Submitted by Neusa Fagundes (neusa.fagundes@unioeste.br) on 2018-09-12T13:35:51Z No. of bitstreams: 2 Jaqueline_Oliveira2018.pdf: 1156255 bytes, checksum: ee45a479286ea424be160c8d58b44964 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-09-12T13:35:51Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Jaqueline_Oliveira2018.pdf: 1156255 bytes, checksum: ee45a479286ea424be160c8d58b44964 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2018-07-06 / Lectins are proteins belonging to a diverse superfamily, which has as its main characteristic, the capacity to specifically and selectively recognize carbohydrates. They are present in a great variety of microorganisms, such as viruses, bacteria, fungi, plants, and animals. Due to its ability to recognize a large number of glycans, they behave as mediators in many biological processes, as in cell migration, immunologic defense and in bacterial, protozoan and viral infections. Among all, plant lectins are the most studied, showing structural heterogeneities, mainly on its carbohydrates binding sites, what grants several biological activities to these proteins, among them, the antimicrobial, insecticide, mitogenic, anti-tumoral and anti-inflammatory activities. On the last decades, a large number of studies have demonstrated the application of lectins as a potential biotechnological tool on diverse fields like on agriculture, being used at the genetic improvement of grains; on biochemistry, where it’s used at pre-purification of glycoproteins, and on the histochemistry, applied at the distinction between normal and tumoral cells. Nowadays, one of the researched applications is the potential of lectins as a carcinogenic agent, so as its uses on the discovery of biomarkers. The present study shows a brief history of the plant lectins, their functional characteristics, and structural, their biotechnological applications, such as in the biomarkers discovery, covering too, some of the techniques employed to this function, like the Lectin Affinity Chromatography (LAC), Lectin Microarrays and the Antibody-Lectin Sandwich Array. / As lectinas são proteínas pertencentes a uma diversificada superfamília, que possui como principal característica a capacidade de reconhecer carboidratos de modo específico e seletivo. Estão presentes nos mais variados organismos, tais como, vírus, bactérias, fungos, vegetais e animais. Devido à sua habilidade de reconhecer uma grande quantidade de glicanos, são mediadoras em diversos processos biológicos, como migração celular, defesa imunológica, infecção por bactérias, vírus e protozoários. As lectinas de plantas são as mais estudadas e revelam-se com heterogeneidades estruturais principalmente na constituição de seus sítios de ligação ao carboidrato, o que lhes confere múltiplas atividades biológicas, dentre elas, a ação antimicrobiana, a ação inseticida, a ação mitogênica, a ação antitumoral e a anti-inflamatória. Nas últimas décadas, um grande número de publicações tem demonstrado a aplicação das lectinas como ferramenta biotecnológica potencial em diferentes áreas, como na agricultura, para melhoria genética de cultura de grãos; na bioquímica, utilizadas na pré-purificação de glicoproteínas e na histoquímica, para distinguir células tumorais das normais. Umas das aplicações amplamente pesquisadas na atualidade é o potencial das lectinas como agentes carcinogênicos, como também a sua utilização na descoberta de biomarcadores. Neste trabalho, apresentamos uma visão geral sobre as lectinas, incluindo um breve histórico das lectinas vegetais, suas características funcionais e estruturais básicas, suas atividades com potenciais aplicações biotecnológicas dentre elas a inseticida, a antimicrobiana e a antitumoral, bem como o emprego dessas proteínas na descoberta de biomarcadores tumorais. Algumas técnicas utilizadas para essa finalidade como a cromatografia de afinidade com lectina imobilizada (LAC - Lectin Affinity Chromatography) e os microarranjos de lectinas e lectinas/anticorpo no formato sanduíche (ALSA - Antibody-Lectin Sandwich Array) são apresentadas.

Produtos de glicação avançada (AGE) são prevalentes no diabete melito e alteram o metabolismo de lípides e lipoproteínas. Neste estudo, avaliou-se a influência da albumina, isolada do soro de indivíduos controles (C, n =12) e de portadores de diabete melito tipo 1 (DM 1, n=13) e tipo 2 (DM 2, n=11), com controle glicêmico inadequado, sobre a remoção de colesterol de macrófagos, o acúmulo intracelular de lípides, o conteúdo do receptor de HDL, ABCA-1 e a captação seletiva de colesterol esterificado de HDL. Além disso, foi determinada a expressão diferencial de genes em macrófagos tratados com albumina C, DM 1 ou DM 2. A concentração plasmática de albumina glicada foi superior no grupo DM 1 e DM 2 em relação ao C e correlacionou-se positivamente com glicemia, hemoglobina glicada e frutosamina. Albumina sérica foi isolada por cromatografia para separação rápida de proteínas e purificada por extração alcoólica. Albumina DM 1 e DM 2 apresentaram maior conteúdo de carboximetil-lisina e apo A-I quando comparada à albumina C. Macrófagos enriquecidos com LDL acetilada e 14C-colesterol foram tratados com albumina C, DM 1 ou DM 2 e, a seguir, incubados na presença ou ausência de apo A-I, HDL3 ou HDL2 para determinação do efluxo de colesterol. Apesar de removerem maior quantidade de colesterol celular, as albumina DM 1 e DM 2 reduziram o efluxo de colesterol mediado por apo A-I (70% e 45%, respectivamente) e HDL2 (55% e 54%, respectivamente) em comparação à albumina C. Com HDL3, a queda no efluxo de colesterol só foi observada em macrófagos expostos à albumina DM 2 (55%). Macrófagos incubados apenas com albumina C, DM 1 ou DM 2 apresentaram conteúdo lipídico semelhante, evidenciado por coloração com Oil Red O. A adição de apo A-I, HDL3 ou HDL2 reduziu o conteúdo lipídico apenas nas células tratadas com albumina C, mas não com albumina DM 1 ou DM 2. A expressão de ABCA-1 foi diminuída 82% e 25% em macrófagos expostos, respectivamente, à albumina DM 1 e DM 2, em comparação às células tratadas com albumina C. As albuminas DM 1 e DM 2 reduziram a captação de 3H colesteril oleoil éter de HDL por células que superexpressam o receptor SR-BI. Estes resultados também foram obtidos com albumina humana modificada in vitro por glicação avançada. As albuminas isoladas dos pacientes diabéticos aumentaram a expressão de receptores envolvidos na captação de LDL modificadas e de proteínas que modulam vias da homeostase do colesterol. Os resultados deste estudo evidenciaram que a modificação in vivo da albumina por glicação avançada prejudica o transporte reverso de colesterol no diabete melito, por reduzir a expressão de ABCA-1 e a remoção de colesterol de macrófagos, bem como a captação seletiva de colesterol esterificado de HDL pelo SR-BI. Independentemente de variação na concentração e composição de HDL, a glicação da albumina pode contribuir para o acúmulo de lípides em macrófagos e gênese da aterosclerose no diabete melito / Advanced glycation end products are prevalent in diabetes mellitus and alter lipids and lipoprotein metabolism. In this study we analyzed the role of albumin, isolated from control individuals (C, n = 12) and uncontrolled type 1 (DM 1, n = 13) and type 2 (DM 2, n = 11) diabetes mellitus patients on macrophage cholesterol removal, intracellular lipid accumulation, expression of the HDL receptor protein level, ABCA-1and the uptake of esterified cholesterol from HDL. It was also investigated the differential gene expression in macrophages treated with C, DM 1 or DM 2 albumin. Glycated albumin was higher in DM 1 and DM 2 groups as compared to C and was positivetly correlated with glycemia, glycated hemoglobin and fructosamine. Serum albumin was isolated by fast protein liquid chromatography and alchoolic extraction. DM 1 and DM 2 albumin presented a higher amount of carboxymethyllysine