Nas Américas, em especial na América do Sul, a infecção por Leishmania (L.) infantum chagasi causa manifestações subclínicas e leishmaniose visceral (LV), a qual quando não tratada é potencialmente fatal. Na América Central, especialmente em Honduras, a leishmaniose cutânea não ulcerada ou atípica e a leishmaniose visceral são causadas pelo mesmo agente etiológico Leishmania (L.) infantum chagasi e ocorrem na mesma região geográfica. Pouco se conhece sobre o perfil da infecção humana por Leishmania (L.) infantum chagasi em Honduras, especialmente sobre a forma não ulcerada ou atípica, sendo assim, no sentido de compreender melhor a patogênese da infecção causada por esta espécie de parasito no município de Amapala (Valle) e Orocuina (Choluteca), Honduras, o presente estudo visou a caracterização histopatológica e da resposta imune celular in situ em lesões de pacientes com leishmaniose cutânea não ulcerada ou atípica. Foram utilizadas 20 biópsias de pele de pacientes com diagnóstico parasitológico confirmado por raspado de lesão corado por Giemsa e observado em microscópio ótico. A histopatologia foi avaliada em cortes histológicos corados por hematoxilina-eosina (HE) e a resposta imune por meio da reação de imunoistoquímica utilizando anticorpos primários para macrófagos (CD68), linfócitos T (CD4, CD8), células natural killer - NK (CD56), linfócitos B (CD20), óxido nítrico sintetase (NOS2) e interferon-gama (IFN-y. Microscopicamente as alterações histopatológicas mais significativas foram observadas na derme superficial e profunda caracterizando-se por um infiltrado inflamatório predominantemente linfohistiocitário de intensidades variável com arranjo difuso e, por vezes, associado à formação de granulomas epitelioides. A observação de formas sugestivas do parasito ocorreu em apenas 55 % dos casos. A análise imunoistoquímica das lesões confirmou a presença de células mononucleares no infiltrado inflamatório caracterizada principalmente pela presença de linfócitos TCD8+, seguido por TCD4+, macrófagos, linfócitos B e células NK. A grande densidade de células INF-y+ e a presença da enzima iNOS, responsável pela produção de óxido nítrico, molécula com atividade leishmanicida, em quase a totalidade dos macrófagos do infiltrado inflamatório, sugere uma resposta imune local bastante efetiva, que colabora para o controle do número de parasitos e consequentemente a evolução do tamanho da lesão / In America, especially in South America, infection by Leishmania (L.) infantum chagasi causes subclinical manifestations and visceral leishmaniasis (VL), which when untreated is potentially fatal. In Central America, especially in Honduras, non-ulcerated or atypical cutaneous leishmaniasis and visceral leishmaniasis are caused by the same etiologic agent Leishmania (L.) infantum chagasi and occur in the same geographic region. Little is known about the profile of human infection by Leishmania (L.) infantum chagasi in Honduras, especially on the non-ulcerated or atypical form. In order to better understand the pathogenesis of the infection caused by this species of parasite in the municipality of Amapala (Valle) and Orocuina (Choluteca), Honduras, the present study aim the characterization of histopathological changes and cellular immune response in situ in lesions of patients with non-ulcerated or atypical cutaneous leishmaniasis. Twenty skin biopsies from patients with parasitological diagnosis confirmed by scraping of Giemsa-stained lesion and observed using an optical microscope. Histopathology, was evaluated by hematoxylin-eosin (HE) and the immunohistochemistry using the primary antibodies to macrophages (CD68), T lymphocytes (CD4, CD8), natural killer cells - NK (CD56), B lymphocytes CD20), nitric oxide synthase (NOS2) and interferon-gamma (IFN-y). Microscopically, the most significant histopathological changes were observed in the superficial and deep dermis, characterized by a predominantly lymphohistiocytic inflammatory infiltrate of variable intensities with diffuse arrangement and sometimes associated with the formation of epithelioid granulomas; the observation of suggestive forms of the parasite occurred in only 55 % of the cases. The immunohistochemical analysis of the lesions confirmed the presence of mononuclear cells in the inflammatory infiltrate characterized mainly by the presence of T-CD8+ lymphocytes, followed by T-CD4+, macrophages, B lymphocytes and NK cells. The high density of INF-y+ cells and the presence of iNOS, enzyme responsible for the production of nitric oxide, molecule with activity leishmanicide, in almost all of the macrophages in the inflammatory infiltrate, suggest an effective local immune response that collaborate to the control in the number of parasites and consequently the evolution of the lesion

A leishmaniose pertence à classe de doenças infecciosas e é causada por parasitas do gênero Leishmania. Essa enfermidade se manifesta nas formas visceral ou cutânea e o tratamento de ambas consiste em quimioterapia utilizando fármacos à base de antimônio. A aplicação desses medicamentos, no entanto, apresenta diversas desvantagens, como o surgimento de efeitos colaterais severos e a disseminação de parasitas resistentes aos fármacos convencionais. Dessa forma, há uma grande necessidade de se desenvolver novos medicamentos, bem como, novas técnicas de tratamento e diagnostico. Neste trabalho foram sintetizados novos fotossensibilizadores derivados da riboflavina (vitamina B2) com potencial aplicação no tratamento de leishmaniose cutânea (através de terapia fotodinâmica) e foram sintetizados novos complexos de Ru (II) com potencial uso como sensores luminescentes de antimônio. Os derivados da riboflavina foram obtidos utilizando a vitamina B2 como material de partida e as transformações químicas estudadas fizeram uso de reações de acilação das hidroxilas da cadeia ribitil e de alquilações do nitrogênio 3 do sistema de anéis isoaloxazina. Essas modificações estruturais permitiram a construção de uma biblioteca de fotossensibilizadores que contém partes hidrofílicas, hidrofóbicas, anfifílicas e iônicas, que possibilitaram estudos da relação estrutura atividade. Com a otimização dessas rotas sintéticas foram obtidos dois derivados flavínicos-catiônicos inéditos na literatura com rendimentos de até 68%. Foi mostrado que as transformações químicas estudadas não afetaram significantemente as propriedades fotofísicas dos derivados flavínicos, sendo todos eles fluorescentes e capazes de fotossensibilizar a produção de oxigênio singlete com rendimento quântico semelhante ao da riboflavina (Φ&#916. ≈ 0,5). Por outro lado, as modificações