 copies), 5A, 6A and one which is non-categorized. This noncategorized gene, is exclusive to the Xanthomonas genus and related to the 3B family but contains an additional domain linked to carbohydrate metabolism, whilst the other catalyzes peptidoglycan biosynthesis, and is widely distributed in gammaproteobacteria. The categorized LTs are probably involved in cell wall remodeling to allow insertion of type 3, 4 and 6 secretion systems, flagellum assembly, division and recycling of cell wall and degradation and control of peptidoglycan production. The TnXax1 passenger LTs (3B family) are not essential to XccA and CC development but are implicated in virulence, biofilm production and aggregation decrease and xanthan gum production increase, corroborating the role of TnXax1 transposon as a virulence and pathogenicity propagating agent in XccA. These findings also suggest that LTs acquisition by horizontal gene transfer mediated by TnXax1 improved bacterial fitness, bringing adaptive advantages to the plant-pathogen interaction process. / 33004102070P6

Made available in DSpace on 2016-03-18T12:15:46Z (GMT). No. of bitstreams: 2 marcia_bezerra_ioc_dout_2012.pdf: 3641805 bytes, checksum: 551d726828aba255caeef4c323eae9ee (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015-04-14 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Esta tese descreve o projeto conceitual do sistema de banco de dados ProteinWorldDB (PWDB). Um ponto importante da proposta do PWDB é permitir a construção de consultas e procedimentos no domínio da genômica comparativa sem a necessidade de comparação de sequências. Além disso, o PCG comparou milhões de sequências de proteína, incluindo o conjunto proteico total de centenas de genomas completos, utilizando programação dinâmica, e não um método heurístico, para os cálculos de similaridade. A estratégia do PCG, assim como a genômica, está fundamentada no conhecimento de que sequências biológicas por si só são pouco informativas; elas precisam ser analisadas a partir de um enfoque comparativo para a inferência de homologia. A comparação de sequências de diferentes organismos introduz uma perspectiva evolutiva ao processo, e o estudo comparativo de genomas completos pode ampliar a escala do conhecimento de um único processo biológico para o de sistemas biológicos complexos em células e organismos. Para responder eficientemente questões dessa natureza, o esquema conceitual apresentado associa bases de dados biológicos de referência aos índices de similaridade já pré-calculados e armazenados pelo PCG Utilizando um formato gráfico de fácil compreensão para representar conceitos e relacionamentos (diagrama ER), o esquema foi proposto para facilitar o planejamento de consultas e procedimentos por pesquisadores da área de genômica (sem conhecimento de linguagens de bancos de dados), assim como guiar o desenvolvimento e a implementação física do PWDB por profissionais da área de computação. Alguns exemplos são apresentados com o objetivo de demonstrar a utilização do esquema conceitual para a especificação de consultas e procedimentos, mesmo antes da existência de um esquema lógico. O esquema pode ser facilmente estendido. Módulos anexos podem ser inseridos/removidos para incluir outros projetos, baseados em comparação de sequências de proteína, que se beneficiem das informações fornecidas pelo módulo central do esquema e novas bases de dados, específicas de diferentes áreas (-ômicas, por exemplo), podem ser integradas ao esquema / This thesis describes the conceptua l design of the database system ProteinWorldDB (PWDB) . An important point of the PWDB p roposal is to allow the construction of queries and procedures in the field of comparative genomics without the need for sequence comparison . Moreover , the PCG compared millions of protein sequences, including the entire set of proteins from hundreds of complete genomes using dynamic programming , rather than a heuristic method , for calculating similarity PCG‘s strategy, like that of genomic studies in general, is grounded in the knowledge that biological sequences alone are uninformative. They need to be analyzed from a comparative approach to infer homology. The comparison of sequences from different organisms introduces an evolutionary perspective to the process and the comparative study of complete genomes can expand our knowledge from a single biological process all the way to complex biological systems in cells and organisms. To efficiently answer questions of this nature, the conceptual schema links selected internati onal reference biological databases to similarity indexes already precomputed and stored by the PCG . By using an easily understandable graphic format to represent concepts and relationships (ER diagram), the schema was proposed to help the design of querie s and procedures by genomic researchers (who may not have knowledge of database languages) as well as to guide the development and physical implementation of the system by developers. Some e xamples are presented to demonstrate the use of the conceptual sch ema for specifying queries and procedures, even before the existence of a logical schema. The schema can be easily extended. Additional modules can be inserted/removed to include other protein sequences comparisons projects that may benefit from the inform ation provided by the schema ́s central module. Likewise, new databases specific to