Na última década o emprego de nanotecnologia tem crescido exponencialmente em função das suas evidentes vantagens: maior eficácia terapêutica, menor toxicidade e liberação modificada do fármaco. Tais características permitem elevar os níveis do fármaco no compartimento intracelular, além de possibilitar sua liberação modificada no sítio específico. Essas vantagens vem ao encontro da otimização do tratamento da leishmaniose devido à falta de medicamentos seguros e de adequada atividade farmacológica. O objetivo do presente projeto constituiu-se na preparação e na avaliação das características físico-químicas da nanopartícula polimérica associada ao novo fármaco hidroximetilnitrofural (NFOH), desenvolvimento e validação do método analítico para a determinação da eficiência de encapsulação, avaliação a atividade leishmanicida in vitro em promastigotas, em macrófagos infectados por amastigotas de L. amazonensis e citotoxicidade do NFOH livre e nanoestruturado. As nanopartículas poliméricas de poli (butil cianoacrilato) (PBCA) obtidas apresentaram potencial zeta de -10,1 mV, tamanho médio de 151,5 nm, polidispersividade de 0,104 e distribuição unimodal muito próximos ao encontrado na literatura. O método analítico validado apresentou especificidade, linearidade, precisão, exatidão e robustez, mostrando-se adequado para a quantificação do NFOH em nanopartículas, o resultado final da eficiência de encapsulação foi de 64,5%. Os testes realizados em promastigotas e macrófagos infectados por amastigotas de L. amazonensis revelaram a maior atividade do fármaco nanoestruturado em relação ao fármaco livre e ao placebo. Os ensaios de citotoxicidade comprovaram que o fármaco, sistema nanoestruturado contendo NFOH e placebo apresentam baixa toxicidade. Logo, as nanopartículas obtidas contendo NFOH são uma alternativa promissora para o tratamento da leishmaniose. / In the last decade the use of nanotechnology has grown exponentially as a function of its obvious advantages: high therapeutic efficacy, lower toxicity and modified release of the drug. This feature allows raising the levels of the drug in the intracellular compartment, and enables the modified release of the drug in its specific site. These advantages come to meet the optimization of the treatment of leishmaniasis due to lack of drugs that are safe and appropriate pharmacological activity. The goal of this project consisted in the preparation and evaluation of physical and chemical characteristics of polymeric nanoparticle associated with new drug hidroxymethylnitrofurazone (NFOH), development and validation of analytical method for the determination of encapsulation efficiency, evaluating the leishmanicidal activity in vitro in promastigotes and in macrophages infected with amastigotes of L. amazonensis and finally cytotoxicity of free and nanostructured NFOH. The polymeric nanoparticles of poly(butyl cyanoacrylate) (PBCA) obtained showed zeta potential of -10.1 mV, average size of 151.1 nm, polydispersity of 0.104 and unimodal distribution very similar to that found in the literature. The validated method showed specificity, linearity, precision, accuracy and robustness, making it adequate for the quantification of NFOH nanoparticles, the final outcome of the encapsulation efficiency was 64.5%. Tests conducted on promastigotes and macrophages infected with amastigotes of L. amazonensis revealed the highest activity of nanostructured drug compared to free drug and placebo. The cytotoxicity assays showed that the NFOH, nanostructured system containing NFOH and placebo had low toxicity. Thus, the obtained nanoparticles containing NFOH are a promising alternative for the treatment of leishmaniasis.

A patogenia na leishmaniose visceral (LV) não é totalmente conhecida. Em LV em hamsteres avaliamos a participação de imunoglobulinas nas lesões. IgG foi detectada no sinusóide hepático, nos septos pulmonares e nos capilares glomerulares, em maior intensidade aos 30 e 45 dias pós-infecção (PI); C3 estava ausente, exceto no rim. Os dados não sendo compatíveis com a deposição de imunocomplexo, estudamos ultraestruturalmente a internalização de imunoglobulinas. No fígado e no rim a quantidade de imunoglobulina em célula endotelial era maior aos 30 dias PI em relação ao controle não infectado e no pulmão, aos 30 dias PI em relação aos 60 dias PI. Imunoglobulina internalizada por célula endotelial observada neste estudo na LV em hamsteres, marcadamente aos 30 dias PI, pode ser um mecanismo alternativo de lesão na LV / Pathogenesis of visceral leishmaniasis (VL) is not fully known. In VL in hamsters we evaluated the participation of immunoglobulins in the lesions. IgG was detected in the hepatic sinusoid, in the lung alveolar walls and in the glomerular capillaries in higher intensity at 30 and 45 days post-infection (PI); there were no C3, except in the kidney. Since the data were not compatible with immune complex deposition, we studied ultraestructurally the internalization of immunoglobulins. In the liver and in kidney the amount of immunoglobulin within endothelial cells was greater at 30 days PI than in non infected control, and in the lung at 30 days PI in relation to 60 days PI. Immunoglobulin internalized by endothelial cells observed in VL in hamsters, remarkably at 30 days PI, may be an alternative mechanism of lesion in VL

