Submitted by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-02-15T15:22:38Z No. of bitstreams: 1 Reprodução Não Autorizada.pdf: 47716 bytes, checksum: 0353d988c60b584cfc9978721c498a11 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-02-15T15:22:53Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Reprodução Não Autorizada.pdf: 47716 bytes, checksum: 0353d988c60b584cfc9978721c498a11 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-02-15T15:23:05Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Reprodução Não Autorizada.pdf: 47716 bytes, checksum: 0353d988c60b584cfc9978721c498a11 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-02-15T15:23:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Reprodução Não Autorizada.pdf: 47716 bytes, checksum: 0353d988c60b584cfc9978721c498a11 (MD5) Previous issue date: 2011-02-25 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Pigmentary disorders such as melasma, freckles, and ephelides have motivated the search for natural products with potential for skin whitening. Given that the main regulatory enzyme of melanin production, tyrosinase can be inhibited by polyphenols and antioxidants, extracts from leaves of Passiflora nitida Kunth, which have been reported as rich in polyphenols and have antioxidant effects, can act as inhibitors of melanogenesis. This study aimed to know the total phenols, the antioxidant effect on tyrosinase, the cytotoxicity and the effect on melanin content of extracts from leaves of P. nitida. Were assessed extracts aqueous by infusion (EAI), aqueous by maceration (EAM), hydroethanolic (EHE) and ethanolic (EE). The EAM showed higher antioxidant activity by DPPH method and by the inhibition of lipid peroxidation and tyrosinase. The percentages of phenolic compounds found in the extracts were EAM = 5.63 ± 0.06%; EAI = 5.10 ± 0.04%, EHE = 3.97 ± 0.08%, EE = 3.35 ± 0, 17%. The median inhibitory concentration (IC50) of DPPH by the extracts were EAM = 38.99 ± 1.56 mg / mL, EHE = 44.16 ± 1.69 mg / mL, EAI = 45.26 ± 0.96 mg / mL, EE = 48.44 ± 0.66 mg / mL and the IC50 of gallic acid was AG = 0.80 ± 0.03 mg / mL. The inhibition of lipid peroxidation reaction at 120 minutes were BHT = 67.55 ± 1.66%, EAI = 56.29 ± 2.63%, EAM = 60.98 ± 2.07%, EHE = 45.04 ± 3 22%, EE = 23.22 ± 3.83%. The extracts also inhibited the tyrosinase which IC50 of kojic acid, the EAI, EAM, EHE and EE respectively were: 0.001 ± 1, 475 ± 28, 440 ± 27, 879 ± 32, 901 ± 29 mg / mL. The cytotoxicity of EAM on NIH 3T3 fibroblasts, melanoma B16F10 and Melan-a melanocyte was time dependent. Was lower for fibroblasts and melanocytes than melanoma. The EAM showed no antioxidant activity in NIH 3T3. EAM at concentrations of 10 and 25 mg / ml in B16F10 induced increase of melanin content to 196 ± 15% and 217 ± 20% respectively and in Melan-a concentrations of 6.25, 12.50 and 25 mg / ml reduced the melanin content to 90 ± 8, 84.8 ± 0.6 and 54 ± 4% respectively. Thus, one can say that EAM was able to reduce the level of melanin in melanocytes, with greater cytotoxicity for melanoma than for fibroblasts and melanocytes. / Distúrbios de pigmentação tais como melasmas, sardas, manchas e efélides têm motivado a procura por produtos naturais com potencial clareador de pele. Tendo em vista que a principal enzima reguladora da produção de melanina, a tirosinase, pode ser inibida por polifenóis e antioxidantes, os extratos das folhas de Passiflora nitida Kunth, que já foram relatados como ricos em polifenóis e ter efeito antioxidante, podem funcionar como inibidores da melanogênese. Esse estudo visou conhecer o teor de fenóis totais, a atividade antioxidante o efeito sobre a tirosinase, a citotoxicidade e o efeito sobre o teor de melanina de extratos das folhas de P. nitida. Foram avaliados os extratos aquoso por infusão (EAI), aquoso por maceração (EAM), hidroetanólico (EHE) e etanólico (EE). O EAM apresentou maior atividade antioxidante pelo método do DPPH e pelo método de inibição da lipoperoxidação e da tirosinase. As porcentagens de fenóis totais encontradas nos extratos foram EAM = 5,63 ± 0,06 %; EAI = 5,10 ± 0,04 %; EHE = 3,97 ± 0,08 %; EE = 3,35 ± 0,17 %. As concentrações inibitórias medianas (CI50) do DPPH pelos extratos foram EAM = 38,99 ± 1,56 μg/mL, EHE = 44,16 ± 1,69 μg/mL, EAI = 45,26 ± 0,96 μg/mL; EE = 48,44 ± 0,66 μg/mL e a CI50 do ácido gálico foi AG = 0,80± 0,03 μg/mL. A inibição da lipoperoxidação aos 120 minutos de