Submitted by Viviane Lima da Cunha (viviane@biblioteca.ufpb.br) on 2016-06-17T14:05:17Z No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 1836345 bytes, checksum: 07b2bb2384050a2c29d3e783883db121 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-17T14:11:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 1836345 bytes, checksum: 07b2bb2384050a2c29d3e783883db121 (MD5) Previous issue date: 2015-05-21 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Leishmaniasis is a disease transmitted by protozoans of the Leishmania gender. A huge number of species are responsible for the infection in human beings, resulting in three clinical phenotypes. The World Health Organization – WHO classify them as neglected diseases, and encourages the search of new medical drugs or formulations that are effective and that have low toxicity to humans. All the medical drugs actually used for the treatment of the leishmaniasis present some kind of restriction such as high toxicity, severe side effects, elevated cost, parenteral administration or teratogenicity. That being said, the development of more effective and selective drugs is very important, and the identification of exclusive metabolic pathways of the parasites that can be targeted might be an interesting starting point. Medicinal plants have been a rich source to the obtaining of molecules to be therapeutically explored. The Bixa Orellana L., popularly know as “annatto”, presents different pharmacological activities that are already proven. The objective of this work was to verify the anti-leishmaniasis potential and the toxicity of the phytochemicals of the oily fraction of Bixa Orellana and bixin extracted of its seeds, aiming to verify and prove its biological activity, security and therapeutic effectiveness in order to develop a phytotherapic drug. The bixin was characterized through a nuclear magnetic resonance spectrum of ¹H and ¹³C, and the oily fraction by a gas chromatography within a mass spectrometer. It can be inferred that the bixin and the oily fraction are presented as toxic because they have shown values of LD50 of 353,64±67,54 and 285,41±35,81μg/mL, respectively, and present low toxicity against swiss mouse erythrocytes and low toxicity after acute administration of the 2000 mg/mL doses. The bixin and the oily fraction inhibited the growth of promastigote forms, generating an IC50 of 2,16 μg/mL and 1,26 μg/mL, respectively, for the Leishmania major. The Trypan blue exclusion test has shown a significant cytotoxicity of the studied substances over murine macrophages. The calculated CC50 for the murine macrophages was 59,51 μg/mL and 111,41 μg/mL, for the bixin and oily fraction, respectively, so, they are more toxic for the parasites than for the relieved macrophages. The bixin and the oily fraction did not present an in vivo anti-Leishmaniasis effect in swiss mice infected with the L. major. It can be concluded that both bixin and oily fraction presented anti-Leishmaniasis activity (leishmaniostatic and leishmanicide) against promastigote forms of L. major. / A leishmaniose é uma doença transmitida por protozoários do gênero Leishmania. Numerosas espécies são responsáveis pela infecção em humanos, resultando em três fenótipos clínicos. A OMS as classificam como doenças negligenciadas, e incentiva a busca de novos fármacos ou formulações que sejam eficazes e que tenham baixa toxicidade ao homem. Todos os fármacos atualmente em uso para o tratamento da leishmaniose apresentam restrições, como toxicidade, graves efeitos colaterais, custo elevado, administração parenteral ou teratogenicidade. Desta forma, o desenvolvimento de fármacos mais eficazes e seletivos é de suma importância, e a identificação de vias metabólicas exclusivas do parasita que possam ser usadas como alvo pode ser um ponto de partida interessante. As plantas medicinais têm sido uma rica fonte para obtenção de moléculas para serem exploradas terapeuticamente. A Bixa orellana L. popularmente conhecido como “urucum” apresenta diversas atividades farmacológicas comprovadas. O objetivo do presente estudo foi verificar o potencial antileishmania e a toxicidade dos fitoconstituintes da fração oleosa da semente de B. orellana L. e da bixina, visando comprovar sua atividade biológica, seguranças e eficácia terapêutica. A bixina foi caracterizada através de espectros de ressonância magnética nuclear de ¹H e ¹³C e a fração oleosa por cromatógrafo a gás acoplado a espectrômetro de massas. Pode-se inferir que a bixina e a fração oleosa apresentam-se como tóxicos para Artemia salina por apresentar valor de DL50, respectivamente, de 353,64±67,54 e 285,41±35,81μg/mL, baixa toxicidade frente eritrócitos de camundongos suíços e baixa toxicidade após administração aguda na dose de 2000 mg/mL.A bixina e a fração oleosa inibiram o crescimento das formas promastigotas, gerando uma IC50 de 2,16 μg/mL e 1,26 μg/mL, respectivamente, para Leishmania major. O teste de exclusão do azul de Trypan demonstrou uma significativa citotoxicidade das substâncias em estudo sobre macrófagos murinos. A CC50 calculada para os macrófagos murinos foi de 59,51 μg/mL e 111,41 μg/mL, para a bixina e fração oleosa, respectivamente, portanto, são mais tóxicas para os parasitos que para os macrófagos avaliados. A bixina e a fração oleosa não apresentaram um efeito antileishmania in vivo em camundongos suíços infectados com L. major. Pode-se concluir que a bixina e a fração oleosa apresentaram atividade antileishmania (leishmaniostática e leishmanicida) sobre formas promastigotas de L.major.

