Microesferas lipídicas (ML) são excelentes sistemas de delivery de drogas e são relativamente estáveis. O Objetivo deste trabalho foi desenvolver um sistema capaz de encapsular proteínas antigênicas da membrana de L. amazonensis. Proteínas de membrana são importantes na formulação de vacinas, uma vez que estas proteínas são os primeiros componentes celulares a entrarem em contato com a célula hospedeira, provocando e mediando a resposta imune. Esta é uma ferramenta útil para evitar ou inativar a invasão do parasita. As ML são constituídas por óleo de soja (OS), dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), colesterol e extrato de proteínas solubilizadas (EPS) (previamente tratadas para remoção do detergente). Primeiramente foram ensaiadas formulações de ML contendo álcool polivinílico (PVA). Estudos de microscopia eletrônica de varredura (MEV) mostraram que as ML são formadas quando PVA 3% (p/v) é usado na formulação. Além disso, foi feito marcação das proteínas com isotiocianato de fluoresceína (FITC) e a microscopia de fluorescência revelou a presença de estruturas esféricas fluorescentes, o qual indicou a encapsulação das proteínas na região lipofílica das ML. A presença do PVA na formulação das ML acarretou em algumas limitações cruciais para a continuidade da nossa pesquisa, levando a substituição deste pelo glicerol. Com o objetivo de otimizar nossa formulação foram avaliadas cinco diferentes formulações contendo glicerol 2,5% (p/v). Nestas formulações foram avaliadas as relações molares de DPPC:Colesterol:OS. As partículas formadas apresentaram um diâmetro médio de 200nm, baixa polidispersão, e estabilidade por um período de 30 dias, de acordo com ensaios de espalhamento de luz dinâmico. Ensaios de gradiente de densidade de sacarose das ML mostraram que proteínas e lipídios se encontram juntos no gradiente de sacarose (5-50% p/v) sugerindo que a preparação de ML foi homogênea e que as proteínas estão interagindo com este sistema lipídico. Termogramas obtidos por calorimetria diferencial de varredura (DSC) corroboram com a formação de um sistema de ML-proteína estáveis, além de fornecer indícios que as proteínas se encontram localizadas no núcleo oleoso das ML. Os resultados mostraram que foram encapsulados 85% das proteínas do EPS nas microesferas, e que estas não perderam sua atividade antigênica mesmo após todo o complexo processo de preparação do sistema. Estudos de viabilidade dos macrófagos peritoneais murinos e o ensaio de geração de nitrito mostraram que o sistema ML associado às proteínas não apresenta efeito citotóxico para os macrófagos e ainda estimula a produção de NO nos mesmos. Com isso, podemos sugerir que ML contendo proteínas antigênicas de membrana de L. amazonensis parece ser um promissor sistema para terapia da leishmaniose. / Lipid microspheres (LM) are excellent drug delivery systems and they are also relatively stable. The aim of this work was to develop a lipid-based system to encapsulate antigenic membrane proteins from Leishmania amazonensis. Membrane proteins are important for vaccine formulation because these proteins are the first ones to get in contact with the host cell, triggering the cell mediated immune response. This is a useful tool to avoid or to inactivate parasite invasion. LM are constituted by soybean oil (SO), dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC), cholesterol and solubilized protein extract (SPE) (previously treated to remove detergent). First, the LM formulations containing polyvinylic alcohol (PVA) were assayed. Scanning electronic microscopy (SEM) studies have shown that LM are formed when 3% PVA (w/v) is used in the formulation. Besides, proteins were marked with fluorescein Isothiocyanate (FITC) and the fluorescence microscopy showed the presence of fluorescent spherical structures, which indicated protein encapsulation in the lipophilic region of the LM. The presence of PVA in the LM formulation has caused some crucial limitations for the continuity of the research, leading to its substitution for glycerol. In order to optimize the system, five different formulations containing 2.5% glycerol (w/v) were evaluated for DPPC:Cholesterol:OS molar ratios. The particles formed (LM-protein) presented an average diameter of 200 nm, low polydispersion and good stability for a period of 30 days, according to dynamic light scattering assays. Isopycnic density gradient centrifugation of LM-protein showed that proteins and lipids floated in the sucrose gradient (5-50% w/v) suggesting that the LM preparation is homogeneous and that the proteins are interacting with these systems. Thermograms obtained by differential scanning calorimetry (DSC) corroborate with the formation of a stable LM system, besides giving indication that proteins are located in the oily LM core. The results show that 85% of the SPE proteins were encapsulated in the LM without loosely their antigenic activity even after the system preparation process. Viability studies of the peritoneal macrophage murines and the nitrate assay generation have shown that system does not have a cytotoxic effect for the macrophages and it yet stimulate their NO production. Therefore, we conclude that LM, encapsulated with L. amazonensis membrane antigenic proteins seems to be a promising system for for therapy of Leishmaniasis

