O câncer de mama é o carcinoma que mais acomete mulheres no Brasil. Os tratamentos disponíveis são recomendados a partir da análise de fatores de prognóstico como a classificação pelo sistema TNM, tipo histológico, status de receptores hormonais e marcadores de proliferação tumoral. No entanto, a classificação dos tumores de mama é muito variável e o poder prognóstico dos marcadores tumorais atuais ainda é limitado, levando muitas pacientes à terapia adjuvante desnecessária. Portanto, novos métodos de prognóstico mais sensíveis são necessários para melhorar a tomada de decisão na clínica oncológica de pacientes com câncer de mama. Do ponto de vista de ciência básica, as modificações transcricionais associadas à oncogênese e progressão do câncer de mama ainda são pouco conhecidas. Além da alteração na expressão de genes codificadores para proteínas, evidências recentes sugerem que RNAs não-codificadores (ncRNAs) podem ter um papel importante na transformação maligna. Este projeto teve como principais objetivos: i) investigar a expressão de ncRNAs intrônicos em amostras de adenocarcinoma de mama e ii) identificar assinaturas de expressão gênica associadas a características anatomo-patológicas e clínicas de tumores de mama com potencial aplicação clínica. Para isso, foram comparados os perfis de expressão gênica de 58 amostras de tecido tumoral de mama, com seguimento clínico conhecido, utilizando uma plataforma de microarranjos de cDNA, enriquecida em ncRNAs provenientes de regiões intrônicas de genes humanos conhecidos. 9 Durante o projeto foram testadas diferentes metodologias para análise da expressão gênica utilizando microarranjos de cDNA com uma ou duas cores. O desenho experimental das hibridizações incluiu a co-hibridização de cada microarranjo com alvos fluorescentes representando o transcritoma da amostra de tumor juntamente com um oligonucleotídeo referência complementar a uma região presente em todas as sondas de cDNA (RefOligo). Este desenho experimental permitiu a avaliação de duas abordagens de análise da expressão gênica: a primeira baseada nas intensidades diretas de cada transcrito (One-Color) e a segunda baseada em razões de expressão onde a intensidade de cada transcrito foi normalizada pelo oligonucleotídeo referência (RefOligo). A utilização direta das intensidades se mostrou mais reprodutível e sensível para a detecção de assinaturas de expressão correlacionadas com características das amostras de mama, e essa abordagem foi escolhida para as análises subseqüentes. Os dados provenientes dos experimentos de microarranjos revelaram níveis de expressão ubíqüos dos transcritos intrônicos nas amostras analisadas, extendendo para o câncer de mama a relevância do estudo desta classe de ncRNAs. Além disso, foi identificada uma assinatura contendo 95 transcritos, correlacionada com o status de expressão do receptor de estrogênio (REr), dos quais cerca de 15% correspondem a ncRNAs. Utilizando apenas amostras com seguimento clínico superior a 4 anos, foi identificada uma assinatura com 113 transcritos, dos quais cerca de 30% são ncRNAs intrônicos, capaz de distinguir com 100% de acurácia pacientes que desenvolveram metástase daqueles que permaneceram livres da doença. Além de contribuir com novos candidatos a marcadores de prognóstico no câncer de mama, este estudo aponta para a participação de ncRNAs intrônicos em complexas redes transcricionais, possivelmente modulando a expressão de genes codificadores para proteínas. A caracterização detalhada da função de ncRNAs com expressão correlacionada a características fenotípicas e clínicas dos tumores de mama deverá fornecer novas informações sobre as bases moleculares da tumorigênese e progressão desta neoplasia. / Breast carcinoma is the most frequently occurring cancer amongst women in Brazil. The treatments available for breast cancer are prescribed based on the results of prognostic factors, such as the TNM classification system, histological type, hormonal receptor status and tumoral markers for cell proliferation. Nevertheless, breast cancer classification can be variable and inconsistent, and the prognosis power of tumoral markers is still limited, resulting in many patients unnecessarily undergoing adjuvant therapy. Therefore, there is an urge for new prognosis methods that are more sensitive, as well as accurate, in order to improve treatment decisions for breast cancer patients. From a basic science perspective, transcriptional modifications associated with oncogenesis and breast cancer progression are still poorly understood. Beyond alterations of the expression of protein-coding genes, recent evidences suggest that non-coding RNAs (ncRNAs) might have an important role in malignant transformation. The main goals of this project are: i) to investigate the expression of intronic ncRNAs in breast cancer tissue and ii) to identify gene expression signatures correlated to anatomo-pathological and clinical characteristics of human breast tumors, with a potential clinical aplication. To achieve this, gene expression profiles of 58 breast tumor samples with clinical follow-up were compared using a microarray platform enriched in non-coding RNAs (ncRNAs) derived from intronic regions of known human genes. During this project different gene expression methodologies were tested for the analysis of one- or two-color cDNA microarrays. The experimental design included the co-hybridization of the microarrays with fluorescent targets representing the tumor sample transcriptome with a reference oligonucleotide that is complementary to a 12 common region present in all cDNA probes (RefOligo). This experimental design permited the evaluation of two gene expression analysis approaches: the first based on direct intensities of each transcript (One-Color) and the second based in expression ratios where the intensity of each transcript is normalized by the reference oligonucleotide (RefOligo). One-Color methodology has shown to provide a more reproducible and sensitive gene expression signatures correlated to the breast samples characteristics and, therefore, this approach was chosen for subsequent analysis. The data provided by the microarray experiments revealed that ubiquitous expression of intronic ncRNAs was observed, confirming the relevance of investigating the role of this class of ncRNAs in breast cancer. Furthermore, a gene expression signature comprising 95 transcripts and correlated to the estrogen receptor status of breast tumor samples was identified, from which approximately 15% are ncRNAs. Using only samples from patients with known follow-up, a signature of 113 transcripts was identified, of which 30% are ncRNAs. This gene expression signature was able to distinguish with 100% accuracy patients that developed metastasis from those that remained disease-free up to 4 years after surgery. Besides the contribution of new molecular prognostic markers for breast cancer, the present study indicates that intronic ncRNAs might play a role in complex transcriptional networks, possibly regulating the expression of protein-coding genes. The detailed caracterization of the functional roles of ncRNAs, whose expression levels are correlated to fenotypical and clinical characteristics of breast tumors, is likely to provide new insigths on the molecular basis of tumorigenesis and progression of this neoplasia.

