Os esteroides anabolizantes androgênicos (EAA) como o decanoato de nandrolona (ND) são hormônios sintéticos derivados da testosterona. Sabe-se que um dos efeitos mais marcantes da administração abusiva destes esteroides é o aumento do comportamento agressivo. Evidências indicam que altas doses de EAA alteram a morfologia e causam hiperativação de sinapses glutamatérgicas, o que se correlaciona com um fenótipo agressivo exacerbado. Fisiologicamente o glutamato é considerado o principal neurotransmissor excitatório no cérebro de mamíferos, entretanto, em níveis elevados, pode causar hiperexcitabilidade neuronal mediada pelos receptores glutamatérgicos ionotrópicos do tipo N-metil-d-aspartato (NMDAr) e, consequentemente alterações no metabolismo mitocondrial. A terminação da sinalização excitatória glutamatérgica é realizada majoritariamente por transportadores existentes em astrócitos. Neste sentido, o transportador astrocitário de glutamato GLT-1 é responsável por mais de 90% da remoção do glutamato da fenda sináptica, contribuindo significativamente, para a manutenção da homeostasis da sinalizacão glutamatérgica. A administração do antibiótico β-lactâmico ceftriaxona (CEF) aumenta a expressão de GLT-1 e diminui a hiperexcitabilidade glutamatérgica, o que poderia potencialmente contrapor mecanismos cerebrais associados ao aumento do fenótipo agressivo induzidos pelo decanoato de nandrolona (ND). Entretanto, estas possíveis interacões moleculares e comportamentais ainda não foram exploradas. Assim, o objetivo primário deste trabalho foi investigar se o aumento da expressão do transportador astrocitário GLT-1 modula mecanismos glutamatérgicos envolvidos na agressividade induzida pelo ND, e a atividade mitocondrial. Para tanto, camundongos CF-1 machos de 60 dias de idade foram divididos em 4 grupos: veículo oleoso (VEH), nandrolona (ND), ceftriaxona (CEF) e nandrolona+ceftriaxona (ND/CEF). A nandrolona foi injetada por via subcutânea (15mg/Kg) por 19 dias. A ceftriaxona (200mg/Kg) ou solução salina foram administradas intraperitonealmente por 5 dias. Após a última injeção foi avaliada a latência para o primeiro ataque e o número de ataques no teste do intruso. Os animais foram sacrificados logo após o teste, e homogeneizados de córtex foram utilizados para imunoquantificação do GLT-1 e da fosforilação da subunidade pNR2Bser1232 do NMDAr. A atividade mitocondrial foi avaliada em sinaptossoma de cérebro total. Os níveis de glutamato foram medidos no líquido cefalorraquidiano. Comparado com o veículo, o tratamento com ND diminuiu significativamente a expressão do GLT-1, aumentou os níveis de glutamato e a expressão da subnidade pNR2Bser1232 o que foi mecanisticamente associado ao aumento do fenótipo agressivo; diminuicão da latência e aumento do número de ataques ao intruso. Ainda, a ND diminuiu o controle respiratório mitocondrial. A administração de CEF aumentou significativamente a expressão do GLT-1 e diminuiu os níveis de glutamato em relação ao grupo ND, enquanto que os níveis de pNR2Bser1232 e a agressividade foram similar ao grupo controle. No grupo ND/CEF o immunoconteúdo de GLT-1 e de pNR2Bser1232, os níveis de glutamato e o fenótipo agressivo, foram significativamente menores que no grupo ND, e similares ao grupo controle. Ainda, a CEF foi capaz de atenuar o prejuízo no controle respiratório mitocondrial causado pela ND. Nossos resultados demonstram que a interação bidirecional entre o transportador astrocitário GLT-1 e a subunidade pNR2Bser1232 neuronal mediada pelo glutamato, exercem um impacto regulatório no fenótipo agressivo induzido pela ND, e no controle respiratório mitocondrial. Desta maneira, este modelo reforça a importância da homeostasia funcional da sinapse tripartide glutamatérgica no fenótipo agressivo. / Anabolic androgenic steroids (AAS) such as nandrolone decanoate (ND) are synthetic hormones derived from testosterone. It is known that one of the most important adverse effects of abusive administration of these steroids is the increase in aggressive behavior. Evidence indicates that high doses of AAS alter morphology and cause hyperactivation of glutamatergic synapses which correlates with an aggressive exacerbated phenotype. Physiologically, glutamate is considered the main excitatory neurotransmitter in the mammalian brain. At high glutamate levels, occurs neuronal hyperexcitability mainly trhough the ionotropic N-methyl-d-aspartate (NMDAr) type of glutamatergic receptors and, consequently, changes in mitochondrial metabolism. Existing transporters in astrocytes predominantly perform the termination of glutamatergic excitatory signaling. In this sense, the GLT-1 glutamate astrocytic transporter is responsible for more than 90% of glutamate removal from the synaptic cleft, contributing significantly to the maintenance of glutamatergic signaling homeostasis. Administration of the β-lactam antibiotic ceftriaxone (CEF) increases GLT-1 expression and decreases glutamatergic hyperexcitability, which could potentially counteract brain mechanisms associated to increased aggressive phenotype mediated by nandrolone decanoate (ND). However, a possible molecular and behavioral interaction has not yet been explored in context. Thus, the primary objective of this work was to investigate whether increased expression of the GLT-1 astrocyte transporter modulates the glutamatergic mechanisms involved in ND-induced aggressive phenotype, and mitochondrial activity. Sixty-day-old male CF-1 mice were divided into 4 groups: oil vehicle (VEH), nandrolone (ND), ceftriaxone (CEF) and nandrolone + ceftriaxone (ND / CEF). Nandrolone was injected subcutaneously (15mg / kg) for 19 days. Ceftriaxone (200mg / kg) or saline solution were administered intraperitoneally for 5 days. After the last injection, the latency for the first attack and the number of attacks on the intruder test were evaluated. The animals were sacrificed after the test, and homogeinized cortex were used for immunoquantification of GLT-1 and phosphorylation of the NMDAr pNR2Bser1232 subunit. Mitochondrial activity was evaluated in total brain sinaptossomes. Glutamate levels were measured in the cerebrospinal fluid. Compared to the vehicle group, treatment with ND significantly decreased the expression of GLT-1, increased glutamate levels and expression of the pNR2Bser1232 which was mechanistically associated with an increase in the aggressive phenotype; decrease in the latency and increase in the number of attacks. Also, ND decreased mitochondrial respiratory control. Administration of CEF significantly increased GLT-1 expression and decreased glutamate levels relative to the ND group, whereas pNR2Bser1232 levels and aggressive phenotype were similar to the control group. In the ND / CEF group the expression of GLT-1 and pNR2Bser1232, glutamate levels and aggressive phenotype were significantly lower than in the ND group, and similar to the control group. Furthermore, CEF was able to attenuate the alteration in the mitochondrial respiratory control caused by ND. Our results demonstrated that the levels of glutamate astrocytic transporter GLT-1 and pNR2Bser1232 are important mechanism behind the increased aggressive phenotype induced by ND, and decreased mitochondrial respiratory control. Also, this model reinforces the importance of glutamate levels and astrocytic molecular targets in the regulation of the aggressive phenotype.