A espécie Leishmania (Viannia) shawi foi caracterizada recentemente pelo grupo de Lainson. Estudos recentes indicam o importante papel médico epidemiológico deste parasito no Brasil. Portanto, os objetivos do presente estudo foram caracterizar o modelo experimental murino desta infecção, purificar antígenos protéicos e avaliar seus graus de proteção após desafio. Para caracterizar o modelo murino de infecção, camundongos das linhagens BALB/c e C57BL/6 foram infectados na pata com formas promastigotas e os achados histopatológicos e imunológicos foram avaliados durante a evolução da infecção. Para os estudos de imunização foram utilizados 10 diferentes antígenos: três secretados/excretados pelas formas promastigotas de L. (V.) shawi, dois intracelulares solúveis das formas amastigotas (AgAma) e promastigotas (AgPro), e cinco frações protéicas purificadas a partir do antígeno intracelular solúvel das formas promastigotas. Estes antígenos foram utilizados para imunizar camundongos da linhagem BALB/c duas vezes, subcutaneamente no dorso. Após uma semana da última imunização, os animias foram desafiados com formas promastigotas. O desenvolvimento das lesões nos animais foram acompanhadas por seis ou oito semanas pós desafio (PD), quando os animais foram sacrificados para análise da carga parasitária e dos aspectos relacionados às respostas imune celular e humoral. Camundongos da linhagem BALB/c foram altamente susceptíveis à infecção, uma vez que as mudanças histopatológicas e da imunidade humoral foram mais pronunciadas nos camundongos BALB/c que em C57BL/6. Os antígenos secretados/excretados de baixa massa molecular induziram alta taxa de proteção em comparação aos animais não imunizados, já os antígenos secretados/excretados de média massa molecular protegeram intermediariamente os animais, possivelmente pela alta expressão de IFN-g e IL-4 nos linfócitos T CD8+. AgAma e AgPro tiveram uma resposta antagônica nos animais, pois o AgAma suprimiu a produção de IFN-g e IL-12, contudo houve maior produção de TGF-b, facilitando o aumento do parasitismo na pele e em linfonodos. A despeito da detecção de TGF-b nos animais imunizados com AgPro, houve um balanço entre a produção de citocinas, com a participação de IL-12 e IFN-g, que levou a um controle do parasitismo em pele. Através da purificação do AgPro foi visto que os antígenos F1 e F5 protegeram os animais da infecção na pele após desafio, e ainda F1 também protegeu os linfonodos destes animais. Os antígenos F3 e F4 levaram a exacerbação das lesões de pele. A identificação, por espectrometria de massa, do antígeno F1 revelou a presença de 67 componentes, sendo que a maioria deles não possui identificação. Ainda, o antígeno F1 protegeu duradouramente os animais associado à estimulação de linfócitos T CD8+ de memória, contudo a presença de baixos números de parasitos pode ser o reflexo da alta produção de IL-10. Estes dados indicam que o antígeno F1 pode representar um importante candidato vacinal contra a Leishmaniose Tegumentar Americana / Leishmania (Viannia) shawi specie was recently characterized by Lainson group. Currently, studies indicate important medical and epidemiological role of this parasite in Brazil. Therefore, the aims of this study were to characterize the experimental murine model of this infection, purify proteic antigens and evaluate their protection degrees after challenge. To characterize the murine model of infection, BALB/c and C57BL/6 mice were infected in the footpad with promastigote forms, and the histopathological and immunological findings were evaluated during the evolution of infection. For the immunization studies, 10 different antigens were used, as follow: three released/excreted by promastigote forms of L. (V.) shawi; two intracellular soluble antigens from amastigote (AgAma) and promastigote forms (AgPro), and 5 proteic fractions purified from soluble intracellular antigens from promastigote forms. These antigens have been used to immunize BALB/c mice twice, subcutaneously in the rump. After 1 week of last immunization, the animals were challenged. The lesion developments in animals were followed during either six or eight weeks post-challenge (PC), when the animals were sacrificed to evaluate the parasite load and aspects of cellular and humoral immune responses. BALB/c mice were the most susceptible to L. (V.) shawi infection, since the histopathological and humoral changes were higher in BALB/c than C57BL/6 mice. Secreted/excreted antigens of low molecular mass induced high protection rate compared to non-immunized mice, already mice immunized with secreted/released antigens of medium molecular mass showed mild protection, possibly caused by high expression of IFN-g and IL-4 by CD8+ T lymphocytes. AgAma and AgPro showed antagonic response in animals, since AgAma suppressed the IFN-g and IL-12 production, however high level of TGF-b has been detected, allowing the increasing of parasitism in the skin and lymph nodes. In spite of the detection of TGF-b in AgPro-immunized mice, there was a balance in the cytokines production, with the participation of IFN-g and IL-12, leading to parasite control in skin. Through the purification of AgPro, it was observed a protective effect of F1 and F5 antigens in the skin after challenge; in addition, F1 also protected the lymph nodes of BALB/c mice. Both F3 and F4 antigens exacerbated the skin infection. The identification, by mass spectrometry, revealed that F1 was composed by 67 components, and the majority has not been identified till now. Moreover, F1 induced long-lasting immunity in BALB/c mice, associated to generation of memory CD8+ T lymphocytes, however low parasitism could be the reflect of high production of IL-10. These data indicate which F1 antigen could be an important vaccine candidate against American Tegumentar Leishmaniasis