and apo A-I as compared to C albumin. In order to determine cholesterol efflux acetylated LDL and 14C-cholesterol enriched J- 774 macrophages were treated with C, DM 1 or DM 2 albumin and then incubated in the absence or presence of apo A-I, HDL3 or HDL2. Although presenting a higher ability to remove cell cholesterol by itself, DM 1 and DM 2 albumin reduced cholesterol efflux mediated by apo A-I (70% e 45%, respectively) and by HDL2 (55% e 54%, respectively) as compared to C albumin. With HDL3 the reduction of the cholesterol efflux was only observed in macrophages treated with DM 2 albumin (55%) in comparison to C albumin. Macrophages incubated with C, DM 1 or DM 2 albumin alone presented similar amount of intracellular lipids as assessed by Oil Red O staining. The addition of apo A-I, HDL3 or HDL2 reduced the lipid content in cells treated with C albumin, but not in those exposed to DM 1 or DM 2 albumin. The expression of ABCA-1 was reduced 82% and 25% in macrophages treated, respectively, with DM 1 or DM 2 albumin, in comparison to C albumin. DM 1 and DM 2 albumin reduced the uptake of 3H colesteril oleoyl ether from HDL by SR-BI overexpressing cells. These findings also were obtained when cells were treated in vitro with human serum albumin submitted to advanced glycation. DM 1 and DM 2 albumin enhanced the expression of receptors involved in the uptake of modified LDL and cholesterol homeostasis. Our findings showed that the advanced glycation of albumin that takes place in diabetes mellitus impairs the reverse cholesterol transport efficiency by reducing the ABCA-1 expression and cholesterol exportation to HDL and also by diminishing the uptake of esterified cholesterol from HDL. Independently of changes in HDL composition and concentration, advanced glycated albumin contributes to cholesterol accumulation in macrophages and atherogenesis in diabetes mellitus

Estudos prévios demonstraram que as atividades biológicas do veneno da serpente Bothrops jararaca sofrem significantes modificações ontogenéticas. Neste estudo é apresentada uma análise comparativa do proteoma, peptidoma e transcriptoma da glândula de veneno de filhotes e adultos de B. jararaca, correlacionando os resultados obtidos com algumas características funcionais dos venenos. Venenos de 694 filhotes de até duas semanas de idade e 110 adultos, provenientes do Estado de São Paulo foram extraídos e liofilizados para as análises proteômicas/peptidômicas e funcionais. O mRNA de glândulas de veneno de 20 filhotes e 10 adultos foi obtido para a contrução de bibliotecas de cDNA e a análise de Expressed Sequence Tag (ESTs). Demonstramos que a atividade hemorrágica é similar para os venenos de filhotes e adultos, enquanto que o veneno de adultos é discretamente mais letal para camundongos; entretanto, o veneno de filhotes mostrou-se extremamente mais letal para aves, uma característica que pode garantir proteção contra potenciais predadores nas fases iniciais de vida da espécie. A atividade coagulante do veneno de filhotes é cerca de 10 vezes mais alta que aquela verificada para o veneno de adultos e é atribuída sobretudo à atividade de metaloproteinases. Essas diferenças nas atividades funcionais se refletiram nos diferentes perfis verificados por eletroforese bidimensional e identificação de spots de proteínas por digestão tripsínica in-gel seguida de análise por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas em tandem, zimografia com gelatina, imunocoloração utilizando anticorpos específicos anti-proteinases, e glicoproteínas com afinidade pela concanavalina -A. A comparação dos venenos por derivatização com tags isóbaros (iTRAQ) e a análise das ESTs revelaram diferenças claras entre os níveis de toxinas presentes nos venenos e as metaloproteinases foram a classe de toxinas mais expressa, além de serem as toxinas cujos perfis estruturais apresentaram maior mudança, como ilustrado pelo quociente PIII/PI, que é maior nos venenos de filhotes. Dimorfismo sexual foi detectado em diversas classes de toxinas no veneno de adultos por análises proteômicas e transcriptômicas e, surpreendentemente, o fator de crescimento de nervo foi detectado apenas no veneno/glândula de veneno de machos. A análise glicoproteômica mostrou que N-glicosilações parecem ser as modificações pós-traducionais mais proeminentes nas toxinas de B. jararaca, e os perfis de N-glicosilação apresentaram-se distintos para as proteínas dos venenos de filhotes e adultos. Entretanto, a composição de N-glicanos não variou entre as amostras, indicando que diferenças na utilização de motivos de N-glicosilação poderiam explicar as diferenças nos níveis de glicosilação observados pelos diferentes perfis eletroforéticos dos venenos. A análise da fração peptídica dos venenos de filhotes e adultos por espectrometria de massas resultou num perfil similar de Peptídeos Potenciadores de Bradicinina (BPPs), que foram detectados em suas formas canônicas e também com novas seqüências, cujas estruturas primárias sugerem um processamento da proteína precursora em sítios até então não descritos. Acreditamos que este seja o estudo mais abrangente sobre a variabilidade do veneno de uma serpente já realizado e os resultados demonstram que há uma relação clara entre as alterações ontogenéticas na dieta e tamanho corporal e o proteoma/peptidoma do veneno desta espécie. / Previous studies have demonstrated that the biological activities displayed by the venom of the snake Bothrops jararaca undergo a significant ontogenetic shift. In this investigation, we performed comparative proteomic, peptidomic and transcriptomic analyses of venoms and venom glands from newborn and adult specimens of B. jararaca and correlated the results with the evaluation of functional venom features. Venoms from 694 two-week old newborns and 110 adults from São Paulo state were milked and lyophilized for functional and proteomic/peptidomic analyses. Additionally, mRNA was obtained from the venom glands of 20 newborns and 10 adults and used for the construction of cDNA libraries and Expressed Sequence Tag (ESTs). We demonstrate that newborn and adult venoms have similar hemorrhagic activities, while the adult venom has a slightly higher lethal activity upon mice; however, the newborn venom is extremely more potent to kill chicks, a feature that might ensure protection against potential predators in early stages of B. jararaca life. Interestingly, the coagulant activity of the newborn venom upon human plasma is ten times higher than that of the adult venom and is contributed mainly by metalloproteinases. Differences in functional activities were clearly reflected in the venom different profiles of two-dimensional gel electrophoresis (2D-PAGE) and protein spot identification by in-gel trypsin digestion followed by liquid chromatography and tandem mass spectrometry (LC-MS/MS), gelatin zimography, immunostaining using specific anti-proteinase antibodies, and concanavalin A-binding proteins. The venom comparison by isobaric tag peptide labeling (iTRAQ) and ESTs analysis revealed clear differences in toxin levels. The metalloproteinases were detected as the toxin class most expressed in the venoms in addition to being the toxins whose structural profile most changed, as illustrated by the ratio P-III/P-I class being higher in newborn venoms. Sexual dimorphism has been detected in various adult venom toxin classes by proteomic and transcriptomic analyses and, interestingly, the nerve growth factor was detected only in the male venom gland/venom. The glycoproteomic analysis showed that N-glycosylation seems to be the most prominent post-translational modification in B. jararaca toxins and the N-glycosylation profiles differed for newborn and adult venom toxins. Nevertheless, the N-glycan composition between the samples did not vary indicating that differences in the utilization of the N-glycosylation motif could be the explanation for the differences in the glycosylation levels indicated by the differential electrophoretic profiles of venom proteins. The analysis of the peptide fraction of newborn and adult venoms by mass spectrometry revealed a similar profile of Bradykinin Potentiating peptides (BPPs), however these were detected in the venoms showing their canonical sequences and also novel sequences corresponding to BPPs processed from their precursor protein at sites so far not described. To the best of our knowledge, this is the most comprehensive study on a snake venom variation and the results clearly demonstrate a relationship between the ontogenetic shift in diet and animal size, and the venom proteome/peptidome in B. jararaca species