Made available in DSpace on 2016-01-26T12:51:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tiagohenrique_dissert.pdf: 1575194 bytes, checksum: 8271470b67a47a98cbae39ef169a4725 (MD5) Previous issue date: 2010-07-05 / Lung cancer is the most common malignancy in human. The average 5 years survival rate is one of the lowest among aggressive cancers, showing no significant improvement in recent years. When detected early, lung cancer has a good prognosis, but most patients present metastatic disease at the time of diagnostic, which significantly reduces survival rates. Despite all the recent advances in cancer treatment, prognostic of these patients have improved minimally. Objectives: The present study aimed to investigate the molecular profile of non-small cell lung cancer as well as new tumor makers relevant to diagnosis and prognosis of this disease. Methods: Total RNA from frozen surgical tissues was extracted using TRIZOL reagent and RNeasy FFPE kit was used for RNA extraction from formalin fixed, paraffin embedded tissue. Aiming to identify differentially expressed genes involved in lung cancer, we analyzed combined data from normal and tumor SAGE (Serial Analysis of Gene Expression) libraries available in the public domain. Proteome profiling was also analyzed in adenocarcinoma, squamous cell carcinoma and normal surgical margin samples using two-dimensional electrophoresis and mass spectrometry. Results: The statistical analysis of SAGE data indentified a subset of differentially expressed tags between normal surgical margins and adenocarcinoma libraries. Three genes displaying differential regulation in SAGE or proteomic analysis, two up- (COL3A1, CTSB) and one down-regulated (ITGB1) in neoplastic cells, were selected for real-time polymerase chain reaction (PCR) experiments using the same set of samples. Similar to the statistical results, quantitative PCR confirmed the upregulation of COL3A1 and CTSB in carcinomas when compared to tumor free tissues. Conclusion: RNA from frozen and arquived samples is appropriate for amplification experiments by real time PCR, although with lower efficiency among the last ones. Therefore, improved methods of RNA extraction in arquived tissues are suitable for Real Time quantitative RT-PCR, and may be used for gene expression profiling of paraffin embedded tissues from cancer patients. To the best of our knowledge, this is the first study reporting SAGE data analysis in lung cancer. The statistical approach as well as the proteomic evaluation were effective in identifying differentially expressed genes and proteins reportedly involved in cancer development and may be useful to disclose new tumor makers relevant to lung tumorigenesis. / O câncer de pulmão é a neoplasia humana mais comum. As taxas de sobrevida em 5 anos estão entre as mais baixas para tumores agressivos e seus valores não têm mostrado diferenças importantes nos últimos anos. Quando detectado nos estágios precoces, o câncer de pulmão mostra bom prognóstico, mas a maioria dos pacientes apresenta doença metastática no momento do diagnóstico, o que reduz a sobrevida significativamente. Apesar de todo o progresso obtido nos últimos anos em tratamento do câncer, o prognóstico desses pacientes permanece desfavorável. Objetivos: O presente estudo teve como objetivo investigar o perfil molecular de câncer de pulmão de células não pequenas, bem como de novos marcadores tumorais relevantes para diagnóstico e prognóstico dessa doença. Métodos: O RNA total de espécimes cirúrgicos congelados foi extraído pelo método do trizol e o kit RNeasy FFPE foi utilizado para extração de RNA de tecidos fixados em formalina e emblocados em parafina. Com o objetivo de identificar genes diferencialmente expressos envolvidos em câncer de pulmão, dados combinados de bibliotecas SAGE (Serial Analysis of Gene Expression) públicas foram analisados. O perfil protéico foi também avaliado em amostras de adenocarcinoma, carcinoma epidermóide e de margens cirúrgicas normais, utilizando eletroforese bidimensional e espectrometria de massas. Resultados: A análise estatística dos dados de SAGE identificou um conjunto de tags diferencialmente expressas entre as bibliotecas de adenocarcinoma e de margens cirúrgicas. Três genes com expressão alterada na análise de SAGE e de proteômica, dois com níveis elevados (COL3A1, CTSB) e um com nível reduzido (ITGB1) em células neoplásicas, foram selecionados para experimentos de PCR (reação em cadeia da polimerase) em tempo real no mesmo conjunto de amostras. Consistente com os resultados estatísticos, a PCR quantitativa confirmou a expressão elevada de COL3A1 e CTSB em carcinomas quando comparados com o tecido livre de tumor. Conclusão: O RNA de amostras congeladas e arquivadas é adequado para amplificação por PCR em tempo real, embora exiba qualidade mais baixa nessas últimas. Portanto, métodos otimizados para tecidos arquivados permitem análises por PCR quantitativa e podem ser utilizados para avaliação do perfil transcricional de espécimes embebidos em parafina procedentes de pacientes com câncer. Este é aparentemente o primeiro estudo descrevendo a análise de dados de SAGE em câncer de pulmão. As abordagens estatística e proteômica foram efetivas em identificar genes e proteínas diferencialmente expressas envolvidas no desenvolvimento do câncer e podem revelar novos marcadores relevantes para a tumorigênese de pulmão.

