O zebrafish (Danio rerio) é uma espécie utilizada como modelo experimental em diversas áreas, tais como neurociências toxicologia. Seu genoma já está praticamente sequenciado e estudos demonstraram que muitos genes deste peixe são similares aos de mamíferos. Além disso, o zebrafish é um excelente modelo para estudar a função de diferentes sistemas de neurotransmissão. O consumo do etanol exerce diversas mudanças na coordenação motora, percepção sensorial e cognição promovendo um amplo espectro de alterações bioquímicas e fisiológicas nas células nervosas. Aqui, nós investigamos o efeito promovido pela exposição crônica de etanol nos sistemas purinérgico e glutamatérgico, e níveis de BDNF no SNC de zebrafish. Os transportadores de alta afinidade de aminoácidos (EAAT) regulam os níveis extracelulares de glutamato. Nós identificamos e descrevemos o padrão de expressão dos genes relacionados aos transportadores e as propriedades de captação de glutamato nas três importantes estruturas cerebrais de zebrafish (telencéfalo, tecto óptico e cerebelo). As pesquisas nos bancos de dados do seu genoma através de análise filogenética confirmaram a presença de diversos EAATs (EAAT2, EAAT3, três EAAT1 parálogos e duas sequências parálogas para EAAT5). Também, a captação de glutamato dependente de sódio foi significativamente maior no tecto óptico, indicando diferenças funcionais entre as estruturas cerebrais. Os EAATs pertencem à família dos carreadores de soluto 1 (SLC1), que constitui os transportadores de alta afinidade de aminoácidos e transportadores de aminoácidos neutros. Recentemente, foi demonstrada uma análise filogenética e clonagem dos genes SLC1/EAAT identificando distintos membros desta família de transportadores. No sentido de unificar a designação dos genes SLC1/EAAT em zebrafish, foi proposta uma nomenclatura comum para estes grupos. O etanol promoveu uma diminuição significativa na captação de glutamato após 7 e 14 dias de exposição (30% e 54%, respectivamente), enquanto que após 28 dias, não foram observadas alterações. Na,K-ATPase, a enzima responsável pelo controle do gradiente iônico, não teve sua atividade alterada após todos os períodos de exposição testados. Além disso, os peixes expostos ao etanol durante 7 e 14 dias tiveram uma redução nos níveis de mRNA para SLC1A1/EAAT3. Entretanto, a expressão gênica do SLC1A8a,b/EAAT6a,b aumentou após todos os períodos testados, enquanto que SLC1A3a,b/EAAT1b aumentou somente após 28 dias. A prolongada exposição ao etanol não foi capaz de alterar as atividades da glutamina sintetase e glutaminase. Da mesma forma, etanol não alterou a hidrólise de ATP e GTP. Entretanto, foi verificada uma diminuição na hidrólise de ADP (46% e 34%) e GDP (48% e 36%) após 7 e 14 dias respectivamente. Após 7 e 14 dias de exposição ao etanol, também foi observada uma significativa alteração na hidrólise de AMP (48% e 36%), enquanto que a hidrólise de GTP foi inibida somente após 7 dias (46%). Os níveis de transcritos das nucleosídeo trifosfato difosfohidrolase (NTPDases) foram alteradas após 7, 14 e 28 dias. Em contraste, a expressão da 5′-nucleotidase não foi alterada. A atividade da adenosina deaminase (ADA) na fração solúvel não foi modificada, mas uma redução da atividade na fração de membrana após 28 dias de exposição ao etanol (44%) foi observada. A análise da expressão gênica demonstrou que ADA1 permaneceu inalterada, enquanto que os transcritos de ADAL, ADA2-2, ADA2-1, e sua isoforma truncada de ―splicing‖ alternativo (ADA2-1/T) foram alteradas após a ação prolongada do etanol. Após 14 e 28 dias, etanol aumentou a expressão gênica do BDNF, mas não alterou os níveis de transcritos para trkB. A determinação da proteína BDNF através dos métodos de ELISA indicou um aumento de (51%), sendo confirmando imunohistioquímicamente. Estes resultados sugerem que a homeostase da função neurotrófica pode ser alterada pelo prolongado consumo de etanol. Esta tembém inclui uma revisão sobre o papel de diferentes neurotransmissores excitatórios e inibitórios em zebrafish, tais como, dopaminérgico, serotoninérgico, colinérgico, glutamatérgico, purinérgico, histaminérgico, nitrérgico, glicinérgico, gabaérgico, enfatizando aspectos farmacológicos e toxicológicos. Em suma, esta tese demonstra o efeito da exposição crônica ao etanol afeta o sistema glutamtérgico e purinérgico, expressão de BDNF em cérebro de zebrafish. O aumento do conhecimento global sobre os sistemas de neurotransmisão em zebrafish e o esclarecimento de efeitos farmacológicos e toxicológicos poderia contribuir para novas estratégias de pesquisa em ciências básicas e biomédicas. / The zebrafish (Danio rerio) is a species used as experimental models in various fields such as neurosciences, toxicology. Its genome has already been sequenced and studies have shown that many genes are similar to those of mammals. Furthermore, zebrafish provides an excellent model to study the function of different neurotransmitter systems. The ethanol consumption exerts several changes in motor coordination, sensory perception and cognition, promoting a wide-spectrum of biochemical and physiological alterations on nervous cells. Here we investigated the effects promoted by chronic ethanol exposure on glutamatergic and purinergic systems, and BDNF levels in zebrafish CNS. High-affinity excitatory amino acid transporters (EAATs) regulate extracellular glutamate levels. We identified and described the expression profile of EAATs-related genes and the functional properties of glutamate uptake in three major brain structures from zebrafish (telencephalon, optic tectum and cerebellum). Searches on zebrafish genome databases and a phylogenetic analysis confirmed the presence of several EAAT-related