La regeneración de plantas a partir de explantes es la base de partida para poder aplicar tecnologías tales como la obtención de plantas haploides o la transformación genética. Este carácter presenta una amplia variabilidad inter e intraespecífica. Así, incluso dentro de la misma especie, podemos encontrarnos genotipos recalcitrantes cuya falta o escasa regeneración limita la aplicación de estas técnicas. Además del componente genético, otros factores que condicionan el éxito de la regeneración son: las condiciones fisiológicas del material de partida, los componentes del medio de cultivo, los reguladores de crecimiento, la temperatura, la luz, etc¿ La falta de información acerca de qué factores determinan que este proceso se produzca por una u otra vía morfogenética (la vía organogénica o la embriogénica) y la incertidumbre de cuantos genes están implicados, indica la necesidad de investigación básica de este proceso. El objetivo principal de este trabajo se centra en incrementar el conocimiento de la base genética así como la localización de QTLs implicados en la regeneración por la vía organogénica que es la predominante en tomate. Para ello, se han utilizado dos poblaciones de mapeo (F2, BC1) obtenidas por la Dra. Gisbert. La población F2 se obtuvo a partir de la autofecundación de una planta F1, resultante del cruce de una planta de tomate (S. lycopersicum L.) seleccionada por su escasa capacidad regenerativa (Anl27) y la accesión PE-47 de S. pennellii Correll. con alta capacidad de regeneración. Por su parte, la población BC1 se obtuvo a partir del cruce (Anl27 x F1). Con estos materiales se ha realizado una caracterización fenotípica y genotípica en clones de cada genotipo, que se han mantenido en cultivo in vitro. Utilizando el programa informático MapQTL¿ se han identificado seis QTL implicados en la regeneración localizados en los cromosomas 1, 3, 4, 7 y 8. Cinco de los QTLs (SpRg-1, Rg-3, SpRg-4a, SpRg- 4b, SpRg-7) proceden del tomate silvestre S. pennellii y uno (SlRg-8) procede de S. lycopersicum. El porcentaje de varianza explicada por cada QTL va desde el 7,4% al 27%, dentro del rango común (6-26%) registrado en el mapeo genético de QTLs relacionados con la regeneración in vitro en otros cultivos. SpRg-1 es el mayor responsable de la respuesta morfogenética mientras que SpRg-7 promueve el desarrollo del brote hacia una planta completa. Por otra parte los QTLs detectados en los cromosomas 8 (SlRg-8) y 4 (SpRg-4a, SpRg-4b) podrían contener genes que influyen en la formación de yemas y su desarrollo, respectivamente. Finalmente Rg-3, situado en la mitad del cromosoma 3 y ligado al gen de la invertasa ácida, se presenta como un alelo putativo del gen Rg detectado en S. peruvianum (Rg-1) y S. chilense (Dunal) Reiche. (Rg-2). Además del genotipo, el tipo y combinación de reguladores de crecimiento son importantes para el éxito de los protocolos de regeneración. En tomate, los reguladores de crecimiento más utilizados son las citoquininas, o la combinación de estas con auxinas. Otros reguladores como el etileno se han estudiado poco y los trabajos publicados muestran conclusiones dispares. Con el fin de estudiar la influencia del etileno en la regeneración se han realizado ensayos con dos compuestos liberadores de etileno (Ácido 1-aminociclopropano-1- carboxílico ¿ACC¿ y ácido 2-Cloroetil fosfónico ¿Ethephon¿) y dos inhibidores de etileno: AgNO3, que inhibe la acción del etileno; y CoCl2, que inhibe la producción de etileno. Los resultados obtenidos muestran que la concentración y el momento de la aplicación son dos factores fundamentales a tener en cuenta para el éxito de la respuesta organogénica. En concreto, la aplicación de inhibidores de etileno y su consecuente disminución tiene un efecto negativo sobre la regeneración en tomate ya que se disminuye y se retrasa la respuesta. Así mismo, las plantas regenerantes obtenidas presentan tamaño reducido, pudiendo aparecer vitrificación y malformaciones. Por otra parte, la suplementación de etileno puede mejorar la regeneración. Así, el número de plantas regeneradas a partir de explantes de S. pennellii se duplicó en los medios con ACC respecto al medio control. Si la aplicación de ACC se realiza tras la inducción de las yemas, pasados 10 días, el rendimiento total será mayor. Este resultado indica que éste compuesto podría ser utilizado para mejorar la regeneración en aquellos genotipos donde una vez formadas las yemas, el desarrollo de estas hacia plantas es el paso limitante. Por otra parte, las plantas regenerantes obtenidas muestran buen desarrollo, por lo que la suplementación de etileno no afecta al posterior crecimiento de las plantas regeneradas. Finalmente se ha estudiado la capacidad organogénica de las especies silvestres de tomate derivadas del complejo S. peruvianum L. sensu lato (s.l.): Solanum arcanum Peralta., Solanum huaylasense Peralta., Solanum corneliomulleri J. F. Macbr. y Solanum peruvianum L. sensu stricto (s.s.). Estas especies pueden tener un papel fundamental en la mejora, sobre todo de resistencias a factores bióticos. Sin embargo, debido a las barreras de hibridación que existen entre éstas y el tomate cultivado, no se han explotado en su totalidad en la mejora del cultivo. Para realizar cruces se ha recurrido a la fusión de protoplastos y el rescate de embriones. Sin embargo, no se ha estudiado la capacidad organogénica de las especies derivadas del complejo Peruvianum, lo que limita la aplicación de estas técnicas. En este trabajo se ha encontrado variabilidad intra e interespecífica en la capacidad organogénica de las especies silvestres derivadas de este complejo. En general, todas las accesiones ensayadas de S. corneliomulleri y S. huaylasense mostraron una elevada capacidad regenerativa y se han identificado accesiones recalcitrantes en S. arcanum (LA-2185) y S. peruvianum s.s (ECU-106 y CH-20). En este trabajo, también se ha realizado un análisis morfológico de las hojas que ha determinado que el número de foliolos y el nivel de dentición de los mismo pueden ser utilizados en la identificación in vitro de las especies del complejo. Sin embargo, el área de foliolo solo permite distinguir a S. arcanum del resto de especies del complejo. Finalmente se ha observado que las accesiones cuyas hojas tienen mayor número de foliolos y mayor nivel de dentición tienen una mayor regeneración. / Trujillo Moya, C. (2013). Estudio de la Capacidad Organogénica en tomate y especies relacionadas: Localización de QTLS implicados y estudio de la influencia del Etileno [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/31665

