Introdução: Obesidade é uma questão de saúde pública em muitos países, inclusive no Brasil. O excesso de peso atinge 1 bilhão de adultos no mundo e, no Brasil, já é um problema maior que a desnutrição. O glutamato monossódico (GMS) é um agente flavorizante utilizado em níveis crescentes nos alimentos industrializados. O GMS administrado em ratos ocasiona obesidade e diminuição do hormônio do crescimento (GH). Objetivo: Avaliar o efeito do GMS nos fetos de ratas prenhas através da comparação do peso, comprimento nasal-anal (CNA) e índice de Lee (IL) ao nascimento e com 21 dias de vida. Métodos: Utilizamos ratas prenhas da linhagem Wistar divididas em três grupos: grupo controle (GC), G10 e G20. Estes, respectivamente, foram alimentados com ração contendo 0, 10 e 20% de GMS desde o período de acasalamento até o final da amamentação. Resultados: O peso e o CNA não foram diferentes entre os grupos ao nascimento. O grupo G20, ao nascimento, teve IL menor que o grupo GC (p < 0,05) e, aos 21 dias de vida, apresentou peso e CNA menores que o grupo G10, o qual foi menor que o GC (p < 0,01). O grupo G20, aos 21 dias de vida, teve IL semelhante aos outros dois grupos. O percentual de ganho de peso do nascimento ao 21º dia de vida foi menor no G20 em relação aos outros dois grupos (p < 0,01). O grupo G20 teve percentual de aumento de CNA do nascimento ao 21º dia de vida menor que o grupo G10, e este menor que o grupo GC (p < 0,01). Conclusões: O GMS nas concentrações de 10 e 20% na ração de ratas prenhas Wistar apresentou uma relação dose-dependente nas variáveis peso e CNA. Houve diminuição no padrão de ganho de peso e de aumento de CNA do nascimento ao 21º dia de vida com uso de GMS. O IL na prole do grupo G20 aumentou em relação ao do grupo GC após 3 semanas de acompanhamento. / Objective: Determine the effects of the MSG (monosodium glutamate) in the offspring of pregnant rats through the comparison of the weight, NAL (nasal-anal length) and IL (Index of Lee) at birth and with 21 days of life. Research Methods & Procedures: We have investigated pregnant Wistar rats and their offspring and divided them into 3 groups: GC, G10 and G20. Each of the groups received 0%, 10% and 20% of MSG, respectively from coupling until the end of the weaning period. Results: Neither weight nor NAL were different among the groups at birth. The group G20 at birth had an IL lower than the group GC (p<0,05) and with 21 days of life presented weight and NAL lower than the groups G10 and this lower than the GC (p<0,01). Otherwise the G20 at 21 days of life had the IL similar to the other two groups. The weight profit percentage from birth to the 21st day of life was lower in the G20 regarding the other two groups (p<0,01). The G20 had a NAL increase percentage from birth to the 21st day of life lower than the G10 and this lower than the GC (p<0,01). Conclusions: MSG presented a dose-dependent relation in the variables weight and NAL. It caused a decrease in the growth pattern as well as in the weight gain pattern until the 21st day of life. The IL of the group 20% had an increased in relation to the control group after 3 weeks of follow up.

Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2016-12-01T12:36:12Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) DISSERTAÇÃO_SUÊNIA_RG.pdf: 2120319 bytes, checksum: 3282857c01e879a00796958f4df66f2f (MD5) / Made available in DSpace on 2016-12-01T12:36:12Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) DISSERTAÇÃO_SUÊNIA_RG.pdf: 2120319 bytes, checksum: 3282857c01e879a00796958f4df66f2f (MD5) Previous issue date: 2016-02-19 / CNPq / Glutamato monossódico (MSG) é um aminoácido neuroexcitatório utilizado como reforçador do sabor dos alimentos. Está envolvido em diversos processos neuropatológicos, através do mecanismo chamado excitotoxicidade. Por outro lado, o exercício físico induz efeitos positivos no sistema nervoso de mamíferos. Neste trabalho, investigamos, em ratos sedentários e exercitados, os efeitos neurais do MSG, administrado por via orogástrica (gavagem) ou por aplicação tópica cerebral. Ratos Wistar receberam MSG (2 ou 1g/kg, respectivamente; grupos MSG-2 e MSG-1), ou água (grupo controle), nos dias pós-natais (P) 7 a 27. No P28-33, os três grupos foram subdivididos em exercitados (esteira motorizada, 3 semanas, 5 dias/semana, 30 minutos/dia) ou sedentários. No P53-60, sob anestesia, registramos o fenômeno designado como depressão alastrante cortical (DAC). Como observado previamente (tratamento subcutâneo), o tratamento com MSG por gavagem aumentou a velocidade da DAC de maneira dose-dependente comparado com grupo controle. O exercício diminuiu essa aceleração, sugerindo que exerceu influência no desenvolvimento e função cerebral. Três grupos adicionais sem tratamento prévio receberam, durante o registro da DAC, aplicação tópica cortical de MSG em três concentrações (25, 50 e 75 mg/ml). O MSG tópico, ao contrário da gavagem, reduziu a velocidade da DAC de forma reversível, dependente da concentração. Os resultados opostos (MSG por gavagem facilitou, e topicamente dificultou a DAC) sugerem mecanismos de atuação diferentes. Sugere-se cuidado em utilizar MSG como reforçador do sabor dos alimentos, principalmente no organismo em desenvolvimento. / Monosodium glutamate (MSG) is an excitatory amino acid used as a food flavor enhancer ("flavoring agent"). MSG administered to newborn rats in systemic and repetitive way is involved in a wide range of pathological processes, through the mechanism called excitotoxicity. On the other hand, exercise induces a positive effect on the mammalian nervous system. In this