Os insetos são capazes de sobreviver em diversos ecossistemas do planeta e, mesmo estando constantemente expostos à ameaça de infecção microbiana, permanecem livres de infecções na maior parte do tempo. Essa capacidade de sobrevivência aliada à larga distribuição dos insetos em regiões totalmente diferentes tem estimulado a pesquisa de novos agentes terapêuticos nesta classe devido à descoberta de diversos componentes de mecanismos inespecíficos de combate à infecção, sendo possível sua aplicação no controle de diversas doenças. Todavia, apesar de um grande número de moléculas de defesa ter sido identificado a partir de vários insetos, pouca informação sobre suas aplicações está disponível. Desta forma, o presente trabalho elucida o perfil transcriptômico geral e dos genes de defesa do tegumento de Podalia orsilochus durante sua fase larval. Como consequência, os transcritos e os dados obtidos permitirão o auxílio em pesquisas posteriores, seja para comparação, citação, conhecimento biológico e das respostas de defesa ou das relações de filogenia do animal. / The insects are able to survive in diverse ecosystems on earth, and even being constantly exposed to the threat of microbial infections, remain free of infection for most of the time. This survivability combined with the wide distribution of insects in totally different regions has stimulated the search for new therapeutic agents in this class due to the discovery of several components of nonspecific mechanisms to fight infection, and possible implementation in the control of various diseases. However, despite a large number of defense molecules have been identified from various insects, little information is available on their applications. Thus, this paper elucidates the general transcriptomic profile and integument of defense gene Podalia orsilochus during their larval stage. As a result, the transcripts and the data obtained will aid in further research, to compare, reference, biological knowledge and defense or animal phylogeny relationships.

Submitted by Hiolanda Rêgo (hiolandarego@gmail.com) on 2016-02-23T13:49:32Z No. of bitstreams: 1 tese-doutorado- Ângela Gomes de Vasconcellos.pdf: 1002243 bytes, checksum: e012a52c53b7825644e52816bc846571 (MD5) / Approved for entry into archive by Delba Rosa (delba@ufba.br) on 2016-02-25T14:08:13Z (GMT) No. of bitstreams: 1 tese-doutorado- Ângela Gomes de Vasconcellos.pdf: 1002243 bytes, checksum: e012a52c53b7825644e52816bc846571 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-02-25T14:08:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese-doutorado- Ângela Gomes de Vasconcellos.pdf: 1002243 bytes, checksum: e012a52c53b7825644e52816bc846571 (MD5) / CAPES;FAPESB / PERFIL DE CITOCINAS E QUIMIOCINAS EM CRIANÇAS HOSPITALIZADAS COM PNEUMONIA ADQUIRIDA NA COMUNIDADE. Introdução: Pneumonia adquirida na comunidade (PAC) é a principal causa de óbito em crianças abaixo de 5 anos em todo o mundo. No entanto, o diagnóstico etiológico da PAC permanece um desafio em pediatria, além de existir uma escassez de estudos sobre a resposta inflamatória nesta doença. Objetivo: Descrever o perfil de citocinas e quimiocinas detectadas na admissão de crianças com PAC e avaliar se existe associação entre os níveis de citocinas e pneumonia pneumocócica em crianças. Metodologia: Estudo prospectivo realizado no pronto atendimento do Hospital da Universidade Federal da Bahia, em Salvador, Brasil. Crianças hospitalizadas com PAC com idade <5 anos foram avaliadas. Na admissão, dados clínicos e radiológicos foram coletados, assim como amostras biológicas para investigar 19 agentes etiológicos e dosar 14 citocinas/quimiocinas séricas (IL-8, IL-6, IL-10, IL-1β, IL-12, TNF-α, IL-2, IL-4, IL-5, IFN-γ, CCL2, CCL5, CXCL9 e CXCL10). Resultados: Foram incluídas 166 crianças. As citocinas que apresentaram níveis detectáveis foram IL-8, IL-10 e IL-6; com as respectivas medianas (IQR): 78,0 (30,7-244,3) pg/ml, 10;6 (4,6-30,6) pg/ml e 3,6 (3,1-4,4) pg/ml. As quimiocinas detectadas foram CXCL10 e CCL2; as medianas (IQR) calculadas foram: 74,2 pg/ml (36,1-164,8) e 19,1 (10,8-22,8) pg/ml, respectivamente. Infecção pneumocócica foi detectada em 38 (22,9%) casos dentre os quais a mediana de IL-6 (pg/ml) foi 32.2 pg/ml (IIQ: 12,4-54,1 pg/ml). Outros agentes etiológicos (Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis, bactérias atípicas e vírus) foram detectados em 128 (77,1%) casos com a mediana de concentração de IL-6 igual a 9,0 pg/ml (IIQ: 4,1–22,0 pg/ml). Na análise multivariada, com pneumonia pneumocócica 7 como variável dependente, IL-6 foi preditor independente para infecção pneumocócica (OR=5,6; IC95% = 2,4–12,7; ponto de corte 12,5 pg/ml). O valor preditivo negativo de IL-6 na concentração sérica abaixo de 12,5pg/ml para infecção pneumocócica foi de 90% (IC95% = 82%-95%). Conclusões: Citocinas e quimiocinas inflamatórias séricas são detectáveis na admissão de criança com PAC; a concentração sérica de IL-6 na admissão esta independentemente associada com infecção pneumocócica em crianças abaixo de 5 anos de idade e com PAC.