Submitted by Gustavo Claro Monteiro null (gustavoquimica32@yahoo.com.br) on 2018-03-06T15:23:05Z No. of bitstreams: 1 Tese Versão Final Repositório.pdf: 65649987 bytes, checksum: e1fba6a3de3c8c866c26d5a3cfce8e09 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Carolina Gonçalves Bet null (abet@iq.unesp.br) on 2018-03-09T11:44:38Z (GMT) No. of bitstreams: 1 monteiro_gc_dr_araiq_int.pdf: 65358605 bytes, checksum: 1767a3640bc025b3ac0e668fb5004e0f (MD5) / Made available in DSpace on 2018-03-09T11:44:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 monteiro_gc_dr_araiq_int.pdf: 65358605 bytes, checksum: 1767a3640bc025b3ac0e668fb5004e0f (MD5) Previous issue date: 2018-02-23 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / As leishmanioses englobam um espectro de doenças que afetam o ser humano e outros mamíferos nas regiões tropicais e subtropicais do planeta. São causadas por pelo menos 20 tipos de parasitas pertencentes ao gênero Leishmania, e apresentam diversas e complexas manifestações clínicas. Podem ser encontradas em mais de 88 países, sendo que o Brasil é um dos países endêmicos onde a doença está mais disseminada. Em 2010 foram confirmados 21.981 casos de leishmaniose tegumen-tar e 3536 de leishmaniose visceral, com 219 mortes. No mundo cerca de 350 mi-lhões de pessoas estão expostas à infecção e acredita-se que cerca de 12 milhões estejam infectadas, com cerca de 1-2 milhões de novos casos por ano e 60 mil óbi-tos. Pensando nisso, o presente estudo visou obter novas substâncias candidatas a serem utilizadas no combate as chamadas “Doenças Tropicais Negligenciadas”, mais especificamente a Leishmaniose. Neste trabalho foram sintetizados doze aná-logos de meroterpenos, sendo nove compostos inéditos e ainda os compostos natu-rais isolados de Psidium guajava (psidial A, guajadial e pisguadial B), utilizando uma rota curta e linear e com rendimento global em torno de 20%. Um estudo sobre o mecanismo da reação de cicloadição [4+2] possibilitou determinar as barreiras de energia envolvidas nas transformações e permitiu compreender algumas limitações da metodologia empregada. Nos testes biológicos, os análogos sintéticos se mostra-ram promissores para combater a forma promastigota de Leishmania infantum, com valores de CE50 entre 29-98 M. Através do estudo de estrutura-atividade frente à leishmaniose verificou-se que o critério em relação à presença de um grupo metil não substituído em posição α ao oxigênio do anel pirânico e a formação de um anel cromânico são de fundamental importância, e estão em concordância com dados relatados na literatura, e ainda, foi estabelecido como novo critério a necessidade de um grupo metilênico (CH2) no núcleo C3 do anel pirânico, para a atividade leishma-nicída dos análogos de meroterpenos. / Leishmaniasis encompasses a spectrum of diseases that affect humans and other mammals in the tropical and subtropical regions of the planet. They are caused by at least 20 types of parasites belonging to the genus Leishmania, and present diverse and complex clinical manifestations. They can be found in more than 88 countries, and Brazil is one of the endemic countries where the disease is most widespread. In 2010, 21,981 cases of tegumentary leishmaniasis and 3536 cases of visceral leish-maniasis were confirmed, with 219 deaths. Around 350 million people worldwide are exposed to the infection and an estimated 12 million are believed to be infected, with about 1-2 million new cases per year and 60,000 deaths. With this in mind, the pre-sent study aimed to obtain new candidate substances to be used in the fight against "Neglected Tropical Diseases", more specifically Leishmaniasis. In this work, twelve meroterpene analogs were synthesized, with nine new compounds and the natural compounds isolated from Psidium guajava (psidial A, guajadial and pisguadial B) using a short and linear route with a global yield of around 20%. A study of the mechanism of the cycloaddition reaction [4 + 2] made it possible to determine the energy barriers involved in the transformations and allowed to understand some limitations of the methodology used. In biological tests, synthetic analogues were shown to be promising to combat the promastigote form of Leishmania infantum, with EC50 values between 29-98 μM. Through the study of structure-activity against leishmaniasis, it was verified that the criterion regarding the presence of an unsubstituted methyl group in position α to the pyran ring oxygen and the formation of a chromic ring are of fundamental importance and are in agreement with data reported in the literature, and the need for a methylene group (CH2) in the C3 nucleus of the pyro ring was established as a new criterion for the leishmanicidal activity of meroterpene analogues. / 141255/2014-5