work, we investigated the phenomenon known as cortical spreading depression (CSD), in rats treated with MSG and/or treadmill exercise. In addition, we studied the effect of cortical topical treatment with MSG on the CSD parameters. Wistar rats received per gavage MSG (2 or 1g / kg, respectively; MSG-2 and MSG-1 groups) or water (control group) in postnatal days (P) 7 to 27. In P28-33, the three groups were subdivided in exercised (treadmill, 3 weeks, 5 days/week, 30 minutes/day) or sedentary. At P53-60, we recorded the CSD and analyzed its propagation velocity, amplitude and duration. Confirming previous observations, MSG administered per gavage increased the CSD velocity in a dose-dependent manner compared with control group, and the treadmill exercise diminished this acceleration, suggesting that it influenced brain development and functioning. Three additional groups, previously untreated, were used to investigate the effect of topical application of three different concentrations of MSG (25, 50 and 75 mg/ml) during the electrophysiological recording. In contrast to the gavage treatment, topical treatment with MSG reduced significantly and reversibly the CSD propagation velocity. The opposite results suggest different mechanisms for gavage and topical action of MSG. Data suggest caution in the use of MSG as a reinforcer of food flavor, especially in the developing organism.

Orientadores: Felix Guillermo Reyes Reyes, Claudio Antonio Barbosa de Toledo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-17T12:09:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Freitas_ThaisFernandaPintodeAlmeida_M.pdf: 1160984 bytes, checksum: b9379e4fd16f451c0710b2ca37537085 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: Alimentar-se faz parte da cultura do ser humano nao estando unicamente associado a necessidades fisiologicas. Um alimento e constituido de diversas moleculas dentre elas os aminoacidos. O glutamato (GLU) e o anion de um dos principais aminoacidos encontrados nos alimentos que, alem de fazer parte da composicao dos alimentos, e uma molecula essencial para a fisiologia do ser humano. Pode tambem ser ingerido devido ao uso do aditivo alimentar glutamato monossodico (MSG). O GLU desempenha inumeras funcoes no organismo, dentre elas podemos citar: neurotransmissor excitatorio do sistema nervoso central, precursor de GABA e de aminoacidos como prolina e glutamina. Como neurotransmissor o GLU atua sobre quatro tipos de receptores: ionotropicos (AMPA, Kainato e NMDA) e metabotropicos (mGluR1-mGluR8) divididos em tres grupos de acordo com a sua homologia genetica e mecanismos de acao. Esses receptores estao presentes em praticamente todo o sistema nervoso central (SNC) e em outros orgaos como coracao, pulmao e intestino. O MSG e utilizado como realcador de sabor em todo o mundo, sendo que o descobrimento do gosto basico conferido pelo glutamato propiciou a producao industrial do seu sal, glutamato monossodico. O gosto basico conferido pelo glutamato e denominado de Umami, que traduzido do japones significa gosto bom, delicioso. Existem inumeros estudos sobre o uso do MSG como aditivo alimentar (funcao tecnologica), assim como sobre sua funcao fisiologica e seus efeitos no organismo de mamiferos. Organizacoes internacionais e agencias de regulamentacao de muitos paises tem reportado e/ou avaliado que o uso do MSG como aditivo alimentar e seguro. Todavia, alguns autores tem relatado efeitos adversos no sistema nervoso central (SNC) associados a exposicao ao MSG. Assim, o presente estudo teve como objetivo exibir dado morfologico sobre a localizacao do receptor mGluR8 no nucleo arqueado do hipotalamo (NARC) de ratos Wistar e avaliar o efeito da ingestao de dietas adicionadas de diferentes concentracoes de MSG (0% (controle), 1%, 2,5% e 5%) sobre o mGluR8. Tambem foi avaliado o ganho de peso corporeo entre os grupos de animais alimentados com as dietas adicionadas de diferentes concentracoes de MSG. Para evidenciar a presenca do receptor mGluR8 foi utilizada a tecnica de imunohistoquimica. Para avaliar o ganho de peso corporeo os animais foram pesados semanalmente. Todos os dados, tanto da contagem celular da tecnica de imunohistoquimica quanto da pesagem, foram analisados por analise de variancia. Os resultados obtidos indicam nao haver diferenca significativa (p <0,05) entre os ratos que ingeriram as dietas adicionadas das diferentes concentracoes de MSG, tanto para o ganho de peso corporeo como para a presenca de receptores mGluR8 no nucleo arqueado do hipotalamo (NARC) / Abstract: Food is part of human culture not only associated to physiological needs. Food is composed of several molecules among them amino acids. Glutamate (GLU) is the anion of one of the main amino acids found in foods that, besides being part of the food composition, is a molecule essential for human physiology. It can also be ingested due to the use of the food additive monosodium glutamate (MSG). The GLU performs many functions in the body, among them we could mention: excitatory neurotransmitter in the central nervous system, precursor of GABA and other amino acids such as proline and glutamine. As a neurotransmitter GLU acts on four types of receptors: ionotropic (AMPA, NMDA and kainate) and metabotropic (mGluR1-mGluR8) divided into three groups according to their genetic homology. These receptors are present in nearly all central nervous system (CNS) and other organs such as heart, lung and intestine. MSG is used as a flavor enhancer all over the world. The discovery of the basic taste due to glutamate, led to the industrial production of its salt, monosodium