Feridas nos membros inferiores são a principal causa de hospitalização e morbidade nos pacientes portadores de diabetes mellitus (DM). Atualmente, atribuem-se as complicações tardias do DM ao acúmulo de produtos finais de glicação avançada (AGE) nos diversos órgãos-alvo, incluindo a pele. Já foi demonstrado que a função deficitária dos fibroblastos de diabéticos está relacionada diretamente ao acúmulo de AGEs. Neste cenário, o uso de células-tronco mesenquimais tem ganhado destaque, tendo sido demonstrado, na literatura, que células-tronco derivadas de medula óssea (BMSC) produzem lisozima, um anti-AGE fisiológico. As células-tronco derivadas do tecido adiposo (ADSC) são de fácil captação e apresentam melhor rendimento em cultura celular quando comparadas às BMSC. Neste estudo, investigamos se as ADSC sintetizam lisozima e avaliamos se o produto das ADSC tem a capacidade de diminuir os efeitos deletérios dos AGEs nos fibroblastos. Para esse fim, foram cultivadas ADSC provenientes de lipoaspiração de pacientes hígidos, fibroblastos provenientes de feridas de pacientes diabéticos e fibroblastos provenientes de pacientes hígidos. Os fibroblastos de pacientes diabéticos ou hígidos foram submetidos a três meios de cultura diferentes: normoglicêmico (controle), contendo AGE ou contendo AGE mais o meio de cultura proveniente de ADSC (eluato) e, nesses grupos, foi feito ensaio de migração de fibroblastos. Observamos que, nos meios contendo AGE, não ocorreu migração dos fibroblastos, e na cultura contendo AGE mais eluato, os fibroblastos apresentaram migração semelhante à do grupo controle. Concluímos que as ADSC produzem lisozima e que os produtos sintetizados por essas células têm a capacidade de inibir os efeitos deletérios dos AGEs em fibroblastos in vitro / Lower limb ulcers are one of the major causes of morbidity and hospital admission in diabetic patients. Current researches indicate that diabetes mellitus (DM) complications are related to the accumulation in target organs, including the skin of advanced glycation end products (AGEs). It has been shown that cutaneous fibroblasts dysfunction in DM patients is directly dependent on AGE accumulation. In this context, the use of mesenchymal stem cells has been proposed, since bone marrow stem cells (BMSC) produce lysozyme, a physiological anti-AGE enzyme. Adipose tissue derived stem cells (ADSC) are easier to harvest and proliferate faster in cell cultures compared to BMSC. In this study, we investigated whether ADSC are able to produce lysozyme and also the ability of those stem cells to reduce the deleterious effects of AGEs in fibroblasts. ADSC were isolated and cultured from liposuction samples from non diabetic patients; fibroblasts were also isolated and cultured from wounds of diabetic patients and from non diabetic patients\' skin. Fibroblasts were maintained in three different conditions: in normoglycemic culture medium (control), a culture medium containing AGE or a culture medium previously in contact with ADSC for 24 hours (eluate) with addition of AGE. A fibroblast migration assay was performed. There was a lack of fibroblast migration in fibroblast culture with AGE-supplemented medium, whereas fibroblast culture containing ADSC\'s eluate and AGE showed fibroblast migration similar to the control group. Our study demonstrates that ADSC can synthesize lysozyme and we infer that the products of ADSC are able to inhibit in vitro AGE deleterious effects in fibroblas

Produtos de glicação avançada (AGE) contribuem para o estresse oxidativo e inflamatório, os quais constituem as bases celulares para as complicações a longo prazo do diabete melito (DM). A albumina é a principal proteína sérica modificada por AGE e afeta adversamente o metabolismo de lípides e a resposta infamatória em macrófagos, a função das ilhotas pancreáticas e a sensibilidade insulínica no músculo. Neste estudo, avaliamos o efeito da administração crônica de albumina AGE, associada ou não ao tratamento com N-acetilcisteína (NAC), sobre a sensibilidade periférica à insulina, infiltrado total e perfil de macrófagos, transcriptoma do tecido adiposo periepididimal e padrão de diferenciação de macrófagos peritoneais em ratos saudáveis. Albumina AGE foi produzida pela incubação de albumina de rato com glicolaldeído 10 mM, durante 4 dias a 37 °C, em agitação, no escuro. Albumina controle (C) foi preparada na presença de PBS apenas. Ratos Wistar com 4 semanas de idade foram divididos aleatoriamente em quatro grupos experimentais (n = 7-8), os quais receberam injeção intraperitoneal diária de albumina C ou albumina AGE (20 mg/Kg/dia) concomitantemente ou não a administração da NAC (600mg/L de água) (grupos albumina C + NAC e albumina AGE + NAC), durante 90 dias consecutivos. Parâmetros bioquímicos foram determinados por técnicas enzimáticas, peroxidação lipídica, pela medida de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) na urina, expressão gênica, por RT-qPCR, e conteúdo proteico, por imuno-histoquímica. AGE total foi determinado por ELISA, carboximetil-lisina (CML) e pirralina (PYR), por cromatografia líquida/espectrometria de massa. O tecido adiposo periepididimal foi analisado por estereologia. A concentração de AGE total, CML e PYR foi, respectivamente, 9,2, 7000 e 235 vezes maior na albumina AGE em comparação à C. Consumo de ração, massa corporal, pressão arterial sistólica e concentração plasmática de colesterol total, triglicérides, ácidos graxos livres, glicose, insulina, ureia, creatinina, alanina aminotransferase, aspartato aminotransferase e excreção urinária de proteínas (24 h) foram semelhantes entre os grupos. A NAC reduziu em 1,4 e 1,6 vezes a concentração urinária de TBARS nos animais tratados com albumina AGE + NAC, em comparação aos grupos AGE e C+NAC, respectivamente. A albumina AGE reduziu em, aproximadamente, 1,4 vezes a sensibilidade à insulina em comparação ao C, o que foi prevenido pela NAC. O peso relativo do tecido adiposo periepididimal, a fração de área e o volume dos adipócitos foram semelhantes entre os grupos experimentais. Maior infiltrado macrofágico, (células F4/80 positivas), foi observado nos animais tratados com albumina AGE (1,3 x), o que também foi prevenido pela NAC. CD11b e CD206 permaneceram inalterados. O tratamento com albumina AGE também não alterou a expressão do mRNA de Ager (RAGE), Ddost (AGE-R1), Cd36, Nfkb1, Il6, Il10, Tnf, Nos2, Il12. No entanto, Itgam (CD11b - M1) e Mrc foram reduzidos no grupo AGE + NAC em comparação a C + NAC (2 e 1,9 x) e AGE (1,8 e 1,5 x, respectivamente). Aumento do mRNA de Slc2a4 (GLUT-4) e Ppara foi observado nos animais tratados com albumina AGE + NAC em comparação a C + NAC (Slc2a4: 1,6; Ppara 2,2 x) e AGE (2,3; 3,3 x). A albumina AGE contribuiu para maior expressão do Col12a1 (3,1 x) em relação ao C. Análise de macrófagos isolados da cavidade peritoneal apontaram elevação no mRNA de Il6 (2,6 x) e Ddost (1,4 x) no grupo AGE em relação ao C. Ddost também foi aumentado (1,2 x) no grupo AGE + NAC quando comparado ao C+NAC. Além disso, a NAC favoreceu o aumento do Arg1 (arginase 1) nos grupos albumina C + NAC (2,5 x) e AGE + NAC (2,6 x) quando comparados aos seus respectivos