Submitted by Lívia Maisa Guiraldi null (livia_maisa_g@hotmail.com) on 2016-07-27T22:27:33Z No. of bitstreams: 1 GUIRALDI LM dissertacao_final.pdf: 5832304 bytes, checksum: abf9a0919d7f06699fed2f2c09bad1b1 (MD5) / Approved for entry into archive by Felipe Augusto Arakaki (arakaki@reitoria.unesp.br) on 2016-07-29T13:59:14Z (GMT) No. of bitstreams: 1 guiraldi_lm_me_bot.pdf: 5832304 bytes, checksum: abf9a0919d7f06699fed2f2c09bad1b1 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-29T13:59:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 guiraldi_lm_me_bot.pdf: 5832304 bytes, checksum: abf9a0919d7f06699fed2f2c09bad1b1 (MD5) Previous issue date: 2016-07-22 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A família Trypanosomatidae inclui agentes etiológicos responsáveis por ocasionar doenças em humanos e demais animais, englobando dezenas de protozoários pertencentes a diferentes gêneros, destacando-se os protozoários representantes dos gêneros Leishmania, causadores das leishmanioses e Trypanosoma, causador de tripanosomíase. Enquanto a transmissão das leishmanioses ocorre devido à picada de insetos fêmeas de flebotomíneos pertencentes ao gênero Phlebotomus no Velho Mundo e Lutzomyia no Novo Mundo, a transmissão da tripanossomíase depende da espécie de tripanosoma envolvida na infecção, podendo ocorrer pela picada de insetos adultos do gênero Glossina; pelas fezes de triatomíneos, sobretudo do gênero Triatoma e mecanicamente por moscas hematófagas, principalmente do gênero Stomoxys. Além dos humanos, animais domésticos e silvestres podem atuar como reservatórios de tripanosomatídeos, incluindo os primatas não humanos, os quais estão associados com o ciclo enzoótico das leishmanioses e tripanosomíase, sendo que a infecção natural por protozoários do gênero Trypanosoma e Leishmania em mamíferos selvagens é comum na natureza. O objetivo do trabalho foi pesquisar tripanosomatídeos em primatas de cativeiro procedentes do Parque Zoológico Municipal de Bauru – SP por meio de anticorpos contra o parasito e pela amplificação do DNA do protozoário. Para tanto, foram coletadas amostras de sangue de 39 primatas. A técnica molecular de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) foi aplicada na pesquisa de Leishmania braziliensis, Leishmania amazonensis e Leishmania infantum, utilizando-se primers espécie-específicos, direcionados à região do kDNA dos parasitos, sendo todos os animais negativos. Porém, com a utilização de primers para a região ribossomal (ITS-1), específicos para a família Trypanosomatidae, 37 dos 39 (94,9%) animais foram positivos para Trypanosoma spp. Realizou-se também a prova sorológica de Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) para Leishmania braziliensis, Leishmania infantum e Leishmania amazonensis, revelando um animal da espécie Erythrocebus patas (macaco-pata) positivo para Leishmania braziliensis com título 160. Os resultados demonstram que os primatas do zoológico estão susceptíveis à infecção por tripanosomatídeos, alertando-se para a necessidade de busca ativa de vetores flebotomíneos e triatomíneos nos recintos e arredores, como medida preventiva para o risco de infecção aos funcionários e visitantes. / The family Trypanosomatidae includes etiological agents responsible for causing diseases in humans and other animals. There are dozens of protozoa belonging to different genres, especially protozoa representatives of Leishmania genre, which causes leishmaniasis and Trypanosoma, responsible for trypanosomiasis. While the transmission of leishmaniasis is due to the bites of female sand flies belonging to the genus Phlebotomus in the Old World and Lutzomyia in the New World, the transmission of trypanosomiasis depends on the species of trypanosome involved in the infection. It may occurs by the bite of adult insects of the genus Glossina or by the feces of insects, especially by the genre Triatoma and mechanically by bloodsucking flies, especially the Stomoxys genre. In addition to humans, domestic and wild animals can act as trypanosomatids reservoirs, including non-human primates, which are associated with the enzootic cycle of leishmaniasis and trypanosomiasis; the natural infection by Trypanosoma and Leishmania protozoa in wild mammals is common in nature. The aim of the study was to investigate trypanosomatids in captive primates coming from Municipal Zoological Park of Bauru by antibodies against the parasite and the amplification of the DNA of the parasite. For this, blood samples were collected from 39 primates. The molecular technique of Polymerase Chain Reaction (PCR) was applied in research for Leishmania braziliensis, Leishmania amazonensis and Leishmania infantum using species-specific primers directed to the region of kDNA parasites; all animals were negative by this technique. However, with the use of primers for the ribosomal region (ITS-1) specific to Trypanosomatidae family, 37 of 39 (94.9%) animals were positive for Trypanosoma spp. It was also conducted serological evidence by the Immunofluorescente Antibody Test (IFAT) for Leishmania braziliensis, Leishmania infantum e Leishmania amazonensis, revealing one (01) animal Erythrocebus patas (patas monkey) positive for Leishmania braziliensis, with titer 160. The results show that primates from Municipal Zoological Park of Bauru are susceptible to infection by trypanosomatids, alerting the need for active search for sandfly vectors and triatomines in the grounds and surrounding areas, as a preventive measure for the risk of infection for staff and visitors. / FAPESP: 2014/12187-0