[ES] De entre los patógenos emergentes presentes en agua, las bacterias del género Helicobacter son de las más alarmantes, ya que se encuentran directamente relacionadas con el cáncer gástrico y hepatobiliar y su epidemiología aún no está clara. Se ha planteado que H. pylori puede ser adquirida por diferentes vías de transmisión, entre las que se destaca el agua. Se ha demostrado su capacidad de supervivencia frente a los tratamientos comunes de desinfección de aguas. Por todo ello, en esta tesis se ha investigado la presencia de células viables, y por tanto infectivas, de H. pylori en aguas potables y de riego, mediante la mejora y la optimización de técnicas de cultivo y moleculares. Este trabajo se inició con la búsqueda de un medio de cultivo óptimo. Se obtuvieron resultados muy positivos con el medio de cultivo Agar Dent con sulfato de polimixina B, independientemente del origen de la muestra. Seguidamente, se desarrolló un método de pre-tratamiento con Propidium Monoazide y PEMAXTM para la detección y cuantificación de células de H. pylori viables, por PCR. Se confirmó que el PMA a una concentración de 50 µM y un periodo de incubación de 5 minutos sería la metodología óptima de tratamiento antes del análisis mediante qPCR. A continuación, se analizaron 20 muestras de agua residual. Mediante la técnica de cultivo, fue posible la detección de 4 colonias sospechosas de Helicobacter spp. y H. pylori, cuya identificación fue confirmada mediante amplificación y posterior secuenciación. La técnica DVC-FISH indico la presencia de células viables de Helicobacter spp. en 15 (75%) de las muestras. Respecto a la detección de células de H. pylori, mediante DVC-FISH y FISH, estos microorganismos se observaron en 10 (50%) y 11 (55%) de las 20 muestras analizadas, respectivamente. La técnica qPCR determino la presencia de H. pylori en las muestras, con un porcentaje de detección del 60%. Finalmente, mediante metagenómica de secuenciación dirigida, se analizó el microbioma de 16 muestras de aguas residuales. Los filos dominantes de las muestras analizadas fueron Proteobacteria, seguido de Bacteroidetes y Firmicutes. H. pylori se detectó en 6 muestras de aguas residuales. Además, se detectaron otras especies de Helicobacter spp., como H. hepaticus, H. pullorum y H. suis. Igualmente, mediante PCR se identificó el gen cagA en 5 muestras de agua residual y una de agua potable. Respecto el genotipo vacAs1, se observó en 4 muestras de agua residual; el genotipo vacAm1, se identificó en una muestra de agua potable y 2 de agua de riego. En las biopelículas analizadas, 2 fueron positivas para el tipo vacAm1, y otros dos para el gen de resistencia pbp1A. Del mismo modo se analizaron 45 muestras de heces. No se observaron colonias sospechosas en Agar Dent selectivo. Mediante qPCR se evidenció H. pylori en 41 muestras (45,56%). Fue posible cuantificar 10 muestras directas y 18 enriquecidas, con concentraciones entre 3,39*103 y 2,61*103 UG/mL, las restantes presentaban niveles superiores al umbral de fiabilidad (>35 ciclos). Por DVC-FISH se observaron células viables de H. pylori en 26 (57,78%) de las 45 muestras directas. La identificación de mutaciones en el 23S rDNA, de la resistencia a la claritromicina, mostro que el 37,79% de las muestras de heces presentaban células de H. pylori potencialmente resistentes. Mediante secuenciación dirigida y posterior análisis bioinformático se identificó H. pylori en 13 muestras directas y 13 muestras enriquecidas, y otras especies como H. hepaticus y H. pullorum. Por último, se evaluó la capacidad de H. pylori para formar biopelículas y su resistencia frente a los tratamientos comunes de desinfección. Se analizaron 27 biopelículas procedentes del sistema de distribución de agua potable para detectar la presencia de H. pylori mediante qPCR. El porcentaje de detección fue del 23%, siendo posible la cuantificación en 5 muestras, con concentraciones entre 7,32*101 y 1,16*101 unidades genómicas/mL. Los resultados obtenidos en esta Tesis confirman la existencia de células viables de H. pylori y otros Helicobacter spp. en aguas residuales tras su tratamiento, lo que significa un riesgo potencial para la Salud Pública. De igual forma se demuesta su presencia en muestras de heces, proporcionando un punto de partida para el estudio del riesgo que puede suponer para el ser humano la trasmisión fecal-oral de estas especies. Este trabajo también demuestra la capacidad de H. pylori de formar biopelículas y su resistencia frente a tratamientos comunes de desinfección y confirma su existencia en sistemas de distribución de agua potable. / [CAT] D'entre tots els patògens emergents presents en aigua, els bacteris del gènere Helicobacter són dels més alarmants, ja que es troben directament relacionats amb el càncer gàstric i hepatobiliar i la seua epidemiologia encara no és clara. S'ha plantejat que H. pylori es pot transmetre per diferents vies de transmissió, entre les quals destaca l¿aigua. S'ha demostrat la seua capacitat de supervivència enfront dels tractaments comuns de desinfecció d'aigües. Per tant, en aquesta tesi s'ha investigat la presència de cèl·lules viables, i per tant infectives, d' H. pylori en aigües potables i de reg, mitjançant la millora i l'optimització de tècniques de cultiu i moleculars. Aquest treball es va iniciar amb la cerca d'un cultiu òptim. Es van obtenir resultats molt positius amb el mitjà de cultiu Agar Dent amb sulfat de polimixina B, independentment de l'origen de la mostra. Seguidament, es va desenvolupar un mètode de pretractament amb Propidium Monoazide i PEMAXTM per a la detecció i quantificació exclusiva de cèl·lules d' H. pylori viables per PCR. Es va confirmar que el PMA a una concentració de 50 µM i un període d'incubació de 5 minuts seria la metodologia òptima de tractament abans de l'anàlisi mitjançant qPCR. A continuació, es van analitzar 20 mostres d'aigua residual. Mitjançant la tècnica de cultiu, va ser possible la detecció de 4 colònies sospitoses d' Helicobacter spp. i H. pylori, la identificació de la qual va ser confirmada mitjançant amplificació i posterior seqüenciació. La tècnica DVC-FISH va demostrar la presència de cèl·lules viables d' Helicobacter spp. en 15 (75%) de les mostres, sense necessitat d'un pas previ d'enriquiment. Respecte a la detecció de cèl·lules d' H. pylori, mitjançant DVC-FISH i FISH, aquests microorganismes es van observar en 10 (50%) i 11 (55%) de les 20 mostres analitzades, respectivament. La tècnica qPCR determinà la presència d' H. pylori a les mostres amb un percentatge de detecció del 60%. Finalment, mitjançant metagenòmica de seqüenciació dirigida, es va analitzar el microbioma de 16 mostres d'aigües residuals. Els talls dominants de les mostres analitzades van ser Proteobacteria, seguit de Bacteroidetes i Firmicutes. H. pylori es va detectar mitjançant aquesta tècnica en 6 mostres d'aigües residuals. A més, es van detectar altres espècies d' Helicobacter spp., com H. hepaticus, H. pullorum i H. suis. Igualment mediant PCR es va identificar el gen cagA en 5 mostres d'aigua residual i una d'aigua potable. Respecte al genotip vacAs1, es va observar en 4 mostres d'aigua residual; el genotip vacAm1, es va identificar en una mostra d'aigua potable i 2 d'aigua de reg. En les biopel·lícules analitzades, 2 van ser positives per al tipus vacAm1, i altres dos per al gen de resistència pbp1A. De la mateixa manera es van analitzar 45 mostres de femta. No es van observar colònies sospitoses en Agar Dent selectiu. Mitjançant la tècnica qPCR es va demostrar la presència d'H. pylori en 41 mostres (45,56%). Va ser possible quantificar 10 mostres directes i 18 enriquides, amb concentracions d'entre 3,39*103 i 2,61*103 UG/ml, les