controles. Em conclusão, a albumina AGE favorece o infiltrado de macrófagos no tecido adiposo o que evidencia a sensibilização deste território à ação dos AGE e pode, a longo prazo, contribuir para piora na resistência à insulina, observada neste modelo animal. A NAC antagoniza os efeitos da albumina AGE e exerce, por si, efeitos benéficos sobre o perfil de diferenciação de macrófagos no tecido adiposo e peritônio, resposta inflamatória, peroxidação lipídica e resistência insulínica. A NAC pode ser uma ferramenta útil na prevenção das ações dos AGE sobre o desenvolvimento de resistência insulínica e complicações do DM / [Thesis]. São Paulo: \"Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo, 2016\". Advanced glycation end-products (AGE) contribute to oxidative and inflammatory stress, which constitute the cellular basis for long-term complications of diabetes mellitus (DM). Albumin is the major serum protein modified by AGE and adversely affects macrophage lipid metabolism and inflammatory response, pancreatic islet function and muscle insulin sensitivity. We investigated the effect of chronic administration of AGE-albumin, associated or not with N-acetylcysteine (NAC) treatment, in peripheral insulin sensitivity, macrophage infiltration and polarization and transcriptome of periepididimal adipose tissue and peritoneal macrophage differentiation in healthy rats. AGE-albumin was prepared by incubating rat albumin with 10 mM glycolaldehyde for 4 days, 37 °C, under shaker, in the dark. Control albumin (C) was incubated with PBS alone. Four-weeks old male Wistar rats (n = 7-8/group) were randomized into four groups receiving daily intraperitoneal injections of C or AGE albumin (20 mg/kg/day) alone or together with NAC (600mg/L drinking water) (C + NAC albumin and AGE + NAC albumin), for 90 consecutive days. Biochemical parameters were determined by enzymatic techniques, lipid peroxidation by the measurement of urinary thiobarbituric acid reactive substances (TBARS), gene expression by RT-qPCR and protein content by immunohistochemistry. Total AGE was determined by ELISA and carboxymethyllysine (CML) and pyrraline (PYR) by liquid chromatography/ mass spectrometry. Periepididimal adipose tissue was analyzed by stereology. Total AGE concentration, CML and PYR were, respectively, 9.2, 7000 and 235 times higher in AGE albumin as compared to C. Food consumption, body weight, systolic blood pressure and plasma total cholesterol, triglycerides, free fatty acids, glucose, insulin, urea, creatinine, alanine aminotransferase, aspartate aminotransferase and urinary protein excretion (24 h) were similar among groups. NAC reduced urinary TBARS in AGE + NAC group as compared to AGE (1.4 x) and C + NAC (1.6 x), respectively. AGE albumin reduced 1.4 times the insulin sensitivity as compared to C albumin; this was prevented by NAC. Adipose tissue relative weight, adipocyte area fraction and volume were similar among groups. A higher (1.3 x) macrophage infiltrate (F4/80 positive cells) was observed in AGE albumin treated animals in comparison to those treated with C albumin and this was prevented by NAC. CD11b and CD206 were unchanged as well as mRNA de Ager (RAGE), Ddost (AGE-R1), Cd36, Nfkb1, Il6, Il10, Tnf, Nos2 and Il12. Itgam (CD11b - M1) and Mrc (CD206 - M2) were reduced in AGE + NAC group in comparison to C + NAC (2 and 1.9 x, respectively) and AGE (1.8 and 1.5 x, respectively). Increased Slc2a4 (GLUT-4) and Ppara mRNA were observed in AGE + NAC group in comparison to C + NAC (Slc2a4: 1.6 x; Ppara: 2.2 x) and to AGE (Slc2a4: 2.3 x; Ppara: 3.3 x). AGE albumin increased the expression of Col12a1 in 3.1 times as compared to C albumin. In peritoneal macrophages there was an increase in Il6 (2.6 x) and Ddost (1.4 x) in AGE group as compared to C. Ddost was also 1.2 times increased in AGE + NAC as compared to C+NAC. NAC increased Arg1 (arginase 1) in C + NAC (2.5 x) and AGE + NAC (2.6 x) as compared to their respective controls. In conclusion, AGE albumin favors macrophage infiltration in adipose tissue promoting over time tissue sensitization to AGE that may contribute to worsening insulin resistance in this animal model. NAC antagonizes the effects of AGE albumin and by itself has beneficial effects in macrophage differentiation in adipose tissue and peritoneal cavity, inflammatory response, lipid peroxidation and insulin sensitivity. NAC may be a useful tool in the prevention of AGE actions on the development of insulin resistance and long-term complications of DM

O melanoma é o tipo de câncer de pele mais letal, apesar de ser o menos incidente. Em virtude de sua alta letalidade e de sua crescente incidência, estudos sobre melanoma são de fundamental importância nos dias de hoje. Assim como células tumorais em geral, células de melanoma apresentam características metabólicas diferenciadas, como, por exemplo, altos níveis de espécies reativas de oxigênio e alta taxa de síntese proteica. Essas modificações no metabolismo dispararam vias de resposta a estresse, como a \"Unfolded Protein Response\" (UPR), contudo, essas células se adaptam a esse estresse constante, que não culmina com a morte das mesmas. Além disso, o padrão de glicosilação em células tumorais também é sabidamente alterado, entre outros motivos, pela expressão diferencial de enzimas da via de glicosilação, como a N-acetilglicosaminiltransferase 5 (MGAT5). Relacionando essas duas características de células de melanoma, propusemo-nos a avaliar se a alta expressão de MGAT5A ( e/ou MGAT5B) funcionaria como uma resposta adaptativa de células de melanoma ao estresse de retículo endoplasmático, e seria, portanto, responsável por manter o equilíbrio diferenciado nessas células. Durante o desenvolvimento desse estudo, foi possível comprovar que a indução de estresse de retículo por meio de tratamento com tunicamicina, um inibidor da N-glicosilação e indutor clássico de UPR, sensibilizou as células de melanoma ao posterior tratamento com cisplatina. Contudo, o tratamento com swainsonina, um inibidor do processamento dos N-glicanos que ocorre no complexo de Golgi, não foi capaz nem de disparar \"Unfolded Protein Response\" nem de induzir morte nessas células e, talvez por esse motivo, não apresentou efeito sensibilizador frente à cisplatina. Além disso, foi observado que as linhagens tumorigênicas apresentam maior expressão de MGAT5A em comparação à linhagem não-tumorigênica melan-a. As tentativas de realização de silenciamento de MGAT5A não foram exitosas. Informações relacionando estresse de retículo e N-glicosilação aberrante em células tumorais ainda serão foco de estudo em nosso grupo. Com os resultados apresentados, é possível concluir que o equilíbrio diferencial dos níveis de estresse de retículo em que se encontram as linhagens tumorigênicas do nosso modelo é importante para a sobrevivência das mesmas. Além disso, é de nosso interesse avaliar a dependência de células tumorais das vias ativadas pela superexpressão de MGAT5A, caso ela realmente exista / Melanoma is the most lethal skin cancer, despite being the least prevalent. Due to its lethality and resistance to a variety of known chemotherapeutic drugs, studies on melanoma are paramount. Tumor cells in general, and melanoma cells particularly, commonly present a disturbed metabolic rate, e.g., altered metabolism of reactive oxygen species and increased rates of protein synthesis. Altogether these perturbations trigger the Unfolded Protein Response (UPR); however, tumor cells are adapted to these conditions and are able to survive. Besides, glycosylation of tumor cells is commonly altered, due to differentiated expression rates of N-glycosylation enzymes, like N-acetylglucosaminyltransferase 5 (MGAT5). Considering these information together, we proposed that the sustained overexpression of MGAT5A (and/or MGAT5B) observed in Tm1 and Tm5 melanoma cells is part of an adaptive response to reticulum stress, maintaining an unstable equilibrium in tumor cells. In this work, we observed that the induction of endoplasmic reticulum stress caused by tunicamycin treatment, a N-glycosylation inhibitor and UPR inducer, sensitized melanoma cells to further cisplatin treatment. In contrast, swainsonine treatment, an inhibitor of Golgi N-glycan processing pathway, did not cause cell death nor UPR signaling, and this may be the reason why this treatment did not sensitize cells to cisplatin treatment. MGAT5A silencing was not successful yet. Altogether, the results above show that the unstable equilibrium under which Tm1 and Tm5 tumor cells are seems necessary for their survival. Therefore, it seems that upon malignant transformation, melanoma cells present dependence of MGAT5A expression. Its our interest exploit this melanoma model to understand the concept of oncogenic dependence for MGAT5A expression in the case of melanomas, if it exists