O carcinoma de célula renal (RCC) subtipo célula clara é o câncer mais letal e prevalente do sistema urinário. O diagnóstico deste tipo de câncer frequentemente é tardio em conseqüência da falta de sintomas perceptíveis aos pacientes. Um dos objetivos deste trabalho é a identificação de novos marcadores moleculares para diagnóstico precoce, o que ajudaria a diminuir a mortalidade em função de complicações resultantes do avanço da doença. Outro objetivo é a identificação de um conjunto de marcadores moleculares de prognóstico, de modo à prever com acurácia a evolução clínica da doença e, por conseqüência, o tempo de sobrevida do paciente. As modificações transcricionais associadas à carcinogênese e à progressão do câncer de rim ainda não foram completamente elucidadas. Além dos oncogenes e genes supressores de tumor, RNAs não-codificadores (ncRNAs) recentemente foram apontados como importantes reguladores da expressão gênica em humanos, e podem ter um papel importante na transformação maligna do câncer de rim. Para analisar a expressão gênica de ncRNAs e de genes codificadores para proteína foram utilizados dois microarranjos desenvolvidos por nosso grupo, enriquecidos em sondas para ncRNAs. Uma das plataformas possui 4 mil sondas de cDNA, das quais 822 sondas são para ncRNAs mapeando em regiões intrônicas. Outra possui 44 mil elementos e combina sondas de oligonucleotídeos (60-mer) intrônicas e exônicas de um mesmo locus genômico. Análises estatísticas foram feitas com a ferramenta Significance Analysis of Microarrays (q &#8804; 0,05) combinadas ou com a técnica de \"patient leave-one-out\" (genes com presença em 8 100% dos subconjuntos), ou alternativamente com o teste discriminante de Golub (p &#8804; 0,01 ou p < 0,05). Com a plataforma de 4 mil sondas foram estudadas 30 amostras de tecido renal de 18 pacientes com RCC subtipo célula clara. Um conjunto de 36 ncRNAs foi identificado como diferencialmente expresso entre amostras tumorais e não-tumorais. Uma assinatura adicional de 265 genes codificadores de proteínas foi identificada, indicando possíveis novos marcadores moleculares. Uma análise estatística supervisionada com dados de 16 pacientes identificou uma assinatura de ncRNAs correlacionada com sobrevida de 5 anos, formada por 27 ncRNAs com significativa expressão alterada em pacientes livres da doença em comparação com pacientes que morreram em função da doença. Uma assinatura adicional de 64 genes codificadores de proteínas também foi identificada como significativamente correlacionada com o acompanhamento clínico dos pacientes. Com a plataforma de 44 mil sondas foram analisados 17 pacientes, com amostras pareadas de tecido renal tumoral e não-tumoral agrupadas em 8 pools, sendo 4 de amostras tumorais e 4 de não-tumorais. Um conjunto de 66 ncRNAs parcialmente intrônicos antisenso e outro de 52 ncRNAs totalmente intrônicos antisenso foram identificados como diferencialmente expressos. Identificamos um subconjunto de 28 ncRNAs totalmente intrônicos antisenso e senso cuja expressão do gene codificador de proteína do mesmo locus estava simultaneamente alterada. Estes dados apontam para possíveis redes de regulação da expressão gênica dos ncRNAs em câncer. A extensa lista de ncRNAs e de genes codificadores para proteína identificados neste estudo podem ser promissores marcadores moleculares de carcinoma renal subtipo célula clara. / Renal cell carcinoma (RCC) is the most common malignancy of the adult kidney, and the clear cell subtype is the most prevalent and lethal cancer of the urinary system. Late diagnosis for this type of cancer is frequent, usually as a consequence of the lack of symptoms. One of the objectives of the present work is the identification of new molecular markers for the early diagnosis, which would help decrease mortality that develops as a function of disease progression. Another objective is the identification of a set of prognosis molecular markers, so as to accurately predict the clinical outcome of the disease, and consequently, patient survival. Transcriptional changes associated to carcinogenesis and to kidney cancer progression have not been entirely elucidated. Besides oncogenes and tumor suppressor genes, non-coding RNAs (ncRNAs) have been recently indicated as important regulators of gene expression in humans, and could have an important role in the malignant transformation in renal cancer. In order to measure ncRNA and protein-coding gene expression we have used two microarray platforms developed by our group, which are enriched in ncRNA probes. One of the platforms has 4 thousand cDNA probes, of which 822 are for ncRNAs that map to intronic regions. Another has 44 thousand elements and combines 60-mer oligonucleotide probes for intronic and exonic regions from the same genomic locus. Statistical analyses have been performed with the Significance Analysis of Microarrays tool (q &#8804; 0.05) combined with a patient leave-one-out approach (genes present in 100% of the sub-sets), or alternatively with Golubs discriminant test (p &#8804; 0.01 or p < 0.05). 11 With the 4-thousand probes platform we studied 30 samples from renal tissue of 18 RCC patients with clear cell subtype. A set of 36 ncRNAs has been identified as differentially expressed between tumor and non-tumor tissue. An additional signature of 265 protein-coding genes has been identified, indicating possible new molecular markers. A supervised statistical analysis with data from 16 patients has identified a ncRNA signature correlated to 5-year survival outcome, comprised of 27 ncRNAs with significantly altered expression in diseasefree patients compared to patients who died from cancer within the 5-year follow-up. An additional 64-gene signature of protein-coding genes has been identified as significantly correlated to clinical outcome. With the 44-thousand probes platform we have analyzed 17 patients, with paired tumor and non-tumor samples grouped into 8 pools, of which 4 were from tumor and 4 from nontumor samples. A set of 66 partially intronic antisense ncRNAs and another of 52 totally intronic antisense ncRNAs have been identified as differentially expressed between tumor and non-tumor tissue. A sub-set of 28 totally intronic antisense or sense ncRNAs were identified as having a simultaneous change in expression of the protein-coding gene from the same locus. Overall, the data point to a possible ncRNA regulatory network in cancer. The extensive lists of ncRNAs and of protein-coding genes identified in the present study can be seen as promising molecular markers of RCC from the clear-cell subtype.