Os protozoários do gênero Leishmania são os agentes etiológicos da leishmaniose cutânea e visceral. A infecção é transmitida por insetos hematófagos, nos quais os parasitos se desenvolvem sob a forma promastigota. Nos hospedeiros mamíferos, incluindo a espécie humana, as formas encontradas são as amastigotas que proliferam nos macrófagos; estas células podem controlar a infecção produzindo radicais derivados do oxigênio e do nitrogênio. O óxido nítrico (NO) é um dos mais potentes radicais com atividade leishmanicida. Existem várias moléculas já descritas que liberam NO em meio aquoso ou quando adicionadas a suspensões celulares. São chamadas de doadoras de NO. Algumas destas vêm sendo estudadas pelo seu potencial terapêutico no tratamento das leishmanioses cutâneas. A molécula S-nitrosoglutationa (GSNO) pertence a um grupo de moléculas conhecido com S-nitroso-tióis e é um doador de NO relativamente estável. A GSNO havia sido previamente testada em culturas de formas promastigotas de L. amazonensis e causou a morte do parasito. O possível uso da GSNO na terapia das leishmanioses cutâneas demanda o conhecimento de suas ações sobre as formas amastigotas encontradas nos hospedeiros mamíferos. Terapias complementares aos antimoniais usados no tratamento da leishmaniose cutânea são necessárias porque estes são apenas injetáveis, têm efeitos colaterais e ocorrem altos índices de desistência do tratamento. O objetivo do trabalho foi analisar o efeito da molécula GSNO nas culturas de células THP-1 (linhagem de monócitos humanos leucêmicos) infectadas com L.major e o efeito da sua administração tópica diretamente na lesão ulcerada leishmaniótica de camundongos infectados. Os experimentos com células THP-1 infectadas com L. major e tratadas com GSNO, mostram marcada redução do parasitismo intracelular, dose dependente, em comparação às culturas sem tratamento. O tratamento com GSNO foi testado em camundongos Balb/c 8 infectados com L. major e em camundongos C57BL/6 desprovidos do gene de IFN<font face=\"symbol\">g- (Knockout de IFN ou IFN-<font face=\"symbol\">g KO) infectados com L. braziliensis. Grupos de animais foram infectados no dorso e após 60 dias iniciou-se o tratamento tópico com GSNO diluída em PBS, em GEL F127 ou com os respectivos veículos, como controles; ainda, outros grupos foram tratados sistemicamente (via endovenosa) com o antibiótico com ação leishmanicida, anfotericina B, ou com anfotericina B associada à aplicação tópica de GSNO. Foram feitas duas medições semanais das lesões. Decorridos aproximadamente 60 dias após o início do tratamento, os animais foram sacrificados e retirados o linfonodo drenante (inguinal superficial) e a lesão para fazer a quantificação parasitária. O tratamento tópico da infecção por L.major com a molécula GSNO reduziu o tamanho da lesão cutânea, chegando a se observar fechamento da úlcera em alguns animais; a carga parasitária no linfonodo drenante e/ou na lesão também sofreu redução. Nos camundongos IFN-<font face=\"symbol\">g KO infectados por L. braziliensis, também ocorreu inibição da progressão da lesão pelo tratamento local com GSNO em comparação ao grupo não tratado. Como conclusão, conseguimos demonstrar que GSNO apresenta efeito leishmanicida sobre formas amastigotas de L. major em cultura celular e reduz a lesão cutânea causada por L.major ou por L. braziliensis em comparação aos grupos controle. / Protozoa of the genus Leishmania are the etiological agents of cutaneous and visceral leishmaniasis. The infection is transmitted by hematophagous insects in which the parasite multiplies and differentiates as promastigotes. In the mammalian hosts, including man, the parasite proliferates as amastigotes inside macrophages; production of reactive oxygen or nitrogen intermediates (ROI and RNI) by these cells can control the infection. Nitric oxide (NO) is a very toxic RNI active against leishmania. The are many molecules that liberate NO in solution or when added to cellular suspensions. They are collectively called NO donors. A few of them have been studied because of their potential therapeutic use in cutaneous leishmaniasis. The molecule S-nitrosoglutathione (GSNO) belongs to the S-nitroso-thiols and is a relatively stable NO donor. GSNO has been previously tested and caused the death of L. amazonensis promastigotes in liquid culture. A putative application of GSNO in the treatment of cutaneous leishmaniasis requires the understanding of its activities on amastigote forms which are the parasite forms found in the mammalian host. Because the classical leishmaniasis treatment relies on injectable antimonial drugs which have many side effects, many patients abandon the treatment. Therefore, additional therapy to accelerate the cure is needed as well as new drugs are much needed. The aim of the present work is to analyze the effect of the molecule GSNO in cultures of THP-1 cells (a leukemia human monocyte cell line) infected with Leishmania major as well as the effect of administering it topically into the lesion of infected mice. The experiments done on L. major-infected THP-1 cells showed marked dose-dependent reduction of parasitism when compared to untreated infected cells. The topical treatment with GSNO was done in BALB/c mice infected with L. major and in C57BL/6 mice deprived of the IFN-<font face=\"symbol\">g gene (IFN- <font face=\"symbol\">g KO) infected with L. braziliensis. Groups of mice were infected in the shaven dorsal skin and 60 days later the topical treatment with GSNO dissolved in PBS, in GEL F127 was started. Still other groups were treated systemically (i.v.) with Amphotericin B which is leishmanicidal or with Amphotericin B associated to topically applied GSNO. The lesions were measured twice a week. After 60 days the mice were killed and the draining lymph node and the lesion were removed for quantifying the parasite numbers. The topical treatment of L. major-induced ulcer with GSNO reduced the size of the ulcer leading in some mice to complete healing; the parasitic loads in the draining lymph node or in the lesion were also reduced. In L. braziliensis-infected IFN-<font face=\"symbol\">g KO mice, inhibition of lesion growth also occurred in the mice topically treated with GSNO in comparison to the untreated control group. In conclusion we showed that GSNO is leishmanicidal to L. major intracellular amastigotes and that the topical treatment reduces the size of the lesion caused in mice by L. major or by L. braziliensis in comparison to the control groups.