different areas ( - omics, for example) can be cross - referenced to the schema / This thesis describes the conceptua l design of the database system ProteinWorldDB (PWDB) . An important point of the PWDB p roposal is to allow the construction of queries and procedures in the field of comparative genomics without the need for sequence comparison . Moreover , the PCG compared millions of protein sequences, including the entire set of proteins from hundreds of complete genomes using dynamic programming , rather than a heuristic method , for calculating similarity PCG‘s strategy, like that of genomic studies in general, is grounded in the knowledge that biological sequences alone are uninformative. They need to be analyzed from a comparative approach to infer homology. The comparison of sequences from different organisms introduces an evolutionary perspective to the process and the comparative study of complete genomes can expand our knowledge from a single biological process all the way to complex biological systems in cells and organisms. To efficiently answer questions of this nature, the conceptual schema links selected internati onal reference biological databases to similarity indexes already precomputed and stored by the PCG . By using an easily understandable graphic format to represent concepts and relationships (ER diagram), the schema was proposed to help the design of querie s and procedures by genomic researchers (who may not have knowledge of database languages) as well as to guide the development and physical implementation of the system by developers. Some e xamples are presented to demonstrate the use of the conceptual sch ema for specifying queries and procedures, even before the existence of a logical schema. The schema can be easily extended. Additional modules can be inserted/removed to include other protein sequences comparisons projects that may benefit from the inform ation provided by the schema ́s central module. Likewise, new databases specific to different areas ( - omics, for example) can be cross - referenced to the schema

Introdução: Durante as últimas décadas, a utilização de métodos moleculares como Hibridizacão in situ por fluorescência (FISH) e Hibridização Genômica Comparativa (array-CGH) mudou dramaticamente a perspectiva em relação à detecção de rearranjos genômicos submicroscópicos. O número de doenças identificadas como causada por microdeleções/microduplicações cromossômicas aumentou rapidamente, trazendo um papel crucial para a citogenética no diagnóstico destas condições. Objetivo: O objetivo deste estudo foi identificar e caracterizar microdeleções cromossômicas associadas a síndromes de malformações em um laboratório de citogenética de referência de um hospital público do sul do Brasil. Métodos: Estudo retrospectivo e prospectivo, em uma série consecutiva de amostras. O estudo foi baseado em registros hospitalares e laboratoriais de amostras de uma coorte de pacientes com suspeita clínica de microdeleção cromossômica. Foram selecionadas amostras de indivíduos em que o diagnóstico clínico proposto incluia uma suspeita de rearranjo nos cromossomos 4p16.3, 5p15.2, 5q35, 7q11.23, 8q24.12, 15q11-q12, 16p13.3, 17p13.3, 17p11. 2,2 e 22q11 que foram analisados por hibridização in situ por fluorescência (FISH). Em 11 amostras com microdeleções, hibridização genômica comparativa (array-CGH) foi realizada. Resultados: Um total de 504 amostras foram avaliadas, sendo as suspeitas mais comuns a deleção 22q11.2 (29,5%), a síndrome de Prader-Willi (21,6%), a síndrome de Williams-Beuren (15%) e da síndrome de Angelman (13 %). Em 120 deles (23,8%) desequilíbrios cromossómicas relacionadas com o diagnóstico clínico foram encontrados. A del7q11.23 foi a alteração mais frequente (8,5%) detectada, seguida por del22q11.2 (5,3%) e del15q11-q12 (4,5%). Conclusões: Nossos achados reforçam à estratégia de que um teste de citogenética molecular sensível associada com uma avaliação clínico qualificado são cruciais para a detecção e caracterização precisa de deleções cromossômicas submicroscópicas. Além disso, nosso estudo enfatiza a necessidade de educação continuada para o desenvolvimento e utilização de novas tecnologias para o diagnóstico citogenético, as quais, em nossa experiência, puderam ser introduzidas com sucesso em um hospital público do sul do Brasil. / Background: During the past decades, the widespread use of FISH and microarray-based technologies dramatically changed our perspective regarding detection of submicroscopic genomic rearrangements. The number of diseases identified as caused by chromosomal microdeletions/microduplications increased quickly, bringing a new and crucial role for cytogenetics in the diagnosis of these conditions. Objective: The purpose of this study was to identify and chraracterize chromosomal microdeletions associated with malformation syndromes in a reference cytogenetics laboratory from a public hospital of Southern Brazil. Methods: Using retrospective and prospective approaches, we evaluated a consecutive series of samples. The study was based in hospital and laboratorial records of samples from a cohort of subjects with clinical suspicion of a chromosomal microdeletion. We selected samples from subjects in whom a clinical diagnosis was proposed, which included deletion of chromosomes 4p16.3, 5p15.2, 5q35, 7q11.23, 8q24.12, 15q11-q12, 16p13.3, 17p13.3, 17p11.2,2 and 22q11 