reação foram BHT = 67,55 ± 1,66 %, EAI = 56,29 ± 2,63 %, EAM = 60,98 ± 2,07 %, EHE = 45,04 ± 3,22 %, EE = 23,22 ± 3,83 %. Os extratos também inibiram a enzima tirosinase cujas CI50 do ácido kojico, do EAI, EAM, EHE e EE respectivamente foram: 1 ± 0,001; 475 ± 28 ; 440 ± 27; 879 ± 32; 901 ± 29 μg/mL. A citotoxicidade do EAM sobre o fibroblasto NIH 3T3, o melanoma B16F10 e o melanócito Melan-a foi tempo dependente. Sendo menor para o fibroblasto e o melanócito. O EAM não apresentou atividade antioxidante em NIH 3T3. O EAM nas concentrações de 10 e 25 μg/mL em B16F10 induziu o aumento do teor de melanina para 196 ± 15 % e 217 ± 20 % respectivamente e em Melan-a nas concentrações de 6,25; 12,50 e 25 μg/mL reduziu o teor de melanina para 90 ± 8; 84,8 ± 0,6 e 54 ± 4 % respectivamente. Assim, pode-se dizer que o EAM foi capaz de diminuir o teor de melanina em melanócito, com maior citotoxicidade para melanoma do que para fibroblasto e melanócito.

Submitted by Marlene Santos (marlene.bc.ufg@gmail.com) on 2016-12-21T15:53:06Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Igor Godinho Portis - 2015.pdf: 1381751 bytes, checksum: 82c1841407115b20ec4e6f5d2f786b17 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-12-26T14:18:16Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Igor Godinho Portis - 2015.pdf: 1381751 bytes, checksum: 82c1841407115b20ec4e6f5d2f786b17 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-12-26T14:18:16Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Igor Godinho Portis - 2015.pdf: 1381751 bytes, checksum: 82c1841407115b20ec4e6f5d2f786b17 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2015-02-24 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Paracoccidioidomycosis is the most prevalent systemic mycosis in Latin America, caused by fungi of the genus Paracoccidioides. The fungus grows as mycelium in the saprophytic environment, with the infection caused mycelium propagules and/or conidia, that will differentiate into the yeast form. Copper is an essential micronutrient for eukaryotes and bacteria, is extremely important to various proteins, and cofactor of many enzymes and used in many biochemical processes. However, excessive, copper can cause damage to proteins, lipids and nucleic acids, inferring the importance of this metal homeostasis. The objective of this study was to evaluate the fungus Paracoccidioides sp behavior in the presence of copper excess, through proteomics analysis. In the presence of copper excess, the yeast colonies of Paracoccidioides sp. depicted brown color. Expression of transcripts encoding CTR3, a copper transporter and the copper chaperone ATX1 showed inhibition and induction, respectively in the presence of excess copper, as verified by qRT-PCR. Proteins related to stress responses, with melanin production and pathways for energy, are regulated, suggesting that Paracoccidioides sp. responds to copper excess with detoxification strategies, protection and induction of various pathways of obtaining energy. / Paracoccidioidomicose é a micose sistêmica mais prevalente da América Latina, causada por fungos do gênero Paracoccidioides spp. O fungo cresce como micélio no ambiente saprofítico, sendo a infecção causada por propágulos de micélio e ou conídios, que se diferenciam na forma leveduriforme no hospedeiro. O cobre é um micronutriente essencial para eucariotos e bactérias, de extrema importância a várias proteínas, sendo cofator de muitas enzimas e utilizado em diversos processos bioquímicos. Entretanto em excesso, o cobre pode provocar danos a proteínas, lipídeos e ácidos nucléicos, por isso a importância da homeostase desse metal. O objetivo deste estudo foi avaliar o comportamento do fungo Paracoccidioides sp. em presença de excesso de cobre, através de análise proteômica. Na presença de excesso de cobre, as colônias leveduriformes de Paracoccidioides sp. apresentaram coloração marrom. A expressão dos transcritos codificantes do transportador de cobre Ctr3 e da chaperona Atx1, apresentaram inibição e indução, respectivamente na presença de excesso de cobre, como verificado através de qRT-PCR. Proteínas relacionadas a respostas ao estresse, com produção de melanina e com vias para obtenção de energia, foram reguladas, o que sugere que Paracoccidioides sp. responde ao estresse de excesso de cobre com estratégias de desintoxicação celular, proteção e indução de várias vias de obtenção de energia.