Neste trabalho, descreve-se a síntese, caracterização e propriedades dos complexos derivados da tetra(3,4-piridil)porfirazina com os grupos [Ru(bipy)2Cl]1+. A conjugação eletrônica entre o resíduo piridínico e o anel da porfirazina promovem uma eficiente comunicação entre os grupos periféricos e o central, que é refletido no espectro de emissão e seu correspondente perfil de excitação. Esse tipo de comportamento revela um efeito antena no sistema H2TPyPzTRu, contrastante com as propriedades fotofisicas das porfirinas análogas TPyPRu, onde os grupos piridínicos exibem baixa interação eletrônica ao anel porfirínico. Apesar do forte acoplamento eletrônico entre os grupos perféricos e o central, as propriedades eletrônicas dos complexos de rutênio foram preservadas, exibindo potenciais redox muito próximos dos complexos livres e comportamento espectroeletroquímico típicos de complexos metálicos N-heterocíclicos. Esses aspectos levam a novas perspectivas relacionadas à estrutura dos compostos, pois são potencialmente interessantes para o estudo referente à formação de oxigênio singlete e para PDT. Outro direcionamento desta tese, foi o de explorar a geração de novas interfaces baseadas na formação de pares iônicos constituídos pelas espécies H2TPyPzTRu/CuTSPc em comparação com o filme da espécie catiônica H2TPyPzTRu. Através de medidas de espectroscopia de impedância eletroquímica, foram constatados mecanismos distintos de condução nos filmes formados, que pode ser ou um mecanismo misto envolvendo os complexos periféricos e o anel central da porfirazina, ou um mecanismo de condução eletrônica envolvendo somente o sistema de empilhamento &#960; do anel central da porfirazina. / In this work, we describe the synthesis, characterization and properties of derived tetra(3,4-pyridil)porphyrazine complex containing four [Ru(bipy)2Cl]1+ groups. The electronic conjugation between the pyridinium moiety and the porphyrazine ring promote an efficient communication between the peripherical groups and central ring, which is reflected in the emission spectrum and related excitation profile. The observed behavior reveals an efficient antenna effect in the H2TPyPzTRu system. ln spite of the strong electronic coupling between the central and peripherical groups, the electronic properties of ruthenium complex were preserved, exhibiting redox potencials very close to those of free complexes. These aspects provided new perspectives of exploiting the compound strutures, particularly the oxygen singlet formation and PDT application. Another aspect focused in this investigation was the generation of new interfaces based on ion-pair formation of H2TPyPzTRu/CuTSPc, in comparison with its cationic species H2TPyPzTRu alone. By means of electrochemical impedance spectrocopy, it was shown that the conduction mecanisms in these films involve either the peripherical complex and the central porphyrazine ring.

Durante uma infecção o número de linfócitos T aumenta dramaticamente. A fase de expansão clonal é seguida pela redução do nível de células T ativadas que depende, em parte, de um processo de morte celular induzida por ativação (AICD). Nosso grupo mostrou que APCs quando são estimuladas com LPS, um agonista de TLR4, produzem PGE2, que inibe a AICD de linfócitos T CD4+ através da supressão da expressão de CD95L (Weinlich et al, 2008). Porém, os efeitos da estimulação direta de TLR nos linfócitos T sobre o processo de AICD foram pouco elucidados. Sendo assim, o projeto tem como objetivo verificar se a estimulação dos diversos TLRs com seus agonistas é capaz de modular a AICD de hibridomas de linfócito T DO11.10. Inicialmente, demonstramos que este hibridoma expressa os TLR1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9 e 11. Dentre todos os agonistas utilizados somente o Imiquimod, um agonista de TLR7, reduziu a morte celular quando adicionado durante a indução de AICD. O efeito protetor desse agonista foi através da inibição da expressão de CD95L, tanto no nível de mRNA quanto protéico. / During an infection the number of T lymphocytes increases dramatically. The clonal expansion phase is followed by reducing the level of activated T cells that depends, in part, a process of cell death induced by activation (AICD). Our group showed that when APCs are stimulated with LPS, a TLR4 agonist, produce PGE2, which inhibits the AICD of CD4 + T cells by suppressing the expression of CD95L (Weinlich et al, 2008). However, the effects of direct stimulation of TLR on T cells on the process of AICD were little explained. Therefore, the project aims to determine whether the stimulation of different TLRs to their agonist is able to modulate AICD of T lymphocyte hybridoma DO11.10. Initially, we demonstrated that this hybridoma expresses TLR1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9 and 11. Among all agonists used only imiquimod, a TLR7 agonist, reduced cell death when added during the induction of AICD. The protective effect of this agonist was by inhibiting the expression of CD95L, both at the mRNA and protein.