identified by fluorescence in situ hybridization (FISH) analysis. In 11 samples with microdeletions, array-based comparative genomic hybridization (array-CGH) was performed. Results: A total of 504 samples were evaluated, being the most common suspicions the 22q11.2 deletion (29.5%), the Prader-Willi syndrome (21.6%), the Williams-Beuren syndrome (15%) and the Angelman syndrome (13%). In 120 of them (23.8%) chromosomal imbalances related to the clinical diagnosis were found. The deletion 7q11.23 was the most frequently finding (8.5%), followed by del22q11.2 (5.3%) and del15q11-q12 (4.5%). Conclusions: Our findings provide support to the idea that a sensitive molecular cytogenetic test associated with a qualified clinical evaluation are crucial for the detection and precise characterization of submiscroscopic chromosome deletions. Additionally, our study emphasizes the need of continuing 6 education for the improvement of the cytogenetic diagnosis technology, which was successfully introduced in a public hospital of Southern Brazil.

Introdução: Durante as últimas décadas, a utilização de métodos moleculares como Hibridizacão in situ por fluorescência (FISH) e Hibridização Genômica Comparativa (array-CGH) mudou dramaticamente a perspectiva em relação à detecção de rearranjos genômicos submicroscópicos. O número de doenças identificadas como causada por microdeleções/microduplicações cromossômicas aumentou rapidamente, trazendo um papel crucial para a citogenética no diagnóstico destas condições. Objetivo: O objetivo deste estudo foi identificar e caracterizar microdeleções cromossômicas associadas a síndromes de malformações em um laboratório de citogenética de referência de um hospital público do sul do Brasil. Métodos: Estudo retrospectivo e prospectivo, em uma série consecutiva de amostras. O estudo foi baseado em registros hospitalares e laboratoriais de amostras de uma coorte de pacientes com suspeita clínica de microdeleção cromossômica. Foram selecionadas amostras de indivíduos em que o diagnóstico clínico proposto incluia uma suspeita de rearranjo nos cromossomos 4p16.3, 5p15.2, 5q35, 7q11.23, 8q24.12, 15q11-q12, 16p13.3, 17p13.3, 17p11. 2,2 e 22q11 que foram analisados por hibridização in situ por fluorescência (FISH). Em 11 amostras com microdeleções, hibridização genômica comparativa (array-CGH) foi realizada. Resultados: Um total de 504 amostras foram avaliadas, sendo as suspeitas mais comuns a deleção 22q11.2 (29,5%), a síndrome de Prader-Willi (21,6%), a síndrome de Williams-Beuren (15%) e da síndrome de Angelman (13 %). Em 120 deles (23,8%) desequilíbrios cromossómicas relacionadas com o diagnóstico clínico foram encontrados. A del7q11.23 foi a alteração mais frequente (8,5%) detectada, seguida por del22q11.2 (5,3%) e del15q11-q12 (4,5%). Conclusões: Nossos achados reforçam à estratégia de que um teste de citogenética molecular sensível associada com uma avaliação clínico qualificado são cruciais para a detecção e caracterização precisa de deleções cromossômicas submicroscópicas. Além disso, nosso estudo enfatiza a necessidade de educação continuada para o desenvolvimento e utilização de novas tecnologias para o diagnóstico citogenético, as quais, em nossa experiência, puderam ser introduzidas com sucesso em um hospital público do sul do Brasil. / Background: During the past decades, the widespread use of FISH and microarray-based technologies dramatically changed our perspective regarding detection of submicroscopic genomic rearrangements. The number of diseases identified as caused by chromosomal microdeletions/microduplications increased quickly, bringing a new and crucial role for cytogenetics in the diagnosis of these conditions. Objective: The purpose of this study was to identify and chraracterize chromosomal microdeletions associated with malformation syndromes in a reference cytogenetics laboratory from a public hospital of Southern Brazil. Methods: Using retrospective and prospective approaches, we evaluated a consecutive series of samples. The study was based in hospital and laboratorial records of samples from a cohort of subjects with clinical suspicion of a chromosomal microdeletion. We selected samples from subjects in whom a clinical diagnosis was proposed, which included deletion of chromosomes 4p16.3, 5p15.2, 5q35, 7q11.23, 8q24.12, 15q11-q12, 16p13.3, 17p13.3, 17p11.2,2 and 22q11 identified by fluorescence in situ hybridization (FISH) analysis. In 11 samples with microdeletions, array-based comparative genomic hybridization (array-CGH) was performed. Results: A total of 504 samples were evaluated, being the most common suspicions the 22q11.2 deletion (29.5%), the Prader-Willi syndrome (21.6%), the Williams-Beuren syndrome (15%) and the Angelman syndrome (13%). In 120 of them (23.8%) chromosomal imbalances related to the clinical diagnosis were found. The deletion 7q11.23 was the most frequently finding (8.5%), followed by del22q11.2 (5.3%) and del15q11-q12 (4.5%). Conclusions: Our findings provide support to the idea that a sensitive molecular cytogenetic test associated with a qualified clinical evaluation are crucial for the detection and precise characterization of submiscroscopic chromosome deletions. Additionally, our study emphasizes the need of continuing 6 education for the improvement of the cytogenetic diagnosis technology, which was successfully introduced in a public hospital of Southern Brazil.

