Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro / O cérebro infantil humano submetido à hipóxia-isquemia (HI) apresenta perda de oligodendrócitos, hipomielinização, astrogliose, alterações no desenvolvimento cortical e no comportamento motor, incluindo a paralisia cerebral. O cerebelo desempenha um importante papel no controle motor e diversos danos vêm sendo observados em humanos e animais que sofreram HI. A excitotoxicidade glutamatérgica é frequentemente associada à HI e junções celulares podem ser responsáveis pela transferência de moléculas capazes de modular os danos decorrentes. Dados prévios de nosso grupo utilizando um modelo de HI pré-natal em ratos demonstraram danos permanentes na estrutura cerebelar, indicando que os efeitos deletérios da HI pré-natal podem ser mantidos até a vida adulta. O objetivo deste trabalho foi caracterizar os níveis de conexinas, receptores e transportadores de glutamato ao longo do desenvolvimento do cerebelo HI, e avaliar a configuração das junções celulares em culturas de astrócitos derivadas do cerebelo de ratos submetidos a esse modelo. Ratas no 18 dia de gestação, após anestesia, tiveram as quatro artérias uterinas obstruídas por 45 minutos (Grupo HI). Animais controle tiveram os úteros expostos sem sofrer a obstrução (Grupo SH). A gestação prosseguiu e apenas filhotes nascidos a termo foram utilizados. Os animais foram decapitados aos 2 (P2), 9 (P9), 16 (P16),23 (P23), 30 (P30), 45 (P45) e 90 (P90) dias pós-natal. Os cerebelos foram submetidos à técnica de Western blotting utilizando os anticorpos anti-NR2B, anti-GluR3, anti-EAAT1, anti-GFAP e anti-Cx43. Para a cultura de astrócitos foram utilizados cerebelos de animais P2. Após terem atingido confluência, as células foram fixadas e imunomarcadas com os anticorpos anti-Cx43, anti-GFAP, anti-nestina e anti-A2B5. Nossos resultados demonstram diferenças nos níveis de GluR3 durante o desenvolvimento do cerebelo SH e HI, havendo uma redução significativa da expressão desta subunidade no grupo HI em P9. Por outro lado, não foram verificadas alterações nos níveis de NR2B e de GFAP entre os grupos nas diferentes idades. Observou-se redução significativa de Cx43 em animais HI em P2 bem como nos astrócitos HI em cultura, os quais também apresentaram alterações morfológicas e diferenças na expressão do marcador A2B5. A alteração referente a GluR3 no grupo HI pode ser causada pela redução da arborização das células de Purkinje e pela redução no número de precursores de oligodendrócitos no cerebelo de animais HI em P9, já observadas em nosso laboratório. A diminuição de Cx43 indica que a passagem de substâncias por canais astrocitários pode estar reduzida e contribuir para a expansão dos danos persistentes descritos em HI. Alterações morfológicas e na expressão de marcadores da diferenciação de astrócitos podem refletir os potenciais efeitos de HI sobre a maturação destas células a longo-prazo. Nossos resultados apontam que a HI sistêmica pré-natal pode ser responsável por alterações que caracterizam a excitotoxicidade glutamatérgica. Ressaltamos também a importância da comunicação entre astrócitos como estratégia neuroprotetora nesta lesão. / Infant human brains submitted to hypoxia-ischemia show oligodendrocyte loss, hypomelination, astrogliosis, cortical development and motor behavior impairments, including cerebral palsy. Cerebellum plays a critical role in motor control and many damages have been demonstrated in humans and animals who suffered HI. Glutamatergic excitotoxicity is usually associated to HI and cellular junctions may be responsible for molecular traffic, being able to modulate HI harm effects. Previous data from our group using a modified model of prenatal HI in rats have shown long-lasting damages in cerebellar structure, indicating that deleterious effects of prenatal HI may be sustained until adult life. The objective of this study was to characterize connexin (Cx) and glutamate receptors and transporters levels during the development of HI cerebellum and to evaluate cellular junctions in astrocyte cultures derived from the cerebella of rats submitted to this same model. Rats on the 18th gestation day were anesthetized, had their uterine horns exposed and the four uterine arteries were clamped for 45 minutes (HI group). Control animals had the uterine horns exposed but no arteries were clamped (SH group). Gestation proceeded after surgery and only pups born at term were used. The animals were decapitated at 2 (P2), 9 (P9), 16 (P16), 23 (P23), 30 (P30), 45 (P45) e 90 (P90) postnatal days. Cerebella were submitted to Western blotting using anti-NR2B, anti-GluR3, anti-EAAT1, anti-GFAP and anti-Cx43 antibodies. P2 cerebella were used in astrocyte primary cultures. After they had achieved confluence, the cells were fixed and immunostained with anti-Cx43, anti-GFAP, anti-nestin and anti-A2B5 antibodies. Our results demonstrate differences in GluR3 levels along cerebellum development of SH and HI animals, with a significant decrease of this subunit expression in HI group at P9. On the other hand, we did not observe any variation in NR2B and GFAP levels between groups at different ages. We also observed a significant decreased Cx43 expression in HI group at P2 as well as in cultured astrocytes, which had morphological modifications and different A2B5 marker expression. The modification related to GluR3 receptor in HI group may be caused by impaired dendritic arborization or by a reduced number of oligodendrocyte progenitors in the cerebellum of HI animals at P9, already described in our laboratory. Cx43 reduction indicates that substances traffic through astrocytic channels may be impaired and contribute to lesion expansion of permanent damages observed in HI. Morphological and markers expression changes related to astrocyte differentiation may reflect potential effects of HI on cell maturation at long-term. Our results confirm that prenatal systemic HI may be responsible for changes that characterize glutamatergic excitotoxicity. We also reassure the importance of astrocyte communication as a neuroprotective strategy in this kind of lesion.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:33:36Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-12-10Bitstream added on 2014-06-13T20:45:26Z : No. of bitstreams: 1 amorim_ab_dr_botfmvz.pdf: 559370 bytes, checksum: 29ab57986a4159c6c7be368b68635707 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / As consequências do desmame precoce são, alterações nas características das vilosidades e das criptas do intestino delgado dos leitões, comprometendo a eficiência dos processos de digestão e de absorção de nutrientes. Foram realizados dois experimentos com o objetivo de verificar a influência das dietas no turnover do carbono e na morfologia da mucosa do duodeno e jejuno de leitões desmamados aos 21 dias de idade. As dietas foram sem glutamina, glutamato e nucleotídeos (DC); contendo 1% de glutamina (DG); contendo 1% de glutamato (DAG) e contendo 1% de nucleotídeos (DN). No primeiro experimento foram utilizados 123 animais, sendo abatidos três leitões no dia 0 e três animais de cada tratamento nos dias 1, 2, 4, 5, 7, 9, 13, 20, 27 e 49 após o desmame, para coleta de amostras da mucosa do duodeno e jejuno, que foram analisadas quanto à composição isotópica de 13C e mensurada a velocidade de substituição do carbono no tempo. No segundo experimento foram utilizados 65 animais, em delineamento experimental em blocos ao acaso, com arranjo fatorial dos tratamentos 4 x 3 +1 (quatro dietas: DC, DG, DAG e DN, três épocas de abate: 7, 14 e 28 dias pós desmame e abate no desmame: dia 0), para análises morfológicas. Os valores da meia-vida do carbono para o duodeno foram 7,3; 7,6; 6,2 e 5,2 dias e para o jejuno de 7,1; 6,7; 6,2 e 4,9 dias para as DC, DG, DAG e DN, respectivamente. As dietas não alteram a altura das vilosidades (AV), profundidade das criptas (PC) e relação altura das vilosidades: profundidade das criptas (AV:PC), com exceção da DN que determinou maior PC no duodeno, quando comparado com a DAG. A inclusão de 1% de nucleotídeos ou de 1% de glutamato nas dietas de leitões acelera o turnover do carbono da mucosa intestinal, sugerindo sua recuperação mais rápida no período... / The consequences of early weaning are the changes in the characteristics of the small intestine villus and crypts of piglets, reduce the efficiency of digestion and absorption of nutrients. Two experiments were conducted in order to study the influence of diets on carbon turnover and morphology of the mucosa of the duodenum and jejunum of piglets weaned at 21 days of age. The diets were: Diets without glutamine, glutamate and nucleotides (DC); containing 1% of glutamine (DG); containing 1% of glutamate (DAG) and containing 1% of nucleotides (DN). In the first experiment a hundred twenty three animals were used and three of them were slaughtered at day 0 and three animals from each diets on days 1, 2, 4, 5, 7, 9, 13, 20, 27 and 49 after weaning, for collecting samples of mucosa duodenum and jejunum was taken, which were analysis for the isotopic composition ‰13C and measured the time of carbon substitution. In the second experiment, sixty five animals were used in a randomized complete blocks design experiment with a 4x3x1 factorial arrangement of diets (four diets: DC, DG, DAG and DN; three slaughter ages: 7,14 and 28 days post weaning and slaughter at weaning day: day 0) for morphology analysis. The values of carbon half-life into the duodenum were 7.3, 7.6, 6.2 and 5.2 and into the jejunum were 7.1, 6.7, 6.2 and 4.9 for DC, DG, DAG and DN, respectively. Diets do not change the villus height (VH), crypt depth (PC) and villus:crypt ration (AV:PC), except that DN determined that most PC duodenum compared with the DAG. The inclusion of 1% of nucleotides or 1% of glutamate in the diet of piglets accelerates the carbon turnover of intestinal mucosa, suggesting a faster recovery post-weaning, however, was not evaluated any effect on the action of products by results of morphology analysis, indicating that the technique... (Complete abstract click electronic access below)