Submitted by Automação e Estatística (sst@bczm.ufrn.br) on 2018-07-02T21:32:55Z No. of bitstreams: 1 RaizaNaraCunhaMoizeis_DISSERT.pdf: 1769599 bytes, checksum: 3f3015a21072896a64b31ea26d1e11be (MD5) / Approved for entry into archive by Arlan Eloi Leite Silva (eloihistoriador@yahoo.com.br) on 2018-07-09T11:36:32Z (GMT) No. of bitstreams: 1 RaizaNaraCunhaMoizeis_DISSERT.pdf: 1769599 bytes, checksum: 3f3015a21072896a64b31ea26d1e11be (MD5) / Made available in DSpace on 2018-07-09T11:36:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 RaizaNaraCunhaMoizeis_DISSERT.pdf: 1769599 bytes, checksum: 3f3015a21072896a64b31ea26d1e11be (MD5) Previous issue date: 2018-04-06 / A infecção pelo vírus Chikungunya causa alta morbidade devido principalmente a artralgia e artrite geradas. A inflamação induzida nas articulações pela infecção viral envolve a imunidade inata e adaptativa. Entretanto, os mecanismos imunológicos envolvidos na proteção ou patogênese não estão ainda, totalmente, elucidados. Dessa forma o objetivo do presente estudo foi avaliar as expressões de receptores da imunidade inata e citocinas induzidas por sua ativação em pacientes infectados pelo vírus Chikungunya. Neste estudo, foi avaliado a expressão de RNAm por PCR em tempo real dos receptores tipo Toll (TLR3, TLR7, TLR8, TLR9), RLR (MDA5 e RIG-1), Moléculas adaptadoras (TRIF e MyD88) e citocinas (IFNα, IFNβ, IFNγ, IL-6, IL-12 e TNFα) em sangue total de pacientes na fase aguda da infecção por Chikungunya (N=28) e em indivíduos saudáveis, não infectados (N=9) utilizados como grupo controle. Os pacientes infectados pelo CHIKV apresentaram aumento da expressão de RNAm de TLR3, em relação aos indivíduos saudáveis. Não foi observada diferença significativa da expressão de TLR7, TLR9, MDA5 e RIG-1 nos pacientes infectados pelo CHIKV, sendo observada, no entanto, uma redução da expressão de RNAm de TLR8, quando comparado aos indivíduos saudáveis. Nossos resultados indicam que a infecção pelo CHIKV em pacientes na fase aguda induz elevada produção de IFN-α, IFN-γ e IL-6, moléculas da imunidade inata, com ação antiviral provavelmente, devido ao reconhecimento do vírus por TLR3 e em menor proporção por MDA5 e RIG-1, além de mecanismos que, possivelmente, envolvam a colaboração de TLR9. Ainda, foram constatadas correlações positivas entre as expressões de RNAm de TLR3, TLR7, TLR9, MDA5 e RIG-1 com expressão IFN-α. De maneira interessante, também foram observadas correlações positivas entre as expressões de RNAm de TLR3 com IFN-α, IFN-γ e IL-12, e entre a expressão de RNAm de MDA5 com IFN-α, IFN-β, IFN-γ e IL-6, IL-12 e TNF-α. / Chikungunya virus infection cause high morbidity mainly due to arthalgia and arthritis generated. An inflammation induced in the joints by viral infection involve innate and adaptive immunity. However, the immunological mechanisms involved in protection or pathogenesis have not yet been completely elucidated. Thus the aim of the present study was to evaluate the expression of innate immunity receptors and cytokines induced by their activation in patients infected with the Chikungunya virus. In this study the expression of mRNA by real-time PCR of Toll receptors (TLR3, TLR7, TLR8, TLR9), RLR (MDA5 and RIG-1), adaptive molecules (TRIF and MyD88) and cytokines (IFN-α, IFN-β, IFN-γ, IL-6, IL-12 and TNF-α) in whole blood of patients in the acute phase of the Chikungunya infection (N=28). Uninfected cases (N=9) were used as negative controls. Pacients infected with CHIKV are older than TLR3 mRNA expression in relation to healthy languages. Influences of the expression of TLR7, TLR9, MDA5 and RIG-1 in CHIKV infected patients in the past have not been confirmed but have been shown to decrease TLR8 mRNA expression when they were found in the healthy populations. Factors related to CHIKV infection in pacients in the suck phase, infection