O Huanglongbing (HLB) é uma das mais temidas doenças da citricultura mundial, associada a bactérias do gênero Candidatus Liberibacter, que foram detectadas no Brasil em 2004. Em 2008, detectou-se outra bactéria associada a sintomas de HLB no Estado de São Paulo, que foi caracterizada como sendo um fitoplasma do grupo 16 SrIX. Fitoplasmas são molicutes fitopatógenos restritos ao floema de plantas, disseminados por insetos vetores. O presente trabalho buscou identificar cigarrinhas potencialmente vetoras do fitoplasma associado ao HLB e plantas hospedeiras desses insetos, bem como desenvolver uma técnica de quantificação de DNA desse patógeno em insetos e plantas. Amostragens de cigarrinhas foram realizadas quinzenalmente por 12 meses em dois pomares de laranja com histórico de ocorrência do fitoplasma 16SrIX na região norte do Estado de São Paulo, usando-se armadilhas adesivas amarelas em duas alturas (0,3 e 1,5 m) da copa de árvores cítricas, e rede de varredura na vegetação espontânea. Dados faunísticos identificaram uma espécie de Agalliinae (Agallia albidula Uhler) e três de Deltocephalinae, [Balclutha hebe (Kirkaldy), Planicephalus flavicosta (Stål) e Scaphytopius (Convelinus) marginelineatus (Stål)], como os cicadelídeos (Hemiptera: Cicadellidae) mais abundantes e frequentes nas áreas estudadas. Essas espécies predominaram na amostragem com rede de varredura e na menor altura de coleta com armadilhas adesivas, indicando comportamento de alimentação em vegetação rasteira. Com observações visuais, verificou-se associação das espécies com certas plantas invasoras, e influência da composição florística da vegetação rasteira sobre a abundância das cigarrinhas. S. marginelineatus e P. flavicosta ocorreram com maior frequência em Sida rhombifolia L. e Althernantera tenella Colla, respectivamente, enquanto que A. albidula foi predominante em Conyza bonariensis (L.) Cronq., e B. hebe ocorreu exclusivamente em gramíneas, principalmente Panicum maximum Jacq.. Plantas invasoras amostradas nas áreas foram testadas para a presença do fitoplasma 16SrIX, porém sem resultados positivos. No entanto, amostras de campo da cigarrinha S. marginelineatus foram positivas por PCR e sequenciamento para o referido fitoplasma. Indivíduos de S. marginelineatus criados em laboratório e mantidos por um período de acesso à aquisição de 72 h em citros infectado com o fitoplasma 16SrIX, foram capazes de transmití-lo para citros, após 21 dias de latência, porém com baixa eficiência (0,5%). Por meio de PCR quantitativo desenvolvido para esse fitoplasma, verificou-se baixo título do patógeno tanto em S. marginelineatus, quanto em plantas cítricas infectadas, o que pode explicar, pelo menos em parte, a baixa eficiência de transmissão pelo inseto tendo citros como fonte. Isto sugere a existência de outros hospedeiros mais adequados como fontes de inóculo para aquisição do fitoplasma por S. marginelineatus ou outro vetor ainda desconhecido. / Huanglongbing (HLB) is a severe citrus disease associated to phloemlimited bacteria in the genus Candidatus Liberibacter, which were detected in Brazil in 2004. In 2008, another bacterium was found in association with HLB symptom in the São Paulo State, and characterized as a phytoplasma belonging to 16SrIX group. Phytoplasmas are vector-borne phytopathogenic mollicutes that inhabit plant sieve elements. The goals of this study were to identify potential leafhopper vectors of the HLB-associated phytoplasma and their host plants, as well as to establish a real-time PCR procedure for pathogen quantification in vectors and plants. Leafhoppers were sampled fortnightly for 12 months by yellow sticky cards placed at two heights (0.3 and 1.5 m) on the citrus tree canopy and by sweep net in the ground vegetation of two sweet orange groves with history of infection by the 16SrIX phytoplasma, in the northern region of São Paulo State. Faunistic analyses indicated 1 Agalliinae (Agallia albidula Uhler) and 3 Deltocephalinae [Balclutha hebe (Kirkaldy), Planicephalus flavicosta (Stål) e Scaphytopius (Convelinus) marginelineatus (Stål)] species that were the most abundant and frequent leafhoppers (Hemiptera: Cicadellidae) in the experimental areas. These species predominated in sweep net and in sticky traps catches at 0.3 m above soil, showing that they inhabit the ground vegetation. Visual observations indicated a strong association of leafhopper species with some weeds and the influence of weed species composition on leafhopper abundance in the ground vegetation. S. marginelineatus and P. flavicosta were more frequent on Sida rhombifolia L. and Althernantera tenella Colla, respectively, while A. albidula was observed more often on Conyza bonariensis (L.) Cronq., and B. hebe occurred solely on grasses, more abundantly on Panicum maximum Jacq. Fourteen weed species sampled in the area were PCR tested for infection by the 16SrIX phytoplasma, but none was found infected. Nevertheless, 3 out of 30 field-collected samples (10 adults per sample) of S. marginelineatus tested positive for this phytoplasma by PCR and sequencing. Healthy lab-reared adults of S. marginelineatus were able to transmit inefficiently (0,5%) the 16SrIX phytoplasma to healthy citrus after a 72-h acquisition access period on infected citrus plants followed by a 21-day latent period on S. rhombifolia plants. By using the qPCR method developed for this phytoplasma, a very low pathogen titer was found both in S. marginelineatus and in infected citrus plants, which may explain, at least partially, the low transmission efficiency by this vector using citrus as a source plant. It also suggests that existence of alternative hosts that might be more adequate as inoculum sources for phytoplasma acquisition and spread by S. marginelineatus or another vector yet to be discovered.