glutamate. The basic taste induced by glutamate is called Umami, which translated from Japanese, means good taste, delicious. There are numerous studies on the use of MSG as a food additive (technological function), as well as its physiological functions and its effects in the organism. International organizations and regulatory agencies of many countries have reported and / or evaluated that the use of MSG as a food additive is safe. However, some authors have reported adverse effects associated with exposure to MSG. Thus, this study aimed to assess the presences of the metabotropic receptor mGluR8 in the arcuate nucleus of the hypothalamus (ARH) of Wistar rats, and to evaluate the effects in the mGluR8 receptor resulting from the dietary intake of different concentrations of MSG (0% [control], 1%, 2 , 5% and 5%) during 90 days. Also, it was evaluated the body weight gain of the rats fed with the diets containing MSG in the different concentrations. To demonstrate the presence of the mGluR8 receptor immunohistochemistry technique was employed, and in order to elucidate the weight gain, the animals were weighed weekly. All the data, cell counts from the immunohistochemistry technique and from the rats weighing, were evaluated by analysis of variance. The results showed no significant difference (p<0.05) for both: body weight gain and the presence of mGluR8 receptors among the animals that were fed with the diets containing the different MSG levels / Mestrado / Engenharia de Alimentos / Mestre em Ciência de Alimentos

Introdução: Os receptores ionotrópicos do glutamato, como o N-metil-D-Aspartato (NMDA), estão envolvidos em desordens psiquiátricas. NMDARs são complexos heteroméricos que incorporam tres diferentes subunidades: NR1, NR2 e NR3. Objetivos: quantificar os níveis plasmáticos das subunidades NR1 e NR2 NMDAR em pacientes em primeiro episódio psicótico (PEP), em comparação com os irmãos e controles saudáveis. Métodos: Este é um estudo transversal de PEP na região de Ribeirão Preto, Brasil, sendo o grupo controle composto por indivíduos saudáveis, pareados por idade, sexo e mesma área de abrangência dos casos. Foram coletados 5 mL de amostra de sangue próxima a data de diagnóstico de PEP. A quantificação plasmática das subunidades NR1 e NR2 foi realizada por ELISA. Os dados foram analisados por ANOVA (significante se p<0,05) e curva ROC. Resultados: Foram incluídos 166 pacientes em PEP (idade: x = 30,34 ± 12,2 anos; 64% homens), destes 84 com diagnóstico de psicose não afetiva, 51 com transtorno bipolar e 31 com transtorno depressivo. Foram tambem incluídos 76 irmãos e 166 controles saudáveis. Os níveis plasmáticos das subunidades NR1 e NR2 foram significativamente menores em pacientes com transtornos psicóticos (NR1: x = 71,0 ± 100,3 pg/mL, NR2: x = 2,5 ± 2 ng/ml), transtorno bipolar (NR1: x = 185,7 ± 319,5 pg/ml; NR2: x = 2,1 ± 2,2 ng/ml), transtorno depressivo (NR1: x = 83,2 ±185,0 pg/ml; NR2: x = 2,1± 2,1 ng/ml) em comparação com os irmãos (NR1: x = 140,6 ± 193,8 pg/ml; NR2: = 6,2 ± 1,5 ng/ml) e voluntários saudáveis (NR1: x = 146,7 ± 361,1 pg/ml; NR2: x = 4,8 ± 2,2 ng/ml) [NR1 e NR2, p < 0,001]. Indivíduos com valores plasmáticos de NR2 inferiores a 3,648 ng/mL apresentam um risco 14,72 vezes maior de estar doente (PEP) de quem não possui o NR2 abaixo deste valor. Conclusões: Este é o primeiro estudo relatando a quantificação e a redução das concentrações plasmaticas das subunidades NR1 e NR2 em transtornos psiquiátricos graves quando comparados aos irmãos e controles, podendo a subunidade NR2 ser um candidato a biomarcador plasmático em pacientes com PEP. / Background: Ionotropic glutamate receptors, such as N-Methyl-D-Aspartate (NMDA), are involved in pathophysiology of several psychiatric disorders. NMDARs are described as heteromeric complexes incorporating distincts subunits within a repertoire of three types: NR1, NR2 and NR3. Aim: to quantify the NR1 and NR2 subunits NMDAR plasma levels in patients with first episode psychosis (FEP), compared with siblings and healthy controls. Methods: This is a cross-sectional study of FEP conducted in Ribeirão Preto, Brazil. The control group were composed by healthy subjects matched for age, sex and same coverage area of cases. 5 ml of blood sample were collected next to the date of FEP diagnosis. NR1 and NR2 subunits plasmatic quantification was performed by ELISA. Data were analyzed by ANOVA (significant at p < 0.05) and ROC curve. Results: FEP sample comprised 166 patients (age: x = 30.34 ± 12.2 years; 64% men), of these 84 with a diagnosis of psychotic disorder, 51 with bipolar disorder and 31 with depressive disorder. It was also included 76 siblings and 166 healthy controls. NR1 and NR2 subunits plasma levels were significantly lower in patients with psychotic disorders (NR1: x = 71.0 ± 100.3 pg / ml, NR2: x = 2.5 ± 2 ng/ml), bipolar disorder (NR1: x = 185.7 ± 319.5 pg/mL; NR2: x = 2.1 ± 2.2 ng/ml), depressive disorders (NR1: x = 83.2 ± 185.0 pg/mL; NR2: x = 2.1 ± 2.1 ng/ml) compared with siblings (NR1: x = 140.6 ± 193.8 pg/mL; NR2: x = 6.2 ± 1.5 ng/ml) and healthy volunteers (NR1: x = 146.7 ± 361.1 pg / mL; NR2: x = 4.8 ± 2.2 ng/ml) [NR1 and NR2, p < 0.001]. Interestingly, individuals with NR2 plasma values less than 3.648 ng/ml present 14.72 times a higher risk to be in FEP than other patients. Conclusions: This is the first study reporting the measurement and reduction of NR1 and NR2 subunits plasma concentrations in severe psychiatric disorders when compared to siblings and controls. And highlighting that NR2 subunit can be a candidate for plasma biomarker in patients with FEP.