O hormônio concentrador de melanina (MCH) foi inicialmente identificado em peixes teleósteos por regular a mudança de coloração, agregando os grânulos de pigmentos nas células pigmentares, levando ao clareamento dos animais. Possui dois receptores conhecidos: MCHR1, encontrado em todas as espécies, e o MCHR2, no SNC de alguns mamíferos e em outros tecidos de teleósteos. Devido a sua ampla distribuição, diversos estudos tem investigado o papel do MCH como um peptídeo que exerce diversas funções fisiológicas: regulação da ingestão de alimentos em mamíferos e peixes, regulação da resposta ao stress e à ansiedade, comportamento, locomoção, reprodução, sono, memória, inflamação. O objetivo desse trabalho foi investigar a possível participação do MCH na ativação das vias de sinalização para oxido nítrico em células de eritroforoma de Carassius auratus (GEM-81). Adicionalmente, incluímos o hormônio estimulador de melanócitos - ?-MSH no estudo, pois este é antagônico ao MCH nas mais diversas funções. Demonstramos que em GEM-81 ocorre a expressão da isoforma iNOS sem o estimulo de lipopolissacarídeos; e que com o tratamento de MCH e Soro Fetal Bovino (SFB) reduzido a 0,5%, sua expressão foi aumentada com o decorrer do tempo, com o máximo alcançado com 180 min e 360 min. Na produção de nitrito foi observado um aumento muito discreto nos mesmos tempos. O α-MSH não apresentou nenhuma diferença de expressão de iNOS e na produção de nitrito. Nossos dados apontam a existência da via do óxido nítrico em células de eritroforoma de Carassius auratus e sugerem que o MCH possa induzir a produção de oxido nítrico pelo aumento de expressão da iNOS / The melanin -concentrating hormone (MCH) was first identified in teleost fish by regulating the color change, aggregating the pigment granules in pigment cells, leading to bleaching of animals. It has two known receptors: MCHR1, found in all species, and MCHR2, in the CNS of mammals and some other tissues of teleosts. Because of their widespread distribution, various studies have investigated the role of MCH as a peptide that exerts various physiological functions: regulation of food intake in mammals and fish, regulation of stress responses and anxiety, behavior, locomotion, reproduction, sleep, memory and inflammation. The aim of this study was to investigate the possible involvement of MCH in the activation of signaling pathways for nitric oxide in cells of Carassius auratus eritroforoma (GEM -81). Additionally, we include the melanocyte stimulating hormone - α - MSH in the study, as this is antagonistic to MCH in various functions. We demonstrated that GEM -81 isoform expression of iNOS without lipopolysaccharide stimulation occurs, and the treatment with MCH and Fetal Bovine Serum (FBS) reduced to 0.5% increased the expression with the passage of time, the maximum reached at 180 min and 360 min. Regarding nitrite production, it was observed a very modest increase at the same time. The α-MSH showed no difference in the expression of iNOS or production of nitrite. Our data indicate the presence of the nitric oxide pathway in cells of eritroforoma Carassius auratus, suggesting that MCH could induce nitric oxide production by increasing the expression of iNOS .