genes (EAAT2, EAAT3, three EAAT1 paralogs and two EAAT5 sequences). Moreover, the glutamate uptake was significantly higher in optic tectum, which indicates functional differences within zebrafish brain structures. EAATs belong to the solute carrier family 1 (SLC1), that constitute high-affinity glutamate and neutral amino acid transporters. Recently, the phylogenetic analysis and cloning reporting of SLC1/EAAT genes from zebrafish identified distinct members of this transporter family. In order to unify the nomenclature of SLC1/EAAT genes in zebrafish, it was proposed a common nomenclature for these groups. The actions of ethanol on glutamate uptake showed a significant decrease in glutamate transport (30% and 54%) after 7 and 14 days of exposure, whereas after 28 days, no significant changes were detected. Na,K-ATPase, the enzyme responsible to generate ion gradients, did not alter after all exposure periods. Moreover, fish exposed to ethanol during 7 and 14 days exhibit a decrease of mRNA levels for SLC1A1/EAAT3. However, the gene expression of SLC1A8a,b/EAAT6a,b increased after all exposure periods, whereas SLC1A3a,b/EAAT1b increased only after 28 days. The prolonged ethanol exposure did not significantly change the glutamine synthetase and glutaminase activities. In the same way, ethanol did not alter the ATP and GTP hydrolysis. However, a decrease in ADP (46% and 34%) and GDP (48% and 36%) hydrolysis was verified after 7 and 14 days, respectively. After 7 and 14 days of ethanol exposure, a significant decrease in AMP hydrolysis (48% and 36%) was also observed, whereas GMP hydrolysis was inhibited only after 7 days (46%). Furthermore, nucleoside triphosphate diphosphohydrolase (NTPDase) transcript levels were altered after 7, 14, and 28 days. In contrast, 5′-nucleotidase expression was not altered. Adenosine deaminase (ADA) activity from soluble fraction was not modified, but a decrease of ADA activity in membrane fraction after 28 days (44%) of ethanol exposure was observed. Gene expression analysis demonstrated that ADA1 remained unaltered, whereas ADAL, ADA2-2, ADA2-1 transcripts, and its truncated alternative splice isoform (ADA2-1/T) were altered after prolonged ethanol exposure. After 14 and 28 days, ethanol increased the BDNF gene expression, but did not change the levels of trkB transcripts. The measurement of BDNF protein through ELISA kit anti-BDNF showed increased amounts after 28 days of exposure (51%), which was also confirmed by immunohistochemstry. These results suggest that the homeostasis of neurotrophic functions may be altered by prolonged ethanol consumption. Moreover, we present a review about the role of different excitatory and inhibitory neurotransmitters systems in zebrafish, such as dopaminergic, serotoninergic, cholinergic, glutamatergic, purinergic, histaminergic, nitrergic, glycinergic, and GABAergic systems, emphasizing pharmacological and toxicological aspects. In conclusion, this thesis demonstrates that chronic ethanol exposure affects the glutamatergic and purinergic systems, and BDNF expression in zebrafish brain. The significant increase in the global knowledge about the neurotransmitters systems in zebrafish and the elucidation of pharmacological and toxicological effects could lead to new strategies and appropriate priorities in research in order to support complementary insights on basic sciences and biomedical research.

O diabetes mellitus é uma doença metabólica caracterizada por níveis elevados de glicose no jejum e está associada com a perda da função cognitiva e um maior risco de desenvolvimento de doenças neurodegenerativas, tais como a Doença de Alzheimer (DA). As complicações do diabetes estão relacionadas com a hiperglicemia, níveis elevados de compostos reativos, como o metilglioxal (MG) e a formação de produtos finais de glicação avançada (do inglês Avanced Glycation End Products - AGEs). Os AGEs e o MG - um aldeído reativo envolvido no estresse dicarbonil e na formação de AGEs – encontram-se elevados em pacientes com diabetes e DA e têm sido sugeridos como mediadores do declínio cognitivo observado nessas patologias. Estudos indicaram que os astrócitos possuem o sistema glioxalase mais efetivo que os neurônios e, portanto, podem proteger os neurônios do estresse dicarbonil. Entretanto, as reações de glicação estão associadas com o prejuízo no funcionamento dos astrócitos, que, desta forma, comprometem a atividade neuronal. Tendo em vista que as reações de glicação estão exacerbadas no diabetes e em doenças neurodegenerativas sugere-se que nestas situações o dano neuronal seja ainda maior. Este trabalho teve como objetivo avaliar a suscetibilidade ao dano induzido pelo MG em culturas de astrócitos e de glioma C6 e examinar o efeito da alta concentração de glicose, do MG e da carboxietil-lisina (CEL), um AGE derivado da reação do MG com a lisina, em parâmetros oxidativos, metabólicos e específicos de astrócitos em fatias de hipocampo in vitro. Além disso, verificar se a administração intracerebroventricular (ICV) de MG causa alterações comportamentais, relacionadas com declínio cognitivo e ansiedade, e alterações bioquímicas em hipocampo, córtex cerebral e líquido cefalorraquidiano (LCR) ex vivo. Em culturas de células observou-se uma alta eficiência do sistema glioxalase em astrócitos em comparação com células C6. O conteúdo de glutationa diminuiu a partir de 1 hora após a exposição ao MG apenas em C6. A captação de glutamato reduziu em astrócitos e aumentou em C6, sendo que este efeito estava relacionado com reações de glicação, mas não com a expressão de transportadores de glutamato analisados. A formação de espécies reativas, a secreção de S100B e o conteúdo da proteína glial fibrilar ácida (GFAP) não foram modificados pelo tratamento com MG nas células estudadas. Em fatias de hipocampo (in vitro) verificou-se que a glicose, o MG e a CEL não alteraram a formação de espécies reativas, a captação de glicose e a atividade da glutamina sintetase. No entanto, a captação de glutamato e a secreção de S100B diminuiram após o tratamento com MG e CEL. Estas mudanças não foram mediadas pela ativação de RAGE e por reações de glicação. A partir do estudo in vivo verificou-se que o MG não causou deficiência nos processos de aprendizagem e memória investigados pelas tarefas de habituação, labirinto em Y e reconhecimento de objetos e não alterou a atividade locomotora dos animais. Contudo, o aumento agudo dos níveis exógenos de MG diminuiu o comportamento do tipo ansiedade, observado através do teste de campo aberto. Em relação às análises ex vivo, o MG induziu alterações persistentes relacionados com a atividade da glioxalase 1, conteúdo de AGEs e captação de glutamato no hipocampo. A formação de espécies reativas, o conteúdo de glutationa, o conteúdo tecidual de GFAP e S100B e a atividade da glutamina sintetase não foram alterados com a administração ICV de MG. É possível concluir que a exposição aguda, in vitro, de fatias de hipocampo ao MG e CEL, mas não à glicose, foi capaz de induzir efeitos semelhantes em fatias de hipocampo, sugerindo que a alta concentração de glicose é tóxica principalmente por elevar a concentração de compostos glicantes, como o MG, e gerar ligações cruzadas com proteínas. O MG foi capaz de induzir prejuízo na captação de glutamato em culturas de astrócitos e fatias de hipocampo, indicando que o MG gera alterações na homestase cerebral através do comprometimento da remoção do glutamato da fenda sináptica, deste modo, contribuindo com as alterações neurológicas relacionadas com o diabetes mellitus. Em suma, as concentrações exógenas de MG e o tempo de exposição a elevadas concentrações deste composto determinam as diferentes características que podem ser observadas em pacientes diabéticos. / Diabetes mellitus is a metabolic disease characterized by high fasting-glucose levels and is associated with loss of cognitive function and a higher risk of developing neurodegenerative diseases, such as Alzheimer's disease (AD). Diabetic complications have been associated with hyperglycemia, high levels of reactive compounds, such as methylglyoxal (MG) and advanced glycation end products (AGEs) formation. AGEs and MG - a reactive aldehyde, involved in dicarbonyl stress and AGEs formation - are elevated in diabetes and AD and have been suggested as mediators of cognitive decline observed in these pathologies. Astrocytes are impaired to glycation processes, although, they have an improved glyoxalase system compared to neurons that protect them from dicarbonyl stress, suggesting that damage to neuronal functions could be increased under diabetes and neurodegenerative diseases. This study aimed to evaluate the susceptibility of astrocytes and C6 glioma cells cultures to MG damage and to examine the effect of high glucose, MG and carboxyethyllysine (CEL), a MG-derived AGE of lysine, on oxidative, metabolic and astrocyte-specific parameters in hippocampal slices in vitro. Furthermore, verify if intracerebroventricular (ICV) administration of MG cause behavioral changes, related to cognitive decline and anxiety, and biochemical alterations in the hippocampus, cerebral cortex and cerebrospinal fluid ex vivo. Since our cultures studies we observed a high efficiency of the glyoxalase system in astrocytes compared to C6 cells. The content of glutathione decreased from 1 hour after MG exposure only in C6 cells. Glutamate uptake was decreased in astrocytes and increased in C6 cells and this effect is related to glycation processes, but not to glutamate transporters expression. The reactive species formation, S100B secretion and glial fibrillary acidic protein (GFAP) content were not modified by MG treatment in either culture studied. With hippocampal slices inbucation (in vitro) it was found that glucose, MG and CEL did not alter reactive species formation, glucose uptake or glutamine synthetase activity. However, glutamate uptake and S100B secretion were decreased after MG and CEL exposure. RAGE activation and glycation reactions did not mediate these changes. From in vivo research it was found that MG did not cause impairment in learning-memory processes investigated by habituation, Y-maze and object recognition tasks and did not alter locomotion behavior of animals. However, the acute increase of MG exogenous levels reduced anxiety-related behavior evaluated in the open field test. Ex vivo findings support that MG induced persistent alterations related to glyoxalase 1 activity, AGEs content and glutamate uptake in hippocampus. The reactive species formation, glutathione content, GFAP and S100B content, as well as glutamine synthetase activity were not altered by MG ICV administration. It is possible conclude that acute MG and CEL exposure, but not glucose, were able to induce similar effects on hippocampal slices in vitro, suggesting that conditions of high glucose concentrations are primarily toxic by elevate the rates of these glycation compounds, as MG, and generate protein cross-links. MG-induced astrocyte glutamate uptake impairment was seen in astrocyte cultures and hippocampal slices, indicating that MG produces changes in brain homeostasis by the impairment of glutamate removal of the synaptic cleft, thus contributing to neurological changes related to diabetes mellitus. The exogenous concentrations of MG and the time of exposure to high concentrations of this compound determine the different features that can be seen in diabetic patients.