restants presentaven nivells per damunt del llindar de fiabilitat (>35 cicles). Mitjançant DVC-FISH es van observar cèl·lules viables d' H. pylori en 26 (57,78%) de les 45 mostres directes. La detecció de mutacions en el 23S rDNA, específiques de la resistència a la claritromicina, va indicar que el 37,79% de les mostres de femta presentaven cèl·lules d' H. pylori potencialment resistents. Mitjançant seqüenciació dirigida i posterior anàlisi bioinformàtica es va identificar H. pylori en 13 mostres directes i 13 mostres enriquides, i altres espècies com H. hepaticus i H. pullorum. Finalment, es va avaluar la capacitat d' H. pylori per a formar biopel·lícules i la seua resistència enfront dels tractaments comuns de desinfecció. Es van analitzar 27 biopel·lícules procedents del sistema de distribució d'aigua potable per a detectar la presència d' H. pylori mitjançant qPCR. El percentatge de detecció va ser del 23%, sent possible la quantificació en 5 mostres corresponents a concentracions d’entre 7,32*101 i 1,16*101 unitats genòmiques/ml. Els resultats obtinguts en aquesta Tesi confirmen la presència de cèl·lules viables d' H. pylori i altres Helicobacter spp. en aigües residuals després del seu tractament, la qual cosa suposa un risc potencial per a la Salut Pública. D'igual forma, s'evidencia la seua presència en mostres de femta, proporcionant un punt de partida per a l'estudi del risc que la transmissió fecal-oral d'aquestes espècies pugui suposar per als humans. Aquest treball també demostra la capacitat d' H. pylori de formar biopel·lícules i la seua resistència enfront als tractaments comuns de desinfecció, i confirma la seua presència en sistemes de distribució d'aigua potable. / [EN] Among all the emergent pathogens in water, bacteria of the Helicobacter genus are among the most disturbing, as they are directly related to gastric and hepatobiliary cancer and their epidemiology is still unclear. It has been suggested that H. pylori can be acquired through different transmission routes, among which water stands out. Its ability to survive against common water disinfection treatments has been demonstrated. In addition, H. pylori can form insoluble biofilms, which favors its resistance to the different disinfection and potabilization treatments. Therefore, in this thesis has investigated the presence of viable cells, and therefore potentially infective, of H. pylori in drinking and irrigation waters, through the improvement and optimization of culture and molecular techniques. This work began with the development of an optimal culture medium. Positive results were obtained with the culture medium Agar Dent with polymyxin B sulfate. Subsequently, a pretreatment method with Propidium Monoazide and PEMAXTM was developed for the exclusive detection and quantification of viable H. pylori cells by PCR. It was confirmed that PMA at a concentration of 50 µM and an incubation period of 5 minutes, would be the optimal treatment methodology before analysis by qPCR. A total of 20 wastewater samples, aseptically collected at the outlet of the biological reactor and after disinfection treatment, were then analyzed. Using the culture technique, it was possible to detect 4 suspicious colonies of Helicobacter spp. and H. pylori, whose identification was confirmed by amplification and subsequent sequencing. DVC-FISH technique demonstrated the presence of viable Helicobacter spp. cells in 15 (75%) of the samples. Regarding the detection of H. pylori cells, by DVC-FISH and FISH, these microorganisms were observed in 10 (50%) and 11 (55%) of the 20 samples analyzed, respectively. The qPCR technique determined the presence of H. pylori in the samples with a detection rate of 60%. Finally, using deep-amplicon sequencing, the microbiome of 16 wastewater samples was analyzed. The dominant phylum in the samples analyzed were Proteobacteria, followed by Bacteroidetes and Firmicutes. H. pylori was detected by this technique in 6 wastewater samples. In addition, others Helicobacter spp., such as H. hepaticus, H. pullorum and H. suis were detected. PCR technique was used to identify the cagA gene in 5 wastewater samples and one drinking water sample. Regarding the vacAs1 genotype, it was observed in 4 samples of wastewater; the vacAm1 genotype, was identified in one drinking water sample and 2 irrigation water samples. In the biofilms analyzed, 2 were positive for the vacAm1 type, and two for the resistance gene pbp1A. Likewise, 45 stool samples were analyzed. No suspicious colonies were observed on selective Dent Agar. The qPCR technique demonstrated the presence of H. pylori in 41 samples (45.56%). It was possible to quantify 10 direct samples and 18 enriched samples, with concentrations between 3.39*103 and 2.61*103 GU/mL, the remaining samples had levels above the reliability threshold (>35 cycles). DVC-FISH showed viable H. pylori cells in 26 (57.78%) of the 45 direct samples. Detection of 23S rDNA mutations specific for clarithromycin resistance indicated that 37.79% of stool samples had potentially resistant H. pylori cells. Through Deep-amplicon sequencing and subsequent bioinformatics analysis, H. pylori was identified in 13 direct samples and 13 enriched samples, as well as other species such as H. hepaticus and H. pullorum. Finally, the ability of H. pylori to form biofilms and their resistance to common disinfection treatments was evaluated. Twenty-seven biofilms from the drinking water distribution system were also tested for the presence of H. pylori by qPCR. The detection rate was 23%, being possible the quantification in 5 samples corresponding to concentrations between 7.32*101 and 1.16*101 GU/mL. / Esta Tesis Doctoral ha sido posible gracias a las ayudas de carácter predoctoral: “Ayuda de conselleria para la contratación de personal investigador en formación -Irene Hortelano Martin (determinación del riesgo para el consumidor de la presencia de H. pylori y otros helicobacters patógenos en aguas de consumo mediante técnicas moleculares y metagenómica) (ACIF/2016/150) Generalitat Valenciana (2016-2019). Y a la financiación de los proyectos: “Helicobacter pylori y otros helicobacters patógenos en aguas y alimento: Desarrollo y aplicación de herramientas moleculares dirigidas a la evaluación del riesgo para el consumidor (REF. AGL2014-53875-R)”. Ministerio de Economía y Competitividad, España. “Determinación del riesgo para la salud pública debido a la presencia de H. pylori en agua y alimentos: Detección (AICO/2018/273)”. Generalitat Valenciana (2018-2020). / Hortelano Martín, I. (2021). Determinación del riesgo para el consumidor de la presencia de H. pylori y otros Helicobacter spp. patógenos en aguas de consumo mediante técnicas moleculares y metagenómica [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/178942