with IFN-α, IFN-γ and IL-6, infections of innate immunity with antiviral action, recognition of the virus by TLR3 and to a lesser extent by MDA5 and RIG-1, in addition to mechanisms that possibly involve TLR9 collaboration. Furthermore, positive correlations were found between the mRNA expression of TLR3, TLR7, TLR9, MDA5 and RIG-1 with IFN-α expression. Interestingly, positive correlations between TLR3 mRNA expression with IFN-α, IFN-γ and IL-12 were also observed, and between MDA5 mRNA expression with IFN-α, IFN-γ and IL-12 were also observed, and between MDA5 mRNA expression with IFN-α, IFN-β, IFN-γ and IL-6, IL-12 and TNF-α.

Made available in DSpace on 2014-06-12T18:28:40Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo3471_1.pdf: 1599282 bytes, checksum: d03d86e94c1e434550a0113b71f52d9f (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2008 / A dermatite atópica apresenta elevada prevalência, principalmente nos países desenvolvidos, o que tem resultado em um importante problema de saúde pública. Esta tese consta de dois artigos. No primeiro, artigo de revisão sob título Lectina ligadora de manose (MBL) e sua associação clínica com dermatite atópica, objetivou-se rever algumas das características estruturais e funcionais da lectina ligadora de manose e sua associação clínica com a dermatite atópica. Para tanto, procedeu-se à revisão bibliográfica de trabalhos publicados entre 1980 e 2007, nas bases de dados Biblioteca Nacional de Saúde, BIREME, Lilacs, Medline, sobre vias do sistema complemento, lectina de ligação à manose, alergias e dermatite atópica, dos quais 48 foram utilizados. Em síntese, os autores comprovaram que a lectina de ligação à manose é uma proteína que se une aos carboidratos da superfície dos patógenos e facilita o processo de fagocitose, participando na modulação da inflamação, tanto como uma terceira via do sistema complemento quanto por sua relação com a apoptose da barreira epidérmica. Identificou-se que, embora a literatura apresente evidência razoável da associação da lectina de ligação à manose com doenças infecciosas e auto-imunes, sua relação com as doenças alérgicas ainda suscita muitas dúvidas e precisa ser confirmada. No segundo artigo, sob título Aspectos clínicos da dermatite atópica e variantes funcionais da proteína ligadora de manose em crianças brasileiras (MBL-2), procedeu-se a estudo do tipo exploratório, comparando 131 crianças com dermatite atópica (média de idade 3,5 ± 0,3 anos, variando de três meses a 12 anos) a 165 indivíduos que não apresentavam essa doença (idade média de 10 anos, variando entre quatro e 18 anos), atendidos no Instituto Materno Infantil Prof. Fernando Figueira, Recife, Pernambuco, Brasil, no período de Agosto de 2006 a Julho de 2008. Após aprovação do comitê de ética e assinatura do Termo de Consentimento Livre Esclarecido, procedeu-se à avaliação clínica da criança e da gravidade da dermatite atópica, pela conversão em pontos da extensão e da severidade dos sinais e dos sintomas, empregando os critérios do SCORing Atopic Dermatitis (SCORAD). As três variantes alélicas do éxon 1 da MBL2 (nas posições 52, 54 e 57) foram genotipadas, assim como as variantes alélicas das regiões promotoras H/L e X/Y, empregando reação de cadeia de polimerase. As freqüências alélicas e genotípicas foram calculadas pela contagem direta gênica e o teste de qui quadrado foi usado para comparação pareada em tabelas de contingência 2x2 e 3x2, em nível de significância de 5%. No grupo de crianças com dermatite atópica, identificou-se freqüência significantemente maior do alelo O, dos genótipos AO e OO e de produtores defeituosos (baixos e deficientes), quando se consideraram os promotores H/L e X/Y. Concluiu-se que crianças com dermatite atópica apresentaram mais freqüentemente o alelo O e genótipos AO e OO, que se associaram aos níveis mais baixos de MBL, podendo ser mais um fator da complexa etiologia da dermatite atópica