As células T exercem papel crucial nas respostas imunes adaptativas e em doenças autoimunes, como a esclerose múltipla. O glutamato, neurotransmissor mais abundante no SNC, age por meio de duas famílias de receptores: metabotrópico e ionotrópico. As células T são alvo do glutamato durante a ativação e apresentação de antígenos, pois está presente nas sinapses imunológicas, porém, pouco se sabe a respeito de seu papel na função das células T. Nós estudamos o papel do NMDAR nas respostas mediadas por células T. In vitro, o uso do antagonista MK801 reduziu a linfoproliferação e a síntese de IFN-&#947; e IL-17A, bem com o NMDA reduziu a proliferação e produção de IFN-&#947; e IL-17A. In vivo, o MK801 reduziu a gravidade da EAE, resultado da menor infiltração de linfócitos Th1 e Th17 no SNC. Além disso, o MK801 reduziu a expressão de Rorc, Il17a, Stat4, Ccr4, Ccr6 e Ifna2 no SNC. Em suma, esses dados confirmam que o NMDAR exerce papel nas funções mediadas por células T, indicando que as células T são alvos do excesso do glutamato via NMDAR em doenças neuroinflamatórias. / T cells play a crucial role in adaptive immune responses and autoimmune diseases, such as multiple sclerosis. Glutamate is the most abundant neurotransmitter in the CNS, and it acts through two receptor families: metabotropic and ionotropic. T cells are target of glutamate during activation and antigen presentation, because glutamate is also present in the immunological synapses, however, little is known about its role on T cell functions. We investigated the role of NMDAR in immune-mediated T cell responses. In vitro, the use of the antagonist MK801 reduced T cell proliferation and cytokine production (IFN-&#947; e IL-17A), as well as NMDA reduced lymphocyte proliferation and IFN-&#947; e IL-17A production, in a dose dependent manner. In vivo, MK801 diminished severity of EAE, result of the minor Th1 and Th17 infiltration in the CNS. In addition, MK801 reduced Rorc, Il17a, Stat4, Ccr4, Ccr6 and Ifna2 expression in the CNS. In short, our data confirm that the NMDAR play a role in T cell-mediated functions, indicating that T cells are target of glutamate excess via NMDAR in neuroinflammatory diseases.