Orientador: Rosangela Zacarias Machado / Banca: Rosemeri de Oliveira Vasconcelos / Banca: Isabel Kinney Ferreira de Miranda Santos / Resumo: A leishmaniose visceral é uma zoonose, considerada como uma entre seis doenças tropicais mais importantes nos países em desenvolvimento. O agente etiológico da enfermidade no Brasil, a Leishmania chagasi, é transmitida pela picada do flebotomíneo Lutzomyia longipalpis, que adquire o parasito ao realizar o hematofagismo em animais infectados. No ambiente doméstico, o cão é considerado o principal reservatório da leishmaniose visceral e, em consequência disso, é também o principal alvo das campanhas de controle da forma humana da doença. Neste trabalho foi avaliado o potencial diagnóstico para a leishmaniose visceral canina de um antígeno recombinante, produzido a partir do gene de uma proteína, isolado em L. chagasi, amostra Jaboticabal. O gene isolado apresenta similaridade com a família A2 de L. chagasi e foi expresso utilizando o vetor pET28a em E. coli. A proteína de 11 KDa expressa, foi avaliada pelo ensaio imunoenzimático (ELISA). O ELISA com o antígeno recombinante His6_A2 detectou anticorpos anti-A2 em 52% dos cães infectados com L. chagasi. Enquanto que, 67% dos soros de animais vacinados e 65% dos animais de áreas-não endêmicas, foram negativos pelo ELISA_A2. Os testes de Western-blotting e Dot-ELISA realizado com soros de camundongos inoculados com essa proteína His_A2 demonstrou resultados positivos de antigenicidade e imunogenicidade. Todos os sequenciamentos de DNA mostraram homologia com genes da família A2. / Abstract: Visceral leishmaniasis is a zoonosis and one of six most important tropical diseases in developing countries. The causative agent of the disease in Brazil, Leishmania chagasi, is transmitted by the bite of the sandfly Lutzomyia longipalpis, who acquired the parasite biting infected animals. In domestic environment, the dog is considered the main reservoir of visceral leishmaniasis, and in consequence it is also the main target of campaigns to control the disease in human beings. This study evaluated the potential of a recombinant antigen produced from the A2 gene Jaboticabal strain L. chagasi for diagnosis of canine visceral leishmaniasis (LVC). The isolated gene showed similarity with L. chagasi family A2 gene, and was expressed using pET28a expression vector in E. coli. The 11-kDa protein expressed was evaluated by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) using known positive and negative sera, previously tested by Indirect Immunofluorescence Assay (IFA). The His-A2 recombinantantigen detected anti-A2 antibodies in 52% of L. chagasi infected dogs. Seventy-seven percent of vaccinated dogs and 65% of dogs from non-endemic areas were both negative by A2-ELISA. The antigenicity and immunogenicity of the expressed protein was confirmed by Western blot and Dot-ELISA assays, performed using sera from mice inoculated with this protein. / Mestre

Orientador: Valéria Marçal Félix de Lima / Banca:Juliana Regina Peiró / Banca: Aparecida de Fátima Michelin / Resumo: A Leishmaniose visceral (LV) no Brasil representa um grave problema de saúde pública; portanto, é importante estudar novas alternativas para o tratamento de cães infectados. O imunomodulador agregado de magnésio-amônio fosfolinoleato-palmitoleato anidrido proteína (P-MAPA) melhora a imunocompetência quando o sistema imunológico está comprometido, mas sua dependência de receptores Toll-like (TLRs) e os mecanismos envolvidos na resposta imune ainda não estão claros. Estudou-se a ação in vitro de P-MAPA sobre a expressão de TLR2 e TLR4, espécies reativas de oxigénio (ROS), óxido nítrico (NO) e p38 ativada por mitógeno proteína quinase (p38MAPK) e fosforilação de IKK em células mononucleares do sangue periférico (PBMC) e macrófagos de cães saudáveis e infectados. O PBMC ou macrófagos foram isolados e cultivados com diferentes concentrações de P-MAPA (20,100 e 200 μg/mL) em uma atmosfera húmida, a 37°C com 5% de CO2. A observação revelou que nos macrófagos de cães infectados com Leishmania sp. mostraram uma diminuição em TLR2 em comparação com cães saudáveis e em indução com P-MAPA. ROS foram aumentados em PBMC de cães infectados com Leishmania sp. em comparação com cães saudáveis e