O transtorno por uso de álcool (TUA) é um transtorno crônico e recorrente, caracterizado pelo uso frequente, perda do controle sobre o uso e sintomas de abstinência quando ocorre a retirada, sendo este processo crítico para a recaída. Durante a síndrome de abstinência de álcool se observam, além de alterações comportamentais, alterações no sistema glutamatérgico, hormônios, neuroinflamação e estresse oxidativo. A N-acetilcisteína (NAC), um modulador do sistema glutamatérgico com propriedades antioxidantes e anti-inflamatórias, vem sendo considerado um fármaco com potencial efeito sobre a adição a algumas drogas de abuso. Entretanto, seus efeitos sobre a abstinência de álcool são pouco explorados. Desta forma, o objetivo principal desta tese foi avaliar os efeitos do tratamento de curto prazo com NAC sobre o comportamento de ratos abstinentes, bem como sobre alterações na concentração de corticosterona e leptina sérica, citocinas inflamatórias e glutationa além da atividade da enzima glutamina sintetase no tecido encefálico durante a abstinência de álcool em ratos. Para isso, se utilizou dois modelos de exposição crônica ao álcool, com diferentes tempos de abstinência e regimes de administração com NAC. No primeiro experimento, ratos Wistar machos adultos foram administrados com 2 g/kg de álcool ou solução glicosada durante 30 dias, 2 vezes ao dia, via gavagem e tratados com NAC (60 e 90 mg/kg), via intraperitoneal (i.p) ou solução salina (n=10/grupo) durante 4 dias após a cessação das administrações de álcool. Após 24 horas da última administração de NAC ou salina (5 dias de abstinência) os animais foram testados no campo aberto por 5 min, logo após eutanasiados e o sangue coletado para a análise de corticosterona e leptina. Em um segundo experimento, foi executado o mesmo protocolo de tratamento do primeiro experimento, entretanto, após a eutanásia foram coletadas estruturas encefálicas para a análise de citocinas inflamatórias, glutationa e atividade da glutamina sintetase. No terceiro experimento, utilizou-se modelo de administração crônica intermitente, sendo os ratos administrados com 2 g/kg de álcool ou salina, via gavagem, 2 vezes ao dia, 5 dias por semana, durante 3 semanas. Quatro dias antes da retirada do álcool os ratos foram tratados com NAC (60 e 90 mg/kg, i.p) ou salina concomitantemente com álcool ou solução glicosada (n=10/grupo). Vinte quatro horas após a última administração de NAC (1 dia de abstinência) os animais foram testados no campo aberto e após eutanasiados para a análise de corticosterona e leptina. Nossos resultados mostraram que o tratamento com NAC instituído após ou prévio ao início da abstinência preveniu hipolocomoção (5 dias de abstinência) ou ansiedade (24 horas de abstinência) em ratos. NAC também preveniu aumento de costicosterona e leptina após abstinência em ratos independentemente do modelo de exposição crônica utilizado. Adicionalmente, NAC preveniu aumento de citocinas inflamatórias no hipocampo e no córtex frontal de ratos abstinentes, além de prevenir a diminuição da atividade da glutamina sintetase no hipocampo durante a abstinência. O presente estudo mostrou que o os modelos de administração crônico-moderados de álcool induziram sinais e sintomas de abstinência em ratos compatíveis com os observados em humanos e, ambos os esquemas de tratamento com NAC, foram eficazes na prevenção de alterações produzidas pela abstinência de álcool. Tais resultados sugerem a indicação da NAC como um adjuvante na terapia para retirada do álcool e consequente prevenção de recaída. / Alcohol use disorder (AUD) is a chronic and recurrent disorder characterized by frequent use, loss of control of drug intake and the withdrawal symptoms when alcohol is withdrawn, being this process critical for relapse. During alcohol withdrawal syndrome behavioral changes, as well as changes in the glutamatergic system, hormones levels, neuroinflammation and oxidative stress are observed. N-acetylcysteine (NAC), a glutamate-modulating agent, with antioxidant and anti-inflammatory properties has been considered a putative anti-addictive drug. However, its effects on alcohol withdrawal are poorly understood. Thus, the aim of this thesis was to evaluate the short-term effects of NAC treatment on behaviors, leptin and corticosterone serum levels, as well as brain levels of pro-inflammatory cytokines, glutathione and glutamine synthetase activity during alcohol withdrawal in rats. Two different models of chronic alcohol exposure were used. In the first experiment, male Wistar rats were administered with 2 g/kg of alcohol, or glucose solution, during 30 days, twice daily, by gavage and treated with NAC (60 and 90 mg/kg, ip) or saline for 4 days after alcohol cessation. Twenty-four hours after the last NAC administration animals were tested in the open field test and euthanized for later corticosterone and leptin. In the second experiment, we used the same protocol of treatment as the first experiment, however, after euthanasia, brain structures were dissected for inflammatory cytokines, glutathione and glutamine synthetase activity analysis. In the third experiment, we used a model of chronic intermittent administration. Rats were administered with 2 g/kg of alcohol, by gavage, twice daily, 5 days/week, for 3 weeks. Four days before alcohol cessation rats were concomitantly treated with NAC (60 and 90 mg/kg, ip) or saline and alcohol or glucose solution. Twenty four hours after the last administration with NAC rats were tested in the open field test and euthanized for serum corticosterone and leptin analyses. Treatment with NAC during alcohol withdrawal prevented hypolocomotion and the increases of leptin and corticosterone serum levels in abstinent rats. The same treatment also prevented changes of frontal and hippocampal levels of inflammatory cytokines and hipocampal glutamine synthetase activity during withdrawal. When administered prior to alcohol withdrawal, treatment with NAC prevented anxiety and again prevented increases in leptin and corticosterone serum levels during early withdrawal. The present thesis showed that the model of moderate chronic alcohol administration induced alcohol withdrawal signs and symptoms in rats consistent with those observed in humans. and NAC treatment, in two different regimens, was effective in preventing these alcohol withdrawal-related alterations. These results suggest the indication of NAC as an adjuvant therapy for alcohol withdrawal and relapse.