O presente estudo tem por objetivo investigar a influência da privação dietética de ácidos graxos ω3 no sistema glutamatérgico no hipocampo de ratos Wistar em parâmetros ontogenéticos e relacionados à neuroproteção. Os ratos foram alimentados, desde a gestação até a vida adulta, com duas dietas diferentes: uma dieta contendo ácidos graxos ω3 (grupo controle, C) e outra deficiente nestes ácidos graxos (grupo deficiente, D). Nos experimentos ontogenéticos, foram avaliados os imunoconteúdos das subunidades de receptores glutamatérgicos ionotrópicos do tipo NMDA (NR2 A/B) e AMPA (GluR1), bem como da isoforma alfa da cinase dependente de cálcio e calmodulina do tipo II (αCaMKII). Também foram avaliados a capacidade do glutamatode ligar-se a seus receptores e a captação de [3H]glutamato em fatias de hipocampo. Para investigar o efeito da privação de ácidos graxos ω3 na resposta cerebral frente à injúria isquêmica, fatias de hipocampo foram submetidas à privação de glicose e oxigênio (OGD), um modelo de isquemia in vitro. O grupo D apresentou imunoconteúdo reduzido de todas as proteínas avaliadas aos 02 dias de vida, o que foi sendo normalizado aos 21 dias (exceto pela αCaMKII) e aos 60 dias. O mesmo padrão foi observado na capacidade de ligação do glutamato aos seus receptores. Porém a captação de [3H]glutamato não foi afetada pelas dietas. Nos experimentos de OGD, o grupo D apresentou maior dano celular e uma queda na captação de [3H]glutamato mais acentuada que o grupo controle. Ainda, a privação de ácidos graxos ω3 influenciou a resposta celular anti-apoptótica após OGD, afetando a fosforilação das proteínas GSK3β e ERK1/2, mas não a fosforilação da Akt. Estes resultados sugerem que os ácidos graxos ω3 são importantes para o desenvolvimento do sistema glutamatérgico e para a proteção celular após dano isquêmico, além de ser importante para ativação de rotas de sinalização anti-apoptóticas. / The effect of dietary deprivation of essential omega-3 fatty acids on parameters of the glutamatergic system related to brain ontogeny and neuroprotection was investigated in this study. Rats were fed with two different diets: omega-3 diet (control group) and omega-3 deprived-diet (D group). In ontogeny experiments, it was evaluated the hippocampal immunocontent subunits of the of ionotropic glutamatergic receptor NMDA and AMPA (NR2 A\B and GluR1, respectively) and the alfa isoform of the calcium-calmodulin protein kinase tipe II (αCaMKII), as well as the binding and uptake of [3H]glutamate. To assess the influence of omega-3 fatty acids deprivation on brain responses to ischemic insult, hippocampal slices were submitted to oxygen and glucose deprivation (OGD), a model of in vitro ischemia. The D group showed lower immunocontent of all proteins analyzed at 02 days of life (P2) than the control group, and it was normalized at P21 (except for αCaMKII) and P60. The same pattern was found for [3H]glutamate binding, while [3H]glutamate uptake was not affected. In the OGD studies, the D group showed higher cell damage and stronger decrease in the [3H]glutamate uptake. Moreover, omega-3 deprivation influenced anti-apoptotic cell response after OGD, affecting GSK-3beta and ERK1/2, but not Akt phosphorylation. Taken together, these results suggest that omega-3 fatty acids are important for the glutamatergic development and cell protection after ischemia, and also seem to play an important role on activation of anti-apoptotic signaling pathways.

A dieta de restrição calórica (RC) tem apresentado efeitos que diminuem a progressão, ou previnem completamente, uma variedade de doenças associadas com o envelhecimento, incluindo doenças cardiovasculares, diabetes e doenças neurodegenerativas. O prejuízo da função celular astroglial, incluindo captação de glutamato, atividade da glutamina sintetase (GS) e secreção de S100B, além de parâmetros de estresse oxidativo alterados podem contribuir para a progressão de doenças neurológicas. Este estudo objetivou avaliar alterações astrocíticas hipocampais em resposta à RC, medindo parâmetros astrogliais, tais como: captação de glutamato, atividade da GS e imunoconteúdo de GFAP e S100B. Nós investigamos também, os efeitos da RC nos parâmetros hipocampais (Hc) e corticais cerebrais (Cx) de estresse oxidativo e de comportamento em ratos Wistar machos. Parâmetros bioquímicos sanguíneos também foram avaliados. Os ratos (60 dias de idade) foram alimentados com dieta ad libitum ou com RC por 12 semanas. Os animais do grupo RC apresentaram um ganho de peso menor, de aproximadamente 16% em relação ganho de peso do grupo controle. A RC induziu um aumento significativo (23%) na captação de glutamato e na atividade da GS (26%). Não houve diferença significativa no imunoconteúdo de S100B ou GFAP. Os parâmetros bioquímicos avaliados não diferiram entre os grupos, indicando bom estado de saúde. Além disso, a RC não alterou parâmetros de ansiedade, mas aumentou significativamente a atividade locomotora, elevou os níveis de GSH e diminuiu a atividade de GPx, diminuiu a produção de ERO. Além disso, não alterou a peroxidação lipídica, conteúdo de óxido nítrico e a atividade da catalase. A RC também diminuiu o nível basal de dano oxidativo ao DNA, medido pelo ensaio cometa. Em resumo, este estudo indica que a RC modula as funções astrocíticas, através do aumento da captação de glutamato e da atividade da GS, sugerindo que a dieta pode exercer seus efeitos neuroprotetores contra patologias do SNC através da modulação destas funções. A RC também pode induzir a modulação hipocampal e cortical cerebral, resultando em alterações metabólicas, que por sua vez, melhoram as condições basais de importantes parâmetros de defesa celular, como por exemplo, o aumento dos níveis de GSH e diminuição do dano oxidativo ao DNA. / The dietary caloric restriction (CR) has been shown to slow the progression of, or even prevent entirely, a range of age-dependent pathologies, including cardiovascular disease, diabetes and neurodegenerative diseases. The impairment of astroglial cell function, including glutamate uptake, glutamine synthetase (GS) activity and S100B secretion, besides oxidative stress parameters altered, may contribute to the progression of neurological disorders. The present study aimed to evaluate hippocampal astrocytic changes in response to CR diet, measuring astroglial parameters, such as glutamate uptake, GS activity and the immunocontent of GFAP and S100B. We investigated also the effects of CR on hippocampal (Hc) and cerebral cortical (Cx) oxidative stress and behavioral parameters in male Wistar rats. Blood biochemical parameters were also analyzed. Rats (60-day old) were fed ad libitum or on CR diets for 12 weeks. CR-fed rats showed approximately 16% less body weight gain than control rats. The CR diet was able to induce a significant increase in glutamate uptake (23%) and in GS activity (26%). There were no statistically significant differences in the immunocontent of either GFAP or S100B. No differences were observed in the biochemistry parameters evaluated, indicating normal healthy. CR did not alter anxiety parameters but increased locomotion performance; increased glutathione content; decreased glutathione peroxidase activity; decreased reactive oxygen species production and did not altered lipid peroxidation, nitric oxide content and catalase activity. Also, CR diet decreased basal DNA damage index, measured by comet assay. In summary, the present study indicates that CR modulates astrocyte functions by increasing glutamate uptake and GS activity, suggesting that CR might exert its neuroprotective effects against brain illness by modulation of astrocytic functions. The CR diet also induced hippocampal and cerebral cortical modulation, resulting in metabolic changes which in turn improve the basal status of important parameters of cellular defenses, such as the increased glutathione content and decreased DNA damage.