P-MAPA melhorou a produção de ROS. A produção de NO foi aumentada no sobrenadante da cultura a partir de macrófagos estimulados por P-MAPA em ambos os grupos de cães saudáveis e infectados com Leishmania sp. O tratamento de macrófagos de cães saudáveis com imunomodulador P-MAPA induziu p38 MAPK e fosforilação de IKK, sugerindo a transdução de sinal por esta via. Estas descobertas sugerem que a P-MAPA tem potencial como uma droga terapêutica no tratamento de leishmaniose visceral canina / Abstract: Visceral leishmaniasis (VL) in Brazil represents a serious public health problem; therefore, it is important to study new alternatives to treat infected dogs. The immunomodulator protein aggregate magnesium-ammonium phospholinoleate-palmitoleate anhydride (P-MAPA) improves immunocompetence when the immune system is impaired, but its dependence on Toll-like receptors (TLRs) and the mechanisms involved in the immune response remain unclear. The in vitro action of P-MAPA on the expression of TLR2 and TLR4, reactive oxygen species (ROS), nitric oxide (NO) and p38 mitogen-activated protein kinase (p38MAPK) and IKK phosphorylation were studied in mononuclear cells from peripheral blood and macrophages from healthy and Leishmania-infected dogs. The PBMC or macrophages were isolated and cultured with different concentrations of P-MAPA (20,100 and 200 μg/mL) in a humid environment at 37°C with 5% CO2. Observation revealed that Leishmania-infected dogs showed a decrease in TLR2 in macrophages compared with healthy dogs and in induction with P-MAPA. ROS were increased in PBMCs from Leishmania sp.-infected dogs compared with healthy dogs and P-MAPA improved ROS production. NO production was increased in culture supernatant from macrophages stimulated by P-MAPA in both healthy and Leishmania-infected dogs. Treatment of macrophages from healthy dogs with immunomodulatory P-MAPA induced p38 MAPK and IKK phosphorylation, suggesting signal transduction by this pathway. These findings suggest that P-MAPA has potential as a therapeutic drug in the treatment of canine visceral leishmaniasis / Mestre

Orientador: Cáris Maroni Nunes / Banca: Francisco Chiaravalloti Neto / Banca: Márcia Dalastra Laurenti / Banca: Marcelo Vasconcelos Meireles / Banca: Mary Marcondes / Resumo: Leishmaniose visceral é uma doença grave que tem no cão seu principal reservatório doméstico. Algumas lacunas no conhecimento dificultam ainda mais o controle da doença. Com relação ao reservatório canino, a possibilidade de se estabelecer indicadores de infectividade ao vetor, como a carga parasitária, poderia resultar em melhor caracterização de seu papel como fonte de infecção na cadeia epidemiológica. Foram realizados xenodiagnósticos em cães acometidos de leishmaniose visceral, com subsequente avaliação da carga parasitária no hospedeiro e no vetor, utilizando-se flebotomíneos da área urbana de Araçatuba,SP. Após cinco dias do repasto, as fêmeas foram dissecadas e submetidas à avaliação parasitológica por meio da demonstração direta do parasito (DDP) e da contagem em câmara de Neubauer (NC). Fragmento de DNA de cinetoplasto (kDNA) de Leishmania spp. foi amplificado por meio da PCR convencional e em tempo real (qPCR), para quantificação da carga parasitária. Os cães foram avaliados para a presença de sinais clínicos e amostras de sangue, swab conjuntival e de pele foram colhidas e processadas por PCR e qPCR. Os resultados dos métodos diagnósticos utilizados foram correlacionados em modelo de regressão linear e a positividade de felbotomíneos foi corrigida pela positividade natural. Tanto a PCR convencional quanto a qPCR mostraram-se adequadas para a avaliação da infectividade canina. Houve correlação entre a carga de parasitos presentes na pele e no swab conjuntival do cão bem como com a cargas de parasitos dos flebotomíneos. Alguns sinais clínicos dos cães, pela análise de componentes principais (PCA), estiveram relacionados com a maior taxa de infecção dos vetores. / Abstract: Visceral leishmaniasis is a severe disease that has the dog as its main domestic reservoir. Gaps in the knowledge difficult even more the control of this disease. Regarding the canine reservoir, the possibility of establishing infectivity indicators, like the dogs parasite load, could result in better characterization of its role as source of infection in the transmission chain. Xenodiagnosis in dogs with visceral leishmaniasis were performed with subsequent parasite load evaluation of the host and the vectors, using sandflies captured in the urban area of Araçatuba,SP. After five days, the female sand flies were dissected, subjected to parasitological evaluation by the direct demonstration of the parasite (DDP) and by counting in a Neubauer chamber (NC). A kinetoplast DNA fragment of Leishmania spp. was amplified by conventional PCR and by qPCR to check the presence and quantification of Leishmania kDNA. Dogs were assessed for clinical signs and blood, skin and conjunctival swab samples were taken and tested for parasite load. The diagnostic methods tested (NC, PCR and qPCR) were correlated by linear regression and positivity results were corrected by the natural infection rate. Conventional PCR and qPCR proved to be appropriate for evaluating canine infectivity. There was a correlation between the parasite load present in the dog' skin and the conjunctive swab, as well as with the sandflies parasite loads. Principal component analysis revealed that some of the clinical signs shown by the dogs were related to a highest sandfly infection rate. / Doutor