Made available in DSpace on 2014-07-29T16:24:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ANGEL jose.pdf: 1885350 bytes, checksum: 8203e3220392d36d98c1cc30c0439590 (MD5) Previous issue date: 2005-08-30 / The araticunzeiro (Annona crassiflora Mart.) is a tropical fruit tree species from the Cerrado (Brazilian Savannah) with high economic potential. The strong degradation of the Cerrado, allied to the predatory extractivism that threatens the species, points out to the necessity of development of research to support future conservation programs. With the aim to furnish information about the genetic status of this species and to guide future conservation strategies, 82 individuals from 11 natural populations were submitted to genetic analysis. The coalescent based analysis of the polymorphism present in the trn-L cpDNA allowed the detection of high levels of genetic diversity in the species. In spite of the high level of genetic similarity among different populations the results produced suggested that, , there is an incipient, but statistically significant, increasing differentiation process taking place due to current status of geographical isolation and genetic drift. The genetic differentiation coefficient estimated was equal to 7.3%. The spatial genetic divergence analyses suggested that the genetic distances are not associated to geographical distances between populations, evidencing the absence of current gene flow between adjacent populations. The coalescent based approach allowed the identification of different evolutionary scenes to the investigated populations. Among sampled populations cases from well conserved status to dangerous low levels of genetic diversity were detected. Results obtained by the use of coalescent models to infer the divergence time between populations suggested that natural populations of A. crassiflora were, until recently, part of a great regional continuum. These findings suggest that the low levels of genetic diversity among different populations must be due to the small time since isolation. / O araticunzeiro (Annona crassiflora Mart.) é uma espécie de árvore frutífera nativa do bioma Cerrado com elevado potencial de utilização econômica. A forte degradação desse bioma, aliada ao extrativismo predatório a que a espécie vem sendo submetida, justifica a necessidade de desenvolvimento de pesquisas que subsidiem a sua conservação. Objetivando obter informações que indiquem o status genético dessa espécie e orientem futuras estratégias de conservação, 82 indivíduos provenientes de 11 populações naturais foram analisados geneticamente. A análise do polimorfismo presente em seqüências da região trn-L do genoma cloroplastidial e posterior aplicação dos modelos associados à teoria da coalescência permitiram a detecção de elevados níveis de diversidade genética para a espécie. Os resultados obtidos indicam que, embora as populações amostradas tenham demonstrando elevada similaridade genética entre si, há uma incipiente, mas significativa, diferenciação genética entre elas, que tende a aumentar progressivamente devido ao efeito do isolamento geográfico e à força da deriva. O coeficiente de diferenciação genética entre as populações analisadas foi de 7,3%. A análise de divergência entre as populações amostradas não evidenciou a existência de associação significativa dos padrões de diferenciação genética com a distância geográfica entre elas. As informações obtidas pela análise baseada no modelo de coalescência permitiram a identificação de diferentes cenários evolutivos para as populações estudadas. Dentre as populações amostradas, foram identificadas desde populações em bom estado de conservação até populações com baixíssimos níveis de diversidade genética. Os resultados obtidos pela utilização do modelo coalescente para se inferir o tempo de divergência entre as populações sugeriram que as populações se A. crassiflora até há muito pouco tempo se constituíam em um grande contínuo populacional, sendo a baixa diversidade encontrada entre as populações atribuída ao pequeno tempo de divergência entre elas.

Made available in DSpace on 2014-07-29T14:52:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TESE LUICE gomes.pdf: 3188724 bytes, checksum: c4156187d61efe808b3d021846f674dd (MD5) Previous issue date: 2010-08-31 / The plant genetic resources stored ex situ are considered as a genetic repository, and are raw material for the development of the world agriculture. In rice, despite its high genetic variability, the lack of information of accessions to compose a databank prevents its use to help the choice of genitors for the breeding programs. The Embrapa Rice Core Collection (ERiCC) was developed from 10,000 accessions from Embrapa GeneBank, and it was set up by 550 accessions, divided in three subsets: 1) 94 lines and cultivars from Brazil (LCB); 2) 148 lines and cultivars from abroad (LCI); and 3) 308 traditional varieties (VT), obtained from germplasm collection expeditions in Brazil. This work aimed: 1) to evaluate the extension of genetic variability of 550 accessions from ERiCC by means of agronomic traits characterization using mixed models and multivariate statistics; 2) to perform a comparative analysis of the genetic divergence considering the agronomical and SSR markers characterizations; and 3) to identify the genotypes with higher genetic diversity and with the best agronomic performances, aiming to promote the most efficient use of such germplasm in breeding programs. The agronomic characterization of 550 accessions was performed in nine field experiments, evaluating 18 phenological-agronomic traits. The data were analyzed using the mixed linear and AMMI models. There was wide variation range of genotypical values for most evaluated traits. In different environments, it was observed VT accessions among the high-yielding materials, demonstrating the potential of this group of germplasm, particularly important due to its high genetic variability, to contribute to the development of cultivars regionally adapted. The AMMI approach allowed a good discrimination of ERiCC rice genotypes in relation to the adaptive performance, identifying the accessions CA880078, CA990001, CA870071 (subset VT), and CNA0009113 (LCI) as having good yield and broad adaptation to distinct environments. The comparative analysis of genetic diversity between agronomic and molecular data was performed using the 242 lines and cultivars accessions from ERiCC, which were characterized by 86 fluorescent SSR markers, and five agronomic traits with genotypic values predicted (values without from the effects of interaction genotypes x environment, from a joint analysis of nine experiments. The genetic divergence among accessions was estimated by the average Euclidian distance for phenotypical data, and by the Rogers modified by Wright (RW) genetic distance. The datasets were jointly analyzed by descriptive and multivariate statistics, using correlation analyses from hierarchical grouping of Ward and UPGMA methods. The phenotypical and molecular data showed a broad distribution of dissimilarity indexes, despite they showed different patterns of variation between them. Low molecular distances were associated to low phenotypical distances, however to high molecular distances, occurred a high broad range of phenotypical variation. The correlation between genetical and phenotypical dissimilarities was significant for both lowland and upland accessions, despite with different