O objetivo do presente trabalho foi avaliar a ação melanogênica das furanocumarinas, psoraleno e bergapteno assim como do extrato seco das raízes de Brosimum gaudichaudii Trécul, contendo 1,2 % m/m de psoraleno, e 5,2 % m/m de bergapteno. A toxidade celular in vitro foi avaliada pelo teste de incorporação do vermelho neutro em quatro linhagens de células diferentes (fibroblastos-L929, queratinócitos-HaCat, Melanoma-B16F10, e melanócitos-Melam-A) e apresentou resposta dose dependente tanto para os fármacos puros quanto para o extrato de B. gaudichaudii. Quando expostas à radiação ultravioleta do tipo A e B houve aumento da toxicidade, proporcional a dose de radiação. A mutagenicidade e genotoxicidade realizas pelos ensaios de micronúcleo e cometa, mostrou que os compostos são genotóxicos e mutagênicos em doses >= 150 ?g.mL-1.A síntese de melanina in vitro realizada em cultura de melanoma B16F10 foi dependente da dose e do tempo de exposição aos fármacos e UV. Nas concentrações máximas usadas (48 ?g.mL-1 de psoraleno, 104 ?g.mL-1 de bergapteno e 0,5 mg.mL-1 de extrato) o psoraleno aumentou a produção de melanina em 26 %, o bergapteno em 69 %, e o extrato de B.gaudichaudii em 163 %. Quando utilizado mistura equivalente 6 ?g.mL-1 de psoraleno e 26 ?g.mL-1 de bergapteno a presente em 0,5 mg.mL-1 de extrato a produção de melanina foi de 61%. A atividade da tirosinase em culturas de B16F10, tratadas com 20 ?g.mL-1 de psoraleno ou bergapteno, quando comparada ao grupo não tratado aumentou em 13% a atividade enzimatica , quando associados foi de 37%, e 0,5 mg.mL-1 de extrato em 54,1%. Com o ensaio de microdiálise in vivo observou-se que os fármacos são rapidamente absorvidos pela pele e distribuídos no plasma. Ambos os composto apresentaram um cinética linear . O estudo de produção de melanina in vivo confimou que a radiação estimula a produçao de melanina assim como o extrato de B.Gaudichaudii, e quando associados (PUVA) a sintese de melanina foi 143% maior em comparação ao controle negativo. Os resultados destre trabalho mostrou a capacidade de pgmentaçao dos fármacos assim como do B.Gaudichaudii, revelando ainda o sinergismo entre psoraleno e bergapteno. / The objective of this study was to evaluate the melanogenic action of furanocoumarins, namely, psoralen and bergapten, as extract of Brosimum gaudichaudii Trécul containing 1.2% m / m (psoralen), 5.2% m / m (bergapten) . The cellular toxicity (in vitro) was evaluated by neutral red incorporation test in four different cell lines (fibroblasts, L929, keratinocytes, HaCaT, melanoma, B16F10, and melanocyte- Melam-A) and showed dose dependent response to both extracted compounds, as well as the whole extract of B. gaudichaudii. The ultraviolet radiation type A and B increased the toxicity associated with the compounds and severity of toxicity was proportional to the radiation dose. The mutagenicity and genotoxicity evaluated by the micronucleus test and comet showed that the compounds are genotoxic and mutagenic compounds at concentrations >= 150 ?g/mL. The in vitro melanin synthesis, performed in melanoma B16F10, was dose, duration and UV dependent. In the maximum concentration used (48 ?g/mL psoralen, 104 ?g/mL bergapten and 0.5 mg.mL-1 extract) psoralen increased melanin synthesis by 26%, bergapten by 69% and the B.gaudichaudii extract by 163%. When administered as an equivalent mixture of 6 ?g/mL psoralen and 26 ?g/mL of bergapten to 0.5 mg/mL of extract, melanin synthesis was increased by 61%. The enzymatic activity of tyrosinase in B16F10 cultures treated with 20 ?g/mL of psoralen or bergapten, when compared to non-treated group, increased by 13%; the increases were 37% and 54.1% in the two-compound mixture and 0.5 mg/mL of whole extract. The in vivo microdialese test in rats showed that the drugs are quickly absorbed through the skin and distributed in plasma. Both compound exhibited linear kinetics. The in vivo evaluation also showed that melanin production was stimulated by UV radiation as well as B.Gaudichaudii extract. When combined with PUVA, melanin synthesis was 143% higher compared to the negative control

Orientador: Douglas Soares Galvão / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Fisica Gleb Wataghin / Made available in DSpace on 2018-08-12T10:36:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ValegaMackenzie_FidelOrlando_M.pdf: 2711520 bytes, checksum: 6eef4b8eb7c976af1efdb0f0bb711dd0 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Nesta dissertação foram estudados, utilizando um enfoque semiempírico e de primeiros princípios, a estrutura e as propriedades eletrônicas de alguns precursores de alomelaninas. As alomelaninas fazem parte de uma classe de pigmentos escuros presentes numa grande variedade de organismos e seus precursores são formados por unidades monoméricas de o-benzoquinona e catecol. Devido à limitada disponibilidade de dados experimentais realizamos inicialmente uma comparação das diferentes grandezas, como momentos de dipolo e entalpias de formação, obtidas a partir de diversas metodologias dentro as quais se incluem Hartree-Fock e DFT, para escolher um modelo semiempírico que descreva melhor o comportamento eletrônico da o-benzoquinona e do catecol. Os modelos semiempíricos utilizados foram o AM1 e o PM3, onde o primeiro parece oferecer melhores resultados reproduzindo as estruturas