O zebrafish (Danio rerio) é uma espécie utilizada como modelo experimental em diversas áreas, tais como neurociências toxicologia. Seu genoma já está praticamente sequenciado e estudos demonstraram que muitos genes deste peixe são similares aos de mamíferos. Além disso, o zebrafish é um excelente modelo para estudar a função de diferentes sistemas de neurotransmissão. O consumo do etanol exerce diversas mudanças na coordenação motora, percepção sensorial e cognição promovendo um amplo espectro de alterações bioquímicas e fisiológicas nas células nervosas. Aqui, nós investigamos o efeito promovido pela exposição crônica de etanol nos sistemas purinérgico e glutamatérgico, e níveis de BDNF no SNC de zebrafish. Os transportadores de alta afinidade de aminoácidos (EAAT) regulam os níveis extracelulares de glutamato. Nós identificamos e descrevemos o padrão de expressão dos genes relacionados aos transportadores e as propriedades de captação de glutamato nas três importantes estruturas cerebrais de zebrafish (telencéfalo, tecto óptico e cerebelo). As pesquisas nos bancos de dados do seu genoma através de análise filogenética confirmaram a presença de diversos EAATs (EAAT2, EAAT3, três EAAT1 parálogos e duas sequências parálogas para EAAT5). Também, a captação de glutamato dependente de sódio foi significativamente maior no tecto óptico, indicando diferenças funcionais entre as estruturas cerebrais. Os EAATs pertencem à família dos carreadores de soluto 1 (SLC1), que constitui os transportadores de alta afinidade de aminoácidos e transportadores de aminoácidos neutros. Recentemente, foi demonstrada uma análise filogenética e clonagem dos genes SLC1/EAAT identificando distintos membros desta família de transportadores. No sentido de unificar a designação dos genes SLC1/EAAT em zebrafish, foi proposta uma nomenclatura comum para estes grupos. O etanol promoveu uma diminuição significativa na captação de glutamato após 7 e 14 dias de exposição (30% e 54%, respectivamente), enquanto que após 28 dias, não foram observadas alterações. Na,K-ATPase, a enzima responsável pelo controle do gradiente iônico, não teve sua atividade alterada após todos os períodos de exposição testados. Além disso, os peixes expostos ao etanol durante 7 e 14 dias tiveram uma redução nos níveis de mRNA para SLC1A1/EAAT3. Entretanto, a expressão gênica do SLC1A8a,b/EAAT6a,b aumentou após todos os períodos testados, enquanto que SLC1A3a,b/EAAT1b aumentou somente após 28 dias. A prolongada exposição ao etanol não foi capaz de alterar as atividades da glutamina sintetase e glutaminase. Da mesma forma, etanol não alterou a hidrólise de ATP e GTP. Entretanto, foi verificada uma diminuição na hidrólise de ADP (46% e 34%) e GDP (48% e 36%) após 7 e 14 dias respectivamente. Após 7 e 14 dias de exposição ao etanol, também foi observada uma significativa alteração na hidrólise de AMP (48% e 36%), enquanto que a hidrólise de GTP foi inibida somente após 7 dias (46%). Os níveis de transcritos das nucleosídeo trifosfato difosfohidrolase (NTPDases) foram alteradas após 7, 14 e 28 dias. Em contraste, a expressão da 5′-nucleotidase não foi alterada. A atividade da adenosina deaminase (ADA) na fração solúvel não foi modificada, mas uma redução da atividade na fração de membrana após 28 dias de exposição ao etanol (44%) foi observada. A análise da expressão gênica demonstrou que ADA1 permaneceu inalterada, enquanto que os transcritos de ADAL, ADA2-2, ADA2-1, e sua isoforma truncada de ―splicing‖ alternativo (ADA2-1/T) foram alteradas após a ação prolongada do etanol. Após 14 e 28 dias, etanol aumentou a expressão gênica do BDNF, mas não alterou os níveis de transcritos para trkB. A determinação da proteína BDNF através dos métodos de ELISA indicou um aumento de (51%), sendo confirmando imunohistioquímicamente. Estes resultados sugerem que a homeostase da função neurotrófica pode ser alterada pelo prolongado consumo de etanol. Esta tembém inclui uma revisão sobre o papel de diferentes neurotransmissores excitatórios e inibitórios em zebrafish, tais como, dopaminérgico, serotoninérgico, colinérgico, glutamatérgico, purinérgico, histaminérgico, nitrérgico, glicinérgico, gabaérgico, enfatizando aspectos farmacológicos e toxicológicos. Em suma, esta tese demonstra o efeito da exposição crônica ao etanol afeta o sistema glutamtérgico e purinérgico, expressão de BDNF em cérebro de zebrafish. O aumento do conhecimento global sobre os sistemas de neurotransmisão em zebrafish e o esclarecimento de efeitos farmacológicos e toxicológicos poderia contribuir para novas estratégias de pesquisa em ciências básicas e biomédicas. / The zebrafish (Danio rerio) is a species used as experimental models in various fields such as neurosciences, toxicology. Its genome has already been sequenced and studies have shown that many genes are similar to those of mammals. Furthermore, zebrafish provides an excellent model to study the function of different neurotransmitter systems. The ethanol consumption exerts several changes in motor coordination, sensory perception and cognition, promoting a wide-spectrum of biochemical and physiological alterations on nervous cells. Here we investigated the effects promoted by chronic ethanol exposure on glutamatergic and purinergic systems, and BDNF levels in zebrafish CNS. High-affinity excitatory amino acid transporters (EAATs) regulate extracellular glutamate levels. We identified and described the expression profile of EAATs-related genes and the functional properties of glutamate uptake in three major brain structures from zebrafish (telencephalon, optic tectum and cerebellum). Searches on zebrafish genome databases and a phylogenetic analysis confirmed the presence of several EAAT-related genes (EAAT2, EAAT3, three EAAT1 paralogs and two EAAT5 sequences). Moreover, the glutamate uptake was significantly higher in optic tectum, which indicates functional differences within zebrafish brain structures. EAATs belong to the solute carrier family 1 (SLC1), that constitute high-affinity glutamate and neutral amino acid transporters. Recently, the phylogenetic analysis and cloning reporting of SLC1/EAAT genes from zebrafish identified distinct members of this transporter family. In order to unify the nomenclature of SLC1/EAAT genes in zebrafish, it was proposed a common nomenclature for these groups. The actions of ethanol on glutamate uptake showed a significant decrease in glutamate transport (30% and 54%) after 7 and 14 days of exposure, whereas after 28 days, no significant changes were detected. Na,K-ATPase, the enzyme responsible to generate ion gradients, did not alter after all exposure periods. Moreover, fish exposed to ethanol during 7 and 14 days exhibit a decrease of mRNA levels for SLC1A1/EAAT3. However, the gene expression of SLC1A8a,b/EAAT6a,b increased after all exposure periods, whereas SLC1A3a,b/EAAT1b increased only after 28 days. The prolonged ethanol exposure did not significantly change the glutamine synthetase and glutaminase activities. In the same way, ethanol did not alter the ATP and GTP hydrolysis. However, a decrease in ADP (46% and 