Orientador: Simone Baldini Lucheis / Coorientador: Wilma Aparecida Starke Buzetti / Banca: Denise Saraiva Bresciani / Banca: Virginia Bodelão Richini Pereira / Resumo: As leishmanioses são zoonoses que acometem o homem e outras espécies de mamíferos silvestres e domésticos. É uma doença causada por protozoários intracelulares do gênero Leishmania. O agente causador da leishmaniose visceral no Novo Mundo é Leishmania infantum (syn. L. chagasi), sendo Lutzomya longipalpis o principal vetor responsável pela sua transmissão. O gato doméstico também desenvolve a infecção, geralmente de forma assintomática, podendo atuar também como reservatório destes protozoários. Tendo em vista a inespecificidade dos achados clínicos da leishmaniose felina (LF), a ausência de sinais e a semelhança dos aspectos clínicos dessa enfermidade com outras enfermidades em gatos, como a micoplasmose, leucemia felina (FIV) e síndrome da imunodeficiência felina (FeLV), esta zoonose deve ser sistematicamente incluída nas suspeitas clínicas de gatos em áreas endêmicas para leishmanioses canina e humana. Foram utilizadas amostras de sangue de 55 gatos procedentes da Associação Protetora dos Animais (APAISA) de Ilha Solteira, co-habitantes com cães portadores de leishmaniose visceral. À técnica de hemocultura, 16,4% (9/55) dos gatos apresentaram protozoários flagelados. A Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) para L. infantum (syn. L. chagasi) foi testada em 51 gatos, revelando 62,7% (32/51) de animais reagentes. Testando-se a técnica de RIFI para Trypanosoma cruzi, 54,9% (28/55) dos animais foram reagentes. Pela busca de anticorpos anti-Leishmania e anti-Trypanosoma, pela técnica de ELISA indireto com antígeno bruto, encontrou-se 72,5% (37/51) e 39,2% (20/55) de animais reagentes, respectivamente. Com o teste de ELISA indireto com rK39 para Leishmania infantum (syn. L.chagasi), obteve-se a positividade em 21,6% (11/51) dos felinos testados. Pela Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR), das 55 amostras de sangue total testadas, cinco (9,1%) foram positivas ... / Abstract: The leishmaniasis are zoonoses that affect humans and other species of wild and domestic mammals. It is a disease caused by intracellular protozoa of the genus Leishmania. Leishmania infantum (syn. L. chagasi) is the causative agent of visceral leishmaniasis in the New World, Lutzomyia longipalpis is the main vector responsible for transmission. The cat, besides living closely with humans, also develops infection, usually asymptomatic and may also act as a reservoir of these protozoa. Given the specificity of clinical feline leishmaniasis (LF), the absence of pathognomonic signs and symptoms, and the similarity of the clinical aspects of this disease with other very common in cats, as mycoplasmosis, feline leukemia virus (FIV) and immunodeficiency syndrome FeLV (Feline), this zoonosis should be systematically considered in the clinical suspicions of cats in of the areas endemic for canine and human leishmaniasis. Samples of blood from 55 cats coming from the Association for the Protection of Animals (APAISA) of Ilha Solteira, co-inhabitants with dogs with visceral leishmaniasis, were collected. The blood culture technique showed 16,4% (9/55) flagellate protozoa. The technique of indirect fluorescent antibody (IFA) for L. infantum (syn. L. chagasi) was tested on 51 cats, showing 62,7% (32/51) of animals reagents. Testing the technique of IFA for Trypanosoma cruzi, 54,9% (28/55) of animals were reactive. The search for anti-Leishmania antibodies and anti-Trypanosoma, the technique of ELISA with crude antigen, we found 72,5% (37/51) and 39,2% (20/55) of animals reagents, respectively. By ELISA with indirect rK39 for Leishmania infantum (syn. L.chagasi) gave a positive result in 21,6% (11/51) of tested cats. For the PCR, the 55 whole blood samples tested, five (9.1%) were positive for Leishmania spp. Confronting all the results obtained with the diagnostic techniques , is possible to determine the ... / Mestre