estruturais na riboflavina alteraram as propriedades físico-químicas em termos de solubilidade e coeficiente de partição. Os derivados sintetizados foram testados contra promastigotas de Leishmania major utilizando LED azul (470 nm). Os fotossensibilizadores apresentaram baixa toxicicidade no escuro (CE50 (concentração efetiva 50%)> 100 µM para todos os compostos) e todos os derivados testados apresentaram maior fototoxicidade (CE50 de até 5 µM) que a riboflavina (CE50 de 50 µM). Foi observado que a fototoxicidade dos derivados da riboflavina está fortemente associada à lipofilicidade do fotossensibilizador. Um complexo de Ru (II) que responde à presença de antimônio foi preparado a partir do bis-complexo Ru(bpz)2Cl2 e do ligante derivado da fenantrolina contendo o grupo bitiofeno (bitiofeno-imidazo-fen). Esse complexo apresenta potencial na construção de sensores luminescentes de antimônio. Foi mostrado que o novo complexo sintetizado [Ru(bpz)2(bitiofeno-imidazo-fen)2+] apresenta baixa luminescência na região do vermelho devido à auto-supressão causada pelo grupo bitiofeno. No entanto, estudos preliminares mostraram que a adição de SbCl3 ou tartarato de antimônio ao meio intensifica significativamente a emissão nessa região do espectro. Devido à formação do complexo Sb-bitiofeno, ocorre o aumento percentual da espécie eletronicamente excitada e a mesma é auto-suprimida com menos eficiência. / The leishmaniases belong to a group of infectious diseases caused by a parasite of the genus Leishmania. This disease manifests as the visceral or the cutaneous forms and the treatment of both types is based on chemotherapies with antimony drugs. The application of these drugs, however, presents drawbacks like several side effects and dissemination of parasites resistant to this conventional treatment. Thus, there is a growing need to develop new drugs, as well as new modalities of treatment and diagnosis. In this work, novel photosensitizers derived from riboflavin (vitamin B2) with potential application in the treatment of cutaneous leishmaniasis (by photodynamic therapy) were synthesized. Also, novel Ru (II) complexes with potential usage as luminescent sensors of antimony were synthesized. The riboflavin derivatives were obtained by using vitamin B2 as the starting material, and the chemical transformations were based on acylation of the hydroxyl groups from the ribityl side chain and alkylation of nitrogen 3 of the isoalloxazine ring system.These structural modifications yielded a library of photosensitizers containing hydrophilic, hydrophobic, amphiphilic or ionic moieties, which provide molecules for a study of the structure-activity relationship. By optimizing these synthetic routes, two novel cationic riboflavin derivatives were obtained in good yield (up to 68%). It has been shown that the chemical modifications performed have not significantly affected the photophysical properties of the riboflavin derivatives. All compounds are fluorescent and able to photosensitize singlet oxygen in yields similar to riboflavin itself (Φ&#916 ≈ 0,5). On the other hand, these structural modifications varied the physic-chemical properties related to solubility and partition coefficient of the derivatives. The obtained derivatives were tested against promastigotes of Leishmania major using blue LED (470 nm). The photosensitizers displayed low dark toxicity (EC50 (Effective Concentration 50%) > 100 µM for all the studied compounds) and all derivatives showed greater phototoxicity (EC50 up to 5µM) when compared to riboflavin (EC50 = 50µM). It was observed that the phototoxicity of the riboflavin derivatives is strongly associated with the lipophilicity of photosensitizer. A Ru (II) complex that responds in the presence of antimony was prepared from Ru(bpz)2Cl2 and a phenanthroline ligand containing a bithiophene group (bithiophen-imidazo-phen). This complex can be potentially applied in the construction of luminescent sensors of antimony. It has been demonstrated that the novel complex [Ru(bpz)2(bitiofeno-imidazo-fen)2+] displays low red luminescence due to the self-quenching promoted by the bithiophen moiety. However, preliminary studies have evidenced that, upon addition of SbCl3 or antimony tartrate to the media, the emission intensifies in the red region of the spectrum. Due to the formation of the chelate Sb-bithiophene, the elf-quenching of the electronic excited species occurs less efficiently.

A leishmaniose visceral (LV) no Brasil é causada pela espécie Leishmania chagasi (L. infantum) e os cães são considerados o principal reservatório doméstico desse parasita. Portanto, o diagnóstico correto e seguro é muito importante para evitar a transmissão da doença ou o sacrifício desnecessário de cães. O objetivo deste trabalho foi avaliar o swab conjuntival (SC), um método não invasivo de amostragem, para o diagnóstico da LV canina por PCR-hibridização. Primeiramente, um teste in vitro foi delineado utilizando-se swabs contaminados com 103 até 1,0 célula de L. chagasi. Três métodos de extração de DNA foram testados: fenol-clorofórmio, kit Wizard e fervura. Em seguida, dois grupos de 23 cães soropositivos foram utilizados. Foram feitos esfregaços por SC em ambos os olhos de cada animal. A extração de DNA de SC foi realizada utilizando-se o método fenolclorofórmio no grupo 1 e a técnica de fervura no grupo 2. Além disso, sangue foi coletado de cada cão sendo que 30&#956;L foram aplicados em papel filtro (PF) e 1,0mL foi tratado para obtenção do anel leucocitário (AL). A purificação de DNA para PF e AL foi realizada da mesma forma em ambos os grupos utilizando-se kits comerciais. A análise de todas as amostras foi feita por PCR seguida de hibridização com sondas de DNA marcadas com 32P. O experimento com swabs contaminados com L. chagasi mostrou positividade na PCR para até 25, 10 e 1,0 célula pelos métodos da fervura, kit Wizard e fenol-clorofórmio respectivamente. A hibridização aumentou a sensibilidade para até 10 e 1,0 célula pelos métodos da fervura e kit Wizard respectivamente. As positividades da PCR para os cães do grupo 1 e 2 foram respectivamente: 73,9% e 52,2% (SC), 8,7% e 30,4% (AL), 8,7% e 17,4% (PF). A hibridização aumentou essas positividades para: 91,3% e 65,2% (SC), 21,7% e 34,8% (AL), 30,4% e 43,5% (PF) respectivamente. Os melhores resultados foram obtidos pela associação de SC com o método de fenol-clorofórmio para extração de DNA. O resultado final obtido desse tratamento foi estatisticamente diferente daqueles referentes ao AL e PF no grupo 1 (p<0,01). No grupo 2, o resultado final proveniente do SC associado com a técnica de fervura para o