LIMA, V.V. Papel da O-glicosilação com N-acetil-glucosamina (O-GlcNAc) nas alterações vasculares associadas a altos níveis de endotelina-1. 2012. 106 f. Tese (Doutorado) - Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2012. A O-Glicosilação com N-acetilglucosamina (O-GlcNAc) é uma modificação pós-traducional altamente dinâmica que modula diversas vias de sinalização. O processo de O-GlcNAc é controlado por duas enzimas: UDP-NAc transferase (OGT) e O-GlcNAcase (OGA). A enzima OGT catalisa a adição de N-acetil-glucosamina no grupo hidroxila dos resíduos de serina ou treonina das proteínas alvo. Por outro lado, a OGA catalisa a remoção hidrolítica de O-GlcNAc das proteínas modificadas. Proteínas com importante papel na função vascular são alvos da O-GlcNAc, e recentemente demonstramos que a expressão de proteínas modificadas com O-GlcNAc está aumentada em artérias de ratos com hipertensão DOCA-sal. Considerando que a produção de endotelina-1 (ET-1) encontra-se aumentada na vasculatura de diferentes modelos de hipertensão sensível ao sal, nós investigamos a hipótese de que o aumento da resposta vascular contrátil induzida pela ET-1 é decorrente da hiperativação da via RhoA/Rho cinase, mediada pelo aumento dos níveis de proteínas O-GlcNAc. Durante a realização de nossos experimentos, demonstramos que a exposição de aortas ou células do músculo liso vascular (CMLV) à ET-1 (0,1 mol/L) aumenta a vasoconstrição para fenilefrina (PE) e serotonina, bem como os níveis de proteínas O-GlcNAc, além de modular a expressão das enzimas OGT e OGA. A infusão de ET-1 (2 pmol/Kg/min) por 14 dias também promoveu aumento dos níveis vasculares de proteínas O-GlcNAc e da resposta contrátil da aorta à PE. O tratamento de aortas ou CMLV com ST045849 (inibidor da OGT, 100 µMol/L) ou atrasentan (antagonista do receptor ETA, 1 mol/L), preveniu o aumento dos níveis de proteínas O-GlcNAc induzido pela ET-1. Além disso, o tratamento com atrasentan por cinco semanas (atrasentan - 5 mg/kg/dia, por via oral) normalizou os níveis vasculares de proteínas O-GlcNAc em ratos DOCA-sal e também diminuiu a resposta contrátil da aorta à PE. A transfecção de CMLV com siRNA para OGT aboliu o efeito da ET-1 sobre os níveis de proteínas O-GlcNAc. Considerando que o aumento nas contrações da aorta à PE, após o tratamento com PUGNAc (inibidor seletivo da OGA) ou ET-1, foi abolido pelo inibidor de Rho cinase (Y-27632, 1 mol/L) e que a ET-1 ativa a via de sinalização da RhoA/Rho cinase, decidimos investigar se aumento dos níveis de proteínas O-GlcNAc ativa/modula a via RhoA/Rho cinase. A incubação de CMLV com ET-1 não mudou a expressão protéica das formas totais de ROCK-, ROCK-, CPI-17, MYPT-1 ou MLC, porém aumentou a expressão das formas fosforiladas da MYPT-1 (Tre853), CPI-17 (Tre38) e MLC (Tre18/Ser19). Estes efeitos não foram observados quando CMLV foram tratadas com ST045849, atrasentan ou previamente transfectadas com o siRNA para OGT. Também observamos que a ET-1 aumentou a atividade e a expressão protéica da RhoA, assim como a expressão da PDZ-Rho GEF e p115-Rho GEF. Este efeito foi abolido, quando CMLV foram previamente transfectadas com siRNA para OGT, incubadas com o inibidor da OGT ou tratadas com o antagonista de receptores ETA. Em conclusão, nossos dados fornecem evidências de que a ET-1 aumenta os níveis vasculares de proteínas O-GlcNAc, resultando na ativação da via RhoA/Rho cinase e no aumento da reatividade vascular. É possível que o aumento de proteínas O-GlcNAc, induzido pela ET-1, possa representar um novo mecanismo para a disfunção vascular induzida por este potente peptídeo. / LIMA, V.V. O-GlcNAcylation contributes to the vascular effects of ET-1 via activation of RhoA/Rho-kinase pathway. 2012. 106 f. Ph.D. Thesis - Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2012. Glycosylation with O-linked -N-acetylglucosamine (O-GlcNAc) is a highly dynamic post-translational modification that plays a key role in signal transduction pathways. The cycling of O-GlcNAc is controlled by two enzymes: UDP-NAc transferase (OGT) and O-GlcNAcase (OGA). Whereas OGT catalyses the addition of O-GlcNAc to the hydroxyl group of serine and threonine residues of a target protein, OGA catalyses the hydrolytic cleavage of O-GlcNAc from post-translationally-modified target. Proteins with an important role in vascular function are targets for O-GlcNAcylation and we have recently shown that the vascular content of O-GlcNAc-proteins is augmented in arteries from DOCA-salt rats. Since endothelin-1 (ET-1) production is increased in the vasculature of salt-sensitive forms of hypertension, we tested the hypothesis that O-GlcNAc contributes to the vascular effects of ET-1, via activation of the RhoA/Rho-kinase pathway. Incubation of rat aortas or vascular smooth muscle cells (VSMCs) with ET-1 (0,1 mol/L) produced a time-dependent increase in O-GlcNAc levels, decreased expression of O-GlcNAc transferase (OGT) and -N-acetylglucosaminidase (OGA), key enzymes in the O-GlcNAcylation process. Overnight treatment of aortas with ET-1 increased phenylephrine (PE) vasoconstriction. ET-1 effects were not observed when vessels were previously instilled with anti-OGT antibody or after incubation with an OGT inhibitor (ST045849, 100 mol/L). Aortas from DOCA-salt rats, which exhibit increased pre-pro-ET-1 expression, displayed increased contractions to PE and augmented levels of O-GlcNAc proteins. Treatment of DOCA-salt rats with atrasentan (ETA antagonist) abrogated augmented vascular levels of O-GlcNAc and prevented increased PE vasoconstriction. Aortas from rats chronically infused with low rate of ET-1 (2 pmol/Kg/min, 14days) exhibited increased O-GlcNAc-proteins and enhanced PE responses. These changes are similar to those induced by PUGNAc (OGA inhibitor which increases O-GlcNAc levels). ET-1 as well as PUGNAc augmented contractions to PE in endothelium-denuded rat aortas, an effect that was abolished by the Rho kinase inhibitor Y-27632 (1 mol/L). Incubation of VSMCs with ET-1 did not change expression of ROCK-, ROCK-, CPI-17, MYPT-1 or MLC, but increased phosphorylation levels of MYPT-1 (Thr853), CPI-17 (Thr38) and MLC (Thr18/Ser19). The effects of ET-1 on MYPT-1, CPI-17 and MLC phosphorylation were prevented by the OGT inhibitor and OGT siRNA transfection, as well as by atrasentan. ET-1 increased RhoA expression and activity in VSMCs, and this effect was abolished by OGT siRNA transfection and OGT inhibition. ET-1 also augmented expression of PDZ-Rho GEF and p115-Rho GEF in VSMCs and this was prevented by OGT siRNA, OGT inhibition (ST045849) and ETA receptor blockade (atrasentan, 1 mol/L). In conclusion, our data strongly suggest that ET-1 augments O-GlcNAc levels and this modification contributes to increase vascular contractile responses, via activation of the RhoA/Rho-kinase pathway. We speculate that the modulatory effect of ET-1 on O-GlcNAcylation may represent a novel mechanism underlying the vascular effects of the peptide.