34%) and GDP (48% and 36%) hydrolysis was verified after 7 and 14 days, respectively. After 7 and 14 days of ethanol exposure, a significant decrease in AMP hydrolysis (48% and 36%) was also observed, whereas GMP hydrolysis was inhibited only after 7 days (46%). Furthermore, nucleoside triphosphate diphosphohydrolase (NTPDase) transcript levels were altered after 7, 14, and 28 days. In contrast, 5′-nucleotidase expression was not altered. Adenosine deaminase (ADA) activity from soluble fraction was not modified, but a decrease of ADA activity in membrane fraction after 28 days (44%) of ethanol exposure was observed. Gene expression analysis demonstrated that ADA1 remained unaltered, whereas ADAL, ADA2-2, ADA2-1 transcripts, and its truncated alternative splice isoform (ADA2-1/T) were altered after prolonged ethanol exposure. After 14 and 28 days, ethanol increased the BDNF gene expression, but did not change the levels of trkB transcripts. The measurement of BDNF protein through ELISA kit anti-BDNF showed increased amounts after 28 days of exposure (51%), which was also confirmed by immunohistochemstry. These results suggest that the homeostasis of neurotrophic functions may be altered by prolonged ethanol consumption. Moreover, we present a review about the role of different excitatory and inhibitory neurotransmitters systems in zebrafish, such as dopaminergic, serotoninergic, cholinergic, glutamatergic, purinergic, histaminergic, nitrergic, glycinergic, and GABAergic systems, emphasizing pharmacological and toxicological aspects. In conclusion, this thesis demonstrates that chronic ethanol exposure affects the glutamatergic and purinergic systems, and BDNF expression in zebrafish brain. The significant increase in the global knowledge about the neurotransmitters systems in zebrafish and the elucidation of pharmacological and toxicological effects could lead to new strategies and appropriate priorities in research in order to support complementary insights on basic sciences and biomedical research.

Quando confrontado com situações de medo os roedores apresentam respostas comportamentais (ex., luta, fuga, imobilidade e vocalização) e neurovegetativas (taquicardia, hipertensão e defecação) que caracterizam a reação de defesa. Em geral essas respostas são acompanhadas de antinocicepção. Estudos demonstram um papel do óxido nítrico (NO) e de receptores NMDA (N-metil-D-aspartato) na mediação de respostas nociceptivas no corno dorsal da medula espinal. Resultados do nosso laboratório demonstraram que a exposição a uma situação ameaçadora, como o labirinto em cruz elevado aberto ou sem paredes (LCEa), provoca antinocicepção de alta magnitude em ratos e camundongos. Assim, o presente estudo teve por objetivo investigar o papel do complexo receptor glutamato/NMDA e NO no corno dorsal da medula espinal na resposta antinociceptiva induzida pela exposição ao LCEa. Camundongos receberam injeção por via intratecal (i.t.) de NMDA (0; 0,4 ou 0,8 nmol/5,0 l) para avaliar seus efeitos intrínsecos sobre a nocicepção. Enquanto a dose de 0,8 nmol de NMDA provocou efeitos nociceptivos, a dose de 0,4 nmol se mostrou desprovida de efeitos. Em seguida, nosso estudo avaliou os efeitos do NMDA (0; 0,1; 0,2 ou 0,4 nmol, i.t.) na nocicepção induzida pela injeção de formalina 2,5% na pata traseira direita do camundongo. Nenhuma dose de NMDA aumentou o tempo de lambidas na pata durante os 10 minutos do teste. Assim, investigamos os efeitos da injeção i.t. de NMDA (0; 0,1; 0,2 ou 0,4 nmol) na antinocicepção induzida pela exposição ao ambiente aversivo (LCEa) ou não aversivo (LCE fechado: quatro braços com paredes; LCEf) em camundongos pré-tratados com formalina a 2,5% na pata traseira direita, durante 10 minutos. O tratamento com NMDA (0,4 nmol) reverteu parcialmente a antinocicepção induzida pela exposição ao LCEa, sem afetar a resposta dos animais expostos ao LCEf. Para avaliar se os efeitos anti-antinociceptivos do NMDA (0,4 nmol) dependem da síntese de NO, camundongos receberam injeção i.t. combinada de L-NAME (N-nitro-L-arginina-metil-éster), um inibidor da NOS, e NMDA. O pré-tratamento com L-NAME (40 nmoles/5,0 l i.t.) bloqueou seletivamente os efeitos anti-antinociceptivos do NMDA. Tomados em conjunto, nossos resultados sugerem que a antinocicepção induzida pela exposição ao LCEa pode ser parcialmente revertida pela ativação de receptores NMDA e indicam que esse efeito depende da síntese de NO no corno dorsal da medula espinal de camundongos. / Rodents exposed to threatening situations (e.g., prey-predator interactions) usually display defensive behaviors (e.g., fight, flight, freezing, vocalization), and neurovegetative (e.g., tachycardia, hypertension, defecation) responses characterized as a fear reaction. Commonly, these responses are accompanied by antinociception. Evidence showing that the glutamate NMDA (N-methyl-d-aspartate) receptor and nitric oxide (NO) complex located within the dorsal horn of the spinal cord in the mediation of the nociceptive response have instigated researchers to investigate the role of the NMDA/NO on some types of fear-induced antinociception. This study investigated the role of the glutamate-NMDA receptor complex and NO in the dorsal horn of the spinal cord of mice in the antinociception induced by a potentially aversive situation, i.e., an exposure to an open elevated plus maze (oEPM: four open arms). Mice were intrathecally (i.t.) injected with N-methyl-D-aspartic acid (NMDA: 0, 0.4 or 0.8 nmol/5.0 l) to assess its intrinsic effects upon nociception. Results showed that NMDA at 0.8 nmol, but not at 0.4 nmol, was able to induce intrinsic nociceptive effect. When injected in animals pre-treated with formalin 2.5% into the right hind paw (nociceptive test), NMDA (0, 0.1, 0.2 or 0.4 nmol, i.t.) did not change time spent licking the formalin injected paw. Then, we investigated the effects of NMDA injection (0, 0.1, 0.2 or 0.4 nmol, i.t.) on nociceptive response induced by formalin test in mice exposed to the oEPM (aversive situation) or enclosed EPM (eEPM: four enclosed arms; control situation) for 10 minutes. NMDA treatment (0.4 nmol) partially reversed the antinociception induced by oEPM exposure without affect nociception in mice exposed to the eEPM. Finally, we investigated whether the anti-antinociceptive effect of NMDA would be dependent on NO synthesis by injecting L-NAME (N-nitro-L-arginine-methyl-ester) i.t., a inhibitor of NOS (nitric oxide synthase), 10 minutes before NMDA injection. L-NAME pretreatment (40 nmol/5.0 l; i.t.) selectivelly blocked anti-antinociceptive effect of NMDA 0.4 nmol. Taken together, our results suggest that antinociception induced by oEPM exposure (i) is, at least in part, reversed by NMDA receptors activation and (ii) this NMDA effect seems to be dependent on NO synthesis within the dorsal horn of the spinal cord in mice.