isolamento de DNA foi estatisticamente distinto apenas do resultado referente ao AL (p<0,05). Concluiu-se que a combinação de SC com a extração de DNA por fenol-clorofórmio é uma ferramenta valiosa para o diagnóstico da LV canina e pode ser recomendada para o diagnóstico em cães sintomáticos. / The visceral leishmaniasis (VL) in Brazil is caused by Leishmania chagasi (L. infantum) and dogs are considered to be the main domestic reservoir. Therefore the correct diagnosis is very important in order to avoid the disease transmission or unnecessary culling of dogs. The aim of this study was to evaluate the conjunctival swab (CS) as a noninvasive sampling method for the canine VL diagnosis by the PCR-hybridization procedure. Firstly, an in vitro test was carried out using cotton swabs seeded with 103 to one cell of L. chagasi. Three DNA purification techniques were tested: phenol-chloroform, Wizard kit and boiling. After that, two groups of 23 seropositive dogs were used. CS samples were obtained from both eyes of each animal. The DNA extraction from CS was performed by the phenol chloroform method in group 1 and by boiling in group 2. In addition, blood was collected from each animal so that 30&#956;L were spotted onto filter paper (FP) and 1.0mL was treated to obtain the buffy coat (BC). The DNA extraction from the BC and FP was accomplished by the same way in both groups using commercial kits. The analysis of all samples was made by PCR associated to the hybridization with 32P labeled DNA probes. The in vitro test with seeded parasites showed positivity to until 25, 10 and one cell for boiling, Wizard kit and phenol chloroform methods respectively. The hybridization step increased the sensitivity until 10 and one cell for the boiling and Wizard respectively. The PCR positivities for the dogs in groups 1 and 2 were respectively: 73.9% and 52.2% (CS), 8,7% and 30.4% (BC), 8.7% and 17.4% (FP). The hybridization step increased the positivities for: 91.3% and 65.2% (CS), 21.7% and 34.8% (BC), 30.4% and 43.5% (FP) respectively. The best frequency of positivity was obtained by the association between CS and the DNA extraction by phenol chloroform. The final result obtained from this treatment was statistically different from the BC and FP data in group 1 (p<0,05). In group 2, the result from CS associated with DNA purification by boiling was distinct only from the BC data (p<0,05). We conclude that the CS associated with the DNA extraction by phenol chloroform is a valuable tool for diagnosis of canine LV and can be recommended for diagnosis of symptomatic dogs.

Infecções causadas por tripanossomatídeos causam milhares de mortes anualmente, além de levarem a redução da capacidade produtiva, com elevada morbidade na população acometida. A eficácia terapêutica é limitada na maioria dos casos, sendo o benzonidazol o único fármaco aprovado para uso do tratamento do Trypanosoma cruzi, sendo ativo somente na fase aguda da Doença de Chagas, com grande efeitos colaterais. No caso das leishmanioses, as substâncias de tratamento existentes causam toxicidade renal e cardíaca, além de induzirem a resistência e apresentarem eficácia insuficiente. Observando todo o contexto torna-se necessário a busca por novas substâncias que sejam mais eficazes e menos tóxicas. Assim, o trabalho representa uma contribuição para a busca de novas moléculas bioativas para o tratamento da doença de Chagas e leishmaniose a partir da padronização e realização de ensaios celulares usando a forma epimastigota da cepa Y do T. cruzi e promastigota para Leishmania chagasi e L. amazonensis. A padronização do método colorimétrico de MTT foi realizada a partir da comparação com o método tradicional de contagem por microscopia usando câmara de Neubauer, seguido do estudo de viabilidade por citometria de fluxo, como método confirmatório e, finalmente a padronização do ensaio de ciclo celular usando os fármacos de referência benzonidazol (T. cruzi) e anfotericina B (Leishmania spp.). Os compostos testados neste estudo são proveniente de classes distintas de inibidores de alvos macromoleculares (cisteíno proteases, DHODH, GAPDH, quinases) e foram planejados e/ou selecionados pelo Grupo de Química Medicinal (NEQUIMED). Dentre todas as substâncias, inibidores de quinases apresentaram maior potencial para estudos subsequentes, sendo o T. cruzi o parasito mais sensível, onde um grande número de substâncias apresentou atividade nos estudos de triagem. Para uma delas (Neq0474) foi realizado o ensaio de dose-resposta, com EC50 = 53 &micromol/L. L. chagasi apresentou a maior resistência dentre todos os parasitos estudados neste trabalho, enquanto que L. amazonensis foi sensível para Neq0438. Algumas substâncias estudadas apresentaram potencial para estudos mais aprofundados visando identificar novas alternativas terapêuticas para estas doenças parasitárias. / Infections caused by trypanosomatides lead to thousands of deaths annually, besides the reduction of the quality of life and working capability, with high morbidity to the patients. The therapy efficacy is limited in most cases, being benznidazole the only approved drug in Brazil, which works only in the acute phase of the Chagas Disease with severe collateral effects. For leishmaniasis, the drugs cause renal and cardiac toxicity and trigger resistance. In this context, novel efficacious and secure substantes are necessary to improve the current therapeutic strategies, which was the goal of this project by means of cell-based assays. The first step was the standardization of the MTT colorimetric assay for the epimastigote form of the Y strain of Trypanosoma cruzi and promastigote form of Leishmania chagasi and Leishmania amazonensis. This was achieved by comparing the results with the standard counting using the Neubauer chamber. The use flow cytometry for the determination of cell viability and the perturbation of the cell cycle were also standardized using the reference drugs benznidazole (T. cruzi) and amphotericin B (Leishmania spp.). New compounds tested in this project were designed or selected based on different macromolecular targets (cysteine proteases, DHODH, GAPDH, kinases) by the Medicinal Chemistry Group (NEQUIMED). Among them, many kinase inhibitors promoted the most dramatic results for T. cruzi, reducing the cell viability of this parasite. One of them (Neq0474) was subjected for a follow-up dose-response assay, with EC50 = 53 &micromol/L. L. chagasi was the most resistant parasite in this work, whereas L. amazonensis was sensitive to Neq0438. Some of these new compounds are of interest for more in-depth studies to these parasitic diseases.