A nefropatia diabética (ND) é uma das principais causas de doença renal terminal. Além da lesão glomerular, o compartimento tubulointersticial é afetado no desenvolvimento da ND, não somente pela proteinúria como pelos efeitos pró-inflamatórios, profibróticos, pró-oxidantes e angiogênicos da hiperglicemia e dos produtos finais de glicação avançada (AGEs). Sabese que as concentrações de marcadores do estresse oxidativo estão aumentadas em pacientes com diabetes mellitus (DM). O sistema tiorredoxina (TXN) é um dos principais sistemas antioxidantes endógenos. A TXN é capaz de interagir com um grande número de fatores de transcrição e proteínas, tal como a Thioredoxin interacting protein (TXNIP) que tem sido reconhecida na patogênese do DM e de suas complicações. Além da TXNIP, a deficiência de tiamina, ou vitamina B1, já foi relatada em modelos experimentais de DM, concomitantemente a um aumento de seu clearance renal. Os transportadores de tiamina 1 (THTR1) e 2 (THTR2) (codificados pelos genes SLC19A2 e SLC19A3, respectivamente) são os responsáveis pela reabsorção de tiamina no túbulo proximal após sua filtração pelo glomérulo. Estudos já demonstraram que a excreção aumentada de tiamina pode ser um fator de risco para o declínio precoce da função renal em pacientes DM. Uma outra proteína de interesse é a beta 2 microglobulina (B2M), expressa em situações que cursam com inflamação, um fenômeno bem caracterizado na tubulopatia diabética. O estudo da ativação intrarenal de vias potencialmente associadas à evolução da ND em humanos é dificultada pela necessidade de biópsia renal. Recentemente o sedimento urinário tem sido utilizado na avaliação das doenças renais, tanto na tentativa de identificar biomarcadores que possam predizer o declínio da função renal, como para o melhor entendimento da patogênese dessa complicação. O objetivo deste trabalho foi estudar a participação dos genesalvo TXNIP, TXN, SLC19A2, SLC19A3 e B2M na patogênese da ND em portadores de DM1. Estudamos o RNA mensageiro (mRNA) do sedimento urinário de pacientes DM1 (n=55), portadores de glomeruloesclerose segmentar e focal (GESF, um modelo de nefropatia não diabética, n=12) e de indivíduos controles (n=11) para avaliação da expressão dos genes-alvo, e sua associação com as manifestações da ND. Também foi extraído mRNA de células linfomononucleares de pacientes DM1 (n=162) e indivíduos controles (n=26) para comparação com os resultados obtidos no sedimento urinário e foram dosadas as concentrações plasmáticas de tiamina em um subgrupos de pacientes DM1 e de indivíduos controles. Além disso, uma linhagem de células renais humanas foi tratada com altas concentrações de glicose e albumina glicada ou não glicada in vitro para avaliar se os AGEs estão implicados na alteração de expressão dos genes-alvos. Como resultado observamos (1) um aumento na expressão de TXNIP e TXN no sedimento urinário de pacientes DM1 com doença renal e associação da expressão de TXNIP com a magnitude do declínio da taxa de filtração glomerular; (2) um aumento na expressão de TXNIP e TXN nas células linfomononucleares dos pacientes DM1; (3) um aumento na expressão de SLC19A2 no sedimento urinário de pacientes DM1 com doença renal; (4) uma diminuição nas concentrações plasmáticas de tiamina nos pacientes DM1 em comparação aos controles; (5) um aumento na expressão de B2M no sedimento urinário de pacientes DM1 com doença renal e (6) um aumento na expressão de TXNIP e B2M nas células renais humanas tratadas concomitantemente com altas concentrações de glicose e albumina glicada. Os resultados do presente estudo sugerem fortemente a participação do sistema TXN e da B2M na etiopatogênese da ND / Diabetic nephropathy (DN) is a major cause of end stage renal disease. Glomerular and tubulointerstitial compartments are affected not only by proteinuria but also by the pro-inflammatory, profibrotic, pro-oxidants and pro-angiogenic effects exerted by hyperglycemia and advanced glycation end products (AGEs) in the development of DN. It is well known that concentrations of oxidative stress markers are increased in patients with diabetes mellitus (DM). The thioredoxin system (TXN) is one of the majors endogenous antioxidant systems; TXN molecule is able to interact with a large number of transcription factors and proteins such as Thioredoxin interacting protein (TXNIP), which has been recognized in the pathogenesis of DM and its complications. Deficiency of thiamine, or B1 vitamin, has been reported in experimental models of DM concomitantly with an increase in its renal clearance. Thiamine transporter 1 (THTR1), encoded by the SLC19A2 gene and Thiamine transporter 2 (THTR2), encoded by the SLC19A3 gene are responsible for thiamine reabsorption in the proximal tubule after glomerular filtration. Studies have shown that increased urinary excretion of thiamine may be a risk predictor for an early decline in kidney function in diabetic patients. Another protein of interest is beta-2-microglobulin (B2M), expressed in situations of inflammation, a well-characterized phenomenon in diabetic tubulopathy. The study of activation or inactivation of intrarenal pathways potentially associated with progression of DN in humans is complicated by the need for renal biopsy. Recently urinary sediment has been used in the evaluation of kidney diseases in an attempt to identify biomarkers that can predict kidney function decline and as a tool for a better understanding of the pathogenesis of this complication. The objective of this work was to study the participation of the target genes TXNIP, TXN, SLC19A2, SLC19A3 and B2M in the pathogenesis of DN in type 1 DM (T1D) patients. We studied the urinary sediment messenger RNA (mRNA) from patients with T1D (n=55); with focal and segmental glomerulosclerosis (FSGS, a non diabetic nephropathy model, n=12) and from control subjects (n=11) to assess the expression of the target genes and their association with the severity of DN. We also studied the mRNA expression of peripheral lymphomononuclear (PLMN) cells from T1D patients (n=162) and control subjects (n=26) in order to compare with the results obtained in the urinary sediment. Plasmatic concentrations of thiamine were also measured in a subgroup of T1D patients and control subjects. In addition, a lineage of human kidney cells was exposed to high glucose concentrations and to glycated and non-glycated albumin to evaluate if AGEs are implicated in the modulation of expression of the target genes. As a result we found that (1) TXNIP and TXN are upregulated in the urinary sediment of T1D patients with kidney disease and TXNIP is associated with the magnitude of glomerular filtration rate decline; (2) TXNIP and TXN are upregulated in PLMN cells from T1D patients; (3) SLC19A2 is upregulated in the urinary sediment of T1D patients with kidney disease; (4) T1D patients present decreased plasmatic thiamine concentrations compared to control subjects; (5) B2M is upregulated in the urinary sediment of T1D patients with kidney disease and (6) TXNIP and B2M are upregulated in human kidney cells exposed concomitantly to high glucose concentrations and glycated albumin. The results of the present study strongly suggest the participation of the TXN system and of B2M in the pathogenesis of DN. Descriptors: diabetes mellitus, diabetic nephropathies, urine, glycosylation end products, advanced, thiamine, thioredoxins, beta 2-microglobulin Diabetic nephropathy (DN) is a major cause of end stage renal disease. Glomerular and tubulointerstitial compartments are affected not only by proteinuria but also by the pro-inflammatory, profibrotic, pro-oxidants and pro-angiogenic effects exerted by hyperglycemia and advanced glycation end products (AGEs) in the development of DN. It is well known that concentrations of oxidative stress markers are increased in patients with diabetes mellitus (DM). The thioredoxin system (TXN) is one of the majors endogenous antioxidant systems; TXN molecule is able to interact with a large number of transcription factors and proteins such as Thioredoxin interacting protein (TXNIP), which has been recognized in the pathogenesis of DM and its complications. Deficiency of