A leishmaniose tegumentar americana (LTA) é causada por várias espécies de protozoários do gênero Leishmania e compreende um grupo de doenças que apresentam características clínicas, histopatológicas e imunológicas distintas. O diagnóstico é realizado em base epidemiológica, clínica e patológica, confirmadas por exames parasitológicos positivos e demonstração de hipersensibilidade retardada a antígeno de leishmânia. Os testes sorológicos para o diagnóstico, utilizados até o momento, apresentam várias limitações e por isso é de grande importância identificar proteínas recombinantes de leishmânia, para que sejam testadas como potenciais antígenos para o desenvolvimento de técnicas para o diagnóstico da LTA. Neste estudo, foram utilizadas duas proteínas recombinantes de leishmânia altamente conservadas, Lb8E e Lb6H, derivadas de Leishmania (Viannia) braziliensis (Lb), avaliando a sua capacidade para detectar anticorpos no soro de vários grupos de pacientes por teste imunoenzimático (ELISA). Os antígenos recombinantes reagiram com amostras de 83,3% e 100,0% (Lb6H) dos pacientes com LTA e 95,4% (Lb8E) e 89,4% (Lb6H) dos soros de pacientes de leishmaniose visceral (LV). Em amostras de indivíduos saudáveis, as reações com Lb8E e Lb6H foram altamente específicas. Soros de 219 pacientes com LTA infectados com diferentes espécies de leishmânia prevalentes no Brasil (Leishmania (Leishmania) amazonensis, L. (Viannia) braziliensis, L. (V.) guyanensis e L. (V.) shawi) e amostras de pacientes com outras infecções parasitárias foram avaliados para a presença de anticorpos anti-rLb6H, obtendo-se sensibilidade de 100,0% nas 219 amostras de LTA e especificidade geral de 93,9% (considerando 68 indivíduos saudáveis e 213 pacientes com outras doenças infecciosas). Além disso, as amostras de outras doenças infecciosas indicaram provável ausência de reação cruzada, pois apenas uma minoria de amostras de pacientes com doença de Chagas possuía anticorpos contra rLb6H e essas respostas foram baixas. Enfim, os resultados obtidos sugerem que a técnica de ELISA utilizando o antígeno rLb6H pode ser consideradoa para uso na rotina do diagnóstico sorológico da LTA. / American tegumentary leishmaniasis (ATL) is caused by various species of protozoan of the genus Leishmania and comprises a group of diseases that present distinct clinical, histopathological and immunological characteristics. The diagnosis is performed based on epidemiological, clinical and pathological features, supported by positive parasitological tests and presence of delayed hypersensitivity to Leishmania antigens. The serological tests used to date have several limitations and therefore it is of great importance to identify recombinant proteins from Leishmania so that they can be tested as potential antigens for the development of techniques for the diagnosis of ATL. In this study, two highly conserved Leishmania recombinant proteins, Lb8E and Lb6H, derived from Leishmania (Viannia) braziliensis (Lb), were used, evaluating their ability to detect antibodies in the serum of several groups of patients by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Recombinant antigens detected 83.3% (Lb8E) and 100.0% (Lb6H) ATL patients, and 95.4% (Lb8E) and 89.4% (Lb6H) visceral leishmaniasis (VL) patients. These reactions with Lb8E and Lb6H were highly specific in healthy subjects. Sera from ATL patients infected with different species of Leishmania, prevalent in Brazil, (Leishmania (Leishmania) amazonensis, L. (Viannia) braziliensis, L. (V.) guyanensis and L. (V.) shawi) and samples from patients with other parasitic infections were evaluated for the presence of anti-rLb6H antibodies. In 219 ATL, the sensitivity was 100.0% e the general specificity, considering 68 healthy subjects and 213 patients with other infectious diseases. In addition, samples from other infectious diseases indicated a probable lack of cross-reactivity, as only a minority of samples from patients with Chagas disease had antibodies against rLb6H and all of these responses were low. Finally, the results suggest that the ELISA using rLb6H antigen may be considered for routine use for serological diagnosis of ATL.