determinadas pelos métodos ab initio, assim como os dados experimentais disponíveis. Consideramos a formação de dímeros a partir de ligações carbono-carbono e carbono-oxigênio-carbono entre diferentes monômeros. Em geral estas estruturas resultaram ser boas aceitadoras de um e até dois elétrons. Nenhum tipo de régio-seletividade foi observada nos dímeros. É provável que a falta de sítios preferenciais na dimerização resulte no fato das alomelaninas serem amorfas. Os espectros de absorção para as formas neutras e iônicas dos precursores também foram simulados / Abstract: In this work we studied, on the basis of a semiempirical and ab initio approaches, the structure and electronic properties of some allomelanins precursors. Allomelanins are part of an ubiquitous class of dark pigments known as melanins and their precursors are formed by monomers of catechol and o-benzoquinone units. Due to the lack of extensive experimental data we first compared different quantities such as dipole moment and enthalpy of formation obtained from several methodologies including Hartree-Fock and DFT, in order to choose a semiempirical model that better describes the electronic behavior of o-benzoquinone and catechol. The semiempirical models used were AM1 and PM3, where the former seems to better reproduce the structures found by ab initio methods as well as the limited available experimental data. We have investigated monomers and some dimers formed through carbon-carbon and carbon-oxygen-carbon linkages from different monomers. In general those structures resulted to be good electron acceptors, accepting one, and in some cases, two electrons. No regioselectivity was found for the dimers. Perhaps the nonexistence of preferential dimerization sites can explain why allomelanins are amorphous. Absorption spectra for neutral and ionic forms of the precursors were also simulated / Mestrado / Física / Mestre em Física

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A legislação brasileira para cosméticos exige que os apelos mercadológicos desses produtos sejam comprovados. Os testes in vivo utilizando animais para avaliação desta categoria de produtos ou os princípios ativos nela contidos são, atualmente, bastante criticados. O presente trabalho teve como objetivo desenvolver um modelo de cultura de pele humana e avaliar a viabilidade dos melanócitos durante o período de 7 dias. A manutenção do tecido foi avaliada pela observação microscópica após coloração com HE e Masson, os melanócitos ativos pela reação de DOPA e a melanina pela coloração Fontana-Masson. Fragmentos de pele com 2mm2 mantidos em meio de Leibovitz à temperatura ambiente e atmosfera com 95% de ar e 5% de CO2, sofreram menos alterações morfológicas comparados aos mantidos em DMEM à temperatura de 37°C, 5% de CO2, 40% de O2 e 55% de N2. Fragmentos com 20mm2 mantidos em Leibovitz apresentaram alterações semelhantes aos de 2mm2. Células em divisão foram observadas em amostras de pele mantidas em Leibovitz enriquecido com SFB e ácido retinóico. A presença de melanina foi verificada durante todo o período de cultura, bem como a dos melanócitos, que se mostraram DOPA reativos. A radiação UVA/UVB, empregada com a finalidade de verificar se os melanócitos sofriam alguma alteração na atividade e morfologia, não provocou qualquer mudança nestas células, por outro lado induziu uma redistribuição da melanina nos queratinócitos dos fragmentos irradiados. Os resultados obtidos mostraram que é possível manter pele humana em cultura por 7dias, bem como a viabilidade dos melanócitos e sugere ser possível a aplicação do modelo estudado em futuros ensaios de eficácia e segurança de produtos tópicos. / The Brazilian law for cosmetics demands that the marketing of these products should be proofed. The tests in vivo utilizing animals for evaluation of this category of products or the active components in it, are very criticized nowadays. The present work had as an objective to develop a model of culture of human skin, and evaluate the viability of the melanocytes during a period of 7 days. The maintenance of the tissue was evaluated by the microscopic observation after coloring with HE and Masson, the active melanocytes by the DOPA reaction and the melanin by coloring of Fontana-Masson. Fragments of skin with 2mm2 kept in Leibovitz at room temperature and atmosphere with 95 % of air and 5 % of CO2, presented less morphologic alterations than the ones kept in DMEM at the temperature of 37, 5% of CO2, 40% of O2 and 55% of N2. Fragments with 20mm2 kept in Leibovitz presented similar alterations to the 2mm2. Mitotic cells were observed in samples of skin kept in enriched Leibovitz with FBS and retinoic acid. The presence of melanin was verified through all of the period of culture as well as the melanocytes that were DOPA-reactive. The radiation UVA/UVB, used with the aim of verifying if the melanocytes presented any alteration in the activity and morphology, didn\'t provoke any changes in the cells, on the other hand it induced a redistribution of the melanin in the keratinocytes of the irradiated fragments. The results obtained showed that it is possible to keep the human skin in culture for 7 days as well as the viability of melanocytes, and suggests the possibility of application of the studied model in future research on the efficacy and the safety of topic products.