Álcool e cigarro sãodrogas de abuso que causam inúmeros malefícios a saúde humana e estão associados a milhões de mortes por ano. No entanto, poucos estudos avaliam o efeito de seu uso combinado. Nosso objetivo foiavaliar o efeito da sua associação sobre parâmetros neurotróficos, neuroinflamatórios, oxidativos e comportamentais de ratos. Ratos Wistar, machos, adultos, foram administrados com veículo ou 2g/kg de álcool, via oral (gavagem). Imediatamente após a administração do álcool, eram colocados em câmaras para exposição ao ar ambiental ou fumaça de 6 cigarros, 2 vezes/dia, por 28 dias.No 26º dia foi realizado o teste de memória (esquiva inibitória)para avaliação da memória decurta duração. No 28º dia, após eutanásia, hipocampo, córtex frontal e estriado foram dissecados para avaliação dos parâmetros neurotróficos e neurotransmissoresatravés do fator neurotrófico derivado do encéfalo (BDNF) e glutationa sintetase (GS), neuroinflamatórios pela quantificação das citocinas fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) e interleucina 1 beta (IL-1) e oxidativos pela determinação de glutationa (GSH) e diclorofluoresceína diacetato (DCFH-DA). Sangue troncular foi coletado para determinação de espécies reativas. Comportamento alimentar e hídrico, bem como variação de peso também foram monitorados. Nossos resultados mostramque os parâmetros neurotróficos, inflamatório e oxidativo variam de acordo com a área encefálica e tipo de tratamento. O uso combinado de álcool e fumaça de cigarro diminuiu BDNF e aumentou IL-1 nas três áreas encefálicas, enquanto TNF-α aumentou no estriado e córtex frontal. Aumento das espécies reativas foi detectado apenas no hipocampo. Memória de curta duração não foi afetada. Os animais expostos à fumaça de cigarro ganharam menos peso e reduziram a ingestão de ração. Portanto, a associação entre álcool e cigarro potencializa mecanismos neurodegenerativos no encéfalo de ratos, representando maior risco para a saúde humana do que seu uso isolado. / Alcohol and cigarettes are drugs of abuse that cause innumerable human health hazards and are associated with millions of deaths each year. However, few studies evaluate the effect of their combined use. Our objective was to evaluate the effect of its association on neurotrophic, neuroinflammatory, oxidative and behavioral parameters of rats. Adult male Wistar rats were given either vehicle or 2 g/kg alcohol via oral (gavage). Immediately after administration of the alcohol, they were placed in chambers for exposure to ambient air or 6 cigarette smoke, twice a day, for 28 days. On the 26th day, the memory test (inhibitory avoidance) was performed to evaluate short-term memory. On the 28th day, after euthanasia, hippocampus, frontal cortex and striatum were dissected to evaluate the neurotrophic parameters and neurotransmitters through brain-derived neurotrophic factor (BDNF) and glutathione synthetase (GS), neuroinflammatory by the quantification of cytokines tumor necrosis factor alpha (TNF-α) and interleukin 1 beta (IL-1β) and oxidative by determination of glutathione (GSH) and dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA). Trunk blood was collected for determination of free radicals. Food and water behavior, as well as weight variation were also monitored. Our results show that the neurotrophic, inflammatory and oxidative parameters vary according to the encephalic area and type of treatment. The combined use of alcohol and cigarette smoke decreased BDNF and increased IL-1β in the three encephalic areas, while TNF-α increased in the striatum and frontal cortex. Increased reactive species was detected only in the hippocampus. Short-term memory was not affected. The animals exposed to cigarette smoke gained less weight and reduced feed intake. Therefore, the association between alcohol and cigarette smoking potentiates neurodegenerative mechanisms in the brain of rats, representing a greater risk for human health than its isolated use.

A correta classificação do tipo de DM leva mais precocemente ao tratamento adequado e atualmente é dividida em 4 categorias: DM tipo 1, DM tipo 2, Outros tipos e Diabete Gestacional. O DM tipo 1 é geralmente auto-imune, surge em geral antes dos 20 anos de idade e é dependente de insulina para impedir a cetoacidose. O DM tipo 2 é responsável por mais de 90% dos casos, acontece em geral após os 45 anos, com história familiar e associado à síndrome metabólica. Na categoria “outros tipos”, o Maturity Onset Diabetes of the Young (MODY) é um subtipo que inicia abaixo dos 25 anos, não-dependente de insulina e apresenta herança dominante. No entanto, apesar da classificação definir essas categorias através de características peculiares, pode existir uma sobreposição de quadros, principalmente no DM que inicia no adulto jovem. Assim, novos sistemas de classificação têm sido propostos, empregando a presença da auto-imunidade (anticorpos) e índices de função de célula β (peptídeo-C) para definir a patogênese e nomenclatura mais específicas. O objetivo desta revisão é descrever e analisar o desempenho destas ferramentas diagnósticas na classificação do DM. Os anticorpos evidenciam a auto-imunidade do DM 1. O IAA (insulin auto-antibody) está presente quando o início do DM se dá, principalmente, antes dos 5 anos de idade e o anti- GAD (glutamic acid decarboxylase) tem seu melhor desempenho nos indivíduos com início da doença acima dos 20 anos, sendo o teste que permanece positivo por mais tempo. A medida do peptídeo-C avalia a reserva pancreática de insulina e deve ser realizada com glicemia entre 70-200 mg/dl. A medida após estímulo é a mais estudada e <1,5 ng/ml define o paciente como DM 1. O estímulo com refeição mista é o recomendado pela ADA, mas o teste com 1 mg de glucagon é mais simples e igualmente acurado. Dados em relação à utilização da classificação baseada na medida de diferentes anticorpos dirigidos ao pâncreas classificação A (anticorpos) e β (peptídeo-C) pode ser adotada como um método acurado, relativamente simples e preciso de classificação de DM. / The correct classification of DM type leads to earlier appropriate treatment and is currently divided into 4 categories: type 1 DM, type 2 DM, Other types and Gestational DM. Type 1 DM is generally autoimmune, it usually appears before the age of 20 years, and depends on insulin to prevent ketoacidosis. Type 2 DM accounts for over 90% of the cases, it usually occurs after the age of 45, with a family history and metabolic syndrome. In the category “other types”, Maturity Onset Diabetes of the Young (MODY) is a subtype that begins before the age of 25, is non-insulin dependent and presents a dominant heritage. However, although the classification defines these categories through peculiar characteristics, there may be superimposed pictures, especially in the case of DM which begins in the young adult. Thus, new classification systems have been proposed, using the presence of autoimmunity (antibodies) and β cell (C-peptide) indexes to define the pathogenesis and more specific nomenclatures. The purpose of this review is to describe and analyze the performance of these diagnostic tools in the classification of DM. The presence of antibodies show the autoimmunity of type 1 DM. IAA (insulin auto-antibody) is present mainly before the age of 5 years, and anti-GAD (glutamic acid decarboxylase) performs best in individuals who begin the disease above the age of 20, and its test remains positive longest. The C-peptide measure evaluates the pancreatic reserve of insulin and should be performed with a glycemia between 70-200 mg/dl. Post-stimulus measuring is more widely studied and <1.5 ng/ml defines the patient as DM1. Stimulation with a mixed meal is recommended by ADA, but the test with 1 mg of glucagon is simpler and just as effective. Data on classification A (antibodies), β (Cpeptide) suggest that it may be adopted as an effective, relatively simple and precise method for DM classification.