Orientador: Maria Isabel Nogueira Cano / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-23T08:15:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Perez_ArinaMarina_D.pdf: 16850057 bytes, checksum: c8339559e1407d1727e423826290d6c8 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: LaRbp38 e uma proteína exclusiva de protozoários tripanosomatideos, entre os quais está os agentes etiológicos da leishmaniose, uma doença endêmica presente em diversas regiões do Brasil. LaRbp38 e codificada por um gene nuclear, que parece exercer diferentes funções nas maquinarias de replicação nuclear e mitocondrial. Foi primeiramente descrita como proteína estabilizadora de RNA mitocondrial e parece estar envolvida com a replicação de DNA mitocondrial. Em Leishmania, LaRbp38 também interage in vivo com DNA mitocondrial, com sequencias ricas em GT e com DNA telomerico simples e dupla fita. Nesta tese mostramos estudos que nos levaram a caracterizar novas propriedades estruturais e biológicas desta proteína. Na primeira parte da tese mostramos, que a LaRbp38 inteira e mutantes truncados da proteína são capazes de interagir com diferentes tipos de DNAs: DNA simples e dupla fitas telomericos e kDNA, porem com diferentes afinidades. Desta forma, foi possível mapear a vizinhança de um domínio de interação desta proteína aos diferentes tipos de DNA (DBD). Como este domínio não compartilha similaridade estrutural com nenhum domínio descrito em outras proteínas, isto sugere que este pode ser um novo domínio presente exclusivamente em tripanosomatideos. Estes resultados estão compilados no artigo entitulado: "Mapping the boundaries of the DNA-binding domain of Leishmania amzonensis Rbp38 (LaRbp38)". Na segunda parte da tese, mostramos a localização subcelular da proteína e como ela e capaz de translocar por diferentes compartimentos celulares utilizando um sinal de localização mitocondrial presente no N-terminal e um sinal de localização nuclear, presente no Cterminal da proteína. Embora a proteína esteja presente de forma mais abundante no cinetoplasto, e possível visualizá-la no núcleo quando o ciclo celular do parasita e sincronizado ou quando este e submetido a um estresse genotoxico. Baseado nesses achados também foram realizados ensaios de interação proteina-proteina, onde foi possível determinar a interação entre LaRbp38 e a proteína importina ?, uma proteína que esta diretamente ligada ao transporte de proteínas ao núcleo via NLS. Estes resultados também foram compilados em um artigo, que esta em fase de preparação, entitulado: "The protein LaRbp38 translocates between the nucleus and the kinetoplast in Leishmania (L.) amazonensis promastigotes". Outro estudo que realizamos para compreender a função da LaRbp38, o qual também esta na forma de um artigo: "LaRbp38 can form part of a shelterin-like complex in L.amazonensis telomeres", mostramos evidencias sobre a interação entre as proteínas LaRbp38 e a LaTRF de L.amazonensis. Aqui, uma analise in silico pela busca de motivos conservados em LaRbp38, nos levou a descobrir que esta proteína contem um motivo do tipo TRFH docking encontrado em proteínas telomericas que interagem com as proteínas da família das TRFs no complexo shelterina de vertebrados e mamíferos (ex: TIN2, PINX1 e APOLLO). Juntas, as TRFs e suas interatoras tem a função na manutenção dos telomeros. Sendo assim, utilizando ensaios de interação proteina-proteina, conseguimos mostrar que LaRbp38 interage fisicamente com a LaTRF, usando um motivo TRFH docking diferente daquele que foi primeiramente encontrado in silico. Nossos resultados mostram que a LaRbp38 interage com a LaTRF usando o motivo ALKTL, que compartilha similaridade de sequencia, com motivos descritos em proteínas interatoras de TRFs e bastante conservado entre as Rbp38 de tripanosomatideos. Estes resultados podem indicar que a LaRbp38 cumpre função análoga a uma das proteínas de vertebrados descritas como interatoras de TRFs, a proteína TIN2, que a exemplo de LaRbp38, também tem função nas mitocôndrias / Abstract: LaRbp38 is a trypanosomatid protein found exclusively in these protozoa, among which are the etiological agents of leishmaniasis, an endemic disease present in several regions of Brazil. LaRbp38 is a protein encoded by a nuclear gene, which probably plays different roles in both mitochondrial and nuclear replication machineries. It was first described as a mitochondrial RNA stabilizing protein involved in the replication of mitochondrial DNA. In Leishmania, LaRbp38 also interacts in vivo with mitochondrial DNA, GT-rich sequences and single- and double-stranded telomeric DNA. Here we show the results that led us to characterize some new biological and structural features of this protein. In the first part of the thesis we show that the entire LaRbp38 and its truncated mutants are able to interacts with different GT-rich DNAs and were possible to map the boundearies of a DNA-binding domain (DBD). This domain doesn't share any sequence or structural similarities with the domains described in other proteins suggesting that it could be a new domain present exclusively in trypanosomatids. These results are compiled in the article entitled: "Mapping the boundaries of the DNA-binding domain of Leishmania amzonensis Rbp38 (LaRbp38)." The second part of the thesis shows the subcellular localization of the protein and how it is able to translocate to different cellular compartments using an N-terminal mitochondrial localization signal (MLS) and a nuclear localization signal (NLS) present in the C-terminus of the protein. Although the protein is seem more abundantly in the mitochondria associated with kinetoplast DNA, its nuclear localization seems to be cell cycle dependent and enhanced at the end of S phase or when parasites are subjected to genotoxic stress. In order to confirm that the protein is able to translocate to the nucleus, we used different in silico approaches. The results strongly suggest the existence of a non-classical and also non-bipartite NLS at the C-terminus of LaRbp38. Based on these findings we did protein-protein interaction assays and verified that LaRbp38 can associate in vitro with importin ?, which is directly linked to protein transport to the nucleus via a NLS. These results were also compiled in an article, which is in preparation, entitled: The LaRbp38 protein translocates between the nucleus and the kinetoplast in Leishmania amazonensis promastigotes. Another study that was carried out and present in the third part of the thesis shows evidence about the interaction between LaRbp38 and the telomeric L.amazonensis LaTRF protein. These results are presented as an article entitled: "LaRbp38 can form part of a shelterina-like complex in L.amazonensis telomeres," Here, an in silico analysis search for conserved motifs in LaRbp38, showed that this protein contains a motif, the TRFH-docking-like typically found in proteins that associate with the TRF paralogue proteins (TRF1 and TRF2) in the shelterin complex of vertebrates and mammallian telomeres (eg.TIN2, PINX1 and APOLLO). TRFs and their interactors work together to regulate the dynamics of telomeric chromatin and telomere length maintenance. By using protein-protein interaction assays we show that LaRbp38 physically interacts with LaTRF. This interaction, however, seems to occurs via a new TRFH docking motif, which is different from the conserved core motif [FY]xLxP. This new TRFH-docking-like motif (ALKTL) aligns and share similarities with the TRH-docking motif described in the shelterin protein TIN2. This motif is also very conserved among the Rbp38 orthologues of other trypanosomatids. Curiously, TIN2 is a telomeric protein that shows nuclear and mitochondrial localization / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutora em Genética e Biologia Molecular