Submitted by Maria Bernadete Dos Santos (mariabpds@id.uff.br) on 2017-09-22T13:48:58Z No. of bitstreams: 3 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertação Júlia Bouzon.pdf: 1678915 bytes, checksum: 16d4cd27fa8d6d7bde066b78795adebc (MD5) Blog.pdf: 86753 bytes, checksum: bcebf4c9cb7f91d4ac040492e3927394 (MD5) / Approved for entry into archive by Biblioteca Central do Valonguinho Biblioteca Central do Valonguinho (bcv@ndc.uff.br) on 2017-10-04T21:44:00Z (GMT) No. of bitstreams: 3 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertação Júlia Bouzon.pdf: 1678915 bytes, checksum: 16d4cd27fa8d6d7bde066b78795adebc (MD5) Blog.pdf: 86753 bytes, checksum: bcebf4c9cb7f91d4ac040492e3927394 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-10-04T21:44:00Z (GMT). No. of bitstreams: 3 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertação Júlia Bouzon.pdf: 1678915 bytes, checksum: 16d4cd27fa8d6d7bde066b78795adebc (MD5) Blog.pdf: 86753 bytes, checksum: bcebf4c9cb7f91d4ac040492e3927394 (MD5) / Com uma proposta de atuação na melhoria do processo de Ensino-Aprendizagem de Química, neste trabalho é descrito o uso de metodologias didáticas alternativas para o ensino dos conteúdos curriculares de Geometria Molecular e de Soluções. O primeiro tópico foi abordado com o uso de balões de aniversário como modelos materiais, enquanto para o segundo utilizou-se substâncias comuns no dia a dia dos alunos na busca de um ensino mais contextualizado. A avaliação da aplicação destas metodologias didáticas foi realizada comparativamente (turmas onde as metodologias foram aplicadas versus turmas que não tiveram acesso as mesmas) por meio de questionários sobre a metodologia em si e exercícios sobre os conteúdos disciplinares. Os resultados alcançados foram positivos demonstrando o favorecimento do processo de ensino-aprendizagem, com maior participação dos alunos tanto na discussão quanto na construção do próprio conhecimento. Considerando os resultados observados e a necessidade de trocas entre os docentes de experiências inovadoras utilizadas para a melhoria do Ensino de Química, este trabalho também relata a construção de um blog que objetiva a discussão de metodologias didáticas e a troca de conhecimentos e experiências entre professores de Química. / Based on a proposal to improve the Chemistry teaching-learning process, this work describes the use of alternative methods for teaching the curricular content of Molecular Geometry and Solutions. The first topic was approached using birthday balloons as material models, while for the second we used common substances in students’ everyday lives to provide a more contextualized learning. The evaluation of the implementation of these teaching methodologies was carried out comparatively (classes where the methodologies were applied versus classes that did not have access to these) through questionnaires on the methodology itself and exercises on the subject content. The results were positive, having demonstrated that the teaching-learning process was favored, from the increased participation of students, both in discussion and in the construction of knowledge itself. Considering the observed results and the need for exchanges among teachers who did innovative experiments to improve their teaching of Chemistry, this paper also describes the creation of a blog that aims to discuss teaching methods and promote the exchange of knowledge and experience among Chemistry teachers.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:26:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 AnaLuciaMaroclo2009.pdf: 1015261 bytes, checksum: 6818d5c27f1e4177015775a772152258 (MD5) Previous issue date: 2009-05-08 / Type 1 (T1R) and Type 2 (T2R) leprosy reactions are complications in the clinical management of leprosy patients because they can lead to neural damage and impairment, resulting in irreversible deformities and disabilities. This thesis, presented as research article/manuscript has investigated potential markers for the diagnosis and prognosis of leprosy reactions. In the first study, we evaluated a multicentric cohort of leprosy patients with single skin lesion which is considered the earliest clinical manifestation of the disease. In this study, at the moment of diagnosis a skin biopsy was collected for histopathology and for the investigation of Mycobacterium leprae DNA by polymerase chain reaction (ML-PCR). After diagnosis patients were treated with single dose of Rifampicin, Ofloxacin and Minocyclin (ROM) and were clinically monitored during 3 years .During follow up, around 15% of patients developed T1R. In multivariate analysis, age > 40 years and MLPCR positivity were associated with T1 manifestation. The second study aimed to identify potential circulating markers associated with leprosy reactions. Plasma levels of 27 cytokines/chemokines/growth factors were quantified by multiplex assay. A nested case control study compared the levels of these factors in leprosy patients with or without T1R and T2R. Leprosy patients were paired by sex, age group (+/- 5 years) and histopathological classification. Significant differences in plasma levels of CXCL10 (p=0.004) and IL6 (p=0.013) were observed in patients with T1R compared with controls without reaction. IL7 levels (p=0.039) and PDGF-BB (p=0.041) were increased in T2R and marginally significant for IL6 (p=0.05). This investigation indicated that CXCL10, IL6 and IL7 may represent potential plasma biomarkers of leprosy reactions. The third study investigated the influence of single nucleotide polymorphism (SNP) in the IL6 gene and the development of leprosy reactions. For this purpose a nested case control study was performed based on a cohort of 409 leprosy patients recruited in Goiânia-GO. After leprosy diagnosis patients were monitored during multidrug therapy regarding the appearance of leprosy T1R and T2R. Evidences of positive associations were observed for leprosy T2R and tag SNPs markers- rs 2069832 (p=0.002), rs 2069840 (p=0.027) and rs 2069845 (p=0.044). These IL6 gene tag SNPs capture information of the whole gene locus. Positive association with T2R was also seen for the functional variant of IL6 gene- tag SNP rs 1800795 (p=0.005). Additionally, IL6 plasma levels among TR2 patients and controls without reaction correlated with different IL6 genotypes. No association was observed