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2017-09-28T12:03:28Z No. of bitstreams: 1 juliocesargomesgraca.pdf: 1848019 bytes, checksum: f98e75e5c5ca605913fabb43b02b8b5b (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2017-09-28T14:14:08Z (GMT) No. of bitstreams: 1 juliocesargomesgraca.pdf: 1848019 bytes, checksum: f98e75e5c5ca605913fabb43b02b8b5b (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-28T14:14:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 juliocesargomesgraca.pdf: 1848019 bytes, checksum: f98e75e5c5ca605913fabb43b02b8b5b (MD5) Previous issue date: 2017-08-11 / O glutamato, aminoácido não-essencial, é um neurotransmissor excitatório do sistema nervoso central (SNC), sendo liberado durante o impulso nervoso. Em situações de patologia cerebral, o acúmulo de glutamato ocorre no espaço extracelular, causando dano neuronal e, eventualmente, apoptose. Muitos trabalhos relataram que a citotoxicidade do glutamato está associada a várias doenças neurológicas. Neste contexto, o acetato, um ácido graxo de cadeia curta, pode beneficiar o SNC de forma energética e estrutural. A acetil-coenzima A, forma metabolicamente ativa de acetato, é utilizada como substrato em vias bioquímicas envolvidas no metabolismo de carboidratos, lipídios e proteínas, além de aumentar a acetilação das histonas, alterando a expressão de genes inflamatórios. A linhagem celular de neuroblastoma humano SH-SY5Y é comumente usada em estudos relacionados a doenças neurodegenerativas, com uma capacidade de expansão em larga escala antes da diferenciação, enquanto que a linhagem de células-tronco de polpa de dente de leite decíduo esfoliado (SHED) é comumente utilizada em modelos de estudo do comportamento celular. O objetivo desta pesquisa foi avaliar os efeitos do acetato mediante a citotoxicidade causada pelo glutamato em células SH-SY5Y e SHED. Células SH-SY5Y e SHED foram cultivadas, respectivamente, em meio DMEM/F12 suplementado com 10% (v/v) de soro fetal bovino (SFB) e 1% (v/v) de penicilina-estreptomicina, e meio alfa-MEM, suplementado com 10% (v/v) de SFB, 1% (v/v), 1% (v/v) de penicilina-estreptomicina, 0,01 mM de aminoácidos não essenciais e 2 mM L-glutamina. A viabilidade celular em diferentes concentrações de acetato (5 a 75 mM) e glutamato (25 a 150mM) foi medida pelo ensaio MTT. A diferenciação foi realizada em SH-SY5Y pela suplementação do meio com 10 μM de ácido retinóico (AR) e redução de SFB para 1% (v/v) durante 4, 7 e 10 dias em cultura, e em SHED pela substituição do meio de cultivo por DMEM Low-Glicose, suplementado com 10% (v/v) de SFB, 1% (v/v) de penicilina-estreptomicina, 10-7 M de dexametasona, 50 μM de 2-fosfato ácido ascórbico e 2 mM de β-glicerolfosfato, a fim de verificar como essas células respondem à mistura de acetato/glutamato. A análise estatística foi realizada teste ANOVA de uma ou duas vias, bem como pelo teste de Kruskal-Wallis, quando apropriado, com p < 0,05 considerado estatisticamente significativo. Após 7 dias de incubação, as concentrações de 5 e 25 mM de acetato apresentaram menor influência sobre a viabilidade de células SH-SY5Y e SHED, enquanto que o IC50% de glutamato ficou em torno de 75mM e 50mM para estas linhagens, respectivamente. Ao submeter as células ao tratamento combinado de acetato e glutamato, observou-se que o acetato não exerceu citoproteção mediante exposição celular ao glutamato. Após análise qualitativa da diferenciação osteogênica em SHEDs, foi observado maior mineralização nas células tratadas com AR e acetato, em comparação com as células controle. Estudos subsequentes, que permitam identificar como tais células respondem ao acetato em nível molecular, considerando a expressão de ciclinas, compactação da cromatina e a presença de marcadores bioquímicos característicos durante a diferenciação de cada linhagem, por exemplo, poderão fornecer um entendimento mais completo de como esse composto atua na dinâmica metabólica e bioenergética celular. / Glutamate, a non-essential amino acid, is an excitatory neurotransmitter of the central nervous system (CNS), being released during the nerve impulse. In situations of cerebral pathology, the accumulation of glutamate occurs in the extracellular space, causing neuronal damage and, eventually, apoptosis. Many studies have reported that glutamate cytotoxicity is associated with various neurological diseases. In this context, acetate, a short chain fatty acid, can benefit the CNS energetically and structurally. Acetyl-coenzyme A, a metabolically active form of acetate, is used as a substrate in biochemical pathways involved in the metabolism of carbohydrates, lipids and proteins, in addition to increasing the acetylation of histones, altering the expression of inflammatory genes. The SH-SY5Y human neuroblastoma cell line is commonly used in studies related to neurodegenerative diseases, with a large scale expansion capacity prior to differentiation, whereas the stem cell line of exfoliated deciduous teeth (SHED) is commonly used in models of cellular behavior. The objective of this research was evaluate the effects of acetate by glutamate-induced cytotoxicity on SH-SY5Y and SHED cells. SH-SY5Y and SHED cells were cultured respectively in DMEM / F12 medium supplemented with 10% (v/v) fetal bovine serum (FBS) and 1% (v/v) penicillin-streptomycin, and alpha-MEM medium, supplemented with 10% (v/v) FBS, 1% (v/v), 1% (v/v) penicillin-streptomycin, 0.01 mM non-essential amino acids and 2 mM L-glutamine. Cell viability at different concentrations of acetate (5 to 75 mM) and glutamate (25 to 150 mM) was measured by the MTT assay. Differentiation was performed on SH-SY5Y by supplementing the medium with 10 μM retinoic acid (RA) and reducing FBS to 1% (v/v) for 4, 7 and 10 days in culture, and in SHED by replacing the culture medium with DMEM Low-Glucose, supplemented with 10% (v/v) FBS, 1% (v/v) penicillin-streptomycin, 10-7 M dexamethasone, 50 μM ascorbic acid 2-phosphate and 2 mM β- Glycerol phosphate in order to verify how these cells respond to the acetate/glutamate mixture. Statistical analysis was performed one-way or two-way ANOVA, as well as Kruskal-Wallis test, when appropriate, with p < 0.05 considered statistically significant. After 7 days of incubation, concentrations of 5 and 25 mM acetate had less influence on the viability of SH-SY5Y and SHED cells, whereas the IC50% of glutamate was around 75mM and 50mM for these lines, respectively. By subjecting the cells to the combined treatment of acetate and glutamate, it was observed that acetate did not exert cytoprotection through cellular exposure to glutamate. After qualitative analysis of the osteogenic differentiation in SHEDs, greater mineralization was observed in the cells treated with RA and acetate, in comparison with the control cells. Subsequent studies to identify how these cells respond to acetate at the molecular level, considering the expression of cyclins, chromatin compaction, and the presence of characteristic biochemical markers during differentiation of each lineage, for example, may provide a more complete understanding of how this component acts on the metabolic dynamics and cellular bioenergetics.