Made available in DSpace on 2016-08-10T10:29:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 VERISSA MARTINS TEIXEIRA.pdf: 734398 bytes, checksum: ba115878ec5516b813d6bc6eedc4c03d (MD5) Previous issue date: 2010-10-01 / Visceral Leishmaniasis (VL), a widespread disease, becomes relevant for its high incidence and lethality in different countries around the world. Brazil follows the global trend, reaching 21 federate units. In the state of the Tocantins the illness indices are high, especially in the city of Araguaína, among the most prevalent of the country. The VL behaves as typical zoonose, the sandflies as vector and the dog as the main reservoir. In the urban area these canids are considered the main infection source due to the high skin parasitism and the man proximity. The canine epidemic is still important for it generally comes from the human epidemic. The diagnosis of the human and canine infection is mainly based on serological methods, in which the Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) stands out. Due to the illness endemic character, the more effective diagnostic methods became primordially available. Aiming to provide safer results free of interferences, as unspecified and immune complex reactions, frequently observed in the immune diagnostic of the human and canine VL, accomplished in this research, variations of the ELISA in serum samples from 140 dogs from the Tocantins endemic region. Verifying if there are unspecified reactions in the ELISA tests urea was added to the samples as diluents. The reduction of the optic densities was observed in the tested samples, presuming that it was break in the weak links or of low antibodies. Glicine and Tris were added to evaluate the interference of the immune complexes in the ELISA test to evaluate the interference with the pH shock, proving that there was an increase of the absorbing rate. These results suggest that method is effective to eliminate the complex antibodies, which had been blocked by circulating antigens. It is believed that the results acquired in this work are relevant in the perspective of the constant search for the diagnostic improvement of infectious and parasitic illnesses. / A leishmaniose visceral (LV), enfermidade de ampla distribuição, torna-se relevante pela alta incidência e letalidade relatadas em diferentes países do mundo. O Brasil acompanha a tendência global, com 21 unidades federadas atingidas. No estado do Tocantins são altos os índices da doença, especialmente na cidade de Araguaína, encontrada entre as mais prevalentes do país. A LV comporta-se como uma típica zoonose, tendo um flebótomo como vetor e o cão como o principal reservatório. Na área urbana esses canídeos são considerados a principal fonte de infecção devido ao alto parasitismo cutâneo e à proximidade ao homem. A epidemia canina é ainda importante por geralmente preceder a epidemia humana. O diagnóstico da infecção humana e canina baseia-se principalmente em métodos sorológicos, entre eles se destaca o Ensaio Imunoenzimático (ELISA). Devido ao caráter endêmico da doença, torna-se primordial que métodos diagnósticos mais efetivos sejam disponibilizados. Com o objetivo de fornecer resultados mais seguros e livres de interferentes, como reações inespecíficas e imunocomplexos, frequentemente observados no imunodiagnóstico da LV humana e canina, realizou-se através deste trabalho, variações de Ensaio Imunoenzimático em amostras de soro de 140 cães procedentes de região endêmica do estado do Tocantins. Para verificar se havia reações inespecíficas em testes ELISA adicionou-se ureia como diluente das amostras. Observou-se a diminuição das densidades ópticas das amostras testadas, presumindo que houve a quebra de ligações fracas ou de anticorpos de baixa avidez. Para avaliar a interferência de imunocomplexos no ensaio ELISA foram adicionados Glicina e Tris, com choque de pH, constatando-se que houve aumento do título das absorbâncias. Estes resultados sugerem que o método é efetivo para eliminar os anticorpos complexados, antes bloqueados por antígenos circulantes. Acredita-se que os resultados obtidos através deste trabalho sejam relevantes na perspectiva da busca constante pelo aprimoramento diagnóstico de doenças infecciosas e parasitárias.

Made available in DSpace on 2016-08-10T10:29:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 CELINA FERNANDES SALES.pdf: 6987681 bytes, checksum: ced3c6b58a0241aea5fe839ddd438bc5 (MD5) Previous issue date: 2010-10-29 / A leishmaniose visceral é uma zoonose típica de áreas tropicais, dependente da tríade: hospedeiro (homem), vetor (flebotomíneo) e reservatório (cão e animais silvestres). Nos países do novo mundo o protozoário responsável pela infecção é Leishmania chagasi. No Brasil, até o presente momento, os surtos da doença estão associados à presença de cães soropositivos e em várias regiões geográficas a epidemia canina precedeu a humana. Lutzomya longipalpis é o principal vetor, possui ampla distribuição geográfica no novo mundo, sendo apontado como o principal responsável pela persistência da doença em várias áreas tropicais e neotropicais do planeta. O Brasil é responsável por 90% dos casos ocorridos na América Latina e a região Nordeste do país registra os maiores índices da infecção seguida pela região Sudeste, Norte, Centro-Oeste e Sul, respectivamente. Era considerada uma enfermidade de caráter eminentemente rural e, mais recentemente, vem se expandindo para as áreas urbanas de médio e grande porte. O estado do Tocantins destaca-se como um dos maiores responsáveis pelo aumento das estatísticas envolvendo a leishmaniose visceral humana na região Norte do Brasil. Araguaína é responsável por aproximadamente 50% dos casos de leishmaniose visceral humana notificados anualmente no Tocantins, e ainda detém o maior número de notificações de leishmaniose visceral canina do Estado. Para o efetivo controle do reservatório canino é preciso haver acurácia no diagnóstico. O diagnóstico laboratorial desta enfermidade continua sendo um desafio. Observa-se um amplo espectro clínico da doença, tanto em humanos, como em animais e segundo alguns autores este fato é responsabilizado, em parte, por dificuldades no diagnóstico laboratorial. Por esta razão, propôs-se avaliar o emprego dos métodos: Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI), Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), Teste Rápido (DPP®), Imunohistoquímica (IH), Imunoensaio Enzimático (ELISA) e Coloração pela Hematoxilina Eosina (HE) em 20 amostras de soro e de linfonodos de cães, considerados positivos para leishmaniose visceral canina, que seguiram para eutanásia no Centro de Controle de Zoonoses de Araguaína em 2009. Foram encontrados 100% de positividade através da RIFI, 95% tanto por DPP®, como por PCR, 90% por ELISA, e 25%, em cada um dos testes IH e HE. Com o objetivo de realizar um estudo comparativo entre os testes, empregou-se o método Kappa de Cohen. Melhores resultados de concordância foram observados quando se comparou ELISA com DPP® obtendo índice Kappa (0,643) considerado bom, conforme parâmetros sugeridos por Landis & Koch (1977). Os resultados obtidos através do presente trabalho, permitem propor o emprego do teste rápido DPP® em inquérito soroepidemiológico canino tendo em vista sua praticidade e facilidade de execução quando se compara com o ELISA.