Orientador: Valéria Marçal Félix de Lima / Banca: Rosemeri de Oliveira Vasconcelos / Banca: Cáris Maroni Nunes / Resumo: Os cães são o principal reservatório doméstico de Leishmania. (L.) chagasi. No hospedeiro vertebrado, incluindo o homem, o parasita pode causar leishmaniose visceral, transmitida aos humanos. As células T regulatórias (Treg) estão envolvidas na indução de supressão de mecanismos efetores relacionados à imunidade celular. Para investigar a possível implicação das células Treg durante a infecção por Leishmania spp., a presença de Treg no baço e no sangue periférico foi avaliada em cães naturalmente infectados e com sinais clínicos compatíveis com a doença. Quinze cães adultos provenientes do Centro de Controle de Zoonoses da Prefeitura Municipal de Araçatuba - SP, Brasil, com reação sorológica positiva para antígenos de Leishmania (L.) chagasi determinada por ELISA indireto e teste rápido rK39 (Kalazar Detect TM Rapid Test, InBios Inc-Seattle, WA-USA). Cinco cães saudáveis, provenientes de área não endêmica foram incluídos no estudo. As células T regulatórias foram quantificadas em amostras de baço e em células mononucleares do sangue periférico utilizando-se anticorpos monoclonais e citometria de fluxo. No baço, menor número de células Treg foi observado em cães infectados do que nos controles (p<0,05), enquanto que nenhuma diferença foi observada nas células mononucleares de sangue periférico. Esses resultados sugerem que as células Treg estão envolvidas na infecção por Leishmania spp. e que podem ter um papel na persistência do parasita e o estabelecimento da infecção crônica / Abstract: Dogs are the main domestic reservoirs of L. (L.) chagasi. Once in the vertebrate host, the parasite may cause visceral leishmaniasis, which can also be transmitted to humans. Regulatory T cells (Treg) have been shown to be involved in the direct induction of immunosupression of effector cellular immune response. To investigate the possible involvement of T reg cells during Leishmania infection, the presence of Treg cells from the spleen and peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of dogs naturally infected with L. (L.) chagasi, and showing clinical signs, was quantified. A total of 15 adult dogs from the Center for Zoonosis Control of Araçatuba - SP, Brazil, positive for Leishmania (L.) chagasi by indirect ELISA and TM rapid test rK39 (Kalazar Detect TM Rapid Test, InBios Inc-Seattleadult healthy dogs from non endemic area were included in the sspleen and PBMC were used for quantification of Treg by flow cytometmonoclonal antibodies. In spleen, Treg levels in infected dogs control group (p<0.05); in PBMC, no differences were observed betgroups. These results suggest that Treg population is involved in infection and may play a role in promoting parasite persistence achronic infection / Mestre

Orientador: Mary Marcondes / Banca: Paulo César Ciarlini / Banca: Raimundo Souza Lopes / Resumo: A leishmaniose visceral é uma zoonose causada por um protozoário do gênero Leishmania, cujo agente etiológico no Brasil é a Leishmania chagasi. O primeiro caso canino autóctone no Estado de São Paulo, Brasil, foi identificado em 1998 no município de Araçatuba. Desde então a doença vem se espalhando por todo o Estado. O objetivo do presente estudo foi determinar a freqüência de ocorrência de anticorpos anti-Leishmania chagasi em amostras de soro de 584 cães de São José do Rio Preto, São Paulo, área não endêmica para a doença e que dista 160 Km de Araçatuba. Asoroprevalência foi de 0,86% por ELISA e 0,17% por imunocromatografia. Areação de imunofluorescência indireta foi utilizada em 138 amostras eidentificou 1,45% de soropositividade. O ELISA identificou cinco cães positivos,a RIFI dois e um cão foi identificado pela imunocromatografia. Um dos cãespositivo pela RIFI havia sido vacinado para leishmaniose visceral. Dois cãesque foram considerados positivos pelo ELISA indireto foram testados por PCRpara detecção da presença de Leishmania chagasi, mas os resultados foram negativos, não confirmando a doença. Somente um cão foi soropositivo em todos os métodos. Ele apresentava sinais clínicos inespecíficos e foi adquirido pelo proprietário em uma área endêmica para a doença. O diagnóstico não pôde ser confirmado por exame parasitológico direto ou PCR porque o cão morreu antes dos resultados dos exames sorológicos. Os resultados obtidos na população do presente estudo permitem concluir que São José do Rio Preto deve ser, ainda, área não endêmica para leishmaniose visceral canina. / Abstract: Visceral leishmaniasis is a zoonosis caused by a protozoa of the genus Leishmania, whose etiological agent in Brazil is Leishmania chagasi. The first canine autochthonous case of the disease in the São Paulo State, Brazil, was identified in 1998 in Araçatuba. Since then, the disease has spread to great part of the State. The aim of the present study was to determine the frequency of occurrence of anti-Leishmania chagasi antibodies in serum samples of 584 dogs from São José do Rio Preto, São Paulo, a