A coloração dos vertebrados deve-se a presença de pigmentos, sintetizados e/ou armazenados em células denominadas células pigmentares cutâneas. A mudança de cor nos vertebrados é principalmente regulada por α-MSH e uma família de enzimas melanossômicas, que incluem tirosinase e as proteínas relacionadas à tirosinase 1 e 2 (TRP-1 e TRP-2, respectivamente). Sua ação está ligada à dispersão dos melanossomos ou síntese de melanina, processos que resultam em escurecimento do animal, enquanto a agregação ou inibição de síntese leva ao seu empalidecimento. Opsinas, como a melanopsina e a rodopsina, além de presentes na retina, podem ser expressas em células pigmentares cutâneas, intermediando foto-respostas de proliferação e de dispersão de melanossomos. O objetivo deste trabalho foi investigar a expressão temporal da rodopsina, tirosinase e do receptor MC1R, bem como os efeitos do tratamento com α-MSH 10-7 M, 10-8 M e 10-9 M por 24 horas sobre esses parâmetros, em melanócitos B16 de Mus musculus, mantidos em escuro constante. Através de PCR em tempo real (quantitativo) demonstrou-se que α-MSH 10-7 M não modula os níveis de mRNA para o receptor MC1R quando comparado com o grupo controle, contudo há uma evidente tendência de redução dos níveis do transcrito. Todavia, na concentração de 10-8 M, observou-se um aumento estatisticamente significativo no nível do transcrito na hora 20 quando comparado ao grupo controle e na concentração de 10-9 M o tratamento mostrou uma diminuição estatisticamente significativa no nível do transcrito entre o grupo controle e o tratado para cada ponto temporal analisado. Para a rodopsina, foi demonstrado que &alpha-MSH 10-7 M modula os níveis do mRNA quando comparado ao grupo controle, mostrando uma diminuição estatisticamente significativa na hora 0 e 16. Na concentração de 10-8 M houve um aumento estatisticamente significativo nos níveis do transcrito na hora 4 quando comparado ao grupo controle. Já, na concentração de 10-9 M, o hormônio induziu um robusto aumento no nível do transcrito quando comparado ao grupo controle para cada ponto temporal analisado. Nossos resultados são pioneiros em demonstrar a modulação de rodopsina por α-MSH, pois não há dados na literatura, seja em retina ou em outros tecidos, que tenham investigado essa ação do hormônio melanotrópico. O mesmo padrão foi observado para a tirosinase, demonstrando uma diminuição estatisticamente significativa na concentração de 10-7 M na hora 0 e um aumento significativo na concentração de 10-8 M na hora 8 e na concentração de 10-9 M na hora 12 e 8. Através de PCR em tempo real (quantitavo) nós demonstramos que α-MSH apresenta uma modulação dose-dependente para o transcrito do mRNA do receptor MC1R, tirosinase e rodopsina, mas não sincronizou a expressão desses genes, que permaneceram arrítmicos / In vertebrates, skin color is given by pigments, synthesized and/or stored in cutaneous pigment cells. The vertebrate color change is mainly regulated by α-MSH and a family of melanosome enzymes, which includes tyrosinase and tyrosinaserelated proteins 1 and 2 (TRP-1 and TRP-2, respectively). α-MSH action is associated with melanosome dispersion or melanin synthesis, processes which lead to skin darkening, whereas melanin aggregation or synthesis inhibition results in skin lightening. Opsins, such as melanopsin and rhodopsin, may be expressed in skin pigment cells, besides being present in the retina, and mediate non visual photoresponses such as cell proliferation and melanosome dispersion. The aim of this study was to investigate the temporal expression of rhodopsin, tyrosinase and the receptor MC1R, as well as the effects of 10-7 M, 10-8 M and 10-9 M α-MSH for 24 hours in Mus musculus B16 melanocytes, kept in constant darkness. Using real time PCR (quantitative) we demonstrated that 10-7 M α-MSH does not modulate MC1R mRNA levels, as compared to the control group, although a tendency to reduction was evident. On the other hand, at the concentration of 10-8 M, we observed a statistically significant increase of the transcript level at the hour 20, as compared to the control group and at the concentration of 10-9 M the treatment showed a statistically significant decrease of the transcript level for each temporal point analyzed. For rhodopsin, we showed that 10-7 M α-MSH modulates mRNA levels, as compared to the control group, demonstrating a statistically significant decrease at the hour 0 and 16. At the concentration of 10-8 M there was a statistically significant increase of transcript levels at the hour 4, as compared to the control group. The hormone at 10-9 M induced a robust increase of the transcript levels, as compared to the control group, for each time point analyzed. Our results are pioneering in demonstrating the regulation of rhodopsin by α-MSH, since there are no data in the literature which report the action of melanotropic hormone on rhodopsin in either the retina or other tissues. Similar pattern was observed for the tyrosinase gene, demonstrating a statistically significant decrease in the concentration of 10-7 M at the hour 0 and a significant increase in the concentration of 10-8 M at the hour 8 and in the concentration of the 10-9 M at the hour 12 and 8. Using real time PCR (quantitative) we demonstrated that α-MSH shows a dose-dependent modulation for mRNA transcripts of the MC1R receptor, tyrosinase and rhodopsin, but the hormone was not able to synchronize the expression of these genes, which remained arhythmic

A área incerto-hipotalâmica (IHy) está envolvida no controle neuroendócrino de fêmeas, com associação de suas células MCHérgicas (hormônio concentrador de melanina). Em ratos, a área pré-óptica medial (MPA), o núcleo periventricular anteroventral (AVPe) e o núcleo arqueado (Arc) são mais densamente inervadas pela IHy em fêmeas do que em machos, sugerindo um dimorfismo sexual das projeções da IHy relevantes para o controle reprodutivo. Nosso objetivo é caracterizar as áreas relacionadas ao controle reprodutivo inervadas pela IHy em camundongos fêmeas, utilizando traçador neuronal anterógrado, analisar a inervação das células GnRH (hormônio liberador de gonadotrofinas) da MPA pela IHy e analisar a inervação do AVPe e Arc pela IHy, usando camundongos Kiss1-hrGFP. Como resultado, observamos que MPA, AVPe e Arc recebem projeções da IHy, assim como áreas relacionadas ao circuito de defesa. Nos animais Kiss1-hrGFP, não encontramos inervação de células KiSS-1 pela IHy. Problemas metodológicos impossibilitaram a análise das projeções da IHy para os neurônios GnRH. / The incerto-hypothalamic area (IHy) is related to the neuroendocrine control of females, involving their MCHergic cells (melanin-concentrating hormone). In rats, the medial preoptic area (MPA), the anteroventral periventricular nucleus (AVPe) and the arcuate nucleus (Arc) are more densely innervated by IHy in females than in males, suggesting a sexual dimorphism of IHy projections relevant to reproductive control. Our aim is to characterize the areas related to reproductive control innervated by IHy in female mice using anterograde neuronal tracer, analyze the innervation of GnRH cells (gonadotropin-releasing hormone) of MPA by IHy and analyze the innervation of AVPe and Arc by IHy using Kiss1-hrGFP mice. As a result, we observed that MPA, AVPe and Arc are innervated by IHy, as well as areas related to the defensive circuit. In Kiss1-hrGFP animals, KiSS-1 cells were not innervated by IHy cells. Methodological problems made it impossible to analyze the projections of IHy to the GnRH neurons.