between IL6 gene variants and leprosy T1R. The description of genetic predictive factors of leprosy reactions may contribute to the development of preventive strategies against these leprosy incapacitating events. / As reações hansênicas do tipo 1 (RT1) e do tipo 2 (RT2) representam complicações no manejo clínico dos pacientes com hanseníase pois podem causar dano neural e conseqüentemente deformidades e incapacidades irreversíveis. Esta tese, apresentada sob a forma de artigo/manuscrito, abordou a identificação de potenciais marcadores para o diagnóstico e prognóstico das reações hansênicas. O primeiro estudo investigou uma coorte multicêntrica de pacientes com lesão única de hanseníase paucibacilar que é considerada a manifestação clínica mais precoce da doença. No momento do diagnóstico os pacientes com lesão única foram submetidos à biópsia de pele para exame histopatológico e para detecção de DNA de Mycobacterium leprae por Reação em Cadeia da Polimerase (ML-PCR). Após o diagnóstico os pacientes foram tratados com dose única de ROM (Rifampicina, Ofloxacina e Minociclina) e acompanhados clinicamente por 3 anos, Durante o acompanhamento, em torno de 15% dos pacientes desenvolveu reação hansênica tipo 1. Em análise multivariada, idade >40 anos e positividade ao DNA do M. leprae por ML-PCR mostraram associação com a ocorrência de reação tipo 1. Visando identificar potenciais marcadores circulantes associados com hanseníase reacional, no segundo estudo, 27 citocinas/quimiocinas/fatores de crescimento plasmáticos foram quantificados simultaneamente por ensaio multiplex. Mediante estudo de casocontrole aninhado comparamos os níveis destes fatores em pacientes com RT1 e RT2 e em pacientes com hanseníase sem reação hansênica. Estes pacientes foram pareados por sexo, grupo etário (+/- 5 anos) e por classificação histopatológica. Diferença significativa nos níveis plasmáticos de CXCL10 (p=0,004) e de IL6 (p=0,013) foi observada em pacientes com RT1 comparados com controles sem reação. Níveis de IL7 (p=0,039) e PDGF-BB (p=0,041) estavam aumentados em pacientes com RT2 e o aumento do nível de IL6 foi marginalmente significativo (p=0,05). Esta análise dos biomarcadores plasmáticos indicou que CXCL10, IL6 e IL7 podem representar potenciais marcadores plasmáticos de reações hansênicas. O terceiro estudo avaliou a influência do polimorfismo de base única (single nucleotide polymorphim/SNP) no gene da IL6 e o desenvolvimento de reações hansênicas. Estudo tipo caso-controle aninhado foi desenvolvido a partir de uma coorte de 409 pacientes com hanseníase, recrutados em Goiânia-GO. Estes pacientes foram monitorados quanto à ocorrência de episódios reacionais tipo 1 e tipo 2 durante a poliquimioterapia. Foram observadas evidências positivas de associação entre RT2 e os marcadores do gene da IL6 tag SNP rs 2069832 (p=0,002), rs 2069840 (p=0,027) e rs 2069845 (p=0,044). Estes marcadores capturam a informação completa do lócus do gene da IL6. Também foi observada associação entre RT2 e a variante funcional do gene da IL6- rs 1800795 (p=0,005). Além disso, níveis plasmáticos de IL6 de pacientes de hanseníase com RT2 e controles sem reação correlacionaram com diferentes genótipos de IL6. Nenhuma associação foi observada entre variantes do gene da IL6 e RT1. A descrição de fatores genéticos preditivos de reações hansênicas pode contribuir para o desenvolvimento de estratégias preventivas contra estes eventos incapacitantes.

Neste trabalho, descreve-se a síntese, caracterização e propriedades dos complexos derivados da tetra(3,4-piridil)porfirazina com os grupos [Ru(bipy)2Cl]1+. A conjugação eletrônica entre o resíduo piridínico e o anel da porfirazina promovem uma eficiente comunicação entre os grupos periféricos e o central, que é refletido no espectro de emissão e seu correspondente perfil de excitação. Esse tipo de comportamento revela um efeito antena no sistema H2TPyPzTRu, contrastante com as propriedades fotofisicas das porfirinas análogas TPyPRu, onde os grupos piridínicos exibem baixa interação eletrônica ao anel porfirínico. Apesar do forte acoplamento eletrônico entre os grupos perféricos e o central, as propriedades eletrônicas dos complexos de rutênio foram preservadas, exibindo potenciais redox muito próximos dos complexos livres e comportamento espectroeletroquímico típicos de complexos metálicos N-heterocíclicos. Esses aspectos levam a novas perspectivas relacionadas à estrutura dos compostos, pois são potencialmente interessantes para o estudo referente à formação de oxigênio singlete e para PDT. Outro direcionamento desta tese, foi o de explorar a geração de novas interfaces baseadas na formação de pares iônicos constituídos pelas espécies H2TPyPzTRu/CuTSPc em comparação com o filme da espécie catiônica H2TPyPzTRu. Através de medidas de espectroscopia de impedância eletroquímica, foram constatados mecanismos distintos de condução nos filmes formados, que pode ser ou um mecanismo misto envolvendo os complexos periféricos e o anel central da porfirazina, ou um mecanismo de condução eletrônica envolvendo somente o sistema de empilhamento &#960; do anel central da porfirazina. / In this work, we describe the synthesis, characterization and properties of derived tetra(3,4-pyridil)porphyrazine complex containing four [Ru(bipy)2Cl]1+ groups. The electronic conjugation between the pyridinium moiety and the porphyrazine ring promote an efficient communication between the peripherical groups and central ring, which is reflected in the emission spectrum and related excitation profile. The observed behavior reveals an efficient antenna effect in the H2TPyPzTRu system. ln spite of the strong electronic coupling between the central and peripherical groups, the electronic properties of ruthenium complex were preserved, exhibiting redox potencials very close to those of free complexes. These aspects provided new perspectives of exploiting the compound strutures, particularly the oxygen singlet formation and PDT application. Another aspect focused in this investigation was the generation of new interfaces based on ion-pair formation of H2TPyPzTRu/CuTSPc, in comparison with its cationic species H2TPyPzTRu alone. By means of electrochemical impedance spectrocopy, it was shown that the conduction mecanisms in these films involve either the peripherical complex and the central porphyrazine ring.