Orientador: Selma Giorgio / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-07T16:29:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_WagnerWelberArraisda_D.pdf: 2543782 bytes, checksum: d4c1a96c9dabbacb3872004b7f017fb8 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Nas infecções com o parasito do gênero Leishmania a incapacidade da célula hospedeira destruir os amastigotas leva à lesão a cronificar-se. A persistência e o aumento da carga parasitária levam a formação de um granuloma macrofágico, que resulta em áreas de inadequada perfusão e conseqüente alteração do microambiente tecidual. Assim, neste trabalho avaliamos durante a evolução da lesão de camundongos infectados com L amazonensis a expressão das proteínas HIF-1a e VEGF, que respondem ao estresse microambiental. Paralelamente, investigamos protocolos terapêuticos com HBO que modulem a curva de crescimento da lesão em modelos animais da infecção por Leishmania amazonensis. A expressão de HIF-1a ocorreu nas fases iniciais, crônicas e fases finais da infecção murina com L. amazonensis. Nas lesões cutâneas de camundongos da linhagem BALB/c a expressão de HIF-1a foi de localização difusa na lesão, enquanto que a expressão de HIF- 1a em lesões cutâneas da linhagem C57Bl/6 foi em forma de cluster restrita aos macrófagos parasitados. A expressão de VEGF nas lesões de ambas linhagens de camundongos foi discreta durante todo o período experimental e não aumentou com o tempo de infecção. O tratamento com oxigênio hiperbárico mostrou efeito deletério sobre formas promastigotas aumentando o acúmulo de lipídios citoplasmáticos e o nível de apoptose. O oxigênio hiperbárico diminuiu os efeitos patológicos e modulou a resposta imune. Concluímos que a expressão de HIF-1a durante a evolução da lesão leishmaniótica não está diretamente relacionada à expressão de VEGF e pode ser resultado de múltiplos fatores, que incluem fatores hipóxicos e não hipóxicos. Sugerimos também que o tratamento hiperbárico é capaz de modular a resposta imunológica e diminuir a progressão da lesão durante a leishmaniose murina / Abstract: The incapacity of host cell in killing amastigotes during Leishmania infections causes to chronic lesions. The increase of parasite burden leaves to macrophage accumulation and consequently granuloma formation that result in inadequate perfusion and tissue microenvironment alterations. Thus, in this work we evaluated the HIF-1a and VEGF expression, proteins that responses for environmental stress, during the course of L.amazonensis infection. We also investigated protocols for hyperbaric oxygen therapy that module the lesion progress in animal models infected with L. amazonensis. HIF-1a expression occurred in the early, chronic and in final stages of murine infection with L. amazonensis. BALB/c mice lesions showed a homogeneous expression of HIF-1a while footpads from C57Bl/6 mice showed HIF-1a expression restrict in clusters of heavily infected macrophages. The VEGF expression was not correlated to the evolution of lesion or the HIF-1 production in both stains. The hyperbaric oxygen treatment showed deleterious effects on promastigotes increasing cytoplasmtic lipids and apoptosis level. The HBO decreased pathological effects and modulated the immune response. The results suggest that the HIF-1a expression during lesion progress induced by L.amazonensis in both murine strains is the result of multiple factors, including hypoxic and non hypoxic factors. There is no direct relation between HIF-1a and VEGF expression during experimental cutaneous leishmaniasis. We also indicated that hyperbaric oxygen therapy was able to modulate immune response and decrease of lesion progress during murine leishmaniasis / Doutorado / Doutor em Parasitologia

Orientador: Carlos Lenz Cesar / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Fisica Gleb Wataghin / Made available in DSpace on 2018-08-08T01:06:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pozzo_LilianadeYsasa_M.pdf: 4076293 bytes, checksum: 5197fda41d6fa440de56b82b104a4bcd (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Microorganismos unicelulares, como os demais seres vivos, necessitam interagir com o ambiente e procurar ativamente por alimentos. Seus orgãos sensoriais, entretanto, se limitam a sensores hidrodinâmicos e receptores bioquímicos de membrana. A quimiotaxia estuda a resposta de organismos unicelulares frente a gradientes de concentração de substâncias atratoras ou repulsoras. Essa resposta é parte essencial do processo de infecção por parasitas no direcionamento e reconhecimento das células a serem infectadas. Dessa forma, um estudo quantitativo da quimiotaxia de parasitas requer o monitoramento tanto dos movimentos do parasita quanto das intensidades, direção e sentido das forças que exerce na presença de gradientes de concentração das substâncias atratoras e repulsoras. Forças de microorganismos com dimensões da ordem de 10 µm são da ordem de pico-Newtons. A pinça óptica é a microferramenta ideal para esse tipo de estudo pelas seguintes razões: (1) tem sensibilidade para medir forças desde 20 femto-Newtons até 200 pico-Newtons, da mesma ordem de grandezas das forças geradas pelos parasitas; (2) é uma técnica remota, sem necessidade de contacto e (3) não destrutiva, pois os lasers no infravermelho não geram calor suficiente para