thiamine, or B1 vitamin, has been reported in experimental models of DM concomitantly with an increase in its renal clearance. Thiamine transporter 1 (THTR1), encoded by the SLC19A2 gene and Thiamine transporter 2 (THTR2), encoded by the SLC19A3 gene are responsible for thiamine reabsorption in the proximal tubule after glomerular filtration. Studies have shown that increased urinary excretion of thiamine may be a risk predictor for an early decline in kidney function in diabetic patients. Another protein of interest is beta-2-microglobulin (B2M), expressed in situations of inflammation, a well-characterized phenomenon in diabetic tubulopathy. The study of activation or inactivation of intrarenal pathways potentially associated with progression of DN in humans is complicated by the need for renal biopsy. Recently urinary sediment has been used in the evaluation of kidney diseases in an attempt to identify biomarkers that can predict kidney function decline and as a tool for a better understanding of the pathogenesis of this complication. The objective of this work was to study the participation of the target genes TXNIP, TXN, SLC19A2, SLC19A3 and B2M in the pathogenesis of DN in type 1 DM (T1D) patients. We studied the urinary sediment messenger RNA (mRNA) from patients with T1D (n=55); with focal and segmental glomerulosclerosis (FSGS, a non diabetic nephropathy model, n=12) and from control subjects (n=11) to assess the expression of the target genes and their association with the severity of DN. We also studied the mRNA expression of peripheral lymphomononuclear (PLMN) cells from T1D patients (n=162) and control subjects (n=26) in order to compare with the results obtained in the urinary sediment. Plasmatic concentrations of thiamine were also measured in a subgroup of T1D patients and control subjects. In addition, a lineage of human kidney cells was exposed to high glucose concentrations and to glycated and non-glycated albumin to evaluate if AGEs are implicated in the modulation of expression of the target genes. As a result we found that (1) TXNIP and TXN are upregulated in the urinary sediment of T1D patients with kidney disease and TXNIP is associated with the magnitude of glomerular filtration rate decline; (2) TXNIP and TXN are upregulated in PLMN cells from T1D patients; (3) SLC19A2 is upregulated in the urinary sediment of T1D patients with kidney disease; (4) T1D patients present decreased plasmatic thiamine concentrations compared to control subjects; (5) B2M is upregulated in the urinary sediment of T1D patients with kidney disease and (6) TXNIP and B2M are upregulated in human kidney cells exposed concomitantly to high glucose concentrations and glycated albumin. The results of the present study strongly suggest the participation of the TXN system and of B2M in the pathogenesis of DN

A doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA) compreende um espectro de alterações que inclui a esteatose simples e a esteatohepatite não alcoólica e é considerada o componente hepático da Síndrome Metabólica. Estudos já demonstraram que os produtos finais de glicação avançada (AGEs) estimulam a produção de proteínas de matriz extracelular, a geração de espécies reativas de oxigênio e de citocinas pró-inflamatórias por células hepáticas e que poderiam participar da patogênese da DHGNA. Em vista da escassez de informações sobre os efeitos metabólicos dos AGEs no fígado, apesar do seu potencial para causar dano hepático, nós avaliamos os efeitos da administração crônica de albumina modificada por glicação avançada sobre: (1) variáveis associadas com a homeostase glicêmica e a sensibilidade à insulina; (2) a expressão hepática de genes envolvidos na via dos AGEs, no metabolismo da glicose e de lípides, no estresse oxidativo e na inflamação; (3) a ativação de proteínas envolvidas na via de sinalização insulínica; (4) a morfologia e o conteúdo de glicogênio hepático. O estudo foi realizado em ratos Wistar que receberam, por via intraperitoneal, 20 mg/kg/peso corporal de albumina de rato modificada (AlbAGE) ou não (AlbCTRL) por glicação avançada durante 12 semanas. A administração crônica de AlbAGE não alterou as concentrações de alanina aminotransferase (ALT) e aspartato aminotransferase (AST) ou outras variáveis analisadas, mas induziu a resistência insulínica, conforme detectado pelo teste de tolerância à insulina (ITT). Os demais resultados, no entanto, sugerem um aumento da sensibilidade insulínica no território hepático, conforme evidenciado pela ativação da serine/threoninespecific protein kinase (AKT), inativação da glicogênio sintase cinase (GSK3), aumento do conteúdo do glicogênio hepático e a diminuição da expressão dos genes da via da gliconeogênese Pck1 e G6pc. Outros resultados observados foram uma redução no conteúdo de gordura hepatica e na expressão dos genes lipogênicos Acaca e Fasn e dos genes pró-inflamatórios Nfkb1, Tnf e Il6. Os mecanismos que poderiam explicar a melhora concomitante da sensibilidade hepática à insulina e do perfil inflamatório após exposição crônica aos AGEs não estão claros, mas incluem a inativação da GSK3beta, enzima que exerce efeitos metabólicos e anti-inflamatórios. Nossos achados devem estar relacionados com a via de administração intraperitoneal empregada neste estudo, que resulta na absorção direta dos AGEs para a circulação portal, o que, por sua vez, torna o fígado a primeira linha de defesa contra a toxicidade desses compostos. Uma vez no fígado, os AGEs desencadeiam respostas adaptativas para contrabalançar os seus efeitos potencialmente prejudiciais / The Nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) comprises a spectrum of conditions that includes simple steatosis and nonalcoholic steatohepatitis and it is considered the hepatic component of the Metabolic syndrome. Studies have shown that advanced glycation end products (AGEs) stimulate the production of extracellular matrix proteins, the generation of reactive oxygen species and of proinflammatory cytokines by liver cells, and that they could participate in NAFLD pathogenesis. In view of the paucity of information regarding the metabolic effects of AGEs on the liver, despite their potential to cause hepatic injury, we evaluated the effects of chronic administration of albumin modified by advanced glycation in (1) variables associated with glucose homeostasis and insulin sensitivity; (2) hepatic expression of genes involved in AGEs, glucose and fat metabolism, oxidative stress and inflammation; (3) activation status of proteins involved in insulin signaling and; (4) hepatic morphology and glycogen content. The study was performed in Wistar rats receiving, by intraperitoneal route, 20 mg/kg/body weight of rat serum albumin modified (AlbAGE) or not (AlbCTRL) by advanced glycation for 12 weeks. Chronic administration of AlbAGE did not alter alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST) concentrations or other evaluated variables, but induced insulin resistance, as detected by the insulin tolerance test. The remaining results, however, suggested an increase in insulin sensitivity in the hepatic territory, evidenced by activation of serine/threonine-specific protein kinase (AKT), inactivation of glycogen synthase kinase (GSK3), increased hepatic glycogen content, and decreased expression of the gluconeogenesis genes Pck1 and G6pc. Other observed findings were a reduction in hepatic fat content, in the expression of the lipogenic genes Acaca and Fasn and of the proinflammatory genes Nfkb, Tnf, and Il6 genes. Mechanisms that could explain the concomitant improvement in hepatic insulin sensitivity and in the inflammatory profile after chronic exposure to AGEs are not clear, but include inactivation of GSK3beta which exerts metabolic and anti-inflammatory effects. Our findings may be related to the intraperitoneal route of administration employed in this study, which results in direct absorption of AGEs into the portal circulation and, it turn, makes the liver the first-line of defense against the toxicity of these compounds. Once in the liver, AGEs trigger adaptive responses to counterbalance their potentially damaging effects