Made available in DSpace on 2016-08-10T10:54:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ALEXANDER GONCALVES FERREIRA GUIMARAES.pdf: 4469683 bytes, checksum: c99a73a338fea40d1443a03224ecd942 (MD5) Previous issue date: 2014-08-15 / Visceral leishmaniasis (VL) is a zoonotic disease of major public health importance, having been considered a neglected disease by the World Health Organization (WHO), has expanded and urbanized, with its transmission and geographic expansion associated to a complex group of factors still badly understood, becoming a major challenge their control to public health in the country. In Brazil, the mode of transmission is through the bite of the vectors Lutzomyia longipalpis and Lutzomyia cruzi, infected by trypanosomatid Leishmania (Leishmania) chagasi. In urban areas, the dog (Canis familiaris) is their main source of infection. In Mato Grosso, 33.33% of the counties had recorded LV in the period 2001-2013. Rondonópolis currently records the highest number of reported cases in the state, being the only one in intense transmission. Objectives: To characterize the possible decisive factors in the development and transmission of VL in urban area of Rondonópolis/MT process in the period 2003-2012. Methods: This is a quantitative research with the development of a descriptive epidemiological study, based on confirmed cases recorded in LVH (SINANNET), being subsidized by secondary data about the vector, animal reservoir and application of a structured interview for collection of socioeconomic, environmental, and about the level of information knowledge of the population affected by the disease. Results: The cure was prevalent in 87.63% of cases. The age group from 1 to 4 years was the most affected. The incidence rate in the period ranged from 0,63 in 2003 to 29,69/100.000 inhabitants in 2009. Mortality reached its highest percentage in 2007 with 35.71%. Recorded deaths prevailed among adults aged 60 years or more. The HVL-HIV co-infection occurred in 6.45% of reported cases. The group of African American individuals, male, with low education 81.65% and lower household income than 2 minimum wages 72.04% were the most affected by LVH in the county. Most visited households own pets, 70.97% of households have no sewerage system, the area nearby the residence is extensive, with great amount of green area in the proximities and accumulation of organic matter in the soil. In Rondonópolis, we found that the level of knowledge of the population in relation to VL limits to superficial information about the disease and that preventive actions carried out are nonspecific or accomplished in a discontinuous way. Conclusion: The data express the endemic character of VL with a high percentage of infection in children and HIV-positive, the largest incidence of the disease coincided with areas of high population density that clearly illustrate the process of urbanization of VL. The high distribution of the canine infection, the wide vector adaptation in the urban environment; the reducing of health investments; the discontinuity of the control actions and the expansion of construction of habitational groups on the outskirts create favorable conditions for diseases of a urban cycle and the active transmission of the disease can increase the number of cases in the next years. / A Leishmaniose Visceral (LV) é uma zoonose de grande importância na saúde pública considerada doença negligenciada pela Organização Mundial de Saúde (OMS), tem se expandido e urbanizado, sendo sua transmissão e expansão geográfica associada a um conjunto complexo de fatores ainda mal compreendidos tornando-se um grande desafio o seu controle para a saúde pública no país. No Brasil, sua forma de transmissão se dá por meio da picada dos vetores Lutzomyia longipalpis e Lutzomyia cruzi, infectados pelo tripanosomatídeo Leishmania (Leishmania) chagasi. Na área urbana, o cão (Canis familiaris) é sua principal fonte de infecção. Em Mato Grosso, 33,33% dos municípios tiveram registro de LV no período de 2001 a 2013. Atualmente Rondonópolis registra o maior número de casos notificados do estado, sendo o único em transmissão intensa. Objetivos: O presente estudo teve como objetivo caracterizar os possíveis fatores determinantes no processo de urbanização e transmissão da LV em área urbana do município de Rondonópolis/MT no período de 2003 a 2012. Métodos: Trata-se de uma pesquisa quantitativa com o desenvolvimento de um estudo epidemiológico descritivo, com base nos casos confirmados LVH registrados no (SINAN-NET), sendo subsidiada por dados secundários sobre o vetor, reservatório animal e aplicação de uma entrevista estruturada para coleta de informações socioeconômicas, ambientais e sobre o nível de conhecimento da população acometida pela doença. Resultados: A cura foi predominante em 87,63% dos casos. A faixa etária de 1 a 4 anos foi a mais acometida. A taxa de incidência no período variou de 0,63 em 2003 a 29,69/100.000 habitantes em 2009. A letalidade atingiu o seu maior percentual em 2007 com 35,71%. Os óbitos registrados predominaram entre adultos na faixa etária de 60 anos ou mais. A coinfecção LVH-HIV ocorreu em 6,45% dos casos notificados. Os indivíduos do grupo Negro, do sexo masculino, com baixa escolaridade 81,65% e de rendimento familiar inferior a 2 salários mínimos 72,04% foram os mais acometidos pela LVH no município. A maioria dos domicílios visitados possui animais domésticos, 70,97% dos domicílios não possuem rede de esgoto, o peridomicílio é extenso, com grande quantidade de área verde nas proximidades e acúmulo de matéria orgânica no solo. Em Rondonópolis, verificamos que o nível de conhecimento da população em relação a LV se restringe a informações superficiais sobre a doença e que as atitudes preventivas são inespecíficas ou realizadas de forma descontínuas. Conclusão: Os dados expressam o caráter endêmico da LV com alto percentual de infecção em crianças e HIV positivos, a maior incidência da doença coincidiu com as áreas de maior densidade populacional que ilustram claramente o processo de urbanização da LV. A alta distribuição da infecção canina, a ampla adaptação do vetor no ambiente urbano, a redução dos investimentos em saúde, a descontinuidade das ações de controle e a expansão das construções dos conjuntos habitacionais na periferia da cidade criam condições favoráveis para a endemicidade de um ciclo urbano de transmissão ativa da doença que poderá aumentar o seu número de casos nos próximos anos.