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:22:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 5326.pdf: 3132298 bytes, checksum: b48fee8c0ed5cf0a98acd523a57a6a84 (MD5) Previous issue date: 2013-06-28 / Universidade Federal de Minas Gerais / The rostroventrolateral medulla (RVLM) is a main central area of origin of sympathetic premotor neurons in the central nervous system (CNS) and has an important role in the generation and maintenance of sympathetic vasomotor tone. The RVLM receives both excitatory and inhibitory influences from different regions of the CNS. Recent results from our laboratory suggest that the activity of forebrain cholinergic and angiotensinergic mechanisms and anteroventral region of the third ventricle (AV3V) is important for the pressor response produced by injection of the excitatory amino acid glutamate in the RVLM. Intracerebroventricular (icv) injection of carbachol (cholinergic agonist) or angiotensin II (ANG II) causes pressor responses dependent on sympathetic activation and vasopressin secretion that are abolished by lesions of the AV3V region. Studies in anesthetized rats suggested that changes in fluid-electrolyte balance, particularly in rats with access to only normal chow and 0.9% NaCl for 14 days, increases sympathetic activity and blood pressure in response to injections of glutamate into the RVLM. In the present study, we investigated the cardiovascular responses produced by injection of glutamate, acetylcholine, GABA and angiotensin II in the RVLM in unanesthetized rats after 24 h water deprivation or access to only normal chow and 0.9% NaCl for 14 days. In this last protocol it was also tested the effects of different doses of glutamate (0.1, 1, 3 and 5 nmol/100 nl) injected into the RVLM. Basal mean arterial pressure (MAP) and heart rate (HR) in rats with 24 h of water deprivation (108 +- 2 mmHg and 354 +- 17 bpm, respectively) or rats treated with normal chow and 0.9% NaCl for 14 days (115 +- 2 mmHg and 359 +- 17 bpm, respectively) were not different from those of control animals (113 +- 2 mmHg and 383 +- 16 bpm, respectively). Changes in MAP of animals with 24 h water deprivation were not different from those observed in control animals after injection into the RVLM of glutamate (5 nmol/100 nl) (51 +- 3 mmHg, vs. controls: 55 +- 4 mmHg), acetylcholine (10 nmol/100 nl) (22 +- 9 mmHg, vs. controls: 15 +- 12 mmHg), angiotensin II (200 ng/100 nl) (41 +- 5 mmHg, vs. controls: 50 +- 6 mmHg) or GABA (1 nmol/100 nl) (-19 +- 3 mmHg, vs. controls: -19 +- 3 mmHg). In animals that had access to 0.9% NaCl for 14 days, the changes in MAP were also similar to control animals after injection into the RVLM of glutamate (42 +- 7 mmHg, vs. controls: 46 +- 16 mmHg), acetylcholine (31 +- 3 mmHg, vs. controls: 26 +- 2 mmHg), angiotensin II (53 +- 4 mmHg, vs. controls: 46 +- 8 mmHg) or GABA (-22 +- 5 mmHg vs. controls: -17 +- 4 mmHg). In rats with access to 0.9% NaCl for 14 days we did not observe differences in the changes in MAP produced by injection of glutamate into the RVLM at doses of 0.1 nmol/100 nl (11 +- 1 mmHg, vs. controls: 10 +- 4 mmHg), 1 nmol/100 nl (17 +- 6 mmHg, vs. controls: 14 +- 4 mmHg), 3 nmol/100 nl (24 +- 9 mmHg, vs. controls: 43 +- 11 mmHg) or 5 nmol/100 nl (43 +- 6 mmHg, vs. controls: 56 +- 6 mmHg). The HR variations produced by the different treatments in the RVLM in control rats, rats with 24 h of water deprivation or those that had access to 0.9% NaCl for 14 days were also similar. Unlike the results in the literature with anesthetized rats, the present results suggest that the access to normal chow and 0.9% NaCl for 14 days does not modify the cardiovascular responses produced by the injection of different doses of glutamate, acetylcholine, ANG II or GABA into the RVLM in unanesthetized rats. The same is true for unanesthetized rats with 24 h water deprivation. Another objective of this study was to investigate the cardiovascular responses produced by injection of glutamate into the RVLM in awake rats pretreated with either carbachol (cholinergic agonist) or ANG II injected into the lateral ventricle (LV). Basal MAP and HR of the animals were 117 +- 4 mmHg and 400 +- 17 bpm, respectively. The pressor response produced by injection of glutamate (5 nmol/100 nl) into the RVLM increased after pretreatment with carbachol (4 nmol/1 £gl) or Ang II (50 ng/1 £gl) injected icv (59 +- 3 and 68 +- 5 mmHg, respectively) compared with the control responses produced by glutamate injection in the RVLM combined with icv injection of vehicle (37 +- 3 mmHg). The pressor responses produced by the injection of carbachol or ANG II icv (which reached a maximum of 56 +- 3 and 44 +- 3 mmHg, respectively) were already reduced (9 +- 2 and 6 +- 3 mmHg, respectively) at the time of injection glutamate into the RVLM (20 min after icv injection). There was no difference in the changes in HR that occurred after the injection of carbachol or ANG II into the LV or glutamate injected into the RVLM alone or combined. These results suggest that central cholinergic or angiotensinergic activation facilitates the pressor response produced by RVLM glutamatergic activation. Moxonidine (£\2 adrenergic/imidazole receptor agonist), used as antihypertensive, reduces sympathetic discharges by central action. Thus, we investigated the effect of previous injection of moxonidine into the RVLM on the cardiovascular responses produced by glutamate injection in the same area. Basal MAP and HR of the animals were 112 +- 4 mmHg and 393 +- 30 bpm, respectively. The previous injection of moxonidine (5 nmol/100 nl) into the RVLM reduced the pressor response produced by the injection of glutamate (5 nmol/100 nl) into the RVLM (23 +- 3 mmHg, vs. after vehicle: 45 +- 6 mmHg) without significant changes in the bradycardic response (-7 +- 18 bpm, vs. after vehicle: -28 +- 15 bpm). The results suggest that activation of £\2 adrenergic/imidazole receptors by the injection of moxonidine into the RVLM attenuates the pressor response resulting from sympathetic activation produced by glutamatergic stimulation of this area. Finally we investigated the cardiovascular responses produced by the injection of carbachol into the LV in rats treated with moxonidine injected bilaterally into the RVLM combined or not with vasopressinergic antagonist (AVP) injected intravenously (iv). Baseline MAP and HR of the animals that were treated with carbachol in the LV combination or not with the antagonist of AVP iv + moxonidine into the RVLM were 118 +- 3 mmHg and 404 +- 12 bpm, respectively. Bilateral injections of moxonidine (5 nmol/100 nl) into the RVLM in these rats caused a reduction in MAP when compared with the pre-injection values or controls. HR reduction was also observed after injections of moxonidine into the RVLM when compared to control. Previous injections of moxonidine (5 nmol/100 nl) into the RVLM reduced the initial pressor response (2 minutes) produced by the injection of carbachol (4 nmol/1 £gl) into the LV (21 +- 4 mmHg, vs. vehicle 40 +- 2 mmHg), whereas later (8 to 18 min after the injection of carbachol) occurred a potentiation of the pressor response to carbachol (63 +- 4 mmHg, vs. vehicle 44 +- 2 mmHg). The prior iv injection of the vasopressin V1 receptor antagonist (10 mg/kg body weight) reduced the late pressor response (8 to 18 min) produced by the injection