A ativação excessiva dos receptores NMDA tem sido descrita no disparo da morte neuronal que ocorre em doenças, como o glaucoma. É possível que a combinação de subunidades (NR2A-D) possa ativar vias de sinalização intracelulares que resultam na morte ou sobrevivência. Nosso objetivo foi investigar o envolvimento de subunidades NR2 e Rac1, membro da família Rho GTPase, na morte de neurônios da retina. A morte induzida por glutamato in vitro foi reduzida após a inibição de Rac1 e bloqueio de NR2B, mas não das subunidades NR2C/D. Resultados semelhantes foram obtidos in vivo após injeção intravítrea NMDA, e a detecção de Rac1 ativo, principalmente, nos processos de glia de Müller foi inibida pelo bloqueio NR2B. Além disso, a produção de TNF-<font face=\"Symbol\">&#945; após a injeção de NMDA foi reduzida pelo bloqueio de NR2B e Rac1. Assim, nossos resultados sugerem que a excitotoxicidade via receptores NR2B/NMDA ativa Rac1 em células da glia de Müller, que por sua vez controla a produção de TNF-<font face=\"Symbol\">&#945 possível responsável pela morte de células ganglionares da retina. / Overactivation of NMDA receptors has been described to trigger neuronal death that occurs in diseases such as glaucoma. It is possible that the combination of subunits (NR2A-D) activate intracellular signaling pathways that result in death or survival. Our aim was to investigate the involvement of NR2 subunits and Rac1, a member of Rho GTPase family, in retinal neuronal death. Glutamate-induced neuronal death in vitro was reduced after Rac1 inhibition and by NR2B blocking, but not NR2C/D subunits. Similar results were obtained in vivo after NMDA intravitreous injection, although active Rac1 was mainly detected in Müller glia processes, and it was inhibited by NR2B blockade. In addition, TNF-<font face=\"Symbol\">&#945 level after NMDA injection were reduced by NR2B blocking and Rac1. Thus, our results suggest that excitotoxicity via NR2B/NMDA receptors activate Rac1 in Müller glia cells, which in turn controls the TNF-<font face=\"Symbol\">&#945 production that triggers retinal ganglion cell death.

Os receptores canabinoides do tipo 1 (CB1) e vaniloides de potencial transitório 1 (TRPV1) presentes no córtex pré-frontal medial ventral (CPFMv) modulam de maneira oposta a resposta emocional condicionada (REC) no modelo do medo condicionado contextual (MCC). Enquanto a ativação de receptores CB1 reduz as respostas comportamental e cardiovascular da REC, a ativação de TRPV1 aumenta tais parâmetros. Além destes receptores, receptores de glutamato do tipo NMDA e o sistema nitrérgico no CPFMv estão envolvidos na modulação da REC. Possivelmente, tanto a resposta modulada pelo receptor CB1 quanto pelo TRPV1 estão ligadas à modulação da liberação de glutamato e produção de óxido nítrico (NO). Outro neurotransmissor que também possui papel importante na REC é a acetilcolina (ACh) e que provavelmente atua via NO e eCBs. O favorecimento desta neurotransmissão no CPFMv aumenta a REC por meio da ativação de receptores muscarínicos M3. É descrito que a ativação de receptores muscarínicos induz a produção de NO, o qual pode aumentar a liberação de glutamato e, assim, aumentar a REC. Além disso, a ativação de receptores muscarínicos também podem induzir a produção de endocanabinoiodes (eCBs), como a anandamida (AEA), neuromoduladores que podem influenciar a liberação de glutamato, via CB1 ou TRPV1 e, consequentemente, podem afetar a REC. Portanto, o objetivo do trabalho foi avaliar se um antagonista CB1 (NIDA41020) e um agonista TRPV1 (capsaicina) atuam através da via NMDA/NO e se o aumento dos níveis de ACh modula a neurotransmissão gluatamatérgicapor meio de eCBs e NO. Ratos wistars com cânulas direcionadas para o CPFMv foram submetidos ao protocolo de medo condicionado ao contexto. No dia seguinte, cateter de polietileno foi implantado na artéria femoral para posterior registro cardiovascular. 24h após, as drogas foram administradas no CPFMv e o tempo de congelamento e a resposta autonômica foram avaliados durante a reexposição ao contexto. Tanto o NIDA quanto a capsaicina aumentaram a expressão da REC, independentemente de a administração ser na porção PL ou IL. A resposta do antagonismo de CB1 parece depender da ativação de TRPV1 e a resposta do antagonismo TRPV1 depende da ativação de CB1. O aumento da REC induzida por antagonista CB1 ou agonista TRPV1 foi prevenida com a administração prévia de antagonista NMDA ou inibidor da enzima nNOS. A administração de um sequestrador de NO ou de um inibidor da enzima guanilato ciclase solúvel (GCs) preveniu apenas a resposta do antagonismo CB1. O aumento da REC evocado pelo agonista TRPV1 foi prevenido com a