A Doença de Alzheimer (DA) é uma doença cerebral progressiva que resulta em prejuízos na memória e disfunção cognitiva global. Entre as principais características neuropatológicas associadas a DA estão à presença de placas senis, emaranhados neurofibrilares e a hiperfosforilação da proteína Tau. A hiperativação do sistema glutamatérgico tem sido implicada na fisiopatologia da DA. O excesso de glutamato na fenda sináptica causa hiperativação do seu receptor ionótropico N-metill-D-aspartato (NMDA) o que favorece o aumento do influxo de cálcio e morte neuronal. A administração intracerebral de ácido ocadáico (AO) causa alterações morfológicas e funcionais similares à DA. O AO promove a inibição da proteína fosfatase 2A (PP2A) favorecendo as atividades cinásicas de proteínas como a cinase dependente de ciclina 5 (Cdk5). A memantina (MN) é uma das principais drogas utilizadas no tratamento da DA e o seu mecanismo de ação envolve um antagonismo não competitivo de baixa afinidade pela subunidade NR2B do receptor NMDA. Neste trabalho, foram avaliados efeitos do pré-tratamento com MN em um modelo semelhante a DA induzido pela administração intrahipocampal de AO em ratos. O pré-tratamento com MN preveniu o déficit na memória especial causado pela infusão intrahipocampal de AO. Os mecanismos envolvidos nestes efeitos neuroprotetores envolvem a prevenção do aumento de glutamato no liquido cefalorraquidiano, juntamente com a regulação da expressão de Cdk5 e em conseqüência a prevenção do aumento da fosforilação de Tau. Desta maneira, a MN pode ser um alvo terapêutico para prevenir as alterações comportamentais e neuroquímicas em um modelo similar a DA induzido pelo AO. / Alzheimer's disease (AD) is a progressive brain disease that causes memory loss and global cognitive dysfunction. The neuropathological alterations associated with AD include senile plaques, neurofibrillary tangles and Tau protein hyperphosphorylation. The glutamatergic system is implicated in the pathophysiology of AD. Indeed, the excessive glutamate levels in the synaptic cleft may cause hyperactivation of glutamate ionotropic N-metill-Daspartate (NMDA), which favors increase calcium influx and neuronal death. The intracerebral administration of okadaic acid (OA) causes morphological and functional alterations similar to AD. The OA inhibits the protein phosphatase 2A (PP2A) thus overstimulating the kinases activities. Memantine (MN) is a drug currently used in the treatment of AD, which mechanism involves a noncompetitive low affinity antagonism for NR2B subunit of NMDA receptors. In this work we evaluate the effects of pretreatment with MN in an AD-like model in rats induced by intrahippocampal administration of OA. The pretreatment with MN could prevent the spatial memory deficits caused by OA intrahipocampal administration in rats. The mechanisms underlying this neuroprotective effects involves the prevention of the increase in brain glutamate levels along with regulation of Cdk5 and, in consequence, downstream phosphorylation of Tau (ser199/202) protein. To conclude, MN has potential therapeutic role in preventing behavioral and neurochemical alterations caused by an AD like model induced by OA.

O presente estudo tem por objetivo investigar a influência da privação dietética de ácidos graxos ω3 no sistema glutamatérgico no hipocampo de ratos Wistar em parâmetros ontogenéticos e relacionados à neuroproteção. Os ratos foram alimentados, desde a gestação até a vida adulta, com duas dietas diferentes: uma dieta contendo ácidos graxos ω3 (grupo controle, C) e outra deficiente nestes ácidos graxos (grupo deficiente, D). Nos experimentos ontogenéticos, foram avaliados os imunoconteúdos das subunidades de receptores glutamatérgicos ionotrópicos do tipo NMDA (NR2 A/B) e AMPA (GluR1), bem como da isoforma alfa da cinase dependente de cálcio e calmodulina do tipo II (αCaMKII). Também foram avaliados a capacidade do glutamatode ligar-se a seus receptores e a captação de [3H]glutamato em fatias de hipocampo. Para investigar o efeito da privação de ácidos graxos ω3 na resposta cerebral frente à injúria isquêmica, fatias de hipocampo foram submetidas à privação de glicose e oxigênio (OGD), um modelo de isquemia in vitro. O grupo D apresentou imunoconteúdo reduzido de todas as proteínas avaliadas aos 02 dias de vida, o que foi sendo normalizado aos 21 dias (exceto pela αCaMKII) e aos 60 dias. O mesmo padrão foi observado na capacidade de ligação do glutamato aos seus receptores. Porém a captação de [3H]glutamato não foi afetada pelas dietas. Nos experimentos de OGD, o grupo D apresentou maior dano celular e uma queda na captação de [3H]glutamato mais acentuada que o grupo controle. Ainda, a privação de ácidos graxos ω3 influenciou a resposta celular anti-apoptótica após OGD, afetando a fosforilação das proteínas GSK3β e ERK1/2, mas não a fosforilação da Akt. Estes resultados sugerem que os ácidos graxos ω3 são importantes para o desenvolvimento do sistema glutamatérgico e para a proteção celular após dano isquêmico, além de ser importante para ativação de rotas de sinalização anti-apoptóticas. / The effect of dietary deprivation of essential omega-3 fatty acids on parameters of the glutamatergic system related to brain ontogeny and neuroprotection was investigated in this study. Rats were fed with two different diets: omega-3 diet (control group) and omega-3 deprived-diet (D group). In ontogeny experiments, it was evaluated the hippocampal immunocontent subunits of the of ionotropic glutamatergic receptor NMDA and AMPA (NR2 A\B and GluR1, respectively) and the alfa isoform of the calcium-calmodulin protein kinase tipe II (αCaMKII), as well as the binding and uptake of [3H]glutamate. To assess the influence of omega-3 fatty acids deprivation on brain responses to ischemic insult, hippocampal slices were submitted to oxygen and glucose deprivation (OGD), a model of in vitro ischemia. The D group showed lower immunocontent of all proteins analyzed at 02 days of life (P2) than the control group, and it was normalized at P21 (except for αCaMKII) and P60. The same pattern was found for [3H]glutamate binding, while [3H]glutamate uptake was not affected. In the OGD studies, the D group showed higher cell damage and stronger decrease in the [3H]glutamate uptake. Moreover, omega-3 deprivation influenced anti-apoptotic cell response after OGD, affecting GSK-3beta and ERK1/2, but not Akt phosphorylation. Taken together, these results suggest that omega-3 fatty acids are important for the glutamatergic development and cell protection after ischemia, and also seem to play an important role on activation of anti-apoptotic signaling pathways.