Uma análise espaço-temporal da leishmaniose visceral americana (LVA) humana no município de Bauru foi conduzida baseada em 239 casos diagnosticados entre junho de 2003 a outubro de 2008. O georreferenciamento, tomando como unidade os setores censitários, foi realizado a partir de informações cedidas pela Secretaria de Saúde de Bauru a respeito do endereço residencial dos pacientes acometidos pela enfermidade. A análise da distribuição espacial da doença demonstrou que os casos ocorreram especialmente na área urbana do município. As incidências cumulativas anuais de LVA, considerando os casos adotados por ano e as respectivas projeções populacionais, foram calculadas, evidenciando que a taxa mais elevada foi observada em 2006. Tal fato foi confirmado pelo delineamento da série histórica, que também derivou o cálculo da tendência, demonstrando que esta foi positiva durante o período analisado. O índice sazonal obtido foi confrontado com dados referentes às médias mensais de precipitação pluviométrica e temperatura do município, o que nos permitiu inferir que meses que obtiveram índices com valores superiores a um, eram, de maneira geral, precedidos por períodos chuvosos. A variável temperatura, por sua vez, apesar de provavelmente estar relacionada à ocorrência da enfermidade na região, aparentemente não exerceu influência na sazonalidade da doença por se apresentar sem oscilações importantes no período. A análise de clusters, utilizando o método estatístico espaço-temporal scan, detectou um provável aglomerado localizado nas regiões sudoeste e central do município no ano de 2006. Uma análise descritiva univariada, comparando setores censitários que apresentaram LVA com relação aos que não relataram casos da doença, foi conduzida. Apesar da diferença significativa observada entre os dois grupos, novos estudos são necessários para se confirmar a hipótese de que variáveis socioeconômicas são prováveis fatores de risco para a infecção na região. / A space-time analysis of human American visceral leishmaniasis (AVL) was carried out based on 239 cases diagnosed from June 2003 through October 2008. The georeferencing, taking the census tracts as units, was performed according to information supplied by the Bauru Health Department about AVL patient addresses. The disease spatial analysis showed that cases occurred specially at the urban area of the city. AVL annual incidence rates, considering adopted cases per year and the respective projected population, were calculated, demonstrating that the highest rate was observed in 2006. It was confirmed by the time series analysis, which also resulted the tendency calculation, showing that it was positive during the analyzed moment. The obtained seasonal indices were confronted with data about the citys average rainfall and temperature, which allowed us to infer that months with indices higher than one, were, generally, preceded by rainy periods. The temperature, on the other hand, although is probably related to the infection occurrence at the region, seemingly did not exert influence on the disease seasonality because it was presented without important fluctuations in the period. The cluster analysis, using scan space-time statistics, detected a most likely cluster located in the Southwest and Central city side in 2006. A univariate descriptive analysis, comparing census tracts that presented AVL with those that did not report case disease, was carried out. Although the significant difference observed between both groups, new researchers are needed to confirm the hypothesis that socioeconomic variables were likely infection risk factors in the region.

Submitted by isabela.moljf@hotmail.com (isabela.moljf@hotmail.com) on 2018-08-06T18:07:50Z No. of bitstreams: 0 / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2018-08-06T18:12:47Z (GMT) No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2018-08-06T18:12:47Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-03-30 / FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Por análises in silico, um domínio B conservado e antigênico foi previamente identificado em nucleosídeo trifosfato difosfohidrolases (NTPDases) de plantas e parasitos. O r-potDomB, um recombinante derivado do domínio B (r78-117) da apirase de batata, foi obtido por expressão heteróloga, e a sua reatividade com anticorpos policlonaisanti-apirase de batata confirmaram a existência de epitopos indutores de resposta imune humoral em mamíferos. A clonagem do gene da NTPDase1 de Leishmania amazonensis (LamNTPDase1; NCBI: AFJ22627.1) e as análises in silico reforçaram a hipótese de conservação do domínio B de NTPDases. O r-potDomB, os peptídeos sintéticos LbB1LJ e LbB2LJ derivados do domínio B de NTPDase1 de Leishmania, e os anticorpos produzidos contra estas biomoléculas, foram usados como ferramentas moleculares para estudos específicos da NTPDase1 de L. amazonensis e da leishmaniose. Por “Western blots”, a NTPDase1 foi identificada como bandas de 48 e 63 kDa em frações de membrana, microssomal e flagelo de promastigotas. Por análise imunocitoquímicaultraestrutural, os anticorpos localizaram a NTPDase1 na superfície de membrana plasmática, núcleo, mitocôndria e cinetoplasto, bolsa flagelar e flagelo, confirmando sua ampla distribuição neste parasito. Análises in silico sugeriram as possíveis modificações pós-traducionais da