microinjeção de antioxidante/sequestrador de radicais livres. Desta maneira, os resultados demonstram que no CPFMv o receptor CB1 modula a expressão da REC através da via NMDA/NO/GCs e o receptor TRPV1 através da via NMDA/NO/Estresse nitrosativo. Além disso, a administração de um inibidor da enzima acetilcolinesterase (AChE) aumentou a REC, sendo este efeito prevenido com a administração prévia de antagonista NMDA, inibidor da nNOS, sequestrador de NO, inibidor da GCs e antagonista de receptores TRPV1. O aumento da REC evocado pelo antagonista CB1 e agonista TRPV1 não foi prevenido pela administração local prévia de antagonista de receptores M3. Este resultado indica que a resposta promovida pela ACh modula a neurotransmissão glutamatérgica possivelmente através da produção de NO e ativação de TRPV1pela AEA e que os eCBs não modulam a transmissão colinérgica no CPFMv. Portanto, podemos sugerir que a re-exposição ao contexto aversivo aumenta os níveis de ACh no CPFMv e, assim, ativa receptores M3 que, por sua vez, induzem a produção de eCBs, possivelmente AEA, e NO. O NO atuaria pré- sinapticamente aumentando a liberação de glutamato, e a AEA ativaria receptores TRPV1 pós-sinápticos que ativaria mecanismos de estresse nitrosativo decorrentes da produção do NO. / CB1 and TRPV1 receptors present in the ventromedial prefrontal cortex (vmPFC) have been related in the modulation of defensive behavior, as fear conditioning response. In contextual fear conditioning, CB1 and TRPV1 antagonism increase and decrease, respectively, the behavior and autonomic response during the reexposure to aversive context. CB1 and TRPV1 activation lead to decrease and increase of glutamate release, respectively. Glutamate is an important neurotransmitter in vmPFC involve in cardiovascular and behavioral response. NMDA activation can promote nitric oxide (NO) production, and this mediator could regulate the pre-synaptic and post-synaptic signaling. Another important neurotransmission related to REC and eCBs/NO is Acetylcholine (ACh). AChE inhibitor in vmPFC increase conditioned response expression through M3 receptor activation. Muscarinic activation leads to NO production and this event can increase the glutamate release. Moreover, muscarinic activation also can induce endocannabinoid (eCBs) production and modulation of glutamatergic neurotransmission by CB1 and TRPV1 receptors. Thus, NO and eCBs production by muscarinic activation probably affect conditioned response through glutamate release. Our aim in this study was to investigate if CB1 antagonism and TRPV1 agonism promote an increase in conditioned response by NMDA/NO pathway. In addition, AChE inhibitor inject in vmPFC modulate glutamatergic neurotransmission by NO and eCBs. Male wistars rats with guide cannulas invmPFC were submitted to contextual fear conditioning. 1 day after conditioning, a polyethylene catheter was implanted in the femoral artery for cardiovascular recording. Following 24h, drugs were administrated in vmPFC and freezing behavior and autonomic response was recorded during context reexposure. CB1 antagonism and TRPV1 agonism increased the expression of conditioned emotional response and the response was not different when injected in PL or IL subareas. The response of CB1 antagonism depends on TRPV1 activation and response of TRPV1 antagonism depends on CB1 activation, demonstrating the relation of these receptors. The effect induced by CB1 antagonism and TRPV1 agonism were prevented by an NMDA antagonism and preferential neuronal NO synthase inhibitor. In case of CB1 antagonism, NO scavenger and a soluble guanylate cyclase inhibitor (sGC) also prevented this response, but not response induced by TRPV1 agonism. Effect of TRPV1 agonism was prevented by administration of antioxidant/free radical scavenger. In addition, inhibition of AChE in vmPFC increased the conditioned response and this effect was prevented by NMDA antagonist, nNOS inhibitor, NO scavenger, sGC inhibitor and TRPV1 antagonist. CB1 antagonist and TRPV1 agonist increased conditioned response and M3 antagonist was not able to prevent this effect. Our results demonstrated that the response promoted by ACh modulate glutamatergic neurotransmission through NO and TRPV1 activation (by AEA). Moreover, endocannabinoid system did not affect cholinergic neurotransmission. Therefore, we suggest that reexposure to aversive context increase ACh concentration in vmPFC and thus induce activation of the M3 receptor. M3 receptor promote NO and eCBs production. NO act in pre-synaptic terminalenhancing glutamate release and AEA activate the TRPV1 receptor in the postsynaptic terminal that act by nitrosative stress in NO pathway.