of carbachol (4 nmol/1 £gl) in the rats treated with LV injections of moxonidine (5 nmol/100 nl) into the RVLM (8': 22 +- 3 mmHg; 10': 19 +- 3 mmHg; 12': 18 +- 3 mmHg; 14': 18 +- 3 mmHg; 16': 14 +- 3 mmHg; 18': 12 +- 3 mmHg) or vehicle treated in RVLM (8': 20 +- 3 mmHg; 10': 16 +- 3 mmHg; 12': 14 +- 3 mmHg; 14': 13 +- 3 mmHg; 16': 12 +- 3 mmHg; 18': 12 +- 3 mmHg). In rats treated with AVP antagonist the initial pressor response (2 minutes) was also reduced in the groups receiving moxonidine in the RVLM (17 +- 3 mmHg) or vehicle in RVLM the (29 +- 4 mmHg). There was no difference in the late response to carbachol of rats receiving injections of vehicle or moxonidine into the RVLM combined with vasopressin antagonist iv. The HR changes that occurred after the injection of carbachol into the LV combined with moxonidine or vehicle injected into the RVLM in rats receiving or not vasopressin antagonist iv were similar. The peak pressor response to carbachol injected into the LV of rats treated with moxonidine injected into the RVLM which was higher (63 +- 4 mm Hg) than that of vehicle-treated rats in RVLM (43 +- 2 mmHg) was reduced to similar values in rats with blockade of vasopressin V1 receptor treated with moxonidine (26 +- 2 mmHg) or vehicle in RVLM (32 +- 2 mmHg). Thus, the present results suggest that the late increase in the pressor response produced by injections of carbachol icv in rats treated with moxonidine in RVLM is due to increased secretion of vasopressin. / A região rostroventrolateral do bulbo (RVL) é um dos principais locais de origem de neurônios pré-motores simpáticos no sistema nervoso central (SNC) e tem uma importante participação na geração e manutenção do tônus vasomotor simpático. A região RVL recebe influências tanto excitatórias quanto inibitórias de diferentes regiões do SNC. Resultados recentes de nosso laboratório sugerem que a atividade de mecanismos angiotensinérgicos e colinérgicos prosencefálicos e da região anteroventral do terceiro ventrículo (AV3V) é importante para a resposta pressora produzida pela injeção do aminoácido excitatório glutamato na região RVL. Injeções intracerebroventriculares (icv) de carbacol (agonista colinérgico) ou angiotensina II (ANG II) causam respostas pressoras dependentes da ativação simpática e secreção de vasopressina que são abolidas pela lesão da região AV3V. Estudos em ratos anestesiados sugerem que modificações do equilíbrio hidroeletrolítico, particularmente em ratos com acesso apenas a ração normal e NaCl 0,9% por 14 dias, resultam em aumento da atividade simpática e da pressão arterial após injeções de glutamato na área RVL. No presente estudo, investigamos as respostas cardiovasculares produzidas por injeção de glutamato, acetilcolina, angiotensina II ou GABA na área RVL em ratos acordados após 24 h de privação hídrica ou do acesso apenas a ração normal e NaCl 0,9% durante 14 dias e neste último também foram testadas as respostas a diferentes doses de glutamato (0,1; 1; 3 e 5 nmol/100 nl) injetadas na área RVL. A PAM e a FC basais dos animais com privação hídrica (108 +- 2 mmHg e 354 +- 17 bpm, respectivamente) ou dos ratos tratados com ração normal e NaCl 0,9% durante 14 dias (115 +- 2 mmHg e 359 +- 17 bpm, respectivamente) não foram diferentes daquelas dos animais controles (113 +- 2 mmHg e 383 +- 16 bpm, respectivamente). As variações da PAM dos animais com 24 h de privação hídrica não foram diferentes das observadas nos animais controles após injeção na área RVL de glutamato (5 nmol/100 nl) (51 +- 3 mmHg, vs. controles: 55 +- 4 mmHg), acetilcolina (10 nmol/100 nl) (22 +- 9 mmHg, vs. controles: 15 +- 12 mmHg), angiotensina II (200 ng/100 nl) (41 +- 5 mmHg, vs. controles: 50 +- 6 mmHg) ou GABA (1 nmol/100 nl) (-19 +- 3 mmHg, vs. controles: -19 +- 3 mmHg). Nos animais que tiveram acesso a NaCl 0,9% por 14 dias, as alterações da PAM também foram similares às dos animais controles após injeção na área RVL de glutamato (42 +- 7 mmHg, vs. controles: 46 +- 16 mmHg), acetilcolina (31 +- 3 mmHg, vs. controles: 26 +- 2 mmHg), angiotensina II (53 +- 4 mmHg, vs. controles: 46 +- 8 mmHg) ou GABA (-22 +- 5 mmHg, vs. controles: -17 +- 4 mmHg). Em ratos com acesso a NaCl 0,9% por 14 dias também não foram observadas diferenças nas alterações da PAM produzidas pela injeção de glutamato na área RVL nas doses de 0,1 nmol/100 nl (11 +- 1 mmHg, vs. controles: 10 +- 4 mmHg), 1 nmol/100 nl (17 +- 6 mmHg, vs. controles: 14 +- 4 mmHg), 3 nmol/100 nl (24 +- 9 mmHg, vs. controles: 43 +- 11 mmHg) ou 5 nmol/100 nl (43 +- 6 mmHg, vs. controles: 56 +- 6 mmHg). As variações de FC produzidas pelos diferentes tratamentos na área RVL em ratos controles, com 24 de privação hídrica ou que tiveram acesso a NaCl 0,9% por 14 dias também foram semelhantes. Diferentemente do que sugerem resultados da literatura obtidos em ratos anestesiados, os presentes resultados sugerem que o acesso apenas a ração normal e NaCl 0,9% por 14 dias não modifica as respostas cardiovasculares produzidas pela injeção de diferentes doses de glutamato, acetilcolina, ANG II ou GABA na área RVL em ratos acordados. O mesmo é válido para ratos acordados com 24 h de privação hídrica. Outro objetivo deste estudo foi Investigar as respostas cardiovasculares produzidas pela injeção de glutamato na área RVL em ratos acordados pré-tratados com carbacol (agonista colinérgico) ou angiotensina II (ANG II) injetados no ventrículo lateral (LV). A PAM e a FC basais dos animais foram 117 +- 4 mmHg e 400 +- 17 bpm, respectivamente. A resposta pressora produzida pela injeção de glutamato (5 nmol/100 nl) na área RVL aumentou após o pré-tratamento com carbacol (4 nmol/1 μl) ou ANG II (50 ng/1 μl) injetados intracerebroventricularmente (icv) (59 +- 3 e 68 +- 5 mmHg, respectivamente) em comparação com as respostas controles produzidas pela injeção de glutamato na área RVL combinada com injeção de veículo icv (37 +- 3 mmHg). As respostas pressoras produzidas pela injeção de carbacol ou ANG II icv (que alcançaram o máximo de 56 ± 3 e 44 ± 3 mmHg, respectivamente) já se encontravam reduzidas (9 ± 2 e 6 ± 3 mmHg, respectivamente) no momento da injeção de glutamato na área RVL (20 min após a injeção icv). Não houve diferença nas modificações de FC que ocorreram após a injeção de carbacol ou ANG II no VL ou glutamato injetado na área RVL sozinhos ou combinados. Estes resultados sugerem que a ativação colinérgica ou angiotensinérgica central facilita a resposta pressora produzida pela ativação glutamatérgica da área RVL. A moxonidina (agonista de receptores adrenérgicos α2/imidazólicos), usada como anti-hipertensivo, reduz descargas simpáticas por ação central. Assim, foram investigados os efeitos de injeções prévias de moxonidina na área RVL sobre as respostas cardiovasculares produzidas por injeções de glutamato na mesma área. A PAM e a FC basais dos animais foram 112 +- 4 mmHg e 393 +- 30 bpm, respectivamente. A injeção prévia de moxonidina (5 nmol/100 nl) reduziu a resposta pressora produzida pela injeção de glutamato (5 nmol/100 nl) na área RVL (23 +- 3 mmHg, vs. após veículo: 45 +- 6 mmHg), sem modificações significantes da