NTPDase1, incluindo a sua conjugação com proteína SUMO. Os polipeptídeos de 48 e 63 kDa e um co-migrante de 12 kDa foram isolados de promastigotas por eletroforese em gel não-desnaturante. Por “Western blots” e espectrometria de massas, a identidade da NTPDase1 foi confirmada nospolipeptídeos de 48 e 63 kDa. Por espectrometria de massas, o polipeptídeo de 12 kDa foi identificado como pertencente à família de proteínas SUMO e, também, adicionado aopolipeptídeo de 63 kDa. Os polipeptídeos de 63 kDa e 12 kDa, mas não o de 48 kDa, foram reconhecidos em “Western blots” pelo soro imune anti- SUMO1, sugerindo a ligação entre NTPDase1 e SUMO, uma modificação descrita pela primeira vez entre os membros da família das NTPDases. Camundongos BALB/c foram infectados com promastigotas, e os anticorpos destes animais reconheceram a NTPDase1 pura, mas não SUMO, confirmando sua antigenicidade. Durante a progressão da doença, alta reatividade entre r-potDomB, LbB1LJ ou LbB2LJ e anticorpos IgG2a dos camundongos infectados foi observada aos 40 dias pós-infecção, revelando a antigenicidade do domínio B e a sua habilidade de induzir a produção deste subtipo nos estágios iniciais da doença. A reatividade de IgG1 foi significativamente maior aos 90-120 dias pós-infecção, coincidindo com o estágio mais ativo da doença, sugerindo participação do domínio em eventos imunoregulatórios. O r-potDomB induziu reação de hipersensibilidade tardia em camundongos Suíços, uma resposta imune celular, com elevação concomitante dos níveis de IgG2a e IFN-y. O r-potDomB, na ausência de adjuvante, usado na préimunização de camungondos Suíços infectados com amastigotas, estimulou a produção de IgG2a e IFN-y, e promoveu proteção parcial contra a progressão da leishmaniose como observado por medida de edema de patas e análises histopatológicas.Os resultados estimulam o aproveitamento biotecnológico do rpotDomB, ou derivados desta biomolécula, em formulações e em protocolos experimentais de imunoterapia e/ou vacinação contra leishmanioses. / By in silico analysis, an antigenic conserved B domain was previously identified within nucleoside triphosphate diphosphohydrolases (NTPDases) of plants and parasites. The r-potDomB, a recombinant belonging to the conserved B domain (r78- 117) from the potato apyrase, was obtained by heterologous expression, and its reactivity with polyclonal anti-potato apyrase antibodies confirmed the existence of epitopes which induce humoral immune response in mammalian. The cloning of the gene from the Leishmania amazonensisNTPDase 1 (LamNTPDase1; NCBI AFJ22627.1) and in silico analysis reinforced the hypothesis of B-domain conservation within NTPDases. The r-potDomB, synthetic peptides LbB1LJ and LbB2LJ derived from the B-domain from LeishmaniaNTPDase 1, and the antibodies raised against these biomolecules, were used as molecular tools for specific studies of the L. amazonensisNTPDase 1 and leishmaniasis. By Western blots, theNTPDase 1 was identified as bands of 48 and 63 kDa in membrane, microsomal and flagellar fractions of promastigotes. By ultrastructural immunocytochemical, the antibodies localized the NTPDase 1 at the surface of plasma membrane, nucleus, mitochondria and kinetoplast, at flagellar pocket and flagellum, confirming its widespread distribution in this parasite. In silico analysis suggested possible post-translational modifications of the NTPDase 1, including its conjugation with SUMO protein. The polypeptides of 48 and 63 kDa and one co-migrant of 12 kDa were isolated of promastigotes by non-denaturing gel electrophoresis. By Western blots and mass spectrometry, the identity of NTPDase1 in the polypeptides of 48 e 63 kDa was confirmed. By mass spectrometry, the polypeptide of 12 kDa was identified belonging to the SUMO protein family and, also, added to the polypeptide of 63 kDa. The polypeptides of 63 and 12 kDa, but not 48 kDa, were recognized in Western blots by immune serum anti-SUMO1, suggesting binding between NTPDase 1 and SUMO, a modification described for the first time among members of the NTPDase family. BALB/c mice were infected with promastigotes, and the antibodies from these animals recognized the pure NTPDase, but not SUMO, confirming its antigenicity. During disease progression, high reactivity between r-potDomB, LbB1LJ or LbB2LJ and IgG2a antibodies of the promastigote-infected mice was observed at 40 days post-infection, revealing both the B-domain antigenicity and its ability for induce the production of this subtype in early disease stages. The IgG1 reactivity was significantly higher at 90-120 days post-infection, coinciding with the most active stage of the disease, suggesting participation of the domain in immuneregulatory events. The r-potDomB induced delayed type-hypersensitivity reaction in Swiss mice, a cellular immune response, with a concomitant increase in the levels of IgG2a and IFN-y. The r-potDomB, in the absence of adjuvant, used in pre-immunization of amastigotes-infected Swiss mice, stimulated the production of IgG2a and IFN-y, and promoted partial protection against leishmaniasis progression, as observed by measuring of footpad swelling and histopathological analysis. The results stimulate biotechnological use of the r-potDomB, or derivatives of this biomolecule, in formulations and experimental protocols of immunotherapy and/or vaccination against leishmaniasis.