Orientador: Reinaldo Fernandes Cooke / Resumo: Esse experimento avaliou a suplementação de um ingrediente contendo saponina, manufaturado a partir do extrato purificado de Yucca schidigera [Micro-Aid (MA); DPI Global; Porterville CA], no desempenho, saúde e respostas fisiológicas em bezerros recém chegados em confinamento. Um total de 105 bezerros Angus x Hereford recém desmamados (75 machos e 30 femeas), provenientes de oito fazendas de cria, foram adquiridos em um leilão comercial no dia -2 e transportados (800 km; 12 h) até o local do experimento. Imediatamente após a chegada no dia -1 foi coletado o peso vazio, e os animais foram agrupados e alocados com acesso a vontade ao feno, suplemento mineral e água. No dia 0, os animais foram ranqueados por sexo, local de origem e peso vazio e alocados em uma das 21 baias (5 animais/baia; contendo uma ou duas fêmeas por baia). As baias receberam uma dieta completa (TMR) e um entre os três tratamentos (matéria natural): (1) 1 g /animal/dia de MA (M1; n=7), (2) 2 g /animal/dia de MA (M2; n=7), ou (3) sem suplementação de MA (CON; n=7). Os animais receberam a dieta completa calculada para conter 15% de sobra (matéria orgânica), e os tratamentos foram dispostos por cima da dieta durante o dia 0 ao 59. Os animais foram monitorados para sintomas de doença respiratória bovina (DRB) e coletou o consumo diário de cada baia. Os animais foram vacinados contra DRB no dia 0 e 21. O peso vazio final foi coletado no dia 60, e amostras de sangue foram coletadas nos dias 0, 2, 6, 10, 14, 21, 28... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Mestre

Em ouriços, os esferulócitos vermelhos são responsáveis pela biossíntese do equinocromo, um pigmento naftaquinônico considerado antioxidante e bactericida, no entanto seu papel na resposta imune permanece pouco elucidado. O presente trabalho avaliou a reposta imune inata de ouriços-do-mar Lytechinus variegatus, através da atividade fagocítica frente a diferentes concentrações de equinocromo (50 e 100 µg/ml). Para tanto, o equinocromo foi extraído e purificado por RP-HPLC. Nossos resultados demonstraram que o equinocromo em ambas as concentrações modula positivamente a fagocitose, aumentando a quantidade de células fagocitando. A concentração de 50 µg/ml foi capaz de ativar os amebócitos fagocíticos (AF), e aumentar a quantidade de AF com quatro ou mais leveduras fagocitadas. Já na concentração de 100 µg/ml, além da ativação dos AF, aumentou também, a quantidade de AF com uma, duas, quatro ou mais leveduras fagocitadas, sugerindo uma atuação dose-dependente. Desta forma, os dados apresentados demonstram que o equinocromo exerce um importante papel na resposta imune. / The biosynthesis of echinochrome is mediated by red sphere cell. This naphthoquinonic e pigment presents antioxidant and bactericidal characteristics. However, the echinochrome role in immune response remains unclear. In this study, we evaluated the innate immune response of the sea urchin Lytechinus variegatus. To this purpose, the echinochrome was extracted and purified by RP-HPLC. Finally, phagocytic amoebocytes were exposed to different concentrations of echinochrome (50 and 100 mg/ml), when phagocytic activity was analysed. Here, we showed that echinochrome positively modulate phagocytosis, increasing the number of phagocytizing cells. The concentration of 50 mg/ml activated phagocytic amoebocytes (AF), and increased the number of AF containing four or more phagocytosed yeasts. For the other hand, at 100 mg/ml exposure, the activation of AF also increased the number of AF with one, two, four or more yeast phagocytosed, suggesting a dose-dependent activity. Thus, the data presented demonstrated that echinochrome plays an important role in the immune response.