causar danos térmicos. Nesse trabalho mostramos como se pode utilizar o deslocamento da posição de equilíbrio de uma microesfera como transdutor de forças vetoriais, determinando quantitativamente intensidade, direção e sentido das forças na microesfera. Um detector de quadrante da luz do próprio laser da pinça óptica fornece o deslocamento da mesma em duas dimensões. Dessa forma foi possível monitorar a força exercida pelo parasita em tempo real em diferentes gradientes de concentração de várias substâncias. Também desenvolvemos uma câmera de gradiente que garantiu um gradiente unidimensional estacionário na qual se pode aprisionar os parasitas e realizar a medida vetorial da força em função do tempo. Demonstramos a capacidade do nosso sistema de realização de medidas de quimiotaxia utilizando o protozoário Leishmania amazonensis, responsável pela doença leishmaniose, na forma promastigota, na presença de gradientes de glucose. Nossos resultados mostram que além das forças serem fortemente direcionadas na direção do gradiente, que a intensidade das mesmas diminui nas direções contrária ou perpendicular ao gradiente. Com esse trabalho mostramos a construção de um sistema de medidas quantitativa capaz de estudar quantitativamente a quimiotaxia de qualquer parasita frente a qualquer gradiente de concentração de diferentes substâncias / Abstract: Unicellular microorganisms, like others live beings, need to interact with environment to find nourishment. They have only hydrodynamics sensors and biochemical receptors on membrane to accomplish this task. The response of the microorganism to concentration gradients of attractive or repulsive chemical substances is called chemotaxis. The investigation of chemotaxis is essential to understand infection processes and how parasites recognizes and directs itself to the cells to be infected. This way a quantitative study of parasites chemotaxis requires the observation of not only its movements, but also the strength, direction and sense of forces exerted in the presence of concentration gradient of attractive or repellent chemical substances. Microorganism¿s forces with dimensions of around 10µm are the order of pico-Newton. Optical tweezers are a suitable tool for this kind of investigation, we can justify this affirmation by the following reasons: (1) it has high sensibility to measure forces from 20 femto-Newton until 200 pico-Newton. These forces are in same order of the forces exerted by the parasites. (2) This technique does not need contact, therefore it is a remote technique; and (3) this tool does not destroy the parasites, because lasers on infrared band do not generate enough heat to cause thermal damage on them. In this work we used the displacements of a microsphere trapped in an Optical Tweezers as the force transducer to measure the direction and the strength of the propulsion forces of flagellum of the microorganism under several gradient conditions. A quadrant detector was utilized to sense the displacement of optical tweeter¿s laser in two dimensions. So we monitor the force exerted by the parasites in real time in several concentrations gradients of different substances. We also developed a system enable to create concentration gradient. This system guaranteed a stationary one-dimensional gradient, which the parasites were arrested and the vectorial measurements of force in time function were realized. In this study, we used the protozoa Leishmania amazonensis in its promastigote form. It is responsible by the disease called leishmaniose and it represents a serious problem of public health. We demonstrated that our system is able to perform chemotaxis measurements in gradients of glucose. Our results suggest that the direction and strength of force can be used to identify the movement of the parasite. We also notice differences in strength forces for both direction x and y for different glucose in several concentrations. Using that system we can investigate quantitatively taxias of any parasites in any concentration gradient with different chemical substance, temperature or other variables / Mestrado / Física / Mestre em Física

A leishmaniose é causada por tripanossomatídeos do gênero Leishmania que infectam preferencialmente macrófagos. Vários factores influenciam a forma e a severidade da doença: a espécies de Leishmania e a resposta imune do hospedeiro. Considerando a importância da ativação dos macrófagos na infecção, o potencial papel de CD100 na modulação da ativação dos macrófagos e os nossos dados anteriores de que CD100 solúvel (sCD100) aumenta a infectividade pelo parasita, pretendemos caracterizar os efeitos do CD100 na infecção por Leishmania (L.) amazonensis. Descobrimos que ambos, promastigotas e amastigotas, são mais infecciosos na presença de sCD100 e que o receptor CD72 é o responsável pelo aumento da infecção. Experimentos in vitro indicaram índice de infecção similares entre macrófagos nocautes para CD100 e selvagens, mas curiosamente, os animais nocautes infectados desenvolveram lesões significativamente menores do que os selvagens, sugerindo que sCD100 presente em outras células pode influenciar a formação da lesão. / Leishmaniasis is caused by trypanosomes of the genus Leishmania that preferentially infect macrophages. Several factors influence the form and severity of the disease: the species of Leishmania and the host immune response. Considering the importance of the activation of macrophages in infection, potential role of CD100 in the modulation of macrophage activation and our previous data that CD100 soluble (sCD100) increase the infectivity of the parasite, we intend to characterize the effect of CD100 in infection with Leishmania (L.) amazonensis. We found that both promastigotes and amastigotes, are most infectious in the presence of sCD100 and the CD72 receptor is responsible for the increased infection. In vitro experiments indicated similar infection rate of macrophages to CD100 knockouts and wild type, but interestingly, the infected knockout animals developed significantly smaller lesions than wild type suggesting that sCD100 present in other cells may influence lesion formation.