Orientadores: Selma Giorgio, Fernanda Ramos Gadelha / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-25T14:07:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Codonho_BarbaraSantoni_M.pdf: 2501497 bytes, checksum: d7ceeef1653b2df4a7d52b28ebd16543 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: As leishmanioses são um conjunto de doenças causadas pelo protozoário do genêro Leishmania, que atingem milhões de pessoas por ano. O tratamento é realizado primeiramente com antimoniais pentavalentes e, em casos de resistência, são indicadas a pentamidina ou anfotericina B. Todos estes fármacos são tóxicos e induzem efeitos colaterais nos pacientes. Devido a dificuldades no tratamento, o estudo de moléculas presentes no parasita se torna importante. Dentre essas, as heat shock proteins 70 (HSP70) são proteínas essenciais para o ciclo de vida da Leishmania. Durante a passagem do vetor para o hospedeiro vertebrado, o parasita encontra vários tipos de estresses que induzem a uma maior expressão da HSP70. Nesse projeto avaliou-se os efeitos da superexpressão da HSP70 em Leishmania (Leishmania) amazonensis, comparando-se parasitas que superexpressam a proteína HSP70 (pTEX-HSP70) com parasitas contendo somente o vetor (pTEX). Os resultados mostraram que os promastigotas transfectados pTEX e pTEX-HSP70 apresentaram vários aspectos ultraestruturais semelhantes aos não transfectados (WT), porém mostraram ser maiores e com o tamanho da área nuclear maior. A superexpressão da proteína HSP70 conferiu aos parasitas uma fase estacionária de proliferação mais estendida do que a observada em parasitas pTEX. Uma maior resistência e capacidade proliferativa foram observadas nos parasitas pTEX-HSP70 quando submetidos a diferentes condições de estresses (tratamentos com H2O2, choque térmico e ambiente hiperbárico), em relação a parasitas pTEX. Os resultados também mostraram que parasitas pTEX e pTEX-HSP70 infectam culturas de macrófagos peritoneais e macrófagos humanos derivados de sangue periférico, em taxas (% de infecção e número de amastigotas/macrófago) semelhantes a de parasitas WT. O processo de infecção em camundongos BALB/c mostrou que o tamanho da lesão induzida pelos parasitas pTEX e pTEX-HSP70 na pata foi diferente nas primeiras semanas, mas semelhante no curso final da infecção. Adicionalmente, as cargas parasitárias nas lesões dos camundongos BALB/c infectados com os parasitas pTEX e pTEX-HSP70 foram semelhantes, mas maiores que as cargas parasitárias nas lesões induzidas por WT. Além disso, os baços dos camundongos infectados com os parasitas pTEX e pTEX-HSP70 apresentaram visceralização. Ensaios da bioenergética destes promastigotas mostraram que parasitas pTEX-HSP70 apresentam maiores taxas de consumo de O2 do que parasitas pTEX, apesar de apresentarem produção de ATP semelhante. A produção de superóxido nos parasitas pTEX-HSP70 e pTEX foram similares, apesar da liberação de H2O2 ser bem inferior nos de parasitas pTEX-HSP70. Os resultados obtidos indicam que a superexpressão da proteína HSP70 protege a L.(L.) amazonensis de situações de estresse imediato, mas não interfere com a sua capacidade infectiva / Abstract: Leishmaniasis are a group of diseases caused by the protozoan genus Leishmania, which affect millions of people each year. The treatment is performed primarily with pentavalent antimony and resistance cases are indicated pentamidine or amphotericin B. All these drugs are toxic and induce side effects in patients. Due to difficulties in treatment, the study of molecules present in the parasite becomes important. Among these, the heat shock protein 70 (HSP70) proteins are essential for the life cycle of Leishmania. During the transition from vector to vertebrate host, the parasite finds various types of stresses that induce a higher expression of HSP70. In this project was evaluated the effects of overexpression of HSP70 in Leishmania (Leishmania) amazonensis, comparing parasites that overexpressing HSP70 (pTEX-HSP70) protein with parasites containing the empty vector (pTEX). The results showed that transfected promastigotes pTEX and pTEX-HSP70 showed several similar ultrastructural aspects similar to promastigotes of L.(L.) amazonensis untransfected (WT), but proved to be larger and the size of the largest nuclear area. Overexpression of HSP70 protein gave the parasites a stationary phase of proliferation more extended than that observed in parasites pTEX. Higher strength and better proliferative capacity were observed in parasites pTEX-HSP70 when submitted to different stress conditions (hydrogen peroxide, heat shock treatments and hyperbaric environment), in relation to parasites pTEX. The results also showed that pTEX and pTEX-HSP70 parasites infect cultures of peritoneal macrophages and human peripheral blood-derived macrophages in rate (% infection and the number of amastigotes / macrophage) similar to WT parasites. The process of infection in BALB/c mice showed that the size of the induced parasitic pTEX and pTEX-HSP70 foot injury was different in the first few weeks but similar in the final course of infection. Additionally, parasitic loads on the lesions of BALB/c mice infected with pTEX and pTEX-HSP70 parasites were similar, but larger than the parasitic loads in lesions induced by WT. Moreover, spleens from infected with pTEX and pTEX-HSP70 parasites mice showed visceralization. Assays of bioenergetics promastigotes showed that these pTEX-HSP70 parasites consume more O2 than pTEX parasites, despite showing similar ATP production. Superoxide production in parasites pTEX and pTEX-HSP70 were similar, despite the release of hydrogen peroxide is considerably lower than pTEX-HSP70 parasites. The results indicate that overexpression of HSP70 protein protect L.(L.) amazonensis in immediate situations of stress, but does not interfere with its infective capacity / Mestrado / Imunologia / Mestra em Genética e Biologia Molecular