values (r=0.156 and r=0.409, respectively). Due to the low relation between phenotypical and molecular data, the analysis of genotypes to be used in breeding programs must include both evaluations to a better accession characterization. Considering the high yielding accessions, the higher molecular distances were identified among the accessions from lowland system of cultivation, among which BR IRGA 413 and CNA0005014, BR IRGA 413 and CNA0005853, and CNA0004552 and CNA0005014. Considering the upland accessions, maximum genetic distances were identified in CNA0000482 and CNA0006422, CNA0001006 and CNA0006422, and CNA0001006 and CNA0003490. The molecular analysis was able to identify accessions with reduced genetic relationship, that if used as genitors, will result in a progeny with a high probability to find new allelic combinations. On the other hand, the phenotypical characterization is important to identify accessions not just genetically divergent, but with superior agronomic trait performances for breeding programs. The results of this work will permit to increase the activities related to the characterization of accessions from rice Genebank, giving support of breeding programs to choose the best accessions to obtain new cultivars, with favorable traits, and broad genetic basis. In addition, a continuous program of phenotypical and molecular characterization of germplasm will be able to identify accessions to increase the genetic variability of ERiCC. / Os recursos genéticos vegetais armazenados ex situ são considerados reservatórios de genes e funcionam como matéria-prima para o desenvolvimento da agricultura mundial. Na cultura do arroz, apesar da extensa variabilidade genética existente, a deficiência de informações que integrem dados que possam efetivamente auxiliar na escolha de genótipos importantes para os programas de melhoramento constitui o principal fator que limita a utilização mais ampla dos acessos armazenados nos bancos de germoplasma. A Coleção Nuclear de Arroz da Embrapa (CNAE) representa a variabilidade genética de mais de 10 mil acessos constituintes do Banco Ativo de Germoplasma (BAG) da Embrapa Arroz e Feijão, e é composta por 550 acessos subdivididos em três estratos: 1) 94 Linhagens e Cultivares Brasileiras (LCB), provenientes de programas de melhoramento de instituições brasileiras; 2) 148 Linhagens e Cultivares Introduzidas (LCI), provenientes de programas de melhoramento de outros países; e 3) 308 Variedades Tradicionais (VT), que reúne acessos obtidos por expedições de coleta de germoplasma realizadas em vários estados do Brasil. Este trabalho teve como principais objetivos: 1) avaliar a extensão da variabilidade genética dos 550 acessos pertencentes à CNAE por meio da caracterização agronômica via metodologias de modelos mistos e estatísticas multivariadas; 2) realizar a análise comparativa da divergência genética entre acessos, determinada pela avaliação de caracteres agronômicos e marcadores moleculares SSR; e 3) identificar os genótipos com maior diversidade genética e com melhores atributos agronômicos, a fim de indicar uma melhor utilização destes recursos genéticos em programas de melhoramento. Na caracterização agronômica foram avaliados 550 acessos em experimentos conduzidos em nove locais no Brasil, envolvendo um total de 18 caracteres fenológico-agronômicos. Os dados foram analisados empregando-se a abordagem de modelos lineares mistos e modelo AMMI de análise. Verificou-se grande amplitude de variação dos valores genotípicos para a maioria dos caracteres avaliados. Nos diferentes ambientes, houve ocorrência de genótipos do estrato VT entre os mais produtivos, o que demonstra o potencial deste grupo de germoplasma, particularmente importante por sua grande variabilidade genética, em contribuir para o desenvolvimento de cultivares regionalmente adaptadas. A abordagem AMMI permitiu uma boa discriminação dos genótipos de arroz da CNAE quanto ao seu comportamento adaptativo, identificando os acessos CA880078, CA990001, CA870071 (do estrato VT), e CNA0009113 (LCI) com estabilidade, produtividade satisfatória e ampla adaptação à diferentes ambientes. Para a análise comparativa da diversidade genética entre dados agronômicos e moleculares foram considerados 242 acessos da CNAE, os quais foram caracterizados utilizando-se 86 marcadores SSR fluorescentes, sendo que para os dados agronômicos, foram realizadas análises conjuntas dos experimentos e considerados os valores genotípicos preditos de cinco caracteres (valores livres dos efeitos de interação genótipos x ambientes). A divergência genética entre os acessos foi estimada pelo procedimento de distância Euclidiana média para os dados fenotípicos, e por meio da distância de Rogers modificada por Wright (RW) para os dados moleculares, analisando-se os conjuntos de dados por meio de estatísticas descritivas e multivariadas, empregando-se análises de correlação entre matrizes de dissimilaridade e análises de agrupamento hierárquico de Ward e UPGMA. Os dados fenotípicos e moleculares apresentaram uma ampla distribuição dos índices de dissimilaridade, embora tenham apresentado diferentes padrões dessa variação. Baixas distâncias moleculares estiveram associadas a baixas distâncias baseada nos valores genotípicos, no entanto para elevadas distâncias moleculares houve ocorrência de ampla escala de variação fenotípica. A correlação entre as dissimilaridades genéticas e valores genotípicos foi significativa tanto no conjunto de acessos irrigados quanto no de sequeiro, porém, com diferentes magnitudes (r=0,156 e r=0,409, respectivamente). Devido esta baixa relação entre os dados fenotípicos e moleculares, o estudo de genótipos para fins de uso no melhoramento genético deve incluir ambas avaliações para a melhor caracterização dos acessos. Entre os materiais mais produtivos, as maiores distâncias moleculares foram identificadas entre os genótipos do sistema de cultivo irrigado, dentre eles BR IRGA 413 e CNA0005014, BR IRGA 413 e CNA0005853, e CNA0004552 e CNA0005014. Entre os materiais de sequeiro, máximas distâncias genéticas foram identificadas entre os acessos CNA0000482 e CNA0006422, CNA0001006 e CNA0006422, e CNA0001006 e CNA0003490. A análise molecular permitiu que fossem identificados genótipos de vínculo genético reduzido, que quando utilizados como parentais em cruzamentos, possibilitarão que as progênies obtidas apresentem maiores chances de combinações alélicas inéditas. Por sua vez, a caracterização fenotípica tem papel fundamental na identificação de materiais que além de divergentes, apresentem desempenho agronômico superior para os programas de melhoramento. Os resultados deste trabalho permitirão aumentar eficazmente as atividades relacionadas à caracterização de acessos do Banco Ativo de Germoplasma de arroz, subsidiando os programas de melhoramento na escolha de genótipos a serem utilizados para a obtenção de novas cultivares, com características favoráveis, de ampla base genética. Em adição, um programa contínuo de caracterização fenotípica e molecular de germoplasma permitirá ainda a escolha de acessos para a ampliação da variabilidade genética da CNAE.