A resposta imune desencadeada em pacientes com leishmaniose tegumentar Americana (LTA) é predominantemente celular. Assim, o estudo dos mecanismos imunológicos responsáveis pela formação, progressão e cura desta infecção é de grande importância, considerando a deformação que ela pode causar em indivíduos infectados. Este estudo investigou a expressão de mRNA de IFN-?, IL-10, IL-27, TNF-?, TGF-? e IL-6 em 40 biopsias de parafina (FFPE) fixadas em formalina de pacientes com diagnóstico clínico e laboratorial para LTA. Um grupo de 10 biópsias FFPE coletadas de pacientes com diagnóstico clínico de leishmaniose mucosa (LM) foi utilizado para o controle da evolução da infecção. Inicialmente, foi padronizado a extração de RNA, a síntese de cDNA e a escolha do gene endógeno em 9 biopsias frescas e 8 FFPE. Após essas padronizações, as moléculas de RNA de fragmentos de biopsias parafinadas, foram extraídas com kit específico, tratadas com DNase, quantificadas por fluorimetria e sintetizadas para cDNA. A expressão relativa de cada citocina foi determinada (em duplicata) por PCR em tempo real. As reações foram normalizadas frente ao padrão de expressão do gene endógeno GAPDH, que foi previamente padronizado. O padrão de expressão de cada gene alvo foram determinados segundo a fórmula do \"CT comparativo\" (2-??CT), na qual calcula-se quantas vezes mais ocorre a expressão do gene alvo em relação a indivíduos normais. Também incluído nesse estudo 5 amostras de biopsia de pele de indivíduos normais (grupo IV). Os resultados foram expressos em média de quantificação relativa, a análise estatística foi realizada utilizando foi determinada por Teste t não pareado e teste F para comparação de variâncias, onde três grupos de pacientes foram formados. Grupo I, 35 pacientes com LTA, cuja expressão relativa de IFN-? foi inferior a 100. Grupo II, 5 pacientes com LTA cuja expressão relativa de IFN-? foi superior a 100. Grupo III, 10 pacientes com leishmaniose mucosa. Os níveis de expressão para IFN-? foram 33,34; 214,1 e 129,6 vezes maiores para os Grupos I, II e III, respectivamente do que as amostras do controle normal. Para o TNF-? foram 11,22; 2,37 e 4,59 vezes superiores ao normal nos Grupos I, II e III, respectivamente. Para IL-10 foram 5,14; 11,54 e 2,51 vezes superiores aos valores normais nos Grupos I, II e III, respectivamente. Para IL-27 foram 15,81; 85,29 e 17,29 vezes superiores ao normal nos Grupos I, II e III, respectivamente. Para o TGF-? foram 5,38; 4,33 e 4,72 vezes superiores ao normal nos Grupos I, II e III, respectivamente. Para a IL-6 foram 5,92; 5,69 e 2,09 vezes superiores aos valores normais nos Grupos I, II e III, respectivamente. Estes resultados foram semelhantes a resultados de estudos que analisam a expressão de citocinas já sintetizadas. No geral, os resultados de expressão gênica das citocinas estudadas sugerem que a exacerbação da resposta imune do perfil Th1 (IFN-?) poderia levar ao surgimento de lesões mais graves nos pacientes dos Grupos II e III. Os níveis elevados de mRNA de IL-10, observado nos pacientes do Grupo II podem promover baixa ativação macrofágica, colaborando com a replicação do parasita e assim culminar com a progressão da doença. A expressão de mRNA de IL-27 não interferiu na expressão de mRNA de IFN-? nas células dos pacientes com leishmaiose tegumentar ou leishmaniose mucocutânea. Em conclusão, estes resultados podem sugerir que os pacientes do Grupo II podem desenvolver formas mais graves de LTA quando comparados aos do Grupo I. / The immune response triggered in patients with American cutaneous leishmaniasis (ACL) is predominantly cellular. Thus, the study of the immunological mechanisms responsible for the formation, progression and cure of this infection is of great importance, considering the deformation that it can cause in infected individuals. This study investigated the expression of IFN-?, IL-10, IL-27, TNF-?, TGF-? and IL-6 mRNA in 40 formalin-fixed paraffin-embedded paraffin biopsies (FFPE) from patients with clinical and laboratory diagnosis for LTA. A group of 10 FFPE biopsies collected from patients with clinical diagnosis of mucosal leishmaniasis (MCL) was used to control the evolution of the infection. Initially, RNA extraction, cDNA synthesis and the choice of the endogenous gene were standardized in 9 fresh biopsies and 8 FFPE. After these standardizations, the RNA molecules of fragments of paraffin-shaped biopsies were extracted with a specific kit, treated with DNase, quantified by fluorimetry and synthesized for cDNA. The relative expression of each cytokine was determined (in duplicate) by real-time PCR. Reactions were normalized against the expression pattern of the endogenous GAPDH gene, which was previously standardized. The expression pattern results for each target gene were determined by the \"comparative CT\" (2-??CT) formula, in which it is calculated how many times more the expression of the target gene occurs in relation to normal individuals. Also included in this study 5 skin biopsy samples from normal subjects (group IV). The results were expressed as mean relative quantification, statistical analysis was performed using was determined by unpaired t test and F test for comparison of variances, where three groups of patients were formed. Group I, 35 patients with ACL, whose relative expression of IFN-? was less than 100. Group II, 5 patients with ACL whose relative expression of IFN-? was greater than 100. Group III, 10 patients with mucosal leishmaniasis. The expression levels for IFN-? were 33,34; 214,1 and 129,6 times higher for Groups I, II and III, respectively than the samples from the normal control. For TNF-? were 11,22; 2,37 and 4,59 times higher than normal in Groups I, II and III, respectively. For IL-10 were 5,14; 11,54 and 2,51 times higher than the normal values in Groups I, II and III, respectively. For IL-27, 15,81; 85,29 and 17,29 times higher than normal in Groups I, II and III, respectively. For TGF-? were 5,38; 4,33 and 4,72 times higher than normal in Groups I, II and III, respectively. For IL-6 were 5,92; 5,69 and 2,09 times higher than the normal values in Groups I, II and III, respectively. These results were similar to the results of studies that analyze the expression of cytokines already synthesized. In general, the gene expression results of the cytokines studied suggest that the exacerbation of the Th1 profile (IFN-?) immune response could lead to more serious lesions in patients in Groups II and III. Elevated levels of IL-10 mRNA observed in Group II patients may promote low macrophage activation, assisting in the replication of the parasite and thus culminating in the progression of the disease. Expression of IL-27 mRNA did not interfere in the expression of IFN-? mRNA in the cells of patients with tegumentary leishmaiosis or mucocutaneous leishmaniasis. In conclusion, these results may suggest that patients in Group II may develop more severe forms of ACL when compared to those in Group I.