A dieta de restrição calórica (RC) tem apresentado efeitos que diminuem a progressão, ou previnem completamente, uma variedade de doenças associadas com o envelhecimento, incluindo doenças cardiovasculares, diabetes e doenças neurodegenerativas. O prejuízo da função celular astroglial, incluindo captação de glutamato, atividade da glutamina sintetase (GS) e secreção de S100B, além de parâmetros de estresse oxidativo alterados podem contribuir para a progressão de doenças neurológicas. Este estudo objetivou avaliar alterações astrocíticas hipocampais em resposta à RC, medindo parâmetros astrogliais, tais como: captação de glutamato, atividade da GS e imunoconteúdo de GFAP e S100B. Nós investigamos também, os efeitos da RC nos parâmetros hipocampais (Hc) e corticais cerebrais (Cx) de estresse oxidativo e de comportamento em ratos Wistar machos. Parâmetros bioquímicos sanguíneos também foram avaliados. Os ratos (60 dias de idade) foram alimentados com dieta ad libitum ou com RC por 12 semanas. Os animais do grupo RC apresentaram um ganho de peso menor, de aproximadamente 16% em relação ganho de peso do grupo controle. A RC induziu um aumento significativo (23%) na captação de glutamato e na atividade da GS (26%). Não houve diferença significativa no imunoconteúdo de S100B ou GFAP. Os parâmetros bioquímicos avaliados não diferiram entre os grupos, indicando bom estado de saúde. Além disso, a RC não alterou parâmetros de ansiedade, mas aumentou significativamente a atividade locomotora, elevou os níveis de GSH e diminuiu a atividade de GPx, diminuiu a produção de ERO. Além disso, não alterou a peroxidação lipídica, conteúdo de óxido nítrico e a atividade da catalase. A RC também diminuiu o nível basal de dano oxidativo ao DNA, medido pelo ensaio cometa. Em resumo, este estudo indica que a RC modula as funções astrocíticas, através do aumento da captação de glutamato e da atividade da GS, sugerindo que a dieta pode exercer seus efeitos neuroprotetores contra patologias do SNC através da modulação destas funções. A RC também pode induzir a modulação hipocampal e cortical cerebral, resultando em alterações metabólicas, que por sua vez, melhoram as condições basais de importantes parâmetros de defesa celular, como por exemplo, o aumento dos níveis de GSH e diminuição do dano oxidativo ao DNA. / The dietary caloric restriction (CR) has been shown to slow the progression of, or even prevent entirely, a range of age-dependent pathologies, including cardiovascular disease, diabetes and neurodegenerative diseases. The impairment of astroglial cell function, including glutamate uptake, glutamine synthetase (GS) activity and S100B secretion, besides oxidative stress parameters altered, may contribute to the progression of neurological disorders. The present study aimed to evaluate hippocampal astrocytic changes in response to CR diet, measuring astroglial parameters, such as glutamate uptake, GS activity and the immunocontent of GFAP and S100B. We investigated also the effects of CR on hippocampal (Hc) and cerebral cortical (Cx) oxidative stress and behavioral parameters in male Wistar rats. Blood biochemical parameters were also analyzed. Rats (60-day old) were fed ad libitum or on CR diets for 12 weeks. CR-fed rats showed approximately 16% less body weight gain than control rats. The CR diet was able to induce a significant increase in glutamate uptake (23%) and in GS activity (26%). There were no statistically significant differences in the immunocontent of either GFAP or S100B. No differences were observed in the biochemistry parameters evaluated, indicating normal healthy. CR did not alter anxiety parameters but increased locomotion performance; increased glutathione content; decreased glutathione peroxidase activity; decreased reactive oxygen species production and did not altered lipid peroxidation, nitric oxide content and catalase activity. Also, CR diet decreased basal DNA damage index, measured by comet assay. In summary, the present study indicates that CR modulates astrocyte functions by increasing glutamate uptake and GS activity, suggesting that CR might exert its neuroprotective effects against brain illness by modulation of astrocytic functions. The CR diet also induced hippocampal and cerebral cortical modulation, resulting in metabolic changes which in turn improve the basal status of important parameters of cellular defenses, such as the increased glutathione content and decreased DNA damage.

Durante o desenvolvimento fetal, o sistema nervoso central (SNC) apresenta-se mais vulnerável aos efeitos tóxicos do etanol. Sabe-se que a exposição pré-natal sob altas doses de álcool aumenta a propensão de síndromes fetais. No entanto, muitas gestantes optam por manter o “beber social”, mesmo que estudos mostrem que doses moderadas de etanol na fase do desenvolvimento possa causar danos ao SNC associados a transtornos cognitivos, sociais e neuroquímicos. O objetivo desta tese é avaliar parâmetros astrogliais e comportamentais no período da adolescência em fatias hipocampais de ratos Wistar machos submetidos a um modelo animal de exposição pré e pós-natal sob doses moderadas de etanol. O modelo animal utilizou cerveja sem álcool para administração por via oral de etanol. As ratas foram expostas ao tratamento durante toda a gestação até o final do desmame. Ratas prenhas foram divididas em três grupos de tratamento: apenas água (grupo controle), cerveja sem álcool (grupo veículo) ou cerveja sem álcool adicionado de 10%v.v. etanol (MPAE group 9 moderate prenatal alcohol exposure). Filhotes adolescentes machos foram submetidos a tarefa de esquiva discriminativa passiva com o objetivo de avaliar o comportamento de aprendizado/memória e de ansiedade. No dia pós-natal 30 (DPN 30) o hipocampo foi dissecado e fatias foram obtidas para a imunoquantificação de GFAP, NeuN, S100B, receptores NMDA e para os transportadores gliais de glutamato, EAAT1 e EAAT2. O ensaio para dosagem da captação de glutamato, bem como o conteúdo de glutationa (GSH) também foram realizados. Os filhotes do grupo MPAE apresentaram comportamento do tipo ansiolítico, mesmo tendo aprendido a evitar o braço aversivo. Observamos neste grupo uma diminuição da