Mesmo a isquemia sendo a terceira causa de morte em países industrializados, os mecanismos relacionados a esta doença ainda continuam polêmicos e obscuros. Utilizou-se a técnica de privação de oxigênio e glicose (OGD) em fatias do hipocampo de rato para investigar parâmetros mitocondriais, neurais, astrogliais e metabólicos no período de isquemia e durante o período de reoxigenação. Os resultados mostraram uma diminuição na atividade mitocondrial durante o período isquêmico que foi mantido durante todo o período de reoxigenação. Analisando o sobrenadante destas fatias submetidas à OGD, foi observado que os níveis de LDH, NSE e GFAP se elevaram. Com relação aos níveis de lactato, verificou-se sua diminuição durante todos os períodos. Os níveis de S100B estavam elevados somente durante o período de reoxigenação. Este aumento pode ser tanto um mecanismo de neuroproteção desta proteína frente ao insulto ou ainda uma liberação por dano celular astrocitário. Além disso, foi observado um grande aumento nos níveis de glutamato durante a isquemia e este aumento retornou no período de reoxigenação. Por fim, houve uma diminuição na captação de glutamato somente no período de reoxigenação. Todos estes resultados podem ser conseqüência de uma hiper-estimulação dos receptores glutamatérgicos devido ao insulto isquêmico. Em resumo, nosso estudo mostrou alterações em diversos parâmetros neuroquímicos específicos tanto no período isquêmico quanto na reoxigenação, mostrando que cada tipo celular, reage diferentemente frente ao insulto isquêmico na técnica de OGD in vitro. / Stroke is the third cause of mortality in industrialized countries, and the mechanisms related to this disease are polemic and unclear. Oxygen and glucose deprivation (OGD) in acute rat hippocampal slices was performed to investigate mitochondrial, neural, astroglial and metabolic neurochemical parameters at different ischemic and reoxygenation periods. Results showed the mitochondrial activity decrease due energy failure during ischemic insult and reoxygenation time. In the supernatant medium, LDH, NSE and glutamate levels were increased and the lactate decrease by the lack of energy observed in the ischemic period. Parameters such as GFAP, S100B and glutamate uptake suffered alterations only at the reoxygenation period. These results have shown the vulnerability of neurons facing ischemic insult. Meanwhile, it was also observed a delayed injure of astrocytes only at reoxygenation time, which demonstrate the difference between cell types at OGD. In summary, our finding has shown altered at specific neurochemical parameters in OGD in vitro which features the ischemic episodes and reoxygenation periods.

Este trabalho apresenta a continuidade da avaliação farmacológica das substâncias LASSBio-579, LASSBio-580 e LASSBio-581, através de ensaios in vitro e in vivo, em busca de um novo protótipo para o desenvolvimento de novos fármacos antipsicóticos de segunda geração. LASSBio-581 se liga a receptores D2-like (Ki=0,95 μM), 5-HT1A (Ki=1,2 μM) e 5-HT2A (Ki=11 μM) com afinidades moderadas. Esta substância é capaz de reduzir a temperatura corporal de roedores, um efeito provavelmente mediado pela ativação de receptores 5-HT1A, e inibir o desenvolvimento de head-twiches e ear-scratches induzidos pela administração de um antagonista de receptores 5-HT2A. Estes efeitos demonstram a capacidade de LASSBio-581 em modular o sistema serotonérgico in vivo e in vitro. Porém, quanto avaliado em modelos animais preditivos de ação antipsicótica, LASSBio-581 foi inativo. LASSBio-580 também é capaz de se ligar a receptores D2-like (Ki=0,73 μM), 5-HT1A (Ki=0,48 μM) e 5-HT2A (Ki=5,7 μM) com afinidades moderadas. Esta substância não foi capaz de inibir o desenvolvimento do comportamento de escalada nem a redução da temperatura corporal de roedores induzidos por apomorfina, não apresentando potencial atividade antipsicótica nos ensaios realizados. Já LASSBio-579 é capaz de modular três diferentes sistemas neurotransmissores envolvidos na patofisiologia da esquizofrenia: a neurotransmissão dopaminérgica, serotonérgica e glutamatérgica. Esta substância se liga a receptores D2-like (Ki=0,11 μM), 5-HT1A (Ki=0,09 μM) e 5-HT2A (Ki=2,2 μM) com afinidades adequadas para uma molécula protótipo que se liga a múltiplos alvos. Apresenta ação antidopaminérgica in vivo, demonstrada em três modelos animais preditivos de atividade antipsicótica (sintomas positivos): inibição da estereotipia anfetamínica (NEVES et al., 2003), bloqueio do comportamento de escalada induzido por apomorfina e hipotermia apomorfínica. A ação agonista 5-HT1A de LASSBio-579 in vivo foi claramente demonstrada através de ensaios de aferição da temperatura corporal, onde o efeito hipotérmico induzido por esta substância é completamente bloqueado pela pré-administração de WAY 100635. Porém, a habilidade de LASSBio-579 em modular a atividade de receptores 5-HT2A in vivo permanece incerta. Ensaios eletrofisiológicos preliminares demonstraram um aumento da liberação de glutamato induzido por LASSBio-579 que parece ser mediado pela ativação de receptores 5-HT2A, porém comportamentos ou efeitos relacionados a ativação deste sub-tipo de receptor serotonérgico não foram identificados em roedores tratados com LASSBio-579. Além disso, a administração de LASSBio-579 não induziu efeitos catatônicos em camundongos em doses até 12 vezes superiores àquela ativa no modelo do bloqueio do comportamento de escalada induzido por apomorfina. Estes resultados demonstram que a estratégia de planejamento de fármacos baseado na estrutura do ligante empregada neste trabalho se mostrou bem sucedida. LASSBio-579 pode ser considerado um novo protótipo de fármaco antipsicótico de segunda geração, ativo em modelos animais de sintomas positivos da esquizofrenia e com baixo potencial de indução de efeitos motores. Porém, algumas limitações em seu perfil farmacológico pode ser identificadas. A afinidade desta substância por receptores dopaminérgicos