Made available in DSpace on 2016-04-28T20:15:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009 - Aline Rodrigues Bernardo.pdf: 1109499 bytes, checksum: 4b0f2adb9ceeb43406ffa4f7d20978ba (MD5) Previous issue date: 2009-02-09 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior / The production of specific antibody (IgY) in chickens (Gallus gallus domesticus) and its purification from the yolk of the egg is attracting the interest of the scientific community due to the numerous advantages of the IgG of mammals. Low cost, high volume production, recognition proteins highly conserved in mammals, in addition to preventing the suffering and death of animals for experimentation, are the main advantages. The aim of our study was to develop, standardize and deploy the technology IgY for aviaries production of antibodies with aim to obtain IGY-specific forms to promastigotes of Leishmania (Leishmania) amazonensis. Initially, matching was performed by two methods of precipitation and the comparison between them, to obtain the pure IgY from the yolk of egg white obtained in trade. The method of purification employing polietienoglicol (PEG-6000) was able to extract IgY with purity comparable to commercial standard IgY (Sigma) and more than obtained by the method with 25% ammonium sulfate. Later, chickens were inoculated with three doses of inactivated antigen (promastigotes forms of L. amazonensis) mixed with incomplete Freund's adjuvant, at 0, 14 and 21 days, IM route. High yield of total and specific IgY was obtained, as determined by the methods of Bradford and ELISA, respectively. The IgY antibodies showed high specificity (indirect immunofluorescence), sensitivity and avidity (ELISA) for promastigotes forms of L. amazonensis, from the second immunization. The level of IgY-specific antibodies remained high until the end of the analysis, around 56 days. Based on the results we can conclude that the "Technology IgY" allows to obtain antibodies with high specificity and sensitivity, in ethics, can be used successfully in various fields of science. / A produ??o de anticorpo espec?fico (IgY) em galinhas (Gallus gallus domesticus) e sua purifica??o a partir da gema do ovo vem atraindo o interesse da comunidade cient?fica devido as in?meras vantagens sobre os anticorpos IgG de mam?feros. Baixo custo, produ??o em quantidades elevada, reconhecimento de prote?nas altamente conservadas de mam?feros, al?m de se evitar o sofrimento e morte de animais de experimenta??o, s?o as principais vantagens. O objetivo geral de nosso estudo foi desenvolver, padronizar e implantar a Tecnologia IgY para produ??o de anticorpos avi?rios, tendo como meta a obten??o de IgY-espec?fica para formas promastigotas de Leishmania (Leishmania) amazonensis. Inicialmente, foi realizada adequa??o de dois m?todos de precipita??o e a compara??o entre eles, visando a obten??o da IgY pura a partir da gema de ovos brancos adquiridos no com?rcio. O m?todo de purifica??o empregando polietienoglicol (PEG-6000) foi capaz de extrair IgY com pureza compar?vel ao padr?o IgY comercial (Sigma) e superior a obtida pelo m?todo com sulfato de am?nio 25%. Posteriormente, galinhas foram inoculadas com tr?s doses de ant?geno inativado (formas promastigotas de L. amazonensis) misturados com adjuvante incompleto de Freund, nos tempos 0, 14 e 21 dias, por via intramuscular. Elevado rendimento da IgY total e espec?fica foi obtido, sendo determinado atrav?s dos m?todos de Bradford e ELISA, respectivamente. Os anticorpos IgY apresentaram elevada especificidade (Imunofluoresc?ncia indireta), sensibilidade e avidez (ELISA) para formas promastigotas de L. amazonensis, a partir da segunda imuniza??o. O n?vel de anticorpos IgY-espec?ficos permaneceu elevado at? o final da an?lise, por volta do 56? dia. Com base nos resultados obtidos podemos concluir que a Tecnologia IgY possibilita a obten??o de anticorpos com alta especificidade e sensibilidade, de forma ?tica, podendo ser utilizada com sucesso em diversos campo da ci?ncia.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:25Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-12-31 / Com o intuito de obter informações sobre a expressão de lipídeos de formas promastigotas de Leishmania (Leishmania) amazonensis, parasitas foram analisados durante o crescimento logarítmico e estacionário quanto à composição de glicolipídeos e fosfolipídeos. Em paralelo, dois anticorpos monoclonais (mAbs), denominados LST-1 e LST-2, foram produzidos, caracterizados e utilizados neste estudo. A expressão de fosfolipídeos em promastigotas durante o crescimento logarítmico e estacionário foi analisada por cromatografia em camada delgada de alta resolução (HPTLC). O extrato lipídico total de promastigotas de L. (L.) amazonensis apresenta fosfatidilinositol (PI), fosfatidilserina (PS), fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE), Liso-PI e inositol fosforilceramida (IPC), este último caracterizado por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa, contendo esfingosina (d18:1) e ácidos graxos, principalmente ácido esteárico (C18:0) e ácido palmítico (C16:0). Enquanto as proporções molares de IPC, PS, PE, Liso-PI aumentaram com o decorrer do tempo de cultura, as proporções molares de PI e PC diminuíram. O perfil cromatográfico dos glicolipídeos se manteve constante durante o crescimento logarítmico e estacionário. Os mAbs LST-1 e LST-2 foram produzidos contra a fração enriquecida em glicolipídeos e IPC de formas promastigotas de L. (L.) amazonensis. Os dois anticorpos pertencem a classe IgM. O mAb LST-1, por imunocoloração de placas de HPTLC, reconhece um componente lipídico acídico, eluído da coluna de DEAE-Sephadex com acetato de sódio 0,2 M, que apresenta migração cromatográfica característica de IPC, o qual é resistente à hidrólise alcalina e é corado com reagente de Dittmer-Lester. Já, o mAb LST-2 foi reativo com a fração de glicolipídeos não retida na coluna de DEAE-Sephadex, e visibilizada nas placas de HPTLC com orcinol/H2SO4. Por IFI, os dois mAbs mostraram alta reatividade com formas promastigotas de L. (L.) amazonensis. O tratamento dos parasitas com isopropranol:hexano:água (IPA:Hex:água) (55:20:25; v/v/v) aboliu a reatividade, indicando que os antígenos reconhecidos pelos mAbs estão presentes somente na fração