Produtos de glicação avançada (AGE) contribuem para o estresse oxidativo e inflamatório, os quais constituem as bases celulares para as complicações a longo prazo do diabete melito (DM). A albumina é a principal proteína sérica modificada por AGE e afeta adversamente o metabolismo de lípides e a resposta infamatória em macrófagos, a função das ilhotas pancreáticas e a sensibilidade insulínica no músculo. Neste estudo, avaliamos o efeito da administração crônica de albumina AGE, associada ou não ao tratamento com N-acetilcisteína (NAC), sobre a sensibilidade periférica à insulina, infiltrado total e perfil de macrófagos, transcriptoma do tecido adiposo periepididimal e padrão de diferenciação de macrófagos peritoneais em ratos saudáveis. Albumina AGE foi produzida pela incubação de albumina de rato com glicolaldeído 10 mM, durante 4 dias a 37 °C, em agitação, no escuro. Albumina controle (C) foi preparada na presença de PBS apenas. Ratos Wistar com 4 semanas de idade foram divididos aleatoriamente em quatro grupos experimentais (n = 7-8), os quais receberam injeção intraperitoneal diária de albumina C ou albumina AGE (20 mg/Kg/dia) concomitantemente ou não a administração da NAC (600mg/L de água) (grupos albumina C + NAC e albumina AGE + NAC), durante 90 dias consecutivos. Parâmetros bioquímicos foram determinados por técnicas enzimáticas, peroxidação lipídica, pela medida de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) na urina, expressão gênica, por RT-qPCR, e conteúdo proteico, por imuno-histoquímica. AGE total foi determinado por ELISA, carboximetil-lisina (CML) e pirralina (PYR), por cromatografia líquida/espectrometria de massa. O tecido adiposo periepididimal foi analisado por estereologia. A concentração de AGE total, CML e PYR foi, respectivamente, 9,2, 7000 e 235 vezes maior na albumina AGE em comparação à C. Consumo de ração, massa corporal, pressão arterial sistólica e concentração plasmática de colesterol total, triglicérides, ácidos graxos livres, glicose, insulina, ureia, creatinina, alanina aminotransferase, aspartato aminotransferase e excreção urinária de proteínas (24 h) foram semelhantes entre os grupos. A NAC reduziu em 1,4 e 1,6 vezes a concentração urinária de TBARS nos animais tratados com albumina AGE + NAC, em comparação aos grupos AGE e C+NAC, respectivamente. A albumina AGE reduziu em, aproximadamente, 1,4 vezes a sensibilidade à insulina em comparação ao C, o que foi prevenido pela NAC. O peso relativo do tecido adiposo periepididimal, a fração de área e o volume dos adipócitos foram semelhantes entre os grupos experimentais. Maior infiltrado macrofágico, (células F4/80 positivas), foi observado nos animais tratados com albumina AGE (1,3 x), o que também foi prevenido pela NAC. CD11b e CD206 permaneceram inalterados. O tratamento com albumina AGE também não alterou a expressão do mRNA de Ager (RAGE), Ddost (AGE-R1), Cd36, Nfkb1, Il6, Il10, Tnf, Nos2, Il12. No entanto, Itgam (CD11b - M1) e Mrc foram reduzidos no grupo AGE + NAC em comparação a C + NAC (2 e 1,9 x) e AGE (1,8 e 1,5 x, respectivamente). Aumento do mRNA de Slc2a4 (GLUT-4) e Ppara foi observado nos animais tratados com albumina AGE + NAC em comparação a C + NAC (Slc2a4: 1,6; Ppara 2,2 x) e AGE (2,3; 3,3 x). A albumina AGE contribuiu para maior expressão do Col12a1 (3,1 x) em relação ao C. Análise de macrófagos isolados da cavidade peritoneal apontaram elevação no mRNA de Il6 (2,6 x) e Ddost (1,4 x) no grupo AGE em relação ao C. Ddost também foi aumentado (1,2 x) no grupo AGE + NAC quando comparado ao C+NAC. Além disso, a NAC favoreceu o aumento do Arg1 (arginase 1) nos grupos albumina C + NAC (2,5 x) e AGE + NAC (2,6 x) quando comparados aos seus respectivos controles. Em conclusão, a albumina AGE favorece o infiltrado de macrófagos no tecido adiposo o que evidencia a sensibilização deste território à ação dos AGE e pode, a longo prazo, contribuir para piora na resistência à insulina, observada neste modelo animal. A NAC antagoniza os efeitos da albumina AGE e exerce, por si, efeitos benéficos sobre o perfil de diferenciação de macrófagos no tecido adiposo e peritônio, resposta inflamatória, peroxidação lipídica e resistência insulínica. A NAC pode ser uma ferramenta útil na prevenção das ações dos AGE sobre o desenvolvimento de resistência insulínica e complicações do DM / [Thesis]. São Paulo: \"Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo, 2016\". Advanced glycation end-products (AGE) contribute to oxidative and inflammatory stress, which constitute the cellular basis for long-term complications of diabetes mellitus (DM). Albumin is the major serum protein modified by AGE and adversely affects macrophage lipid metabolism and inflammatory response, pancreatic islet function and muscle insulin sensitivity. We investigated the effect of chronic administration of AGE-albumin, associated or not with N-acetylcysteine (NAC) treatment, in peripheral insulin sensitivity, macrophage infiltration and polarization and transcriptome of periepididimal adipose tissue and peritoneal macrophage differentiation in healthy rats. AGE-albumin was prepared by incubating rat albumin with 10 mM glycolaldehyde for 4 days, 37 °C, under shaker, in the dark. Control albumin (C) was incubated with PBS alone. Four-weeks old male Wistar rats (n = 7-8/group) were randomized into four groups receiving daily intraperitoneal injections of C or AGE albumin (20 mg/kg/day) alone or together with NAC (600mg/L drinking water) (C + NAC albumin and AGE + NAC albumin), for 90 consecutive days. Biochemical parameters were determined by enzymatic techniques, lipid peroxidation by the measurement of urinary thiobarbituric acid reactive substances (TBARS), gene expression by RT-qPCR and protein content by immunohistochemistry. Total AGE was determined by ELISA and carboxymethyllysine (CML) and pyrraline (PYR) by liquid chromatography/ mass spectrometry. Periepididimal adipose tissue was analyzed by stereology. Total AGE concentration, CML and PYR were, respectively, 9.2, 7000 and 235 times higher in AGE albumin as compared to C. Food consumption, body weight, systolic blood pressure and plasma total cholesterol, triglycerides, free fatty acids, glucose, insulin, urea, creatinine, alanine aminotransferase, aspartate aminotransferase and urinary protein excretion (24 h) were similar among groups. NAC reduced urinary TBARS in AGE + NAC group as compared to AGE (1.4 x) and C + NAC (1.6 x), respectively. AGE albumin reduced 1.4 times the insulin sensitivity as compared to C albumin; this was prevented by NAC. Adipose tissue relative weight, adipocyte area fraction and volume were similar among groups. A higher (1.3 x) macrophage infiltrate (F4/80 positive cells) was observed in AGE albumin treated animals in comparison to those treated with C albumin and this was prevented by NAC. CD11b and CD206 were unchanged as well as mRNA de Ager (RAGE), Ddost (AGE-R1), Cd36, Nfkb1, Il6, Il10, Tnf, Nos2 and Il12. Itgam (CD11b - M1) and Mrc (CD206 - M2) were reduced in AGE + NAC group in comparison to C + NAC (2 and 1.9 x, respectively) and AGE (1.8 and 1.5 x, respectively). Increased Slc2a4 (GLUT-4) and Ppara mRNA were observed in AGE + NAC group in comparison to C + NAC (Slc2a4: 1.6 x; Ppara: 2.2 x) and to AGE (Slc2a4: 2.3 x; Ppara: 3.3 x). AGE albumin increased the expression of Col12a1 in 3.1 times as compared to C albumin. In peritoneal macrophages there was an increase in Il6 (2.6 x) and Ddost (1.4 x) in AGE group as compared to C. Ddost was also 1.2 times increased in AGE + NAC as compared to C+NAC. NAC increased Arg1 (arginase 1) in C + NAC (2.5 x) and AGE + NAC (2.6 x) as compared to their respective controls. In conclusion, AGE albumin favors macrophage infiltration in adipose tissue promoting over time tissue sensitization to AGE that may contribute to worsening insulin resistance in this animal model. NAC antagonizes the effects of AGE albumin and by itself has beneficial effects in macrophage differentiation in adipose tissue and peritoneal cavity, inflammatory response, lipid peroxidation and insulin sensitivity. NAC may be a useful tool in the prevention of AGE actions on the development of insulin resistance and long-term complications of DM