non endemic area for the disease, 160km far from Araçatuba. Seroprevalence was 0,86% by ELISA and 0,17% by imunochromatography. IFAT, used to test 138 samples, identified 1,45% of seropositivity. ELISA identified five positive dogs, IFAT two, and immunochromatography one. One of the dogs that were considered positive by IFAT has been vaccinated for visceral leishmaniasis. Two dogs that were considered positive by indirect ELISA were tested by PCR for the presence of leishmania chagasi, but the results were negative, not confirming the disease. Only one dog was seropositive by all methods. He presented inespecific clinical signs and was acquired by his owner in an endemic area for the disease. The diagnoses could not be confirmed by direct parasitological test or PCR, because the dog has died before serologic results. The population results achieved in this study allow us to conclude that São José do Rio Preto city still must be a canine visceral leishmaniasis non-endemic area. / Mestre

Resumo:O estresse oxidativo ocorre quando há desequilíbrio entre as defesas antioxidantes e os agentes oxidantes no organismo. Considerando que cães com leishmaniose visceral podem desenvolver uremia, o que afeta o metabolismo oxidativo e a apoptose dos neutrófilos, propusemos investigar a hipótese de que o estresse oxidativo, a alteração do metabolismo oxidativo e da apoptose dos neutrófilos de cães variam com o estágio da doença e que a instalação do quadro de uremia contribui para esta variação. Para tal, foram avaliados marcadores plasmáticos de estresse oxidativo (capacidade antioxidante total, peroxidação lipídica, glutationa, ácido úrico, bilirrubina e albumina), a produção de superóxido (método de redução do tetrazólio nitroazul e citometria de fluxo com a sonda hidroetidina), viabilidade e taxa de apoptose (método morfológico e citometria de fluxo utilizando o sistema anexina V-PE) de neutrófilos de cães com leishmaniose classificados de acordo com o LeishVet Consensus em estágio moderado da doença, estágio muito severo quando a uremia está instalada e de cães com uremia sem leishmaniose, comparando-os a cães saudáveis. A leishmaniose, independentemente do estágio, e a uremia causam estresse oxidativo levando à redução da capacidade antioxidante total, que pode estar relacionado à maior produção de superóxido e maior apoptose induzida observada nesses grupos. Espontaneamente, neutrófilos de cães com leishmaniose muito severa e com uremia possuem menor viabilidade, maior apoptose e maior peroxidação lipídica, sugerindo que a uremia seja a causa de tais alterações. Conclui-se que ocorre estresse oxidativo independente do estágio da leishmaniose, entretanto a condição urêmica contribui para diminuição da viabilidade dos neutrófilos em cães no estágio final da doença. As alterações do metabolismo oxidativo dos neutrófilos ocorrem concomitante ao / Abstract:Oxidative stress occurs due to an imbalance between oxidants and antioxidant defenses. Considering that dogs with leishmaniasis may develop uremia, which affects the oxidative metabolism and apoptosis of neutrophils, we proposed to investigate the hypothesis that oxidative stress, alteration of oxidative metabolism and apoptosis of neutrophils in dogs varies according to stage of leishmaniasis and that uremia, commonly occurs in late stages of disease, would contribute to such variations. To this, we evaluated plasma markers of oxidative stress (total antioxidant capacity, lipid peroxidation, glutathione, uric acid, bilirubin and albumin), superoxide production (method of nitroblue tetrazolium reduction and flow cytometry with the probe hydroethidine), and viability and apoptosis rate (morphological method and flow cytometry using annexin V-PE system) on neutrophils from dogs with leishmaniasis classified according to the LeishVet Consensus in moderate stage of the disease, very severe stage when uremia is installed and dogs with uremia negative for leishmaniasis, comparing them to healthy dogs. Leishmaniasis regardless of stage and uremia cause oxidative stress with reduced total antioxidant capacity, which may be related to greater induced production of superoxide and stimulated apoptosis observed in these groups. While spontaneously, neutrophils of dogs in very severe stage and with uremia had lower viability, increased apoptosis and higher lipid peroxidation, suggesting that uremia is the cause of such changes. Can be concluded that the intensity of oxidative stress does not vary with the stage of leishmaniasis, however uremic condition contributes to reduce the viability of neutrophils in late-stage dogs. Changes of neutrophil oxidative metabolism occur concomitant with oxidative stress and increased neutrophil apoptosis in both leishmaniasis and in uremia alone / Orientador: Paulo César Ciarlini / Banca: Mirela Tinucci Costa / Banca: Mary Marcondes / Mestre