lipídica. LST-1 não foi reativo com parasitas vivos, sugerindo que o IPC está críptico na membrana, sendo talvez expresso somente no folheto interno da membrana plasmática. Já, o mAb LST-2 apresentou forte reatividade com promastigotas vivos, aglutinando-os, indicando que os glicolipídeos reconhecidos por LST-2 encontram-se na superfície do parasita. Por imunofluorescência indireta com LST-1 e LST-2 verificou-se que amastigotas isoladas de lesão não são reconhecidos pelos mAbs, e por outro lado, forte fluorescência foi detectada com amastigotas axênicos. Por cromatografia em placas de HPTLC, de extratos lipídicos purificados de amastigotas, verificou-se que os amastigotas isolados de lesão de animais infectados por L. (L.) amazonensis, apresentam diferentes perfis cromatográficos de glicolipídeos e fosfolipídeos em relação aos promastigotas e aos amastigotas axênicos. Enquanto os amastigotas isolados de lesão são ricos em glicoesfingolipídeos, os amastigotas axênicos e promastigotas apresentam glicoinositolfosfolipídeos (GIPLs) reconhecidos pelo mAb LST- 2 e IPC reconhecido pelo mAb LST-1. O mAb LST-1 apresentou reatividade com formas promastigotas de todas as espécies de Leishmania analisadas, e também com formas epimastigotas de T. cruzi. Nestes parasitas, foi observado que LST-1 reconhece especificamente IPC, sendo o resíduo de inositol e a ceramida essenciais para a reatividade do mAb LST-1. Já, o mAb LST-2, por imunofluorescência indireta, apresentou forte marcação somente com formas promastigotas ou amastigotas axênicos de L. (L.) amazonenis, reconhecendo 4 componentes glicolipídicos denominados bandas a, b, c, e d, que correspondem a GIPLs. A porção carboidrato é fundamental para a reatividade do mAb LST-2. Analisando-se macrófagos infectados com promastigotas de L. (L.) amazonensis, verificou-se por imunofluorescência indireta com o mAb LST-2, que os promastigotas durante a adesão/infecção de macrófagos, secretam ou transferem para os macrófagos os antígenos glicolipídicos, reconhecidos pelo mAb LST-2. Forte fluorescência na superfície de macrófagos infectados é observada já na primeira hora de infecção, e com o decorrer da infecção (até 4 horas) observa-se, somente nos macrófagos infectados, pequenas vesículas fluorescentes, que não correspondem a fagossomos contendo os parasitas. Assim, nesta tese, foi demonstrado que amastigotas isolados de lesão em relação a amastigotas axênicas e promastigotas de L. (L.) amazonensis apresentam padrões distintos de glico(fosfolipídeos). Enquanto amastigotas isoladas de lesão expressam GSLs, amastigotas axênicas e promastigotas expressam IPC e GIPLs, sendo que estes últimos sendo liberados pelo promastigota durante a infecção de macrófagos. / In order to obtain information about the lipid expression of promastigote forms of Leishmania (Leishmania) amazonensis, the parasites lipid composition profile was analyzed during log and stationary phase. Two monoclonal antibodies (mAb) termed LST-1 and LST-2 were produced, characterized and used in this study. Promastigote phospholipid expression on log and stationary growth phases were analyzed by high performance thin layer chromatography (HPTLC). At either phase the total lipid extract of L. (L.) amazonensis promastigotes presents phosphatidylinostol (PI), phosphatidylserine (PS), phosphatidylcholine (PC) phosphatidylethanolamine (PE), Lyso- PI and inositol phosphorylceramide (IPC). IPC was characterized by GC/MS, and it was detected sphingosine (d18:1) and fatty acids, mainly palmitic acid (C16:0), and stearic acid (C18:0). It was noted that the molar proportions of IPC, PS, PE and Lyso-PI increased during the culture time, while the percentage of PI and PC decreased. Unlikely, the glycolipid chromatographic profile did not change during the promastigotes growth at log and stationary phases. The mAbs LST-1 and LST-2 were produced against a glycolipid and IPC enriched fraction purified from promastigote forms of L. (L.) amazonensis. Both antibodies are IgM. By HPTLC immunostaining it was demonstrated that mAb LST-1 recognized an acidic lipid component, eluted with 0.2 M of sodium acetate from DEAE-Sephadex column. The LST-1 reactive component presents: i) chromatographic migration characteristic of IPC, ii) is resistant to alkaline hydrolysis; iii) is stained with Dittmer-Lester reagent. On the other hand, the mAb LST-2 was reactive with the glycolipid fraction not retained in DEAE-Sephadex column, and this fraction was visualized on HPTLC by primuline and orcinol/H2SO4 staining. By indirect immunofluorescence, both antibodies showed high reactivity with L. (L.) amazonensis promastigotes. Parasites delipidation with isopropanol:hexane:water (55:20:25; v/v/v), abolished the mAbs reactivity, indicating that the antigens recognized by LST-1 and LST-2 are present exclusively in the lipid fraction. MAb LST-1 did not react with non-fixed parasites, suggesting that IPC is cryptic in the membrane, and maybe localized only in the inner leaf of plasma membrane. Contrasting, mAb LST-2, showed a strong reactivity with live L. (L.) amazonensis promastigotes, also parasite agglutination was observed, indicating that the glycolipids recognized by LST-2 are in parasite surface. By indirect immunofluorescence with LST-1 and LST-2 no reactivity was observed with amastigotes isolated from L. (L.) amazonensis infected hamsters, conversely axenic amastigotes showed a strong fluorescence with both mAbs. By HPTLC it was verified that the lipid fractions of promastigotes, axenic amastigotes and amastigotes isolated from footpad lesions, presented distinct glycolipids and phospholipids profiles. Amastigotes isolated from lesions are rich in glycosphingolipids, whereas axenic amastigotes and promastigotes present glycoinositolphospholipids (GIPLs) recognized by LST-2, and IPC recognized by mAb LST-1. The LST-1 antibody recognized promastigotes from all species of analyzed, and also T. cruzi epimastigotes. It was determined that LST-1 recognizes specifically IPC in these parasites, and it was established that the inositol residue and the ceramide are essential for LST-1 reactivity. By indirect immunofluorescence with mAb LST-2 a strong labeling of only L. (L.) amazonensis promastigotes and axenic amastigotes was observed. LST-2 recognizes 4 glycolipid components termed a, b, c and d, which correspond to GIPLs. It was demonstrated that the carbohydrate moiety is fundamental for LST-2 reactivity. L. (L.) amazonensis promastigotes infected macrophages showed by indirect immunofluorescence, that promastigotes during the macrophage adhesion/infection, secrete or transfer GIPLs recognized by mAb LST-2 to the macrophage. Strong fluorescence in infected macrophage was observed in the first hours of infection. During the next hours of infection (up to 4 hours) also small fluorescent vesicles were observed in the infected macrophages, which did not correspond to phagossomes containing parasites. Thus, these studies describe distinct (glyco)phospholipid profile in lesion amastigotes, axenic amastigotes and promastigotes, and GIPLs vesicles formation during macrophage infection by promastigotes. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Submitted by Tatiana Silva (tsilva@icict.fiocruz.br) on 2012-11-19T18:30:11Z No. of bitstreams: 1 karen_s_charret_ioc_bp_0055_2011.pdf: 28875915 bytes, checksum: 38bf86603dba71d83a48b9e25560c47f (MD5) / Made available in DSpace on 2012-11-19T18:30:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 karen_s_charret_ioc_bp_0055_2011.pdf: 28875915 bytes, checksum: 38bf86603dba71d83a48b9e25560c47f (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz.Instituto Oswaldo Cruz. Rio de janeiro, RJ, Brasil / Atualmente, não há vacina eficaz e o controle das leishmanioses depende principalmente da quimioterapia. Recentemente, novos compostos sintéticos os derivados carbohidrazidas pirazolocas apresentaram atividade em Leishmania amazonensis in vitro e quando testadas em modelo experimental murino de infecção de L. amazonensis mostraram eum efeito um efeito terapêutico significativo. Um estudo com compostos intermediários da síntesedas carbohidrazidas poderia ser interessante, pois estes possuem uma potencial atividade leishmanicida e ajudaria a cmpreender os mecanismos de ação dos compostos finais. Por outro lado, é necessário conhcer o comportamento do sistema imune frente a estes compostos na infecção por leishmaniose.Os compostos precursores naão foram ativos em formas promastigotas de L. amazonensis. No entanto, todos os compostos apresentaram atividade sobre formas de amastigotas e sem citotoxicidade em célula de mamíferos. Aqui, foi sugerida a contribuição farmacofórica do anel N-heteroaromático para a atividade leishmanicida e do grupamento hidrazina para o composto intermediário. Além disso, foi mostrado que todos os componentes podem induzir um aumento da produção de óxido nitrico em macrófagos estimulados ou não. Em camundongos CBA infectados com L amazonensis e tratados por via oral com os derivados carbohidrazidas, o estudo histopatológico rervelou que mudanças na derme foram correlacionadas com o tamanho macroscópico da lesão. Camundongos CBA infectados e tratados tinham lesões cutâneas menores, e as estruturas da epiderme e derme tinham níveis mais baixos de infiltrtado inflamatório, comparadas com as de camundongos controles infectados e não tratados. Também foi observado um infiltrado inflamatório misto contendo linfócitos e neutrófilos. Além disso, expressão de IL-4 RNAm foi menor no grupo tratado.. Um aumento dos níveis de anticorpos das subclasses específicas anti-Leishmania IgG2a e IgG3 foi observado nos grupos tratados com as pirozol carbohidrazidas exercem efeitos terapêuticos significativos, podendo agir diretamente sobre o parasito e/ou sobre as células dos sistemas imune do hospedeiro.. / Currently, there is no effective vaccine and control of leishmanioses depends mainly on the chemotherapy. Recently, new synthetic carbohidrazidas derivatives pirazolocas compounds showed activity on Leishmania amazonensis when tested in vitro and in experimental murine model of infection of l. amazonensis showed a significant therapeutic effect effect. A study of intermediate compounds síntesedas carbohidrazidas could be interesting, as these have a potential activity leishmanicida and help cmpreender the mechanisms of action of compounds. On the other hand, it is necessary to know the behavior of the immune system against these compounds in leishmaniasis infection.The precursor compounds are active in ways does promastigotas of l. amazonensis. However, all compounds showed activity on amastigote forms and without cytotoxicity in mammalian cell. Here, it was suggested the contribution farmacofórica of the ring N-heteroaromatic compound for leishmanicida and activity of hydrazine to the intermediate grouping. In addition, it was shown that all components can induce an increase in nitric oxide production in macrophages stimulated or not. In CBA mice infected with l. amazonensis and treated orally with carbohidrazidas derivatives, the histopathologic study rervelou that changes in the DermIS were correlated with the macroscopic size of the lesion. CBA mice infected and treated tin

Submitted by Alessandra Portugal (alessandradf@ioc.fiocruz.br) on 2013-09-24T19:58:00Z No. of bitstreams: 1 Eduardo_regis_tese_doutorado_FINAL_total.pdf: 9624685 bytes, checksum: ea18ab165120397862060c5181e22f91 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-09-24T19:58:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Eduardo_regis_tese_doutorado_FINAL_total.pdf: 9624685 bytes, checksum: ea18ab165120397862060c5181e22f91 (MD5) Previous issue date: 2012 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Os parasitos do gênero Leishmania são protozoários que se replicam em macrófagos após a infecção do hospedeiro vertebrado pelo vetor flebotomíneo. O controle da infecção depende basicamente do desenvolvimento de uma robusta resposta do tipo Th1 específica contra o parasito, e a IL-27 já foi descrita como uma citocina capaz de participar nos estágios inciais do comprometimento para Th1. Nesta tese, investigamos a função direta de IL-27 na interação macrófago/L.amazonensis, e observamos que esta citocina é expressa por macrófagos infectados pela L.amazonensis de maneira depentende de PKR e interferons do tipo I. Curiosamente, pacientes infectados por diversas espécies de Leishmania apresentam níveis menores de IL-27 no soro/plasma quando comparados aos controles. Ainda, a IL-27 promove a replicação de L.amazonensis tanto