Made available in DSpace on 2014-07-29T16:24:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 taryana.pdf: 5876234 bytes, checksum: 626e6debe969770d6329c335e12d0cad (MD5) Previous issue date: 2006-08-24 / The Species Palicourea coriacea (Cham) K,Shum is a species little know, it is belonging to the Rubiaceae family, popularly known as douradinha. The popular use medicine in the therapy of kidneys illnesses. The popular name douradinha is associated with the color of the bracts and of the stem and the species occurs in Cerrado s Bioma, however in different environments. Studies about the genetic diversity and its distribution in natural populations of P. coriacea are of extreme importance for the definition of adequate strategies of handling and cultivation, however they do not exist in literature, studies of this nature. This work had as objective to evaluate the genetic structure from nine natural populations of P. coriacea, collected in States of Goiás and Bahia and to evaluate the genetic diversity of these populations through markers RAPD. The P. coriacea species presented one high level of genetic diversity, or heterozygosity waited by Nei (1972) that it varied between 0,259 and 0,338 in the populations, with equal on average value the 0,296. The AMOVA disclosed that 23% of the total variability is meeting each other between populations. Although the estimates of apparent gene flow (Nm) have disclosed values inferior to one, on the other hand, equal the 0,83. The analyses of Bayesian Statistics had disclosed to a value of f (FIS) equal the 0,98 suggesting the possibility of this species has behavior like autogamous species. The analyses of grouping of the populations using Bayesian and AMOVA statistics disclosed that it does not exist a correlation between geographic distance and genetic distance all the nine populations they grouping, eventually, not obeying its geographic origin. Then, the hypothesis previously formulated of that geographically next populations would be genetic next, was discarded for the results gotten for the Mantel test where it got a correlation of 0,155. In addition, this relatively high inter populations differentiation allows to recommend to a strategy ex situ of the genetic variability using the biggest possible number of populations. In what, the conservation says respect in situ must be taken in account characteristic genetic and demographic of this species considering that this fact implies in the possibility of a continuous evolution and in the development of new adaptable strategies. It is necessary to have conscience on the distribution of the genetic diversity of these areas with intention to not only promote polities for preservation of found natural populations in national parks, but yes to private preservation of the legal reserves and properties. / A espécie Palicourea coriacea (Cham.) K. Schum é uma espécie pouco conhecida cientificamente, pertencente à família Rubiaceae, popularmente conhecida como douradinha. É utilizada pela medicina popular na terapia de doenças renais. O nome popular douradinha está associado à cor das brácteas e do caule e a espécie ocorre no bioma Cerrado, porém em diferentes fitofisionomias. Estudos sobre a diversidade genética e sua distribuição em populações naturais de P. coriacea são de extrema importância para a definição de estratégias adequadas de manejo e cultivo, porém não existem, na literatura, estudos dessa natureza. Este trabalho teve como objetivo avaliar a estrutura genética de nove populações naturais de P. coriacea, coletadas nos Estados de Goiás e Bahia e avaliar a diversidade genética dessas populações utilizando marcadores RAPD. A espécie P. coriacea apresentou um alto nível de diversidade genética, ou heterozigosidade esperada de Nei (1972) que variou entre 0,259 e 0,338 nas populações, com um total geral igual a 0,296. A AMOVA revelou que 23 % da variabilidade total se encontram entre populações e 77 % se encontra dentro de populações. As estimativas de fluxo gênico aparente (Nm) foram inferiores a um, ou seja, igual a 0,83. As análises do índice de fixação (f) por abordagem bayesiana forneceram valores médio igual a 0,98 sugerindo a possibilidade dessa espécie se comportar como uma espécie autógama. As análises de divergência genética e padrão espacial das populações utilizando as matrizes de &#952;B e &#934;ST par a par revelou que não existe uma correlação entre distância geográfica e distância genética todas as nove populações se agrupam aleatoriamente, não obedecendo a sua origem geográfica. Assim, a hipótese previamente formulada de que populações geograficamente próximas teriam que ser geneticamente próximas, foi descartada pelos resultados obtidos no teste de Mantel onde a correlação foi igual a 0,155. Assim essa diferenciação interpopulacional relativamente alta permite recomendar uma estratégia de amostragem para a conservação ex situ da variabilidade genética, utilizando o maior número de populações possível. No que diz respeito a conservação in situ, deve ser levado em conta características genéticas e demográficas dessa espécie, considerando que esse fato implica na possibilidade de uma evolução contínua e no desenvolvimento de novas estratégias adaptativas. É necessário ter conhecimento sobre a distribuição da diversidade genética destas áreas com o intuito de auxiliar nas políticas para preservação não somente de populações naturais encontradas em parques nacionais, mas também preservação das reservas legais e propriedades privadas.