[pt] A administração de antimoniais no tratamento da leishmaniose é uma rara oportunidade para estudar o metabolismo de antimônio e das suas espécies químicas no corpo humano. No presente trabalho, a técnica de espectrometria de massa (ICPMS), acoplada ou não à cromatografia iônica (IC) e à geração de hidretos (HG), foi utilizada para determinação das concentrações de antimônio total e de suas espécies químicas, Sb(III), Sb(V) e trimetilantimônio (TMSbV) em amostras clínicas de pacientes com leishmaniose e/ou de macacos Rhesus (Mucaca mulatta) tratados com antimoniato de meglumina (AM). Diferentes regimes terapêuticos foram avaliados, incluindo a administração de doses baixa e alta (5 mg ou 20 mg de Sb(V) por kg de massa corpórea). A concentração total de Sb foi determinada após a decomposição de amostras por HNO3/H2O2. Análises de especiação foram realizadas em amostra de plasma e urina, através do acoplamento em linha da CI ao instrumento de ICPMS. Duas colunas de troca aniônica PRP-X100 foram utilizadas para a separação de espécies empregando o EDTA (eluição isocrática: 4,7 mmol L-1, 2,5% v/v metanol, pH 4,7) ou tampão de EDTA/fosfato (eluição com variação abrupta de eluente: 1o. eluente - 20 mmol L-1 EDTA + 2 mmol L-1, pH 4,5; 2o. eluente - 50 mmol L-1 (NH4)2PO4, pH 8,3) como fase móvel. As características de desempenho de todos os métodos foram avaliadas e serão apresentadas. Testes de estabilidades mostraram que as espécies de antimônio estudadas são suficientemente estáveis permitindo análises de especiação dentro de 24 horas após a coleta. Em humanos, assim como em macacos Rhesus, as concentrações de antimônio em amostras de urina e/ou plasma coletadas após o período de administração de AM, mostraram uma rápida cinética inicial de excreção (t1/2 ~ 3 dias) da droga, seguida de duas fases mais lentas. Determinou-se concentrações de Sb significativamente maiores em frações de hemácias do que nas amostras de plasma correspondentes, com exceção da fase inicial de administração da droga (primeiras 12 horas). A bioredução de Sb(V) a Sb(III) foi observada e confirmada como um importante processo metabólico durante a fase de eliminação. Nenhuma evidência de formação de TMSb (V) foi obtida em nossos estudos. As concentrações de antimônio em amostras de tecidos de macacos Rhesus coletadas aproximadamente 60 dias após a última administração de AM foram maiores na tireóide, seguida por fígado e baço. As concentrações no fígado foram pelo menos 1000 vezes maiores que a concentração basal. Amostras de cabelos/pelos e unhas de pacientes e símios tratados com AM também apresentaram altas concentrações, as quais corresponderam ao histórico de administração da droga e também mostraram que a incorporação de Sb nestes tecidos é acumulativa, mesmo após o fim da administração de AM. Em cabelos, mesmo após mais de 300 dias do fim do tratamento as concentrações de Sb não retornaram ao nível basal. / [en] Clinical applications of antimonials in the treatment of leishmaniasis are a unique opportunity to investigate the metabolism of antimony and its species in the human body. In this work, inductively coupled plasma mass spectrometry (ICPMS), without or in combination with ion chromatography (IC) and flow injection hydride generation (FI-HG), has been used for the determination of total antimony concentrations [Sb] and three of its expected species, Sb (III), Sb (V) and trimethyl antimony (TMSbV), in clinical samples of leishmaniasis patients and/or of rhesus monkeys (Mucaca mulatta) treated with meglumine antimoniate (AM). Different drug administration schemes were evaluated, including low and high dose administration (5 mg or 20 mg of Sb5+ per kg of body mass). Total [Sb] was assayed after wet decomposition of the samples by HNO3/H2O2. Speciation analysis was performed on plasma and urine samples using IC on-line coupled to the ICPMS instrument. Two PRP-X100 anion exchange columns were used for species separation employing EDTA (isocratic elution: 4.7 mmol L-1, 2.5% v/v methanol, pH 4.7) or EDTA/phosphate buffer (step elution: 1st eluent - 20 mmol L-1 EDTA + 2 mmol L-1 KHP, at pH 4.5; 2nd eluent - 50 mmol L-1 (NH4)2HPO4 at pH 8.3) as the mobile phases. Performance characteristics of all methods were evaluated and are presented. Stability tests showed that all studied antimony species are sufficiently stable to allow speciation analysis within 24 hours after collection. In humans, as well as in rhesus monkeys, the concentrations of antimony in urine and/or plasma samples measured after the administration period of MA, showed rapid excretion kinetics (t1/2 ~ 3 days) of the drug followed by two slower ones. Significantly higher concentrations of [Sb] were measured in erythrocyte fractions than in corresponding plasma samples, excepting the very initial phase of drug administration (first 12 hours). Bio-reduction of Sb5+ to Sb3+ was observed and confirmed as an important metabolic process during the slow elimination phase. No evidence for the formation of TMSbV was so far obtained in our studies. Antimony concentrations in tissue samples of rhesus monkeys 60 d after the last AM administration were highest in thyroid, followed by liver and spleen. Liver concentrations were at least 1000 times the basal concentrations. Hair and nail samples from treated patients and monkeys had also very high Sb concentrations, which matched drug administration history and showed also that incorporation of Sb into these tissues is continuing, even after ceasing AM application. In human hair, more than 300 days are required for the return of antimony concentrations to basal levels.

A cutaneous leishmaniasis is the most common clinical form of human disease caused by parasite of the genus Leishmania. They are transmitted between the hosts by haematophagous females of dipteran sand flies of the genus Phlebotomus in the Old World and Lutzomyia in the New World. One of the major agents of cutaneous leishmaniasis in the Old World is Leishmania major. The disease caused by this species is a zoonosis where rodents act as reservoir host. The parasite long time circulates between reservoir rodents and sand flies, while humans are infected only accidentaly in the focus of infection. Rodents of the genus Arvicanthis belongs to the most abundant in the African continent. The genus has evolved in Ethiopia from where it expanded to a major part of Sub - Saharan Africa and the delta of the river Nile. These rodents are very abundant in endemic locations of cutaneous and visceral leishmanias and fulfil many reservoir host criterias including repeated field findings of individuals infected by L. major and another Leishmania species in nature. However, their role in the disease cycle remains to be confirmed. A. neumanni used in this study is an East African species spread from Ethiopia and Somalia to Kenya and Tanzania. Animals were experimentally infected with three different L. major...