Neste trabalho foram estudados computacionalmente os [2.2]ciclofanos ([2.2]paraciclofano (1), anti-[2.2]metaciclofano (2a), sin-[2.2]metaciclofano (2b) e [2.2]metaparaciclofano (3)), que são os [2n]ciclofanos mais simples, contendo dois anéis fenílicos conectados por duas pontes etilênicas. Os ciclofanos têm apresentado inúmeras aplicações importantes, podendo atuar como auxiliares em sínteses assimétricas e como catalisadores que simulam funções enzimáticas, apresentando seletividade em relação aos substratos. Eles são empregados tanto em químicab supramolecular quanto em áreas biomédicas. Estudos que empregam ressonância de spin eletrônico ou que investigam propriedades ópticas não-lineares dos [2.2]ciclofanos indicam que os mesmos apresentam interações transanulares, que ocorrem através de recobrimento direto entre orbitais pertencentes a anéis diferentes, through-space, ou através de recobrimento entre orbitais dos anéis e das pontes, through-bond. As interações transanulares possuem um papel fundamental na química dos ciclofanos, alterando o comportamento reacional destes compostos e as transições espectroscópicas. Apesar dos métodos de preparação de ciclofanos, desde os mais simples aos mais complexos, serem intensamente investigados, estudos computacionais, que busquem compreender as correlações entre tensão e aromaticidade, estrutura eletrônica e o mecanismo de ocorrência das interações transanulares, são raramente encontrados na literatura. Desse modo, o objetivo deste trabalho foi estudar as interações transanulares, bem como correlacionar as diferenças estruturais, a tensão sobre anéis e pontes, cargas atômicas, aromaticidade e os deslocamentos químicos, não apenas para os isômeros dos [2.2]ciclofanos, mas também seus derivados fluorados (perfluoração de um dos anéis dos [2.2]ciclofanos), bem como avaliar os efeitos de diversos substituintes (CN, Cl, C=O, NH2 e NO2) e da protonação na estrutura eletrônica do isômero [2.2]paraciclofano. As otimizações de geometria de 1, realizadas com diferentes métodos e conjuntos de funções de base, mostraram que os modelos MP2/6-31+G(d,p) e B3PW91/6-31+G(d,p) fornecem os melhores resultados em comparação com os dados de raios-x. Buscas conformacionais mostraram que 2a e 2b são confôrmeros com energias diferentes e que 3 possui dois confôrmeros degenerados. As energias relativas e de tensão das pontes, seguiram a mesma ordem, indicando que a tensão sobre as pontes e a repulsão entre as nuvens ? dos anéis aromáticos são determinantes para a estabilidade dos [2.2]ciclofanos. As reações isodésmicas indicaram que os anéis comportam-se como absorvedores de tensão. NICS e HOMA mostraram que apesar das perdas de planaridade dos anéis a aromaticidade é mantida. O método NBO confirmou que todos os [2.2]ciclofanos apresentam interações through-bond, mas apenas 2a e 2b apresentaram interações through-space significantes. A análise AIM mostrou que as interações transanulares observadas são do tipo camada fechada (iônica ou ligação de hidrogênio) e que estabilizam os [2.2]ciclofanos. Para os derivados fluorados as principais alterações geométricas observadas foram para os diedros das pontes. As reações isodésmicas revelaram que as tensões das pontes e as energias relativas são afetadas pela fluoração. Além disso, os anéis dos isômeros fluorados absorvem mais tensão que os anéis dos isômeros não fluorados. NICS e HOMA mostraram que a substituição por flúor aumenta a aromaticidade dos [2.2]ciclofanos. A análise NBO indicou que a perfluoração aumentou o número e a intensidade das interações through-space, mas as mesmas ficaram restritas principalmente aos derivados fluorados de 2a e 2b. A mesma análise evidenciou que há uma conjugação dos pares de elétrons dos átomos de flúor com o sistema ?. Por outro lado, a análise AIM sugeriu que a substituição não aumenta o número de interações through-space, mas confirmou a conjugação dos pares de elétrons dos átomos de flúor. Os demais substituintes empregados afetam os parâmetros geométricos do [2.2]paraciclofano (1) de maneira diferenciada. A análise particionada das reações isodésmicas mostrou que as tensões nos anéis e nas pontes dependem não apenas do substituinte empregado, mas também da posição da substituição. NICS e HOMA indicaram que a aromaticidade no anel não-substituído dos derivados substituídos é maior que em 1. A análise NBO revelou que a substituição e a protonação aumentam a ocorrência de interações transanulares through-space. O método AIM indicou a presença de interações transanulares apenas para o derivado substituído com NH2 e CN e para a espécie protonada. No entanto, tais interações apresentaram características de interações de camada fechada. com pequenas estabilizações. As cargas atômicas e os deslocamentos químicos confirmaram as mudanças na densidade eletrônica, observadas através do método AIM. / In this work, the [2.2]cyclophanes ([2.2]paracyclophane (1), anti-[2.2]metacyclophane (2a), syn-[2.2]metacyclophane (2b) e [2.2]metaparacyclophane (3)), which are the simplest [2n] cyclophanes that contain two phenyl rings connected by two ethanediyl linkages, were studied computationally. Cyclophanes have presented several important applications, such as auxiliary in asymmetric synthesis, catalysts that simulate enzymatic functions, presenting selectivity in relation to the substrates. They are employed either in supramolecular chemistry or in biomedical areas. Studies that apply electron spin resonance or that investigate the non-linear optical properties of [2.2]cyclophanes, indicate that these compounds present transannular interactions, which occur through direct overlap of orbitals lying in different rings, throughspace, or through overlap between orbitals from rings and bridges, through-bond. The transannular interactions have a fundamental role in cyclophane chemistry, changing the reactional behavior of these compounds, and the spectroscopic transitions. Despite the fact that the well known methods of preparation, from the simplest to the most complex cyclophanes, have been studied intensively, computational studies that intent to comprehend the correlations between tension and aromaticity, electronic structure, and the mechanism of the transannular interactions are rarely found in the literature. Therefore, the aim of this work was not only to study the transannular interactions, correlating the structural differences, tension in rings and bridges, atomic charges, aromaticity, and chemical shifts of the [2.2]cyclophanes isomers but also to extent a similar treatment to the fluorinated derivatives. In addition, the effects of substituents such as (CN, Cl, C=O, NH2, and NO2) and the protonation on the electronic structure of [2.2]paracyclophane were also evaluated. The geometry optimizations of 1, carried out by using different methods and basis set, showed that the models MP2/6-31+G(d,p) and B3PW91/6-31+G(d,p) provide the best results in comparison with the x-ray data. Conformational searches showed that 2a and 2b are the conformers that present the same energy and the isomer 3 has two degenerated conformers. The strain energies of the bridges followed the same tendency as the relative energies, indicating that the tension on the bridges and the repulsions between the ? clouds of the aromatic rings are the key factors that determine the [2.2]cyclophane stabilities. The isodesmic reactions indicated that the rings are absorbents of tension. NICS and HOMA showed that the aromaticity of the rings is preserved despite the changes on the planarity. The NBO method confirmed that all [2.2]cyclophanes present through-bond interactions, but only 2a and 2b exhibit noteworthy through-space interactions. The AIM analysis pointed out that the transannular interactions behave as closed shell interactions (ionic or hydrogen bond), stabilizing the [2.2]cyclophanes. The main geometric changes, observed to the fluorinated derivatives, were those related with the dihedral angle of bridges. The isodesmic reactions pointed out that the tensions of bridges and the relative energies are affected by the fluorination. In addition, the fluorinated rings absorb more tension than the non-fluorinated rings. NICS and HOMA showed that the substitution by fluorine increases the aromaticity of the [2.2]cyclophanes. The NBO analysis indicated that the number of through-space interactions increase with the fluorination, but it is restrict to the derivatives of 2a and 2b. In addition, the same analysis pointed out a conjugation of the fluorine lone pairs with the ? system. On the other hand, the AIM analysis suggested that the substitution do not increase the number of through-space interactions, but confirmed the conjugation of the fluorine lone pairs. The other substituents can affect the geometric parameter of 1 noticeably. The partitioned analysis of isodesmic reactions showed that the tensions in bridges and rings not only depend on the substituents employed but also on the position of substitution. NICS and HOMA pointed out that the aromaticity is bigger in the non-substituted rings of [2.2]paracyclophane derivatives than in 1. The NBO analysis showed that the substitution and protonation increase the number of through-space interactions. AIM method indicated the transannular interactions occur only to the derivate substituted by NH2 and CN, and to the protonated specie. However, these interactions presented features of closed shell interactions with small stabilizations. The atomic charges and the chemical shifts confirmed the changes of the electronic density, observed through the AIM method.