captação de glutamato, que parece ser dose 9 dependente, além de alterações na quantificação dos receptores NMDA e dos transportadores de glutamato EAAT1 e EAAT2, que podem ter contribuído para os efeitos comportamentais encontrados. Os níveis da proteína S100B estavam claramente elevados no líquido cefalorraquidiano apenas no grupo MPAE e alterações na expressão de GFAP também foram evidenciadas neste grupo. Contudo, este trabalho mostra que mesmo doses moderadas de etanol, administradas durante o período do desenvolvimento fetal, podem interferir no comportamento de risco associado a diminuição da ansiedade, visto na fase da adolescência. Além disso, os resultados ressaltam uma maior vulnerabilidade do sistema glutamatérgico à toxicidade do etanol, bem como da possibilidade das células da glia participarem de uma resposta de ativação e reparo após o tratamento pré-natal com etanol. / The central nervous system (CNS) is more vulnerable to ethanol effects during fetal development. It is known that high doses of prenatal ethanol exposure increases the probability of fetal alcohol syndromes. Women have chosen to continue drinking socially despite being pregnant, even with studies demonstrating that moderate doses of ethanol during development can impact the CNS leading to cogitive, social and neurochemical impairments. The aim of this thesis is evaluate glial and behavior parameters during adolescence period on hippocampal slices of male Wistar rats submitted to an animal model of prenatal and postnatal ethanol exposure under moderate dose. An animal model of oral self-administration of etanol through a non-alcoholic beer was performed during the role gestation period until weaning. The pregnant rats were divided in three treatment groups: only water (control group), non-alcoholic beer (vehicle group) or non-alcoholic beer with 10% v.v. added (MPAE group – moderate prenatal alcohol exposure). Adolescent male offspring were subjected to the discriminative passive avoidance task to evaluate the learning/memory and anxiety-like behavior. On postnatal day 30 (PND 30) hippocampi were dissected and slices were obtained for immunoquantification of GFAP, NeuN, S100B, NMDA receptors and for glial glutamate transporters, EAAT1 and EAAT2. In addition, we measured the glutamate uptake, as well as the GSH content. Offspring from MPAE group presented an anxiolytic-like behavior, even though they had learned how to avoid the aversive arm. We observed a decrease in glutamate uptake, that seems to be dose-dependent, and alterations in the quantification of glutamate NMDA receptors and EAAT1 and EAAT2 transporters, that could contribute to the behavior findings. The S100B protein levels were clearly increased in the cerebrospinalfluid only for MPAE group and alterations in GFAP expression were also seen for this group. Nevertheless, this thesis shows that even moderate ethanol doses administred during fetal development can impact the rink taking behavior associated to reducement in anxiety, common seen during adolescence. Moreover, the results highlight a vulnerability of glutamate system associated to etanol toxicity, as well as the possibility of glial cells are involved in an activated and repair response after prenatal etanol treatment.

Submitted by Amanda Silva (amanda.osilva2@ufpe.br) on 2015-04-08T14:48:36Z No. of bitstreams: 2 Tese de Doutorado_Will de Barros Pita_CCB_2012.pdf: 2965963 bytes, checksum: babbeaf0d359662414391200c3f5a596 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-08T14:48:36Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese de Doutorado_Will de Barros Pita_CCB_2012.pdf: 2965963 bytes, checksum: babbeaf0d359662414391200c3f5a596 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2012 / CNPq; CAPES; FACEPE / A levedura Dekkera bruxellensis é consistentemente associada a contaminações de processos de fermentação alcoólica industrial. Na produção de vinhos, esta levedura é responsável pela produção de aromas indesejáveis, enquanto que na produção de etanol combustível, D. bruxellensis compete com Saccharomyces cerevisiae pelo substrato industrial. Apesar de compartilhar alguns fenótipos com S. cerevisiae, D. bruxellensis apresenta características peculiares, como por exemplo, a capacidade de utilizar nitrato como única fonte de nitrogênio. No ambiente industrial, as quantidades de açúcares são elevadas e, nesses casos, o fator limitante do crescimento é geralmente a disponibilidade de nitrogênio, um nutriente essencial para todas as formas de vida. O objetivo do presente trabalho foi investigar o metabolismo de diferentes fontes de nitrogênio e determinar a influência da natureza e da concentração destas fontes na fisiologia e expressão gênica de D. bruxellensis, em busca de potenciais fatores positivos de adaptação para esta levedura. Os resultados mostraram que a assimilação de nitrato pode favorecer D. bruxellensis no ambiente industrial, pois fornece o nitrogênio necessário para manter o crescimento desta levedura mesmo após a depleção da amônia no caldo de cana. Adicionalmente, a escassez de nitrogênio diminui a taxa de crescimento, consumo de açúcares e produção de etanol em D. bruxellensis. No entanto, a limitação de carbono é ainda mais drástica para o metabolismo celular, ocasionando redução significativa dos principais parâmetros fisiológicos. Com relação à assimilação de fontes de nitrogênio, as enzimas glutamato desidrogenase e glutamato sintase podem trocar de papéis como principal via de biossíntese de glutamato e que genes codificantes de permeases de nitrogênio estão sob rígido controle transcricional. Além disso, D. bruxellensis apresenta preferência pela utilização do metabolismo respiratório em detrimento da fermentação em condições limitantes de crescimento. Finalmente, um novo grupo de genes de referência para ensaios de expressão gênica em D. bruxellensis foi estabelecido. A partir dos resultados gerados no presente trabalho, é possível entender as repostas metabólicas de D. bruxellensis em diferentes fontes de nitrogênio, o que pode auxiliar na identificação de novos fatores de adaptação para esta levedura, que permitem o seu estabelecimento e manutenção no ambiente indutrial.