O diabetes mellitus (DM) é caracterizado por hiperglicemia associada à falta ou à ineficiência da insulina. DM também é marcado por alterações em diversos processos celulares que precisam ser mais bem entendidos. Estudou-se a via da autofagia em diferentes macrófagos, verificando se o tratamento com insulina é capaz de modular esse processo. Foram estudados macrófagos derivados da medula óssea (BMM), do lavado broncoalveolar (LBA) e do tecido esplênico de ratos Wistar, machos, diabéticos (aloxana, 42 mg/kg, i.v., 10 dias), ratos diabéticos tratados (insulina 4UI, s.c.) e respectivos controles. Para caracterização do modelo e avaliação do efeito da insulina sobre o processo autofágico, as seguintes análises foram realizadas: (a) glicemia, número de leucócitos no sangue periférico, número de células do LBA; (b) concentrações de citocinas: interleucina (IL)-1beta, fator de necrose tumoral (TNF)-alfa, IL-6, IL-4, IL-10, cytokine-induced neutrophil chemoattractant (CINC)-1 e CINC-2 no sobrenadante do LBA pela técnica de ELISA; (c) caracterização de macrófago alveolar (MA) do LBA quanto a antígenos de superfície (MHCII, pan-macrophage KiM2R, CD11b) e marcadores autofágicos (proteína de cadeia leve associada a microtúbulo (LC)3 , gene/proteína relacionado à autofagia (ATG) pela técnica de citometria de fluxo e microscopia confocal ; (d) estudo dos macrófagos diferenciados, a partir da medula óssea, por citometria de fluxo e microscopia confocal; (e) estudo da arquitetura do baço pela técnica de imuno-histoquímica associada à microscopia confocal. Avaliando os resultados em conjunto, a via autofágica parece ser de extrema importância e de capacidade inovadora para alvo terapêutico. Observou-se que a insulina exerceu efeitos antagônicos sobre os macrófagos de tecidos diferentes: aumentou a expressão LC3 nos macrófagos recuperados por LBA e não conseguiu alterar a atividade autofágica em macrófagos da polpa vermelha do baço em ratos diabéticos. Os BMM originários de ratos diabéticos comportaram-se de maneira contrária aos do animal controle: os BMM tipo M1 tiveram o conteúdo de LC3 diminuído, enquanto os M2 tiveram o conteúdo autofágico aumentado. O tratamento com insulina nos ratos diabéticos não alterou o nível do conteúdo LC3 dos BMM, mesmo após uma semana de cultura in vitro. Concluímos, assim, que o tratamento com dose única de insulina foi capaz de induzir a autofagia em macrófagos alveolares, mas insuficiente para resgatar os níveis basais da autofagia em macrófagos da medula óssea e da polpa vermelha do baço / Diabetes mellitus (DM) is characterized by hyperglycemia associated to a lack or ineffectiveness of insulin. DM is marked by changes in several cellular processes that need to be better understood. Autophagy pathway in macrophages from different tissues was studied with the purpose to verify whether treatment with insulin is capable of modulating this process. Bone marrow derived macrophages (BMM), bronchoalveolar lavage (BAL), and splenic tissue macrophages from Wistar rats, diabetic (alloxan, 42 mg/kg, iv, 10 days) and diabetic rats treated with insulin were studied. To characterize the model and evaluate the effect of insulin upon the autophagic process, the following analyzes were performed: (a) glucose levels, number of leukocytes in peripheral blood, BAL cell number; (b) concentrations of cytokines (interleukin (IL)-1beta, tumor necrosis factor (TNF)-alfa, IL-6, IL-4, IL-10, cytokineinduced neutrophil chemoattractant (CINC)-1 and CINC-2 in the supernatant of BAL fluid by ELISA; (c) characterization of BAL alveolar macrophage (AM) surface antigens (MHCII, pan macrophage marker KiM2R, CD11b) and autophagic markers (microtubule-associated protein light chain (LC)3, gene/protein associated to autophagy (ATG) by flow cytometry and confocal microscopy (d) study of macrophages diferenciated from bone marrow by flow cytometry and confocal microscopy; (e) the architecture of spleen and macrophages from red pulp by immunohistochemical techniques associated to confocal microscopy. Evaluating these results together, the autophagic pathway appears to be innovative for therapeutic target. In this study, it was observed that insulin exerted diverse effects on macrophages from different tissues: increased expression of LC3 in AM recovered from BAL and was unable to change the autophagic activity of macrophages from the red pulp of the spleen in diabetic rats. BMM from diabetic rats behaved in an antagonistic way compared to control animals: BMM M1 type decreased their autophagy content while M2 macrophages increased autophagic levels and insulin treatment did not alter the level of LC3 expression. In conclusion, treatment with a single dose of insulin was able to induce autophagy in alveolar macrophages, but insufficient for recovering baseline levels of autophagy in bone marrow derived macrophages and macrophages from the red pulp of the spleen