e serotonérgicos é considerada moderada e inferior a de antipsicóticos atualmente no mercado. Ainda, LASSBio-579 induziu um prejuízo na coordenação motora em roedores e apresentou um perfil farmacocinético pouco adequado a utilização clinica (CONRADO et al., 2008). Estes dados encorajam a busca de substâncias com um perfil farmacológico superior ao de LASSBio-579. Neste sentido, uma triagem farmacológica de 18 derivados N-fenilpiperazínicos análogos a LASSBio-579 foi realizada. Os resultados obtidos nos ensaios de radioligação a receptores D2-like, 5-HT1A e 5-HT2A foram utilizados na proposição de relações qualitativas entre estrutura química das substâncias e a afinidade apresentada pelos diferentes receptores. A partir dos resultados obtidos in vitro, cinco outras substâncias foram selecionadas para avaliação da potencial atividade frente a sintomas positivos da esquizofrenia no modelo de bloqueio do comportamento de escalada induzido por apomorfina. Neste ensaio, apenas LASSBio-664 apresentou atividade, sem induzir catatonia nos animais. Porém, esta substância também induz um importante prejuízo motor nos animais. Ensaios adicionais são necessários a fim de diferenciar o perfil farmacológico de LASSBio-664 e LASSBio-579. Outro objetivo deste trabalho foi iniciar o desenvolvimento de um modelo animal de sintomas da esquizofrenia. Os resultados obtidos até o momento apontam para a possibilidade do desenvolvimento de um modelo relacionado a sintomas negativos/cognitivos da esquizofrenia baseados na esposição à natação forçada repetida. Foi demonstrado que apenas clozapina e não imipramina é capaz de reverter o aumento de imobilidade ao longo dos dias acarretado pela exposição repetida à natação forçada em roedores. Este dado demonstra uma potencial validade preditiva, o primeiro grau de validação necessário para um novo modelo animal. O efeito de LASSBio-579 também foi avaliado neste procolo experimental. / This study strengthened the pharmacological evaluation of the heterocyclic Nphenylpiperazine derivatives LASSBio-579, LASSBio-580 and LASSBio-581 by means of in vitro and in vivo pharmacological assays searching a new second generations antipsychotic lead compound. LASSBio-581 presented moderate affinitties for D2-like (Ki=0.95 μM), 5-HT1A (Ki=1.2 μM) e 5-HT2A (Ki=11 μM). This compound induced an hypothermic effect in rodents probably mediated by 5-HT1A receptor activation. LASSBio-581 administration inhibited the induction of head-twiches and ear-scratches by a 5-HT2A agonist. These results shown that LASSBio-581 modulates serotonergic neurotransmission in vivo and in vitro. However, it was inactive on animal models predictive of antipsychotic activity. LASSBio-580 presented moderate affinitties for D2-like (Ki=0.73 μM), 5-HT1A (Ki=0.48 μM) e 5-HT2A (Ki=5.7 μM). This compound did not inhibited apomophine-induced climbing nor apomorphine-induced hypothermia. Thus, among the three compounds initially evaluated, LASSBio-579 was the only one that exhibited promising results. This derivative was able to modulate three neurotransmitter systems involved in schizophrenia’s pathophysiology: dopaminergic, serotonergic and glutamateric ones. As a multi-target lead compound, LASSBio-579 presented adequated affinities for D2-like, 5-HT1A and 5-HT2A receptors (Ki D2-like = 0.11 μM, 5-HT1A = 0.093 μM and 5-HT2A = 2.2 μM). Its antidopaminergic in vivo effect was demonstrated in three animal models of positive symptons of schizophrenia: amphetamineinduced stereotypy (NEVES et al., 2003), apomorphine-induced climbing behavior and apomorphine-induced hypothermia. Regarding the serotonergic system, LASSBio-579 was considered a 5-HT1A receptor agonist, since the hypothermia induced by this compound was blocked by WAY 100,635 pre-administration. The ability of LASSBio-579 to modulate 5-HT2A receptors was not fully characterized. Electrophysiological assays demonstrated an increase on synaptic glutamate release induced by LASSBio-579 that may be related to 5-HT2A receptor activation, however this compound did not induce any behavior related to 5-HT2A activation in rodents. In addition, LASSBio-579 did not induce catalepsy in mice at doses 12 folds higher than those active at apomorphine-induced climbing test. Thus, LASSBio-579 represents a new antipsychotic lead compound active in animal models of positive symptoms of schizophrenia and with a mild propensity to induce motor side effects. However, some limitations on LASSBio-579’s pharmacological profile could be identified. The affinity of LASSBio-579 for dopamine and serotonin receptors is moderate and lower than those presented by second generation antipsychotics. Furthermore, this compound induced a mild decrease on locomotion and exploratory behavior, a meaningful motor coordination impairment and presents a limited oral bioavailability and a low brain penetration (CONRADO et al., 2008). Considering this, a pharmacologycal screening of 18 N-phenylpiperazine derivatives were done in order to achieve an optimized analogue of LASSBio-579. Structural features of this molecular scaffold were discussed regarding binding affinity and selectivity for D2-like, 5-HT1A and 5-HT2A receptors. Among the compounds prepared, LASSBio-664 exhibited an adequate binding profile and a potential for schizophrenia positive symptoms treatment without cataleptogenic effects. However, the motor coordination impairment remained. Additional pharmacological characterization of LASSBio-664 is still needed to find differences from LASSBio-579’s profile. Another aim of this study was to start the development of an animal model of schizophrenia symptons. It was shown that clozapine but not imipramine presented an anti-immobility effect in animals repeated exposed to forced swimming. This result points to the usefullness of repeated forced swimming protocol for developing new animal models predictive of antipsychotic action. The effect of LASSBio-579 in this protocol was also evaluated.