INTRODUÇÃO: A Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) é uma doença infecciosa endêmica no Brasil, causada por protozoários do gênero Leishmania e possui duas formas clínicas principais, a leishmaniose cutânea (LC) e a leishmaniose mucocutânea (LMC). Os macrófagos têm papel crucial na patogênese da Leishmaniose como hospedeiros do parasita e atuam como células apresentadoras de antígenos, promovendo uma resposta imune de perfil Th1 contra a Leishmania. Os macrófagos polarizados M2, relacionados com resposta anti-inflamatória (Th2), são envolvidos no controle da inflamação e dano tecidual em várias doenças e estão associados à cronicidade nas doenças infecciosas. O objetivo deste trabalho foi verificar a participação dos macrófagos M2 nos sítios de lesão cutânea da LTA MÉTODOS: Sessenta e três biópsias de pele de lesões de LTA, obtidas de 48 doentes com LC e 15 de LMC, foram submetidas ao método imuno-histoquímico com os anticorpos anti-CD163 e anti-CD206, marcadores de macrófagos M2. Dez espécimes foram também submetidos à técnica imuno-histoquímica de dupla marcação com a utilização dos marcadores pSTAT-1 e CD68 para identificação de macrófagos M1 e CMAF e CD163 para identificação de macrófagos M2. RESULTADOS: Os espécimes de pele com reação inflamatória difusa (n = 26) exibiram maior número de células imunomarcadas com CD163, quando comparadas ao grupo com reação granulomatosa bem organizada (n = 37) (p= 0,01). Os macrófagos CD163+ também foram mais numerosos nas lesões de pele com a presença de formas amastigotas de Leishmania (n = 39) ao exame histopatológico (p=0,02), quando comparadas às lesões onde os parasitas não foram observados (n = 24). O mesmo ocorreu quando comparados somente os espécimes do grupo de doentes com LC com a presença de parasitas (n = 31) e ausência dos mesmos (n = 17) (p = 0,04). As lesões de pele de doentes com LMC mostraram maior número de células CD206+ (n = 15) que a de doentes com LC (n = 48) (p=0,008). Houve correlação positiva entre o número de células imunomarcadas com os anticorpos CD163 e CD206 (r de Spearman= 0,369). Os macrófagos +pSTAT1/CD68+ (M1) mostraram-se mais numerosos que os macrófagos CMAF+/CD163+ (M2) nos sítios de lesão cutânea da LTA. CONCLUSÕES: Os resultados obtidos sugerem que os macrófagos M2 têm um papel na resposta imune \"in situ\" da LTA. Essas células devem atuar como células alvo, facilitando a entrada dos parasitas, a progressão da doença e parecem estar envolvidos nos mecanismos de cronicidade e nos processos de remodelamento tecidual dessa doença. As moléculas CD163 e CD206 podem ser consideradas bons marcadores teciduais de macrófagos M2, uma vez que mostraram correlação positiva em sua expressão. A técnica de dupla marcação confirmou a presença dos macrófagos M2 nas lesões cutâneas da LTA. Embora ocorra a presença de macrófagos M2, os macrófagos M1 são a população macrofágica predominante da resposta imune \"in situ\" da LTA / INTRODUCTION: American tegumentary leishmaniasis (ATL) is an endemic infectious disease in Brazil, caused by Leishmania parasites and it has two main clinical forms, cutaneous leishmaniasis (CL) and mucocutaneous leishmaniasis (MCL). Macrophages play a key role in leishmaniasis pathogenesis. They are definite parasite host and act as antigen presenting cells, eliciting a Th1 pattern of immune response (M1) against Leishmania. M2 polarized macrophages, related to an anti-inflammatory response (Th2), are involved in controlling inflammation and tissue damage in several diseases and are related to chronicity in infectious diseases. The aim of this study was verifying M2 macrophages \"in situ\" participation in ATL. METHODS: Sixty-three skin biopsies from LTA lesions, obtained from patients with CL (n=48) and MCL (n=15), were subjected to imunohistochemical technique with M2 macrophages markers CD163 and CD206 antibodies. Ten samples were selected for double staining technique with pSTAT1 and CD68 markers for M1 identification, and CMAF and CD163 markers for M2 macrophages identification. RESULTS: Skin samples displaying diffuse inflammatory reaction (n = 26) exhibited higher number of CD163 immune stained macrophages when compared to the well-organized granulomatous reaction group (n = 37) (p=0.01). CD163+ macrophages were higher in samples displaying Leishmania parasites (n = 39) at histopathology exam than the samples without parasites (n = 24) (p=0.02). Same result was observed when comparing the lesions of CL lesions with (n = 31) and without (n = 17) parasites (p = 0.04). MCL skin lesions (n = 15) showed higher number of CD206+ cells (p = 0.008) in comparison with skin lesions taken from CL patients (n = 48). Spearman test demonstrated a positive correlation between the number of CD163+ and CD206+ immune stained cells (Spearman r = 0,369). M1 macrophages (pSTAT1+/CD68+) were present in higher number when compared to M2 macrophages (CMAF+/CD163+) in the samples studied. CONCLUSIONS: The results suggest that M2 macrophages play a role in the in situ immune response of ATL. M2 polarized macrophages may act as host target cells facilitating parasites entry and promoting disease progression, but also seem to be involved with chronicity and tissue remodeling of ATL lesions. CD163 and CD206 molecules may be considered as good markers for M2 macrophages. Double staining technique confirmed the presence of M2 macrophages, although M1 macrophages are the predominant macrophagic component in skin lesions of ATL