Os invertebrados impedem o estabelecimento de uma infecção através de uma resposta imune eficiente. Esta resposta envolve reações celulares e humorais. Existem poucos trabalhos sobre a imunidade das aranhas. O principal objetivo deste estudo foi verificar o papel dos hemócitos e dos peptídeos antimicrobianos na resposta imune da aranha Acanthoscurria gomesiana. Inicialmente, a localização relativa da gomesina e da acanthoscurrina foi determinada, mostrando que 58% dos hemócitos armazenam os dois peptídeos antimicrobianos. Além disso, foi verificado que a gomesina é direcionada aos grânulos dos hemócitos da forma de pró-peptídeo. Observou-se ainda, que após um desafio, os hemócitos migram para o sítio de infecção, onde deve secretar componentes da cascata de coagulação e peptídeos antimicrobianos. Além disso, os resultados mostraram que a fagocitose não é o principal mecanismo ativado após uma infecção. Assim sendo, as principais respostas imunes da aranha são através da coagulação e secreção dos peptídeos antimicrobianos. / Invertebrates avoid the infection establishment through an efficient immune response. This response consists in cellular and humoral reactions. Few data are available concerning the spider\'s immunity. The main aim of this study was to determine the role of hemocytes and antimicrobial peptides on the immunity of the spider Acanthoscurria gomesiana. Initially, the localization of gomesin and acanthoscurrin was determined, showing that 58% of hemocytes store both antimicrobial peptides. Moreover, our results show that gomesin is addressed to the hemocyte granules as a pro-peptide. We also demonstrate, by in vivo and in vitro experiments, that hemocytes migrate to the site of microbial infection. Once at the site of infection, hemocytes might secrete components of coagulation cascade and antimicrobial peptides. Besides, our results suggest that phagocytosis is not the major defense mechanism activated after microbial challenge. Therefore the main reactions involved in the spider defense might be through the coagulation and antimicrobial peptides secretion.

Estudos em nosso laboratório caracterizaram camundongos B10.A e A/J, respectivamente, como susceptíveis e resistentes à infecção pulmonar pelo fungo Paracoccidioides brasiliensis. A imunidade inata desempenha papel fundamental no controle inicial dos patógenos e na regulação da resposta imune adquirida. Como os macrófagos alveolares são as primeiras células do hospedeiro a interagir com o fungo, propusemo-nos a estudar a capacidade fungicida e secretora dos macrófagos alveolares de camundongos susceptíveis e resistentes ao P. brasiliensis para melhor compreender a PCM pulmonar. Camundongos B10.A e A/J normais (n: 10-15) foram submetidos a lavagem bronco-alveolar (LBA) e a suspensão celular obtida (2x105 células/poço) foi pré-ativada durante a noite com IFN-&#947;, IL-12 ou a combinação destas duas citocinas (50.000, 10.000 e 2.000 pg/rnL) e desafiados in vitro com leveduras viáveis de P. brasiliensis (relação fungo-macrófagos de 1:50). Após 72h de incubação a atividade fungicida dos macrófagos foi avaliada através da contagem do número de fungos viáveis pelo método de unidades formadoras de colônias (UFC). A produção de nitrito e de citocinas foi avaliada no sobrenadante de cultivo através da reação de Griess e ELISA, respectivamente. Os dados foram expressos como média &#177; EP e analisados pelo teste T -Student. Nossos resultados mostraram que os macrófagos de camundongos B 10.A pré-ativados com IFN-&#947;, IL-12 ou ambas as citocinas nas diferentes concentrações ensaiadas apresentaram elevada capacidade fungicida (51-97%) acompanhada de produção aumentada de NO, IL-12 e MCP-l e baixa síntese de IL-10 e GM-CSF. Por outro lado, somente o tratamento com a mais alta concentração de IFN-&#947; foi capaz de induzir atividade fungicida em macrófagos