O cancro cítrico é uma doença que afeta diversas espécies de Citrus, cujo agente causal é Xanthomonas axonopodis pv citri (XAC). O genoma desta fitobactéria consiste de um cromossomo de ~5 Mpb e dois plasmídeos, que juntos codificam 4313 CDS (seqüências codificadoras), das quais 2710 apresentam similaridade com proteínas conhecidas. Neste trabalho realizamos uma análise comparativa detalhada do genoma de XAC com genomas de três fitopatógenos, Xanthomonas campestris campestris, Xylella fastidiosa 9a5c e Xylella fastidiosa temecula. Com esta análise identificamos genes espécie e gênero-específicos, potencialmente relevantes para adaptação aos seus respectivos nichos ou hospedeiros, além de ilhas de inserção e deleção genômica putativas. Também identificamos vias metabólicas relacionadas com osmoproteção/osmorregulação e com degradação de compostos aromáticos em XAC, que possivelmente são determinantes na eficácia de sua interação com o hospedeiro. Analisamos o nível de expressão de 9 CDS após crescimento de XAC em diferentes concentrações de glicose e verificamos que este açúcar modula positivamente a expressão de CDS relacionadas à síntese de goma e ao sistema de osmoproteção. Além disso, descrevemos a construção de microarranjos de DNA representando 2760 CDS de XAC, constituindo-se uma nova ferramenta para estudos de genômica comparativa e expressão gênica deste fitopatógeno. / Xanthomonas axonopodis pv citri (XAC) is the bacterial pathogen that causes citrus canker disease in several species of Citrus plants. XAC genome consists of a main cromosome of ~5 Mpb and two plasmids that together encode 4313 CDS (coding sequences). Approximately 63% of the CDS have assigned biological functions. In this work, we present a detailed genomic comparison between the genomes of XAC and of three other phytopathogens, X. campestris campestris, Xylella fastidiosa 9a5c and X. fastidiosa Temecula. Based on this analysis, we identified species and genus-specific genes that might be relevant for adaptation to their niches and hosts. We mapped putative insertion/deletion regions in the XAC genome possibly related to gene gains and losses during the divergence of the four bacterial lineages. We have identified the metabolic pathways related to osmoprotection/osmoregulation and aromatic compound degradation important for XAC efficient host colonization and interaction. Expression levels of 9 CDS were analyzed after XAC growth under different glucose concentrations revealing that this sugar upregulates the expression of CDS related to gum synthesis and to osmoregulation. In addition, we describe here the construction of a DNA microarray representing 2760 CDS of XAC as a new tool for comparative genomic and gene expression studies in this phytopathogen.