Este estudo visou observar os efeitos plásticos induzidos pelo exercício a curto prazo em regiões motoras do encéfalo de ratos. Observou-se a expressão das subunidades GluR1 e GluR2/3. Os animais foram divididos em grupos de: 3 dias(COR3), 7 dias(COR7) e 15 dias(COR15); e um grupo controle(CONT). Empregaram-se as técnicas de imuno-histoquímica e immunoblotting. A expressão de GluR1 no cerebelo, demonstrou um decréscimo em COR3. No hipocampo houve uma queda na expressão em COR3(40%), retornando aos níveis basais em COR7. No córtex cerebral observou-se uma queda da expressão com máxima queda em COR7(52%), retornando à expressão basal em COR15. O estriado não sofreu alterações na expressão de GluR1 ao longo dos primeiros 7 dias, tendo um aumento em COR15(90%). A expressão de GluR2/3 não foi alterada, exceto no cerebelo, onde houve um decréscimo em dois momentos distintos, COR3(55%) e COR15(25%), retornando à expressão basal em COR7. Os nossos dados revelam que o exercício físico a curto prazo foi capaz de promover alterações plásticas ao longo do treinamento. / This study aimed at analyzing the plastic effects of the short-term exercise upon the rat motor area. We check the expression of GluR1 and GluR2/3. We divided into 3 experimental groups based on duration of exercise: 3 days(COR3), 7 days(COR7), and 15 days(COR15); and a control group(CONT). The experimental animals were subjected to a treadmill exercise protocol. The brains were subjected to the techniques of immunohistochemistry and immunoblotting. In the cerebellum, there was a decrease for COR3(17%). In the hippocampus, there was a decrease of the GluR1 expression for COR3 (40%). In the cerebral cortex there was a drop of GluR1 expression for COR3 and COR7(52%). In the striatum, there was no change of GluR1 expression during the first seven days, with a increase for COR15(90%). The GluR2/3 expression did not change in any brain structure analyzed, except in the cerebellum, where there was a significant decrease for two distinct groups, COR3(55%) and COR15(25%). Our data show that short-term physical exercise was able to promote plastic changes during training.

O núcleo acumbens (Acb) é subdividido em core e shell (AcbSh). Há evidências que as divisões do Acb vão além da dicotomia core-shell e que regiões pobres em tirosina hidroxilase (TH) e calretinina (Calr) formam um sistema de corredores no AcbSh. Para detalhar melhor a organização do Acb investigamos a distribuição de TH, Calr, DARPP-32 e do transportador de dopamina (DAT). Em seguida, foi comparada a distribuição destes marcadores com a das subunidades GluA2/3 dos receptores de glutamato do tipo AMPA. Finalmente, exploramos se as aferências pré-frontais são direcionadas à distintos compartimentos do AcbSh. Nossos resultados revelaram que regiões que contém neurônios GluA2/3+ intensamente marcados formam um sistema de corredores no AbSh que coincide com áreas pobres em TH, Calr e DAT. Os experimentos de rastreamento anterógrado indicaram que somente uma pequena parte das aferências pré-frontais é direcionada aos corredores. Nossos resultados delinearam um sistema de corredores no AcbSh que provavelmente constitui um compartimento neuroquímico altamente especializado. / The nucleus accumbens (Acb) is subdivided in core and shell (AcbSh). There is evidence that accumbal subdivisions go beyond this core-shell dichotomy and that regions poor in tyrosine hydroxylase (TH) and calretinin (Calr) form a corridor system in the Acbsh. To better detail accumbal organization, we investigated the distribution of TH, Calr, DARPP-32 and of the dopamine transporter (DAT). Then we compared the distribution of these markers with that of the AMPA-type glutamate receptor subunits GluA2/3. Finally, we explored whether prefrontal afferents are directed to distinct AcbSh compartments. Our findings revealed that regions containing intensely labeled GluA2/3+ neurons form a corridor system in the AcbSh that coincides with regions poor in TH, Calr, and DAT. Anterograde tracing experiments indicated that only a small portion of the prefrontal afferents is specifically related to the corridors. Our findings delineated a complex corridor system in the AcbSh which might constitute a highly specialized neurochemical compartment.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Seizures have important consequences in terms of mortality and quality of life of the affected population, being a risk factor for the development of cognitive and behavioral abnormalities. Considering the promising pharmacological properties of molecules containing selenium, in article 1, we evaluated the anticonvulsant action of 1-(2,5-diphenylselenophen-3-yl)-3-methylpent-1-yn-3-ol, generically called 3-alkynyl selenophene (3-ASP) against seizures induced by pilocarpine (PC), pentylenetetrazole (PTZ) and kainate (KA) in 21-days-old rats. Animals were pre-treated with 3-ASP (10, 25 or 50 mg/kg; per oral, p.o.) or vehicle, 30 minutes before of intraperitoneally administration of PC (400 mg/kg), PTZ (80 mg/kg) or KA (45 mg/kg). 3-ASP pre-treatment (50 mg/kg) abolished seizures and the death induced by PC administration. 3-ASP (50 mg/kg) increased the latency to the first convulsive episode, as well as decreased the mortality and incidence of seizures caused by PTZ and KA. In article 1, the antioxidant activity of 3-ASP (10, 25 or 50 mg/kg; p.o.) against the oxidative stress induced by PC (400 mg/kg, i.p.) in 21-days-old rats was evaluated. Our results demonstrated that 3-ASP pre-treatment was effective in protecting against the inhibition of cerebral activity of superoxide dismutase, decreased ascorbic acid levels, stimulation of catalase activity and increase of reactive species levels caused by PC. Additionally, 3-ASP protected against the inhibition of acetylcholinesterase and Na+, K+-ATPase activities resulting from convulsions induced by PC. The involvement of glutamatergic and GABAergic systems in the anticonvulsant action of 3-ASP was investigated (Articles 1 and 2). The combination of sub-effective doses of 3-ASP (10 mg/kg, p.o.) and diazepam (GABA agonist; 0,5 mg/kg, i.p.), 5S,10R-(+)-5-methyl-10,11-dihydro- 5H-dibenzo[a,d]cyclohepten-5,10-imine maleate (MK-801, a non-competitive N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor antagonist; 0.1mg/kg, i.p.) or 6,7-dinitroquinoxaline-2,3-dione (DNQX, a non-NMDA receptor antagonist; 5 mg/kg, i.p.) was effective in increasing the latency to the first convulsive episode, as well as, in decreasing the incidence of convulsions induced