alveolares de animais A/J. A síntese de NO ocorreu sempre em baixos níveis e nos sobrenadantes dos co-cultivos observamos altos níveis de IL-10 e GM-CSF associados a baixas concentrações de IL-12 e MCP-l. A inibição da síntese de NO por aminoguanidina demonstrou que a atividade fungicida dos macrófagos de animais B10.A, mas não de A/J, era mediada por este composto tratamento dos macrófagos com anticorpo monoclonal anti-IL-10 não alterou a capacidade fungicida dos macrófagos de ambas as linhagens, entretanto induziu franca produção de NO que, para animais A/J, não se traduziu em atividade microbicida aparente. Por outro lado. a neutralização de TGF-&#946; induziu alta capacidade fungicida das células de animais A/J níveis aumentados de NO e TNF-&#945; aliados a níveis reduzidos de IL-10. O mesmo tratamento não alterou a já elevada capacidade fungicida dos macrófagos alveolares de animais B10.A mas aumentou a produção de NO, IL-12 e TNF-&#945;. Em conclusão, os macrófagos alveolares de camundongos B10.A são facilmente ativáveis por 1FN-&#947; e IL-12, apresentam elevada capacidade fungicida, NO-dependente, sobre leveduras do P. brasiliensis associada com a síntese de níveis elevados de NO e IL-12. Por outro lado, os macrófagos de camundongos A/J são pobremente ativados por 1FN-&#947; e IL-12, produzem baixos níveis de NO, a sua capacidade fungicida, que parece ser NO-independente, pode ser aumentada pela neutralização do TGF-&#946; endógeno, mas não pelo tratamento com anti-IL-10. / Previous studies in our laboratory characterized B10.A and A/J mice as susceptible and resistant strains to pulmonary Paracoccidioides brasiliensis infection. Innate immunity plays a fundamental role on the control of the initial growth of pathogens as well as in the acquired immunity that subsequently develops. As alveolar macrophages are the first host cells to interact with P. brasiliensis we decided to study the fungicidal and secretory ability of alveolar macrophages from resistant and susceptible mice to P. brasiliensis to better understand the pulmonary model of paracoccidioidomycosis. Normal B10.A and A/J mice (n=10-15) were submitted to bronchoalveolar lavage (BAL) and cell suspensions (2x105 cells/well) were pre-activated ovemight with IFN-&#947;, IL-12 or the combination of these two cytokines (50,000, 10,000 and 2,000 pg/rnL). After that, macrophages were in vitro challenged with P. brasiliensis yeasts (1:50 fungus: macrophage ratio) and 72h later fungicidal activity was determined by colony forming units counts (CFU). Nitrite and cytokines production were determined in culture supematants by Griess reaction and ELISA, respectively. Data were expressed as means &#177; SE and analyzed by Student\'s t test. Our results showed that B10.A macrophages pre-activated with the different assayed concentrations of IFN&#947;, IL-12 or both cytokines presented elevated fungicidal ability (51¬-97%) concomitant with the presence of high levels of NO, IL-12 and MCP-l and low amounts of IL-10 and GM-CSF. NO synthesis occurred in low levels but high concentrations of IL-10 and GM-CSF associated to low amounts of IL-12 and MCP-1 were detected in the co-cultures supematants. NO synthesis inhibition by aminoguanidine clearly showed that the fungicidal ability of B10.A but not of A/J macrophages was NO¬ dependent. Treatment with anti-IL-10 monoclonal antibodies did not alter the fungicidal ability of macrophages from both mouse strains but enhanced NO synthesis which, however, did not alter the absent microbicidal ability of A/J macrophages. On the contrary, anti-TGF-&#946; treatment induced an increased fungicidal ability of A/J cells associated with enhanced levels of NO and TNF-&#945; besides diminished amounts of IL-10. The same treatment did not alter the high fungicidal ability of B10.A alveolar macrophages but increased NO, IL-12 and TNF-&#945; production. In conclusion, alveolar macrophages from susceptible mice are easily activated by IFN&#947; and IL-12, present a high and NO-dependent ability to kill P. brasiliensis yeasts and secrete elevated levels of NO and IL-12. In contrast, alveolar macrophages from resistant mice are poorly activated by IFN&#947; and IL¬12, secrete low amounts of NO and high of IL-10. Their fungicidal ability which appears to be NO-independent can be restored by neutralization of endogenous TGF-&#946; but not by anti-IL-10 treatment.