bradicardia (-7 +- 18 bpm, vs. após veículo: -28 +- 15 bpm). Os resultados sugerem que a ativação de receptores adrenérgico +-2 e/ou imidazólicos pela injeção de moxonidina na área RVL atenua a resposta pressora que resulta da ativação simpática produzida pela estimulação glutamatérgica desta área. Por último foram investigadas as respostas cardiovasculares produzidas pela injeção de carbacol no VL de ratos tratados com moxonidina injetada bilateralmente na área RVL combinada ou não com antagonista vasopressinérgico injetado intravenosamente (iv). A PAM e a FC basais dos animais que foram tratados com carbacol no VL combinado ou não com o antagonista de AVP iv + moxonidina na área RVL foram 118 +- 3 mmHg e 404 +- 12 bpm, respectivamente. As injeções bilaterais de moxonidina (5 nmol/100 nl) na área RVL também nestes ratos causaram redução da PAM quando comparado com o valor pré-injeção ou aos valores controles. Em relação à frequência cardíaca foi observada redução após as injeções de moxonidina da área RVL apenas quando comparados ao controle. As injeções prévias de moxonidina (5 nmol/100 nl) na área RVL reduziram a resposta pressora inicial (2 minutos) produzida pela injeção de carbacol (4 nmol/1 μl) no VL (21 +- 4 mmHg, vs. veículo: 40 +- 2 mmHg), enquanto que mais tardiamente (de 8 a 18 min após a injeção de carbacol) levou a uma potenciação da resposta pressora do carbacol (63 +- 4 mmHg, vs. veículo: 44 +- 2 mmHg). A injeção iv prévia do antagonista de receptores V1 de vasopressina (10 μg/kg de peso corporal) reduziu a resposta pressora tardia (de 8 a 18 min) produzida pela injeção de carbacol (4 nmol/1 μl) no VL em ratos tratados com injeções de moxonidina (5 nmol/100 nl) na área RVL (8 : 22 +- 3 mmHg; 10 : 19 +- 3 mmHg; 12 : 18 +- 3 mmHg; 14 : 18 +- 3 mmHg; 16 : 14 +- 3 mmHg; 18 : 12 +- 3 mmHg) ou tratados com veículo na área RVL (8 : 20 +- 3 mmHg; 10 : 16 +- 3 mmHg; 12 : 14 +- 3 mmHg; 14 : 13 +- 3 mmHg; 16 : 12 +- 3 mmHg; 18 : 12 +- 3 mmHg). Nos ratos tratados com antagonista de AVP também ocorreu redução da resposta pressora inicial (2 minutos) nos grupos que receberam moxonidina na área RVL (17 +- 3 mmHg) ou veículo na área RVL (29 ± 4 mmHg). Não houve diferença na resposta tardia do carbacol entre ratos que receberam injeção de veículo ou moxonidina na área RVL combinada com antagonista de vasopressina iv. As modificações de frequência cardíaca que ocorreram após a injeção de carbacol no VL combinada com moxonidina ou veículo injetado na área RVL em ratos que receberam ou não antagonista de vasopressina iv foram semelhantes. O pico da resposta pressora do carbacol injetado no VL em ratos tratados com moxonidina na área RVL que foi maior (63 +- 4 mmHg) do que aquele dos ratos tratados com veículo na área RVL (43 +- 2 mmHg), foi reduzido para valores semelhantes em ratos com bloqueio dos receptores V1 de vasopressina tratados com moxonidina (26 +- 2 mmHg) ou veículo na área RVL (32 +- 2 mmHg). Assim, os presentes resultados sugerem que o aumento tardio da resposta pressora produzida por injeções de carbacol icv em ratos tratados com moxonidina na área RVL é devido ao aumento da secreção de vasopressina.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The interest in organoselenium biochemistry and pharmacology has increased in the last two decades due to a variety of organoselenium compounds that possess biological activity. Accordingly, bis selenide is known as a safe drug when administered acutely to mice at doses that have antiinflammatory and antinociceptive activities. Therefore, the search for the mechanisms by which this compound exerts its effects is extremely important for the therapeutic application. Based on the considerations above, the aims of the present study were to evaluate the antinociceptive properties, as well as the possible mechanisms involved in this process. The oral administration of bis selenide caused significant inhibition of the biting behavior induced by intrathecal (i.t.) injection of glutamate, kainate, (±)-1-aminocyclopentane-trans-1,3-dicarboxylic acid (trans-ACPD), capsaicin, substance P (SP), interleukin 1β (IL-1β) and tumor necrosis factor-α (TNF-α) but completely failed to affect the nociception induced by α-amino-3-hydroxy-5-mehtyl-4-isoxazolepropionic acid (AMPA) and N-methyl-D-aspartate (NMDA). In addition, the oral administration (p.o.) of bis selenide caused a significant increase in hot plate (55 °C) response latency. The antinociceptive effect caused by bis selenide in the hot plate test was reversed by i.t. injection of several K+ channel blockers tetraethylammonium (TEA, non-selective voltage-dependent K+ channel inhibitor) and glibenclamide (ATP-sensitive K+ channel inhibitor) but was not significantly reversed by pretreatment of animals with apamin and charybdotoxin (large- and smallconductance Ca2+- activated K+ channel inhibitors, respectively). These results suggest the participation of glutamatergic, peptidergic and vanilloid systems and potassium channel in the antinociceptive action caused by bis selenide in mice. / Nos últimos anos, os compostos orgânicos de selênio têm sido alvos de interesse em síntese orgânica em virtude da descoberta de suas aplicações sintéticas e de suas propriedades farmacológicas. O seleneto vinílico bis substituído (SVBS) é um composto orgânico de selênio que apresenta baixa toxicidade quando administrado pela via subcutânea em camundongos, nas doses em que exerce ação antinociceptiva e antiinflamatória. Assim, a pesquisa dos mecanismos pelos quais esse composto exerce os efeitos farmacológicos é importante para a sua aplicação terapêutica. Desta forma, no presente trabalho investigou-se as propriedades antinociceptivas do SVBS, bem como os possíveis mecanismos envolvidos em tal processo. A administração oral do SVBS preveniu a nocicepção induzida pela injeção intratecal (i.t.) de glutamato, cainato, ácido (±)-1- aminociclopentano-trans-1,3-dicarboxílico (trans-ACPD), capsaicina, substância P (SP), fator de necrose alfa (TNF-α) e interleucina 1β (IL-1β), mas não bloqueou significativamente a nocicepção causada pela injeção i.t. do ácido α- amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolopropionico (AMPA) e ácido N-metil-D-aspártico (NMDA). Além disso, a administração oral do SVBS foi capaz de prevenir a nocicepção térmica, no modelo da chapa quente a 55°C. A antinocicepção causada pela administração oral do SVBS no teste da chapa quente foi revertida pelo pré-tratamento com tetraetilamônio (TEA; bloqueador de diferentes tipos de canais de potássio, inclusive os dependentes de voltagem) e glibenclamida (bloqueador de canais de K+ dependente de ATP), mas não foi revertida pelo pré-tratamento dos animais com apamina (bloqueador de canais de potássio de baixa condutância ativados por cálcio) e caribidotoxina (bloqueador de canais de potássio de alta condutância ativados por cálcio). De acordo com o presente trabalho pode-se concluir que os mecanismos responsáveis pela ação antinociceptiva causada pelo SVBS em camundongos envolvem a participação dos sistemas glutamatérgicos, peptidérgicos e vanilóides e canais de potássio.