Orientador: Felix Guillermo Reyes Reyes / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-17T15:50:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Maluly_HellenDeaBarros_D.pdf: 1502288 bytes, checksum: 2755d6e579f948905440f6ae2d7bbd17 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: Tem sido relatado que a administração de glutamato monossódico (MSG) por via parenteral e oral possui um efeito lesivo sobre o núcleo arqueado do hipotálamo provocando alterações na regulação do apetite e, como conseqüência, obesidade e distúrbios relacionados à síndrome metabólica, que são caracterizados por alterações no metabolismo de carboidratos (resistência à glicose e insulina), dislipidemia e doença cardiovascular. Este estudo teve como objetivo avaliar possíveis alterações metabólicas e cardiovasculares quando da exposição oral ao MSG em níveis de até 5,0% na dieta. O estudo foi realizado com ratos diabéticos e não diabéticos. A utilização de animais diabéticos se justifica por serem susceptíveis a indução de possíveis distúrbios metabólicos. Foi avaliado o perfil metabólico característico da condição diabética, incluindo eletrocardiograma, testes bioquímicos, determinação de aminoácidos livres no soro dos animais e a possível alteração histológica de órgãos que são afetados pela condição diabética (fígado, rins e coração). Concluiu-se que o uso de MSG na concentração de até 5,0% na dieta, não alterou os parâmetros estudados, tanto nos animais não diabéticos, como nos diabéticos. As alterações observadas em animais diabéticos refletiram aos distúrbios característicos desta enfermidade, independente da adição de MSG na dieta / Abstract: It has been reported that the parenteral or oral administration of monosodium glutamate (MSG) has an deletereous effect on the arcuate nucleus of the hypothalamus, inducing alterations in the control of appetite that can lead to obesity and disorders related to the metabolic syndrome, such as alterations in carbohydrate metabolism (glucose and insulin resistance), dyslipidemia and cardiovascular disease. This study aimed to evaluate possible metabolic and cardiovascular alterations as a consequence to oral exposure to MSG at levels up to 5.0% in the diet. The study was carried out using diabetic and non-diabetic rats, the use of diabetic animals being justified by their susceptibility to the induction of possible metabolic disorders. The metabolic profile characteristic of the diabetic condition was evaluated, including electrocardiogram, biochemical tests, determination of amino acids in the serum and the possible histological alteration in the organs that are affected by this condition (liver, kidneys and heart). In conclusion, the use of MSG at levels up to 5.0% in the diet did not change the parameters studied in both: non diabetic and diabetic animals. The alterations observed in the diabetic animals reflected the metabolic changes characteristic of this disease, regardless the addition of MSG to the diet / Doutorado / Doutor em Ciência de Alimentos

Peçonhas de aranhas são uma rica fonte de moléculas, dentre as quais se destacam os peptídeos neuroativos, que atuam no tecido nervoso de insetos e mamíferos, tais como receptores colinérgicos e glutamatérgicos A retina constitui um neuroepitelio, uma das membranas do segmento posterior do olho, é uma extensão do sistema nervoso central. A lesão isquêmica nesse tecido desencadeia um processo de degeneração celular, sendo os neurônios os principais afetados. Várias patologias oculares, como o glaucoma, estão associadas a uma degeneração neuronal secundária à isquemia, na qual o excesso de L-glutamato (L-Glu) extracelular é lesivo aos neurônios. A peçonha da aranha Parawixia bistriata contém componentes com grande potencial neuroprotetor, como a Parawixina10 (Pwx10), que atua potencializando o transporte de L-Glu e glicina para o meio intracelular. Neste contexto, diante da necessidade de se buscar novas terapias para o tratamento de neuropatologias e de se entender a lesão isquêmica, a Pwx10 surge como potencial fármaco neuroprotetor. Portanto, o objetivo deste trabalho foi analisar o potencial neuroprotetor da Pwx10, em um modelo de isquemia retiniana aguda, com e sem reperfusão, em ratos Wistar. Durante os experimentos de isquemia (ISQ), a pressão intra-ocular (PIO) foi aumentada para 120 mmHg, e mantida por 45 minutos. Nos experimentos em que houve reperfusão (ISQ/REP), após a isquemia, a pressão foi reduzida aos níveis normais e mantida por mais 15 minutos, de forma a restaurar o fluxo sanguíneo e os níveis basais da PIO. As drogas utilizadas para tratamento foram injetadas por via intravitrea, 15 minutos antes do início da isquemia. Após a cirurgia foram realizados os processos histológicos que envolvem técnicas de H-E e Fluoro-Jade C. Em seguida, foram analisadas as densidades de células viáveis na camada nuclear interna (CNI) e camada de células ganglionares (CCG). Os resultados mostraram que os tratamentos com a Pwx10 protegeram as células da CNI tanto em ISQ como ISQ/REP. Comparada com o Riluzole, a Pwx10 foi mais eficaz em CCG ISQ em 15% e CNI ISQ/REP em 23%. Portanto, a Pwx10 apresenta efeitos neuroprotetores em ratos Wistar submetidos à isquemia retiniana aguda, seguida por reperfusão ou não. / Spider venoms are a rich source of molecules, among which stand out the neuroactive peptides that act on the nervous tissue of insects and mammals, such as cholinergic and glutamatergic receptors. The retina is a neuroepithelium, a membrane lining the cavity of the eyeball, it being an extension of the central nervous system. Ischemic injury that tissue triggers a cell degeneration process, and the neurons affected major. Various eye diseases such as glaucoma, are associated with neuronal degeneration secondary to ischemia in which excess L-glutamate (L-Glu) extracellular is harmful to neurons. The venom of Parawixia bistriata spider contains components with high neuroprotective potential, as Parawixina10 molecule (Pwx10), which operates enhancing the transport of L-Glu and glycine to the intracellular medium. In this context, on the need to seek new therapies for the treatment of these diseases and to understand the ischemic injury, Pwx10 emerges as potential neuroprotective drug. Therefore the aim of this study was to evaluate the neuroprotective potential of Pwx10 on an acute retinal ischemia model, with and without reperfusion in rats. During the experiments ischemia (ISC), the intraocular pressure (IOP) was increased to 120 mmHg and maintained at this level for 45 minutes. In experiments in which there was reperfusion (I/R) after the period of ischemia, the pressure was reduced to normal levels and maintained there for 15 minutes in order to restore blood flow and baseline IOP. The drugs used for the treatment were intravitreally injected 15 minutes before the onset of ischemia. After surgery were performed histological techniques involving procedures H-E and Fluoro-Jade C. Then, viable cell densities in the inner nuclear layer were analyzed (INL) and ganglion cell layer (GCL). The results showed that the treatments with Pw10 protected the INL cells both in ISC as IR. Compared with Riluzole, the Pwx10 was more effective in GCL ISC 15% and INL I/R 23%. Therefore, Pwx10 shows neuroprotective effects in Wistar rats with acute retinal ischemia followed by reperfusion or not.