em macrófagos humanos quanto murinos. Buscando mapear as vias de sinalização envolvidas no aumento parasitário mediado pela IL-27, demonstramos que a IL-27 é capaz de induzir a ativação/fosforilação de PKR em macrófagos, e que o bloqueio desta enzima e até a deleção gênica, anulam o crescimento intracelular da Leishmania promovido pela IL-27. Ainda, demonstramos que a indução de IL-10 pela IL-27 é fortemente regulada pela PKR. Bloqueamos o receptor de IL-10 na superfície de macrófagos infectados pela Leishmania e observamos que esta citocina é a mediadora do aumento de L.amazonensis promovido pela IL-27. Finalmente, como IL-27 diminui a replicação do HIV-1, nós analisamos o papel desta citocina na co-infecção HIV-1/Leishmania através da exposição de macrófagos albergando estes patógenos à IL-27. Nós encontramos que esta interleucina não parece modular o crescimento parasitário neste modelo. Em conclusão, demonstramos que a IL-27 é um fator indutor do crescimento de L.amazonensis em macrófagos e parece contribuir significativamente na biologia deste parasito. / Leishmania is a protozoan parasite that replicates within macrophages after vertebrate infection by the sandfly vector. The infection control basically depends on the robust development of a specific Th1 response against the parasite, and Interleukin (IL)- 27 has been described as a cytokine able to participate in the early steps of Th1 commitment. Here, we addressed the function of IL-27 on the interplay between macrophages and L. amazonensis, and we observed that this cytokine is expressed by macrohpages infected by L.amazonensis and that expression is dependent on PKR and type I interferons. Curiously, patients harboring a variety of Leishmania species present lower levels of IL-27 in plasma/serum when compared to healthy individuals.Trying to map the signaling pathway involved in the IL-27-mediated Leishmania growth enhancement, we demonstrated that IL-27 is able to induce Protein Kinase R (PKR) activation/phosphorilation in macrophages, and that enzyme blockage, or even gene deletion, abrogates the intracellular Leishmania enhancement driven by IL-27. In addition, we showed that IL-10-induction by IL-27 is strongly regulated by PKR. We blocked IL-10 receptor on the surface of Leishmania-infected macrophages and we described that IL-10 is the critical mediator of IL-27-mediated L. amazonensis augmentation. To finish, IL-27 is known to diminish HIV-1 replication, thus, in order to investigate the role of this cytokine in HIV-1/Leishmania co-infection, we exposed macrophages harboring both pathogens to IL-27 and found that this interleukin does not seem to modulate parasite growth in this model. In conclusion, we found that IL-27 is an inducer of L.amazonensis growth inside macrophages and contributes with this parasite biology.

Orientador: Maria Isabel Nogueira Cano / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-10T10:53:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 SiqueiraNeto_JairLagede_D.pdf: 2960762 bytes, checksum: 91f4b8aed472a4d4c93cf040e8c534e7 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: A leishmaniose é uma parasitose humana emergente e ainda não controlada, causada por protozoários pertencentes ao gênero Leishmania. Atualmente, a doença atinge mais de 12 milhões de pessoas, não existindo ainda métodos eficientes para seu controle e erradicação. Por estas razões a Organização Mundial da Saúde classifica a leishmaniose como doença de categoria I e incentiva o desenvolvimento de novos métodos para controlar a doença para buscar novos alvos para drogas contra parasita. No presente trabalho, estudou-se as proteínas LaRBP38 e LaRPA-1 previamente identificadas por se associarem in vitro com a simples-fita telomérica rica em ¿G¿ de L. amazonensis. Os telomeros são extremidades físicas dos cromossomos de eucariotos, formados por complexos nucleoproteicos. São responsáveis por conferir estabilidade aos cromossomos, envitando a degradação pela maquina de reparo celular e a fusão entre extremidades cromossomais. Instabilidades no telômero causam normalmente danos irreparáveis à célula podendo levar à senescência e morte celular. As proteínas que se mantém complexadas ao telômero são responsáveis por mantê-lo funcioal. Cada proteína desempenha um papel importante, seja na proteção, processo replicativo ou manutenção da estabilidade estrutural do telômero, sendo portanto, alvos potenciais para o desenvolvimento de terapias antiparasitárias. A proteína RPA é conservada em toda escala evolutiva e cumpre importantes papéis nas maquinarias de replicação, recombinação e reparo do DNA genômico ...Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: Leishmaniasis is an emerging and non-controlled human disease, caused by protozoan belonging to the Leishmania genera. More than 12 million people are infected and there are no efficient methods for the controlling or eradication of the disease. For those reasons, the World Health Organization classifies leishmaniasis as category I disease and encourages the development of new methods to control the disease and to find new targets for drugs against the parasite. In the present work, we studied the proteins LaRBP38 and LaRPA-1, prior identifield by in vitro assays as proteins that associates with the Leishmania amazonensis G-rich single-stranded telomeric DNA. Telomeres are the physical ends of eukaryote chromosomes formed by proteins and DNA complexes. They are responsible for the chromosome stability, avoiding degradation by the rapair machinery end-to-end fusion. Telomere instability may cause irreversible damage in the cell, leading to senescence and cell death. The proteins that interact with the telomeres are responsible for the functional dynamics of theses structures. Each protein has an important role in the protection, replication process or in the stability maintenance. Therefore, telomeric protein could be considered good targets for the development of new therapies. RPA is an evolutionary conserved protein and plays important roles in replication, recombination and repair machineries. At the telomeres, RPA recruits telomerase, the protein responsible for telomeric elengation ...Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutor em Genetica e Biologia Molecular