Dermatófitos são um grupo de fungos intimamente relacionados, que tem a capacidade de invadir tecidos queratinizados como pele, cabelos e unhas de homens e outros animais causando dermatofitoses. Os agentes envolvidos nessas infecções pertencem aos gêneros Trichophyton, Microsporum ou Epidermophyton e, de acordo com seu habitat natural, são classificados em espécies geofílicas, zoofílicas ou antropofílicas. A maior incidência de dermatofitoses é causada pelo gênero Trichophyton, sendo T. rubrum a espécie mais prevalente em infecções de pele e unhas em humanos. Devido à severidade e longevidade destas infecções, e à resistência ao tratamento, o estudo de fatores envolvidos na interação patógeno-hospedeiro, na resistência dos dermatófitos a agentes antifúngicos e na manutenção do processo infeccioso são de grande relevância. Por análises morfológicas, fisiológicas e de expressão gênica, comparamos cinco dermatófitos cujos genomas foram sequenciados por iniciativa do Broad Institute, Microsporum canis, Trichophyton equinum, Trichophyton interdigitale, Trichophyton rubrum e Trichophyton tonsurans. Cultivos em queratina, mimetizando o processo infeccioso, foram utilizados para analisar o envolvimento dos dermatófitos na interação patógeno-hospedeiro e manutenção do processo infeccioso. Também expusemos as espécies a concentrações subinibitórias de agentes terapêuticos, de modo a verificar a resposta destes fungos a diferentes drogas. Observamos que o acúmulo de transcritos dos genes relacionados à virulência em dermatófitos avaliados durante o crescimento em queratina sugere que a maquinaria metabólica com atividade de formação da parede celular do fungo, metabolização do substrato e adesão ao hospedeiro ativa nos períodos iniciais de infecção. Contudo, um padrão de expressão correlacionado à similaridade das sequências genômicas não foi observado nas condições testadas. Também não se observa correlação direta entre o nicho preferencial dos dermatófitos e os níveis transcricionais em resposta à queratina de origem animal. Analisamos três genes envolvidos na resistência a múltiplas drogas (MDR) durante crescimento na presença de drogas com atividade antifúngica. Nossos dados sugerem que os genes MDR atuam sinergicamente em dermatófitos, e podem atuar de forma compensatória quando em presença de drogas antifúngicas, o que pode ser uma importante causa de falhas no tratamento. Nossos resultados fornecem evidências de que a expressão dos genes analisados não se correlaciona com as relações filogenéticas entre estes dermatófitos, visto que apesar da íntima relação entre o conteúdo genético e organização do genoma, os níveis transcricionais destes genes são diferentes entre as espécies. Assim, diferenças na adaptação a nichos específicos e a progressão da doença entre os dermatófitos podem ser explicadas por diferentes perfis de transcrição do gene. / Dermatophytes are a group of closely related fungi, which have the ability to invade keratinized tissues, such as skin, hair, and nails of both human and animal hosts causing dermatophytosis. The agents involved in these infections belong to the genera Trichophyton, Microsporum or Epidermophyton and, according to their natural habitat, are classified as geophilic, zoophilic or anthropophilic species. The higher incidence of dermatophytosis is caused by the genera Trichophyton, being the specie T. rubrum the most prevalent causative of human skin and nail infections. Because of the severity and longevity of these infections and their resistance to treatment, the study of the factors involved in host-pathogen interaction, in resistance of dermatophytes to antifungal agents, and in maintenance of the infection is relevant. Through morphological, physiological and gene expression analysis we compared five dermatophytes, whose genomes were sequenced by initiative of the Broad Institute: Microsporum canis, Trichophyton equinum, Trichophyton interdigitale, T. rubrum and Trichophyton tonsurans. Growth in keratin, which mimetize the infectious process, was used to analyze the involvement of dermatophytes in host-pathogen interaction and maintenance of the infectious process. We also exposed the species to subinibitory concentrations of therapeutic agents to verify the response of these fungi to different drugs. We observed that the accumulation of transcripts of genes related to virulence in dermatophytes evaluated during growth in keratin, suggest that the metabolic machinery with activity on fungal cell wall formation, substrate metabolization, and host adhesion is activated in early stages of infection. However, an expression pattern correlating to genomic sequence similarity was not observed in the conditions tested. We also did not observe a direct correlation between the preferential niche of these dermatophytes and the transcriptional levels in response to the keratin from animal origin. We analyze three genes involved in multidrug resistance (MDR) during growth in the presence of drugs with antifungal activity. Our data suggest that MDR genes act synergistically in dermatophytes, and they may compensate for one another when challenged with antifungal drugs, which can be an important cause of therapeutic failure. We provide evidence that the expression of the analyzed genes does not correlate with the phylogeny of these dermatophytes since, in spite of the different species being highly related in gene content and genome organization, the transcription level of these genes is different among these species. Thus, differences in adaptation to a specific niche and disease progression among dermatophytes would be explained by different gene transcription profiles.