by PC. On the other hand, the combination of 3-ASP and 2-methyl-6-phenylethynyl pyridine hydrochloride (MPEP, an antagonist of metabotropic glutamate receptor mGluR5; 0,5 mg/kg, i.p.) did not protect against convulsions. The oral administration of 3-ASP (50 mg/kg) caused an inhibition of 64% and 58% of GABA uptake in the cortex and hippocampus, respectively. However, no change in glutamate uptake after 3-ASP administration (50 mg/kg) was found. Additionally, in article 2, we investigated the possible interaction between sub-effective doses of 3-ASP and GABA uptake or GABA transaminase (GABA-T) inhibitors against PC-induced seizures in 21-days-old rats. To this, sub-effective doses of 3-ASP (10 mg/kg; p.o.) and DL-2,4-diamino-n-butyric acid hydrochloride (DABA, an inhibitor of GABA uptake; 2 mg/kg; i.p.) or aminooxyacetic acid hemihydrochloride (AOAA; a GABA-T inhibitor; 10 mg/kg, i.p.) were co-administrated in 21-days-old rats before of PC administration (400 mg/kg). The treatment with 3-ASP and DABA abolished the PC-induced seizures. Similar results were found when sub-effective doses of 3-ASP and AOAA were administrated in 21-days-old rats. Finally, in the article 3 we investigated the effect of 3-ASP or diazepam against convulsions, the increased susceptibility to the development of seizures and long term memory impairment resulting from febrile seizures induced by hyperthermia. 21-Days-old rats were pre-treated with 3-ASP (25, 50 or 100 mg/kg; p.o), diazepam (1 or 5 mg/kg; i.p.) or vehicle. After the treatment, animals were exposed to a stream of heated air to approximately 41°C. Thirty days after the exposure to hyperthermia, the susceptibility to the development of seizures and long term memory impairment were evaluated. We verified that the pre-treatment with 3-ASP or diazepam did not protect against stereotyped behavior, facial automatisms and body flexion induced by hyperthermia. The protective effect of 3-ASP (100 mg/kg) against the increased susceptibility to the development of seizures and long term memory impairment resulting from febrile seizures induced by hyperthermia was demonstrated. Diazepam (1 or 5 mg/kg) did not protect against long term memory impairment caused by febrile seizures. In addition, diazepam (1 mg/kg) treatment caused a significant cognitive impairment in animals kept at room temperature. These results suggest that 3-ASP had anticonvulsant action in 21-days-old rats and that this action appears to be mediated by glutamatergic and GABAergic systems. In addition, the anticonvulsant action of 3-ASP seems to be associated with its antioxidant activity. Finally, 3-ASP can represent an important tool to protect against increased susceptibility to seizures and cognitive impairment resulting from febrile seizures. / As convulsões têm conseqüências importantes em termos de mortalidade e qualidade de vida da população afetada, sendo um fator de risco para o desenvolvimento de alterações cognitivas e anormalidades comportamentais. Tendo em vista as promissoras propriedades farmacológicas das moléculas contendo selênio, no artigo 1 avaliamos a ação anticonvulsivante do (1-(2,5-difenilselenofeno-3-il)-3-metilpent-1-in-3-ol, que foi genericamente denominado de 3-alquinil selenofeno (3-ASP) frente as convulsões induzidas por pilocarpina (PC), pentilenotetrazole (PTZ) e cainato (KA) em ratos de 21 dias de vida. Os animais foram pré-tratados com 3-ASP (10, 25 ou 50 mg/kg; per oral, p.o.) ou veículo, 30 minutos antes da administração intraperitoneal (i.p.) de PC (400 mg/kg), PTZ (80 mg/kg) ou KA (45 mg/kg). Verificamos que o pré-tratamento com 3-ASP (50 mg/kg) aboliu as convulsões e a morte induzidas pela administração de PC. O 3-ASP (50 mg/kg) aumentou a latência para o primeiro episódio convulsivo, bem como, diminuiu a mortalidade e a incidência das convulsões causadas por PTZ e KA. Ainda no artigo 1, consideramos importante o estudo da ação antioxidante do 3-ASP (10, 25 e 50 mg/kg; p.o.) frente ao estresse oxidativo induzido pela PC (400 mg/kg, i.p.) em ratos de 21 dias de vida. Os resultados demonstraram que o pré-tratamento com 3-ASP mostrou-se eficaz na proteção contra a inibição da atividade cerebral da superóxido dismutase, diminuição dos níveis de ácido ascórbico, estimulação da atividade da catalase e aumento dos níveis de espécies reativas causadas pela PC. Adicionalmente, o 3-ASP protegeu contra a inibição da atividade da acetilcolinesterase e da Na+,K+-ATPase resultantes das convulsões induzidas pela PC. Em um segundo momento, o envolvimento dos sistemas glutamatérgico e GABAérgico na ação anticonvulsivante do 3-ASP foi verificado (Artigos 1 e 2). A combinação de doses sub-efetivas de 3-ASP (10 mg/kg, p.o.) e diazepam (agonista GABAérgico; 0,5 mg/kg, i.p.), 5S,10R (+)-5-metil-10,11-dihidro-5H-dibenzo [a,d] ciclohepteno -5,10- imina maleato (MK-801; antagonista não-competitivo do receptor NMDA; 0.1mg/kg, i.p.) ou 6,7-dinitroquinoxalina-2,3-diona (DNQX; antagonista de receptores não-NMDA; 5 mg/kg, i.p.) aumentou a latência para o primeiro episódio convulsivo, bem como diminuiu a incidência de convulsões induzidas pela PC. Por outro lado, a combinação de 3-ASP e 2-metil-6-feniletinil piridina hidroclorada (MPEP; antagonista do receptor glutamatérgico metabotrópico do tipo 5; 0,5 mg/kg, i.p.) não apresentou efeito protetor contra os episódios convulsivos. A administração oral de 3-ASP (50 mg/kg) causou uma inibição de 64% e 58% da captação de GABA no córtex e no hipocampo, respectivamente. Entretanto, nenhuma alteração na captação de glutamato após a administração de 3-ASP (50 mg/kg) foi observada. Adicionalmente, no artigo 2 investigamos a possível interação entre doses sub-efetivas de 3-ASP e inibidores da captação de GABA ou da GABA transaminase (GABA-T) frente às convulsões induzidas por PC em ratos de 21 dias de vida. Para isto, doses sub-efetivas de 3-ASP (10 mg/kg; p.o.) e ácido DL-2,4-diamino-n-butírico hidroclorado (DABA - um inibidor da captação de GABA; 2 mg/kg; i.p.) ou ácido aminooxiacético hemihidroclorado (AOAA um inibidor da GABA-T; 10 mg/kg, i.p.) foram co-administrados em ratos de 21 dias de vida antes da administração de PC (400 mg/kg; i.p.). A presença de episódios convulsivos foi avaliada. Verificamos que o tratamento com o 3-ASP e DABA aboliu as convulsões induzidas por PC, corroborando com nossos resultados neuroquímicos. O mesmo foi observado quando foram administradas doses sub-efetivas de 3-ASP e AOAA. Por fim, no artigo 3 investigamos o efeito do 3-ASP ou diazepam frente as convulsões, aumento da