Na fase ativa da leishmaniose visceral (LV) ocorrem alterações no metabolismo de lipoproteínas com redução dos níveis de HDL e aumento de triglicérides. A partir desses dados, focamos neste projeto essas alterações na progressão da infecção e apontamos alguns elementos como seus possíveis desencadeantes. Como essas alterações poderiam resultar de redução de atividade e expressão da lipoproteína lipase (LPL), do receptor alfa do proliferador ativado de peroxissoma (PPAR?) e da proteína transferidora de ésteres de colesteril (CETP), a sua expressão foi avaliada durante a progressão da LV em hamster. Em hamsteres infectados com 2 x 107 amastigotas de L. (L.) infantum observamos aumento de triglicérides nos hamsteres com 55 dias (mediana = 294,0 mg/dL) e 90 dias (303,0 mg/dL ) de infecção comparados aos controles de 55 dias (119,0 mg/dL) e de 90 dias (117,0 mg/dL) (p <= 0,05). Os níveis de colesterol total e de HDL não apresentaram diferença significante entre controles e infectados com 30, 55 e 90 dias de infecção. A expressão de mRNA de PPAR? no fígado com 55 e 90 dias de infecção apresentou tendência de redução nos infectados. Já de CETP no fígado dos hamsteres com 55 dias de infecção, a expressão relativa (CT) estava reduzida nos infectados (0,08) comparados aos controles (1,69) (p <= 0,05) e de LPL no coração dos hamsteres com 90 dias de infecção também estava reduzida (1,43) com relação aos controles (2,61) (p <= 0,05). Há dados na literatura sugerindo a importância de lipídios para o desenvolvimento de amastigotas no hospedeiro vertebrado e é possível que as alterações dos níveis de lipoproteínas contribuam na progressão da infecção. Assim, avaliamos neste estudo o efeito da droga hipolipemiante ciprofibrato no controle do parasitismo na LV em hamster, sabendo-se que ciprofibratos atuam aumentando a expressão de PPAR? e a produção e atividade de LPL. O tratamento com ciprofibrato nos hamsteres com 55 dias de infecção gerou redução de triglicérides (123,0 mg/dL) em relação aos infectados não tratados (294,0 g/dL) (p <= 0,05), além dos níveis de triglicérides nos animais infectados não tratados terem aumentado quando comparados aos controles não tratados (119,0 mg/dL) (p <= 0,05). Houve também, redução de triglicérides nos animais não infectados tratados com ciprofibrato (89,0 mg/dL) comparando-se aos infectados não tratados (p <= 0,05). Os níveis de colesterol nos hamsteres não infectados tratados com ciprofibrato reduziram (53,5 mg/dL) em comparação aos infectados não tratados (93,0 mg/dL) (p <= 0,05). Já naqueles que foram infectados e tratados com ciprofibrato, constatamos redução de colesterol (53,5 mg/dL) quando comparados aos infectados não tratados (p <= 0,05). Os níveis de HDL não aumentaram com ciprofibrato e foram similares entre os hamsteres infectados não tratados e os controles não tratados. A carga parasitária no baço e no fígado não foi reduzida com ciprofibrato. Na leishmaniose visceral em hamster ocorrem alterações do metabolismo lipídico com aumento de triglicérides e redução da expressão da mRNA de LPL e CETP. O tratamento com ciprofibrato foi eficaz no controle das alterações de níveis de lipoproteínas. / In the active phase of visceral leishmaniasis (VL) changes occur in lipoprotein me-tabolism with reduction in HDL and increase in triglyceride (TG) levels. From these data, in this project we focused these changes during the progression of the infection and we approached some elements as their underlying factors. Since these changes may result from the reduction of the activity and the expression of the lipoprotein lipase (LPL), of the peroxisome proliferator-activated receptor alpha (PPAR?) and of the cholesteryl ester transfer protein (CETP), their expression were evaluated during VL progression in hamster. In 2 x 107 L. (L.) infantum amastigote-infected hamsters we observed an increase in the triglycerides in hamsters with 55 days (median = 294.0 mg/dL) and 90 days (303.0 mg/dL) of infection compared with controls of 55 days (119.0 mg/dL) and of 90 days (117.0 mg/dL) (p <= 0.05). The total cholesterol and the HDL levels did not present significant differences between control and in-fected groups at 30, 55 and 90 days of infection. The expression of mRNA of the PPAR in the liver with 55 and 90 days of infection tended to be reduced in infected animals. However the relative expression (CT) of CETP in the liver of hamsters with 55 days of infection was signicantly reduced in infected (0.08) compared with control animals (1.69) (p <= 0.05). The relative expression (CT) of LPL in the heart of hamsters with 90 days of infection was also reduced (1.43) in relation to controls (2.61) (p <= 0.05). There are data in the literature suggesting the importance of lipids for the development of amastigotes in vertebrate host and it is possible that the changes in the lipoprotein levels contribute for the infection progression. Therefore, we evaluated in this study the effect of the lipid-lowering drug ciprofibrate in the control of parasitism in VL in the hamster, knowing that ciprofibrate acts increasing the expression of the PPAR? and of the LPL production and activity. The treatment with ciprofibrate in infected hamsters at 55 days lead to the reduction of triglyceride level (123.0 mg/dL) in relation to non-treated infected animals (294.0 g/dL) (p <= 0.05). Further the triglyceride levels in the non-treated infected animals were in-creased when compared with untreated controls (119.0 mg/dL) (p <= 0.05). There was also reduction of triglyceride in ciprofibrate treated-non infected animals (89.0 mg/dL) compared with non-treated infected animals (p <= 0.05). The cholesterol lev-els were reduced in the ciprofibrate-treated non-infected hamsters (53.5 mg/dL) in comparison to the non-treated infected ones (93.0 mg/dL) (p <= 0.05). In the ciprofibrate-treated infected ones we found a reduction of cholesterol level (53.5 mg/dL) when compared with non treated infected animals (p <= 0.05). The HDL lev-els did not increase with ciprofibrate and they were similar between the non-treated infected hamsters and non-treated controls. The parasite load in the spleen and liver were not reduced with ciprofibrate. In the visceral leishmaniasis in hamster changes occur in the lipid metabolism with increase in the triglyceride level and the reduction of expression of mRNA of LPL and CETP. The treatment with ciprofibrate was ef-fective in the control of changes in the lipoprotein levels.