As bactérias são reconhecidas pelos macrófagos através dos receptores do tipo Toll (TLR), que ativam as vias do NF-&#954;B e das MAPKs, resultando em respostas como a fagocitose e a produção de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio (ROS/RNS), que causam a morte do microrganismo. P. aeruginosa, uma causa comum de pneumonia associada à ventilação mecânica, é uma bactéria que utiliza diversas estratégias de virulência e defesa, incluindo mecanismos antioxidantes. O objetivo deste trabalho foi verificar a relação entre o papel da 1-Cys peroxirredoxina LsfA está envolvida na virulência de P. aeruginosa. Linhagens mutantes com deleção em lsfA ou com uma mutação pontual neste gene (troca da Cys45 por Ala, RB302) foram construídas, sendo mais sensíveis a peróxido de hidrogênio que a linhagem selvagem PA14, como verificado pelo halo de inibição de crescimento. A atividade peroxidásica de LsfA foi medida in vitro pelo ensaio de tiocianato férrico e apenas a proteína com a sequência selvagem foi ativa, enquanto uma mutação na Cys45 aboliu completamente a sua atividade. Infecção de macrófagos J774 com as linhagens &#916;lsfA ou C45A resultaram em uma diminuição da morte dos macrófagos, aumento do clearance bacteriano e aumento da secreção de TNF-&#945; em comparação aos macrófagos infectados com a linhagem PA14, sugerindo uma maior ativação das vias do NF-&#954;B e das MAPKs nos macrófagos infectados com as linhagens mutantes. Para verificar se LsfA poderia alterar o estado oxidativo dos macrófagos, eles foram infectados com as linhagens PA14 ou RB302 (C45A) e incubadas com carbóxi-H2DCFDA, um indicador que se torna fluorescente quando oxidado. Macrófagos infectados com a linhagem mutante demonstraram um maior estado oxidativo em comparação aos macrófagos infectados com a linhagem selvagem, confirmando que LsfA limita a ativação dos macrófagos, resultando numa menor produção de TNF-&#945; e diminuição da citotoxicidade. A via das MAPKs e do NF-&#954;B são requeridos para a produção máxima de TNF-&#945; nos macrófagos infectados com a linhagem RB302, o que foi demonstrado utilizando-se de inibidores farmacológicos para essas vias. Como esperado, quando os macrófagos foram infectados com a linhagem RB302 na presença do antioxidante N-acetil-cisteína, houve uma redução da produção de TNF-&#945; a níveis semelhantes dos macrófagos infectados com a linhagem selvagem. Em modelo de pneumonia aguda, todos os camundongos infectados com a linhagem PA14 morreram 48h pós-infecção, enquanto os camundongos infectados com a linhagem RB302 sobreviveram por mais de 60 dias após a infecção. Houve uma redução do número de bactérias nos pulmões, baço e fígado nos camundongos infectados com a linhagem RB302 em comparação aos camundongos infectados com a linhagem PA14. Também foi observado um aumento na produção de citocinas pró-inflamatórias nos camundongos infectados com a linhagem RB302 em comparação aos camundongos infectados com PA14. Com isso, foi demonstrado pela primeira vez o envolvimento de uma 1-Cys peroxirredoxina de bactérias na virulência, com a modulação da resposta imune do hospedeiro in vitro e in vivo. / Bacteria are recognized by macrophages via Toll-Like Receptors (TLR), leading to a signaling pathway that activates NF-&#954;B and MAPKs. Killing in phagossomes is achieved by reactive oxygen and nitrogen species (ROS/RNS) generation. P. aeruginosa is a common cause of ventilator associated pneumonia and it uses several strategies for virulence and defense, including antioxidant mechanisms. In this work, we show for the first time that the 1-Cys peroxiredoxin LsfA is implicated in P. aeruginosa virulence. Mutant strains with a deletion in lsfA or with a mutation (Cys45 to Ala, RB302) were constructed and they were more sensitive to H2O2 than the wild type strain PA14, as verified by a growth inhibition assay. In vitro peroxidasic activity of LsfA was measured by ferric-thiocyanate assay, and while the wild-type protein was active, the mutation in Cys45 abolished its activity. Infection of J774 macrophages with &#916;lsfA or C45A strains resulted in lower cell death, increased bacterial clearance and higher TNF-&#945; production in comparison to PA14-infected macrophages, suggesting a higher level of MAPKs and NF-&#954;B activation due to the mutant strains. To verify whether LsfA could modify the oxidative state of infected macrophages, they were infected with PA14 or RB302 strains and incubated with carboxy-H2DCFDA, an indicator that emits fluorescence when oxidized. Macrophages infected with mutant strains showed a higher oxidative state in comparison to PA14-infected cells, thus confirming that LsfA limits macrophages activation that leads to TNF-&#945; production and cytotoxic activity. MAPKs and NF-&#954;B pathways are required to full production of TNF-&#945; in macrophages infected with RB302, as shown using pharmacological inhibitors for those pathways. When macrophages were infected with RB302 in the presence of the antioxidant N-acetyl-cysteine, there was a reduction in TNF-&#945; production as compared to PA14, as expected. In an acute pneumonia model, all PA14-infected mice died at 48h post-infection, while C45A-infected mice survived as long as 60 days. There was also reduction in bacterial counts in the lungs, spleen and liver of mice infected with RB302, in comparison to PA14-infected mice. A greater pro-inflammatory cytokine production was observed in mice infected with mutant strain in comparison to mice infected with PA14. Altogether, this work shows for the first time the role of a bacterial 1-Cys Prx that modulates host immune response in vitro and in vivo.