susceptibilidade ao desenvolvimento de convulsões e prejuízo na memória a longo prazo resultantes da convulsão febril induzida pela hipertermia. Os ratos de 21 dias de vida foram pré-tratados com 3-ASP (25, 50 ou 100 mg/kg; p.o), diazepam (1 ou 5 mg/kg; i.p.) ou veículo. Após o pré-tratamento, os animais foram expostos a uma temperatura de 41°C. Trinta dias após a exposição à hipertermia, avaliamos o aumento da susceptibilidade ao desenvolvimento de convulsões e prejuízo na memória a longo prazo. Verificamos que o pré-tratamento com 3-ASP ou diazepam não foi capaz de proteger contra o comportamento estereotipado, automatismos faciais e flexão corporal induzidos pela hipertermia. O efeito protetor do 3-ASP (100 mg/kg) contra o aumento da susceptibilidade ao desenvolvimento de convulsões e prejuízo na memória a longo prazo resultantes da convulsão febril induzida pela hipertermia foi verificado. O diazepam (1 ou 5 mg/kg) não protegeu contra o prejuízo na memória a longo prazo causado pela convulsão febril. Além disso, o tratamento com diazepam (1 mg/kg) nos animais mantidos a temperatura ambiente causou um significativo prejuízo cognitivo. Estes resultados sugerem que o 3-ASP apresenta ação anticonvulsivante em ratos de 21 dias de vida e que essa ação parece ser mediada pelos sistemas glutamatérgico e GABAérgico. Além disso, a ação anticonvulsivante do 3-ASP parece estar associada à sua atividade antioxidante. Por fim, o 3-ASP pode representar uma importante ferramenta para a proteção contra o aumento à susceptibilidade às convulsões e o prejuízo cognitivo resultantes das convulsões febris.

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Made available in DSpace on 2015-03-26T13:54:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 646482 bytes, checksum: e24f14a04e6d76f0071ed6751a17d95a (MD5) Previous issue date: 2009-02-10 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The objective in this trial was to evaluate the effects of supplementation with nitrogenous compounds sources on insoluble fiber utilization of through acid lactic bacteria (LAB) growth, microbial protein production, and activity of the enzymes carboxymethilcellulase (CMC) and glutamate dehydrogenase (GDH). Three experiments were carried out. At the first one, four incubations were performed using the ruminal fluid taken from a Holstein x Zebu steer fitted with ruminal canullae and fed signal grass (Brachiaria decumbens Stapf.) pasture plus 200 g/day of supplemental protein. The fluid was collected and centrifuged. The microbial pellet was re-suspended in a basal media and used as inoculum. Eight treatments were evaluated: Cellulose, Cellulose plus Casein, Cellulose plus Soy Peptone, Cellulose plus Urea:Ammonium Sulfate (9:1), Starch, Starch plus Casein, Starch plus Soy Peptone, and Starch plus Urea:Ammonium Sulfate (9:1). The flasks were kept at 39°C with orbital shaking (70 rpm). Successive incubations were done to select the microorganisms according to the energy and nitrogenous sources. After 24 hours of incubation, on the third and fourth transfers, the pH were evaluated and the resulting fluid was diluted and plated on a selective media for LAB according to spread plate technique. After 48 hours the colonies forming units (CFU/mL) were counted. It wasperformed a test to detect the presence of inhibitory substances on the inhibitory activity by using the LAB obtained in the previous procedure. The growth of LAB was favored (P<0.05) when starch was used as energy source compared to cellulose. The true protein sources (soy peptone and casein) increased the growth of these bacteria (P<0.05) compared to control and urea. The pH was not affected by energy source (P>0.05), but the inclusion of urea resulted in higher pH (P<0.05) compared to other sources of nitrogenous compounds. None inhibitory activity was detect on LAB cultures. In the second experiment, three incubations were performed according to the experimental procedures described above. Four treatments were evaluated: Cellulose, Cellulose plus Casein, Cellulose plus Urea:Ammonium Sulfate (9:1), and Cellulose plus Casaminoacids. After the first transfer, a flask of each treatment was taken at 6, 12 and 24 hours of incubation. The microbial enzymes were extracted and the activities of CMC and GHD were evaluated. A second group of flasks was incubated in order to obtain samples at 6, 12 and 24 hours to quantify the concentration of ammonia nitrogen (AN) and microbial protein. In all incubation times higher AN concentration was observes for urea (P<0.05). At 12 and 24 hours of incubation the sources of true protein (casein and casaminoacids) caused increase in AN concentrations compared to control (P<0.05). In a general, the concentration of microbial protein was stable among treatments. The activity of CMC was higher with the use of urea and casaminoacids (P<0.05) compared to control and casein. Supplementation with casaminoacids implied higher activity of GDH (P<0.05) compared to control at 6 hours of incubation, with intermediate positions for casein and urea. At 12 hours, the activity of GDH was also stimulated by casein (P<0.05). At 24 hours the activity of GDH was not different among treatments (P>0.05). In the third experiment three Holstein x Zebu steers, with average initial body weight of 350 kg, fitted with ruminal canullae and kept in individual stalls, were used. The animals were fed Tifton hay (Cynodon sp.), ad libitum. The treatments were: control, without supplementation; supplementation with non-protein nitrogenous compounds (urea: ammonium sulfate, 9:1); and supplementation with true protein (albumin). The level of supplementation with nitrogenous compounds was 1 g/kg body weight in crude protein. The experiment was carried out according to a 3 x 3 Latin square design, with three experimental periods lasting five days each, being three days for the adaptation of animals to supplementation. In the fourth day of each experimental period, samples of rumen fluid were collected at 6, 12 and 24 hours after supplementation to evaluate pH and ruminal AN concentration. At same time, it was carried out an in situ incubation procedure in order to quantify the activity of the enzymes CMC and GHD. The average of the ruminal pH was 6.55, with no differences among treatments and time of evaluation (P>0.05). In a general way, the activity of GHD was increased between times of evaluation (P<0.05). However, there were no differences among treatments (P>0.05). The control treatment show higher activity of the CMC