Made available in DSpace on 2016-12-08T16:24:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGCA11MA068.pdf: 13593 bytes, checksum: bb2118cc19310d22381d61f71c63aee7 (MD5) Previous issue date: 2011-06-01 / The mitochondrial enzyme Glutamate Dehydrogenase (GDH: EC 1.4.1.2) catalyzes the reversible deamination of the L-glutamate for 2-oxoglutarate (α-ketoglutarate) using NAD+ and NADP+ as coenzymes. It is a complex allosteric enzyme that consists of six identical subunits being its activity influenced by both, the ADP its positive modulator, and by the GTP, its negative modulator.It is one of the most important liver enzymes found in hepatocytes of cattle, sheep and goats. Infections by Fasciola spp or severe acute intoxication by toxins of plants such as Xanthium spp and Senecio spp as well as intoxication by copper result in the release of this enzyme in blood. The increase of the GDH indicates damage or hepatic necrosis in cattle and sheep. This is an enzyme of choice to evaluate the function of the ruminants. In the present study the cDNA, that codifies the GDH enzyme of the hepatocyte of sheep, was synthesized by means of the RT-PCR making use of mRNA extracted from the liver of sheep. Part of the region where the cDNA of the GDH of the ovine is codified was amplified by PCR from primers synthesized through the comparison of the aligned sequences of Ovis aries with those of the Bos taurus,. Homo sapiens, Rattus norvegicus and Mus musculus available in the database, where highly conserved regions, as well as variable regions were identified.The cDNA was cloned in the vector pGEM®-T Easy Vector Systems and inserted in competent cells of the Escherichia coli DH10B by means heat shock. The plasmid DNA was purified and after sequencing, the presence of an insert of 1292 pb was confirmed. The alignment of the sequence deduced of amino acid with other species revealed high homology among the GDH / A enzima mitocondrial Glutamato Desidrogenase (GDH : EC 1.4.1.2) catalisa a desaminação reversível do L- glutamato para 2-oxoglutarato (α-cetoglutarato) usando o NAD+ e NADP+ como coenzimas . É uma enzima alostérica complexa que consiste em seis subunidades idênticas sendo sua atividade influenciada tanto pelo ADP, seu modelador positivo, como pelo GTP, seu modelador negativo. É uma das mais importantes enzimas hepáticas encontradas em hepatócitos de bovinos, ovinos e caprinos. Infecções por Fasciola spp ou intoxicação grave aguda por toxinas de plantas tais como Xanthium spp e Senecio spp e intoxicação por cobre resultam na liberação dessa enzima no sangue. O aumento da GDH indica danos ou necrose hepática em bovinos e ovinos. Esta é a enzima de escolha para avaliar a função hepática dos ruminantes. No presente trabalho o cDNA que codifica a enzima GDH do hepatócito de ovino foi sintetizado por meio de RT-PCR utilizando mRNA extraído do fígado de ovino. Parte da região de codificação do cDNA da GDH de ovino foi amplificada por PCR a partir de oligonucleotídeos iniciadores sintetizados através da comparação das sequências alinhadas de Ovis aries com de Bos taurus, Homo sapiens, Rattus norvegicus e Mus musculus disponíveis em banco de dados, onde foram identificadas regiões bastante conservadas e regiões variáveis. O cDNA foi clonado no vetor pGEM® -T Easy Vector Systems e inserido em células competentes de Escherichia coli DH10B através de choque térmico. O DNA plasmidial foi purificado e após o sequenciamento a presença de um inserto de 1292 pb foi confirmado. O alinhamento da sequência deduzida de aminoácidos com outras espécies revelou alta homologia entre as GDH

Submitted by Automa??o e Estat?stica (sst@bczm.ufrn.br) on 2016-02-22T23:19:51Z No. of bitstreams: 1 JoseXavierDeLimaNeto_DISSERT.pdf: 20857554 bytes, checksum: 04aea5694e5da65425668c7f81185381 (MD5) / Approved for entry into archive by Arlan Eloi Leite Silva (eloihistoriador@yahoo.com.br) on 2016-02-26T00:31:29Z (GMT) No. of bitstreams: 1 JoseXavierDeLimaNeto_DISSERT.pdf: 20857554 bytes, checksum: 04aea5694e5da65425668c7f81185381 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-02-26T00:31:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 JoseXavierDeLimaNeto_DISSERT.pdf: 20857554 bytes, checksum: 04aea5694e5da65425668c7f81185381 (MD5) Previous issue date: 2015-02-26 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior - CAPES / No sistema nervoso central de mam?feros, a transmiss?o sin?ptica r?pida entre c?lulas nervosa ? realizada primariamente pelo receptor ?-amino-3-hidroxi-5-metil-4- isoxazolpropi?nico (AMPA), um Receptor Ionotr?pico de Glutamato, que est? relacionado com a aprendizagem, mem?ria e homeostase do sistema nervoso. Defici?ncias em seu funcionamento s?o correlacionadas com o desenvolvimento de muitas desordens cerebrais, tais como epilepsia, esquizofrenia, autismo, Parkinson e Alzheimer. O uso dos an?logos de wilardina tem se mostrado uma poderosa ferramenta para o entendimento dos mecanismos de ativa??o e dessensibiliza??o deste receptor, pois a modifica??o em um ?nico ?tomo deste ligante permite a observa??o de variados n?veis de efic?cia. Neste trabalho, tirando vantagem das estruturas de Fl?or Wilardina (1.35?), Hidrog?nio Wilardina (1.65?), Bromo Wilardina (1.8?) e Iodo Wilardina (2.15?), co-cristalizadas com o receptor GluA2 com os c?digos 1MQI, 1MQJ, 1MQH e 1MQG, respectivamente, buscou-se diferenciar energeticamente a efic?cia dos quatro ligantes. Os complexos foram submetidos a c?lculos energ?ticos baseados na teoria do funcional da densidade (DFT), sob a ?ptica do m?todo do fracionamento molecular com caps conjugados (MFCC). Os resultados obtidos mostram uma rela??o entre os valores energ?ticos e a ordem de efic?cia de cada wilardina (FW > HW > BrW > IW), ainda evidenciam a import?ncia de E705, R485, Y450, S654, T655, T480 e P478 como os amino?cidos que contribuem mais fortemente com a intera??o dos quatro agonistas parciais wilardina. Juntamente com isto, delineamos o comportamento de M708, sendo atra?do pelos ligantes FW e HW, e repelido por BrW e IW. Com os dados relatados neste trabalho, faz-se poss?vel um melhor entendimento do receptor AMPA, o que pode servir como auxilio no desenvolvimento de novos f?rmacos para este sistema. / In the central nervous system (CNS) of mammalian, fast synaptic transmission between nerve cells is performed primarily by ?-amino-3-hydroxy-5-methyl-4- isoxazolepropionic acid (AMPA) receptors, an ionotropic glutamate receptor that is related with learning, memory and homeostasis of the nervous system. Impairments in their functions are correlated with development of many brain desorders, such as epilepsy, schizophrenia, autism, Parkinson and Alzheimer. The use of willardiine analogs has been shown a powerful tool to understanding of activation and desensitization mechanisms of this receptors, because the modification of a single ligand atom allows the observation of varying levels of efficacy. In this work, taking advantage of Fluorine Willardiine (1.35?), Hydrogen Willardiine (1.65?), Bromine Willardiine (1.8?) and Iodine Willardiine (2.15?) structures co-crystalized with GluA2 with codes 1MQI, 1MQJ, 1MQH and 1MQG, we attempted to energetically differentiate the four ligands efficacy. The complexes were submitted to energetic calculations based on density functional theory (DFT), under the optics of molecular fractionation with conjugate caps (MFCC) method. Obtained results show a relationship between the energetic values and willardiines efficacy order (FW> HW > BrW > IW), also show the importance of E705, R485, Y450, S654, T655, T480 e P478 as the amino acids that contribute most strongly with the interaction of four partial agonists. Furthermore, we outlined the M708 behaviour, attracted by FW and HW ligands, and repels by BrW and IW. With the datas reported on this work, it is possible for a better understanding of the AMPA receptor, which can serve as an aid in the development of new drugs for this system.