Melanina é um polímero constituído por uma grande heterogeneidade de monômeros tendo como característica comum a presença de grupos indóis. Por outro lado, a eumelanina produzida pela oxidação enzimática da tirosina é um polímero mais simples constituído principalmente de monômeros 5,6-dihidroxindol (DHI) e de indol-5,6-quinona (IQ). Tirosinase é a enzima chave na produção de melanina, sendo que a sua atividade cinética é medida em função da formação do intermediário dopacroma. Nanopartículas (NPs) de sílica são partículas nanométricas compostas de oxido de silício e são obtidas pelo processo sol-gel desenvolvido por Stöber de hidrólise e condensação de tetraetilortosilicato (TEOS), usando etanol como solvente em meio alcalino. As NPs foram funcionalizadas com 3-Aminopropiltrietoxissilano (ATPES) e depois com glutaraldeído. Este último permitiu a imobilização da tirosinase na superfície da sílica. Caracterizamos as NPs antes e após a reação da enzima, a atividade catalítica da enzima ligada à NP e o mecanismos de formação de melanina na superfície da sílica. As NPs foram caracterizadas por espectrofotometria de absorção e de reflectância, termogravimetria e microscopia eletrônica. A síntese da NP de sílica retornou partículas esféricas com 55nm de diâmetro e a funcionalização da partícula mostrou modificar eficientemente a sua superfície. A imobilização da tirosinase por ligação covalente foi de 99,5% contra 0,5% da adsorção física. A atividade da tirosinase foi caracterizada pela formação de dopacroma. O Km da enzima imobilizada não sofreu alteração em comparação com a tirosinase livre, mas a eficiência catalítica - que considera a eficiência recuperada - foi de apenas 1/3 para a enzima ligada covalentemente, significando que 2/3 das enzimas ligadas não estão ativas. Obtivemos NPs revestidas com melanina a partir de oxidação de tirosina solubilizada em duas preparações: NP com tirosinase ligada covalentemente na superfície e NP funcionalizada com glutaraldeido dispersa em solução de DHI e IQ. O revestimento de melanina foi na forma de um filme fino com espessura ~1,9nm, conferindo perfil de absorção luminosa equivalente ao da própria melanina. Mostramos que o mecanismo de polimerização passa pela oxidação da tirosina pela tirosinase, que gera intermediários oxidados (principalmente DHI e IQ) que vão para solução (mesmo quando a tirosinase está ligada covalentemente na sílica). Estes intermediários ligam-se ao glutaraldeido e a superfície da sílica passa a funcionar como ambiente de polimerização da melanina. / Melanin is a polymer consisting of a large heterogeneity of monomers having as a common feature the presence of indole groups. Contrarily, eumelanin produced by enzymatic oxidation of tyrosine is a simpler polymer consisting mainly of 5,6-dihidroxindol (DHI) and indole-5,6-quinone (IQ) monomers. Tyrosinase is the key enzyme in melanin production, and its kinetic activity is measured by the formation of the intermediate dopacroma. Nanoparticles (NPs) are made of silica nanoparticles of silicon oxide and are obtained by sol-gel method developed by Stöber of hydrolysis and condensation of tetraethylorthosilicate (TEOS), using ethanol as solvent in an alkaline medium. NPs were functionalized with 3-Aminopropyltriethoxysilane (ATPES) and then with glutaraldehyde. The latter allows the immobilization of tyrosinase on the silica surface. We characterized NPs before and after the reaction of the enzyme, the catalytic activity of the enzyme bound to the NP and melanin-forming mechanisms on the silica surface. NPs were characterized by absorption spectrophotometry and reflectance, electron microscopy and thermogravimetric analysis. The synthesis of silica NP returned spherical particles of 55nm diameter and particle functionalization showed efficiently modify its surface. The immobilization of tyrosinase by covalent bond was 99.5% versus 0.5% by physical adsorption. The activity of tyrosinase was characterized by the formation of dopacroma. The Km of the immobilized enzyme did not change compared to the free tyrosinase, but the catalytic efficiency - considering the recovered efficiently - was only 1/3 for the enzyme covalently bound, meaning that 2/3 of the enzymes are not connected active. We obtained melanin coated NPs from tyrosine oxidation in two preparations: NP with covalently bound tyrosinase in the NP surface and NP functionalized with glutaraldehyde dispersed in DHI and IQ solution. The melanin coating was in the form of a thin film with the thickness of ~ 1,9 nm, giving light absorption profile equivalent to that of melanin itself. We showed that the polymerization mechanism involves the oxidation of tyrosine by tyrosinase, which generates oxidized intermediates (especially DHI and lQ) that go into solution (even when tyrosinase is covalently bound to the silica). These intermediates bind the glutaraldehyde and the surface of the silica begins to function as an environment for melanin polymerization.