compared to treatments with supplementation (P<0.05). However, supplementation with urea implied higher activities of the CMC than albumin (P<0.05). The sources of nitrogen compounds (urea and albumin) caused increase in RAN concentrations compared to control (P<0.10). The concentrations of RAN decreased from the first moment of evaluation (P<0.10). From those results, it can be concluded that true protein sources cause deleterious effects on utilization of insoluble fibrous substrates because they stimulate the growth of nonstructural carbohydrates degrading bacteria. / Objetivou-se avaliar os efeitos da suplementação com diferentes fontes de compostos nitrogenados sobre a utilização da fibra insolúvel por intermédio da mensuração do crescimento de bactérias ácido-láticas (BAL), produção microbiana e atividade das enzimas carboxi-metil-celulase (CMC) e glutamato desidrogenase (GDH). Foram realizados três experimentos. No primeiro experimento realizaram-se quatro incubações utilizando-se como inóculo o fluido ruminal de um novilho mestiço Holandês-Zebu fistulado no rúmen, e alimentado com pasto de capim-braquiária (Brachiaria decumbens Stapf.) e 200 g/dia de proteína bruta (PB) suplementar. O fluido ruminal coletado foi centrifugado e o pellet de microrganismos re-suspenso em meio basal utilizado como inoculo. Os substratos foram acondicionados em frascos de vidro de forma a compor oito tratamentos: Celulose, Celulose + Caseína, Celulose + Peptona de Soja, Celulose + Uréia:Sulfato de Amônio (9:1), Amido, Amido + Caseína, Amido + Peptona de Soja, Amido + Uréia:Sulfato de Amônio (9:1). Os frascos foram mantidos a 39 ºC, sob agitação orbital (70 rpm). Foram realizadas incubações sucessivas a fim de selecionar os microrganismos em função das fontes energéticas e de compostos nitrogenados. Após 24 horas de incubação, nas terceira e quarta transferências, procedeu-se à avaliação do pH e o fluido resultante foi diluído e plaqueado em meio seletivo para bactérias ácido láticas (BAL) segundo técnica de spread plate. Após 48 horas de crescimento, realizou-se a contagem das unidades formadoras de colônia por mL (UFC/mL). Com o objetivo de detectar a presença de substâncias inibidoras do crescimento microbiano, realizou-se teste de atividade inibitória com as BAL obtidas no procedimento anterior. O crescimento de BAL foi favorecido (P<0,05) quando se utilizou amido como fonte de energia em relação à celulose. As fontes de compostos nitrogenados de origem protéica (peptona de soja e caseína) estimularam o crescimento dessas bactérias (P<0,05) em comparação ao controle e ao uso de uréia.O pH não sofreu influência da fonte de energia (P>0,05); entretanto, a inclusão de uréia resultouem pH mais elevado (P<0,05) em relação às demais fontes de compostos nitrogenados Não foi detectada atividade antimicrobiana nas culturas de BAL isoladas. No segundo experimento realizaram-se três incubações segundo os mesmos procedimentos do experimento descrito anteriormente, avaliando-se quatro tratamentos: Celulose, Celulose + Caseína, Celulose + Uréia:Sulfato de Amônio (9:1) e Celulose + Casaminoácidos. Após uma transferência, tomou-se uma frasco de cada tratamento às 6, 12 e 24 horas de incubação, realizando-se extrações das enzimas e teste de atividades da CMC e da GHD. Incubou-se uma segunda bateria de frascos a fim de se obter amostras nos tempos 6, 12 e 24 horas para quantificação da concentração de nitrogênio amoniacal (NA) e de proteína microbiana. Nos três tempos de incubação, a concentração de NA foi maior (P<0,05) quando uréia foi utilizada como fonte de compostos nitrogenados. Às 12 e 24 horas de incubação as fontes de compostos nitrogenados protéicos (caseína e casaminoácidos) causaram incremento nas concentrações NA em relação ao controle (P<0,05). De maneira geral, a concentração de proteína microbiana manteve-se estável entre os tratamentos. A atividade da enzima CMC foi superior com a utilização de uréia e casaminoácidos (P<0,05) em relação ao controle e caseína. A suplementação com casaminoácidos propiciou maior atividade da GDH (P<0,05) em relação ao controle na 6ª hora de incubação. com posições intermediárias observadas para caseína e uréia, às 12 horas a atividade da GDH passou a serestimulada também pela caseína (P<0,05). Às 24 horas a atividade da GDH não apresentou diferenças entre tratamentos (P>0,05).Para o terceiro experimento utilizaram-se três novilhos mestiços Holandês x Zebu, compeso corporal inicial de 350 kg fistulados no rúmen, mantidos em baias individuais recebendo feno de Tifton (Cynodon sp.) ad libtum.Os tratamentos foram: controle, sem suplementação; suplementação com compostos nitrogenados não-protéicos (uréia:sulfato de amônio, 9:1); e suplementação com compostos nitrogenados protéicos (albumina). Para os tratamentos que compreenderam suplementação com compostos nitrogenados definiu-se o fornecimento em 1 g/kg de peso vivo dos animais em proteína bruta. O experimento foi conduzido segundo delineamento em quadrado latino 3 x 3, com três períodos experimentais com duração de cinco dias cada, sendo os três primeiros dias destinados à adaptação ruminal dos animais à suplementação. Para avaliação do pH e da concentração de NA ruminal coletou-se, no quarto dia de cada período experimental, alíquotas de líquido ruminal nos tempos 6, 12 e 24 horas após a suplementação. Simultaneamente a esta avaliação, conduziu-se procedimento de incubação in situ para quantificação da atividade das enzimas CMC e GHD. A média do pH do líquido de rúmen foi de 6,55, não havendo diferenças entre os tratamento e os tempos de avaliação (P>0,05). Em termos gerais, a atividade da GHD foi ampliada nos intervalos avaliados (P<0,05). Entretanto não foram observadas diferenças entre os tratamentos (P>0,05) sobre a atividade da GDH. De maneira geral, o tratamento controle apresentou maior atividade da CMC em relação ao tratamentos que continham fontes suplementares de nitrogênio (P<0,05). Entretanto, a suplementação com uréia propiciou maiores atividades da CMC em relação à albumina (P<0,05). As fontes de compostos nitrogenados (uréia e albumina) causaram incremento nas concentrações NA em relação ao controle (P<0,10). As concentrações de NA decresceram a partir do primeiro momento de avaliação (P<0,10). A partir dos resultados obtidos concluiu-se que fontes de compostos nitrogenados de origem protéica provocam efeitos deletérios sobre a utilização de substratos fibrosos insolúveis devido ao favorecimento do crescimento de bactérias fermentadoras de carboidratos não-estruturais.