O estudo dos efeitos de neurotransmissores e neuromoduladores em circuitos nervosos tradicionalmente consiste em observar o comportamento de um sistema, ou parte dele, quando exposto a concentrações constantes da droga, ignorando flutuações ou padrões temporais de liberação. Neste trabalho implementamos um protocolo dinâmico e dependente da atividade do próprio sistema nervoso, que permitiu estudar experimentalmente a influência da dinâmica de liberação nos efeitos que glutamato (Glu, 1 mM) e serotonina (5-HT, 10 mM) produzem no padrão emergente de um centro gerador de padrões (CPG). Os experimentos foram realizados no sistema nervoso estomatogástrico de Callinectes sapidus e Callinectes danae (CPG pilórico) durante sua operação normal in vitro, que pode ser caracterizada por sua frequência de burst, número de spikes/burst dos neurônios, duty cycle dos neurônios, etc. A partir da atividade de um dos neurônios do CPG, medida extracelularmente, um algoritmo baseado no protocolo dynamic clamp (interação em tempo real entre tecido nervoso vivo e simulação computacional) identifica em tempo real um padrão de atividade pré-escolhido e dispara um injetor de picolitros semelhante a um picospritzer&reg;, aspergindo uma pequena quantidade de solução com a droga nas vizinhanças dos neurônios e sinapses que compõe o CPG, de onde é retirada por perfusão contínua de solução fisiológica. Assim, podemos comparar o comportamento emergente do CPG quando este é estimulado de maneira síncrona com sua atividade ou de maneira assíncrona, mas de forma que a mesma quantidade média de droga seja aspergida nos dois casos. Nossos resultados demonstram que um mesmo estímulo apresentado de duas maneiras diferentes, para um mesmo circuito nervoso, pode produzir respostas diferentes na mesma célula. O protocolo se mostrou mais eficiente em mostrar diferenças quando a atividade da droga ocorre em uma escala de tempo menor que aquela do comportamento do CPG. Novos estudos devem ser realizados com outros neutrotransmissores e moduladores tanto de ação ionotrópica quanto metabotrópica, para se adequar o protocolo aos diferentes tipos de substâncias. / Studying the effect of neurotransmitters and neuromodulators usually consists in observing the behavior of a system, or part of it, when exposed to stationary concentrations of the drugs that completely lack any time dependency. Here we describe a protocol that we developed to study the changes of the emerging rhythmic pattern of a Central Pattern Generator (CPG) due to the effects of the aplications dynamics of tiny puffs of glutamate (Glu, 1mM) or serotonin (5-HT, 10 mM) to the neurons and their neuropil. We experimented on the stomatogastric nervous system of Callinectes sapidus and Callinectes danae (pyloric CPG) during normal operation in vitro, that was characterized using bursting frequency, neurons number of spikes/burst, their duty cycle, etc. From the extracelular activity of one of the CPG neurons, a dynamic clamp based protocol (real time interaction between living nervous tissue and computer simulation) detected in real time a given pattern of activity present in a burst and triggered a picospritzer to puff a small amount of solution with the drug in the neighborhood of the neurons and synapses of the CPG, from where it was washed through constant perfusion of normal saline. Such arrangement allowed us to address what are the differences on the emerging CPG behavior when the stimuli was activity synchronous or asynchronous, but with the same mean amount of drug delivered in both cases. In general, our results showed that the same stimulus presented in different ways to the same nervous circuit may generate different responses even in a cell level. Finally, the protocol proved to be more efficient when the drug activity time scale is smaller than the time scale of the CPG bursting behavior. In the future we should work with other neuromodulators and neurotransmiters to improve the protocol.

As bioconversões executadas com enzimas, que requerem NADP ou NADPH, são limitadas pela eficiência com que esta substância é mantida na forma particular requerida pelo catalisador ao longo de toda a reação, assim como pela sua recuperação no final do processo. Neste trabalho, foram caracterizadas as enzimas Glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PDH) e Glutamato desidrogenase (GLUDH), além do estudo do reciclo NADP/NADPH em sistema constituído por essas enzimas. Determinou-se a temperatura (30ºC) e pH ótimo da G6PDH (pH 7,5), assim como a temperatura (40ºC) e o pH ótimo (pH 8,0) da GLUDH, além dos volumes e concentrações dos substratos utilizados na hidrólise enzimática. No caso da reação acoplada descontínua, a duração foi de 90min, às temperaturas de 30ºC e 40ºC, utilizando-se o cofator solúvel ou imobilizado. Em ambas as condições, mais de 85% das concentrações iniciais de G6P e NH4+, respectivamente, substratos da G6PDH e GLUDH, foram convertidas, sendo o reciclo NADP/NADPH mantido durante toda a reação. No caso da reação bienzimática em reator contínuo, não foi possível chegar ao estado estacionário da reação e a conversão dos subsratos G6P e NH4+ variaram de acordo com o período do teste. / The Bioconversion performed with enzymes that require NADPH or NADP are limited by the efficiency with which this substance is maintained in the particular form required by the enzyme throughout the reaction, as well as for his recovery at the end of the process. The main aim of this work was to study the NADP/NADPH recycling through a bienzyme coupled reaction constituted by glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH) and glutamate dehydrogenase (GLUDH). The reaction was carried out in the discontinuous or continuous mode. The discontinuous process, which was carried out with soluble or immobilized NADP at 30&#176;C or 40&#176;C, had a total duration of 90min. Independently on the temperature used, around 85% of the initial concentration of glucose 6-phosphate (G6P) and ammonia were consumed, being the recycle of NADP/NADPH maintained throughout the reaction. In the continuous process, the addition of G6P and ammonia into the membrane reactor was made by turns of 2h. During the 15h-process the NADP/NADPH recycling was attained and the mean consumption yield of ammonia and G6P neared 30% and 60%, respectively.