Carcinomas de mama são heterogêneos e consistem de diversos tipos celulares. Perfis de expressão gênica usando DNA microarrays identificaram quatro subtipos moleculares fundamentais baseados na expressão de receptores hormonais (estrógeno e progesterona) e de fator de crescimento epidérmico (HER2) (luminal tipo A, luminal tipo B, tumores expressando somente HER2 e triplos negativos) refletindo a heterogeneidade molecular dos carcinomas. Sugeriu-se que esta heterogeneidade advém da presença de células tronco tumorais com a capacidade de se diferenciar ao longo de vias divergentes e outros estudos sugeriram que a presença destas células tronco tumorais pode ser evidenciada pela análise fenotípica de CD44 e CD24. Nosso objetivo foi detectar a freqüência de CD24 e CD44 isolados ou combinados, analisados por imunoistoquímica e sua associação com os subtipos moleculares e com diversos marcadores biológicos em 95 casos de carcinoma ductal infiltrativo organizados em um microarranjo tissular (TMA). Realizamos determinações imunoistoquímicas de CD44, CD24, citoqueratinas (CK5, CK6, CK18), claudina 7 e Ki67. Subgrupos moleculares foram definidos pela expressão imunoistoquímica de RE, RP e HER2. Resultados: Os tumores apresentaram uma maior freqüência dos grupos luminais (49,5%) atribuído à alta expressão de RP ou RE (47,4%), e freqüência menor de tumores triplo negativos (21,5%) e HER2 (9,5%). Os fenótipos CD44+CD24- e CD44-/CD24+ estavam respectivamente presentes em 8,4% e 16,8% dos tumores e o fenótipo duplamente positivo foi predominante (45,3%). Ausência de ambas as proteínas foi evidente em 6,3% dos tumores. Tumores com fenótipo CD44+CD24- (definido como um marcador de células tronco tumorais por estudos in vitro) foram mais comuns em tumores triplos negativos mas não demonstraram nenhum tipo de associação com características clinico-patológicas e demais marcadores. Este fenótipo não foi expresso nos tumores HER2 positivos. O fenótipo duplamente positivo CD44+CD24+ mostrou-se mais freqüente nos subtipos luminais ou com alta expressão de HER2. Os fenótipos (CD44-CD24+ e CD44-CD24-) não mostraram associação com os subgrupos. Tumores expressando CD24+ isolado, com grande freqüência deste marcador (74,7%), mostraram significativa associação com positividade do RE, RP e Ki67 e uma significância marginal com marcadores de diferenciação luminal (CK18 e claudina 7, p = 0,14). Nenhuma associação foi observada com tumores CD44+ quando analisado isoladamente. A expressão de claudina 7 e Ki67 não mostrou associação com os subgrupos e a expressão de CK5 apresentou uma tendência a uma maior negatividade nos subtipos luminais e uma freqüência maior de positividade nos tumores HER2 e triplo negativos. De outro lado, associação da freqüência da expressão positiva de CK18 nos subgrupos luminais foi estatisticamente significativa (p = 0,003). Para se determinar se CD24+ e CD44+ e seus subtipos combinados poderiam afetar a sobrevida global e o intervalo livre da doença preparamos curvas de sobrevida de acordo com Kaplan-Meier que foram analisadas estatisticamente (log rank test). A mediana do período de seguimento das pacientes do nosso estudo foi de 4,8 anos (0,36 10,9 anos). Estas análises não demostraram influência dos fenótipos CD44+CD24- ou CD44+ sobre a sobrevida global ou intervalo livre de doença, mas observamos uma tendência a um prognóstico mais favorável. Interessantemente tumores HER2 positivos não expressaram este fenótipo, sugerindo que outros marcadores de células tronco caracterizam estes tumores. O fenótipo CD44-CD24+ mostrou-se mais freqüente nos tumores luminais, mas não apresentou correlação com marcadores clínico-patológicos ou biológicos analisados. Não houve diferenças significativas com respeito a sobrevida global ou intervalo livre de doença . A expressão de CD24+ isolado associou-se a expressão dos marcadores de diferenciação celular e a uma diminuição do intervalo livre de doença. A sobrevida livre de doença (10 anos) indicou uma percentagem de 94,1% para CD24- e 72,1% para os pacientes CD24+ enquanto a sobrevida global foi de 84,2% para os pacientes CD24- e 72,1% para os pacientes CD24+. Citoqueratinas (CK5, CK18) e Ki67 não influenciaram a sobrevida e o intervalo livre de doença. No entanto a expressão positiva de claudina 7, embora não associada à sobrevida global, foi estatisticamente associada ao decréscimo do intervalo livre da doença (p = 0,05). Conclusão: As características dos tumores CD44+CD24- e sua tendência a associação um prognóstico mais favorável parecem não estar de acordo com as propriedades descritas na literatura para células tronco e enfatizam a necessidade de outros marcadores. A determinação da freqüência de CD44+ e claudina 7 positiva pode contribuir para a análise do prognóstico em carcinoma de mama / Background: Breast carcinomas consist phenotypically of diverse cells and exhibit intra tumoral heterogeneity being stratified in several subgroups based in gene expression profiles or histochemical biomarkers. It was suggested that this heterogeneity is derived in part from the transformation of different subsets of cancer stem cells (CSC) in each intrinsic subgroup. The presence of CSC can be evidenced by phenotypic analysis of CD44 e CD24. This study aimed to identify the CD24 and CD44 immunophenotype within invasive ductal breast carcinoma (IDC) subtypes and determine its influence on prognosis as well as its association with the expression of Ki67, citokeratins (CK5, CK6 and CK18) and claudin-7. Methods: Immuno expression of CD44 and CD24 alone or in combination was investigated in 95 IDC cases arranged in a tissue microarray (TMA). The association with intrinsic subgroups defined as luminal A (ER+, PR+, HER2-), luminal B (ER and or PR+, HER2+), HER2 subtype (ER-, PR-, HER2+) and triple negative (ER-, PR-, HER2-), and the other markers and prognosis was analyzed. Results: CD44+CD24- and CD44-CD24+ were respectively presents in 8.4% and 16.8% of the tumors, a lack of both proteins was detected in 6.3%, while CD44+CD24+ was determined in 45.3% of the tumors. Although there was no significant correlation between subgroups and different phenotypes, the CD44+CD24- phenotype was more common in the basal subgroups but the frequency of this subtype has not been associated with clinical characteristic or biological markers. The phenotype was absent in HER2 tumors whereas luminal tumors are enriched in CD44-CD24+ and CD44+CD24+ cells which did not show associations with clinical/biological markers features. There was also no significant association of the subtypes with the event free (DFS) and overall survival (OS) but the CD44+CD24- phenotype showed a more favorable prognostic as compared to CD44-CD44+ phenotype that showed a worse prognosis (p = 0.26) (median follow up, 4.8 years) CD44+ alone was evident in 57.9%, while CD24+ was positive in 74.7% of the tumors, the latter showing a significant association with ER, PR and Ki67 and a marginal association with CK18 and claudin-7. Expression of claudin-7 and Ki67 did not associate with the cancer subgroups, while a positive association between CK18 and the luminal subgroups was found. CD44+ was not significantly associated with OS (p = 0.684) and DFS (p = 0.386) whereas CD24+ expression was also no significantly associated with OS (p = 0.32) but was associated with a decrease in DFS (p = 0.07). CK5, CK18 and Ki67 expression had no influence in OS or DFS, however claudin-7 positive although not statistically associated with OS, was associated with reduced DFS (p = 0.05). Conclusions: The heterogeneity of cells with several CD44CD24 expression may indicate the presence of different stem cell populations. Ocurrence of CD44+CD24- phenotype is more common in triple negative tumors and lower in tumors of luminal type and absent in HER2 tumors. Although not associated significantly with patho-biological markers or OS and DFS, the CD44+CD24- phenotype has a tendency to be a favorable prognostic marker in breast cancer raising the possibilty that the putative tumorigenic ability may no be restricted to cells of this phenotype. The presence of CD44-CD24+ may indicat a worse prognosis. CD24+ was associated with ER, PR, Ki67and showed a marginal association with CK18 and claudin-7. CD24 and Claudin-7 positivity were the only biological markers associated with reduced DFS. These two investigated markers can be used to improve the assessement of prognosis in breast cancer

O material particulado (MP) atmosférico é associado a vários agravos e doenças, sendo recentemente classificado como carcinogênico para humanos (Grupo 1) pela Agência Internacional de Pesquisa em Câncer (IARC). Embora sua toxicidade, incluindo a genotoxicidade, esteja reconhecidamente ligada ao tamanho das partículas, a contribuição da sua composição química para esses efeitos ainda não está completamente elucidada. O tamanho e a composição das partículas são influenciados por características meteorológicas e climáticas, com destaque para a temperatura e o período de radiação solar. O teste Salmonella/microssoma é o mais utilizado para avaliação da mutagenicidade de amostras de MP, contudo um número reduzido de linhagens é usado. Assim, o objetivo desse estudo foi investigar e comparar a influência das diferentes condições atmosféricas e climáticas das cidades de Limeira (Brasil), Estocolmo (Suécia) e Quioto (Japão) nos perfis de mutagenicidade, utilizando 11 linhagens com diferentes seletividades, e nos perfis de composição química de amostras compostas de partículas totais em suspensão (PTS) coletadas durante o inverno dessas cidades. Para que os resultados pudessem ser diretamente comparados foi adotada a mesma metodologia, incluindo o procedimento de amostragem, o método de preparo de amostra, o protocolo do teste de mutagenicidade e as técnicas de análises químicas para identificação de hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPA) e de seus derivados alquilados. Limeira apresentou a maior concentração de PTS (99,0 µg/m3), seguida por Quioto (28,0 µg/m3) e Estocolmo (6,2 µg/m3). Apesar da concentração de PTS em Limeira ser 16 vezes maior que em Estocolmo e 3,5 vezes maior que em Quioto, as porcentagens de material orgânico extraído (MOE) obtidas foram 9, 15 e 5%, respectivamente. Os extratos das amostras de PTS coletadas nas três cidades apresentaram atividade mutagênica para todas as linhagens, tanto na ausência quanto na presença de S9, com exceção da TA102 que não detectou a atividade mutagênica em nenhum dos extratos, e para YG7108 na presença de S9, apenas para a amostra de Limeira. Apesar das diferenças nas condições meteorológicas e climáticas dessas cidades, seus perfis de mutagenicidade foram semelhantes. A menor potência mutagênica para a YG7108 na ausência de S9 e a ausência de mutagenicidade na presença de S9 revela a menor contribuição de agentes alquilantes para a mutagenicidade da amostra de Limeira em relação as demais cidades. Considerando a seletividade das linhagens utilizadas, foi observado maior contribuição de compostos que causam danos oxidativo ao DNA e de agentes alquilantes para a mutagenicidade da amostra de Quioto. Porém, de acordo com as respostas das linhagens que possuem atividade aumentada das enzimas nitroredutase (NR) e/ou O-acetiltransferase (OAT), YG1021, YG1024 e YG1041, revelam a maior contribuição de nitroarenos e aminas aromáticas para a mutagenicidade das três cidades, com destaque para aqueles mutágenos que dependem da ativação via OAT. As potências mutagênicas expressadas em função da massa de MOE (rev./µg MOE) foram similares para todas as amostras. Quando expressas por volume de ar (rev./m3), as potências mutagênicas foram proporcionais às concentrações de PTS das três cidades (Limeira > Quioto > Estocolmo). Quando aplicadas as razões diagnósticas foi possível verificar uma mistura de fontes de poluição em Limeira e Estocolmo. As razões diagnósticas dos HPA indicam que a amostra de Limeira é composta por partículas frescas, com um leve predomínio de fontes de combustão. A amostra de Estocolmo apresenta partículas envelhecidas e com predomínio de fontes petrogênicas. Esse resultado foi inesperado, uma vez que as condições atmosféricas de Limeira são mais favoráveis ao envelhecimento das partículas que as de Estocolmo. O estudo do transporte das massas de ar explica, pelo menos em parte, a presença de partículas envelhecidas na amostra de Estocolmo. Sugere também que a redução das concentrações de HPA em Limeira depende do controle das fontes locais, enquanto em Estocolmo o controle das fontes locais não seria eficiente na diminuição desses poluentes. Em paralelo a avaliação das amostras de PTS, foi desenvolvido um novo protocolo miniaturizado do teste Salmonella/microssoma em microssuspensão. O protocolo utilizando microplacas de 12 poços foi validado empregando treze compostos mutagênicos testados com três linhagens de Salmonella selecionadas baseadas em suas diferentes frequências de reversão espontânea (baixa, média e alta). Tanto o teste miniaturizado em microplacas de ágar (MPA) quanto o em microssuspensão apresentaram sensibilidades semelhantes, concluindo que o MPA é uma ferramenta promissora e pode ser particularmente adequado para estudos ambientais como Análise Dirigida pelo Efeito (EDA) ou programas de monitoramento. / Atmospheric particulate matter (PM) is associated with various diseases and has recently been classified as carcinogenic to humans (Group 1) by the International Agency for Research on Cancer (IARC). Although the PM toxicity, including genotoxicity, is known to be related to particle size, the contribution of its chemical composition to the observed effects has not yet been fully elucidated. The size and composition of the particles are influenced by meteorological and climatic characteristics, especially the temperature and the period of solar radiation. The Salmonella/microsome assay is the most used for the evaluate of the mutagenicity of PM samples, however a small number of strains are used. The objective of this study was to investigate and compare the influence of the different atmospheric and climatic conditions of the cities of Limeira (Brazil), Stockholm (Sweden) and Kyoto (Japan) on mutagenicity profiles, using 11 strains with different selectivity, and chemical composition profiles of total particles suspended (TPS) composed samples collected during the winter of these cities. For the results to be directly compared, the same methodology was adopted, including the sampling procedure, the sample preparation protocol, the mutagenicity test protocol, and the chemical analysis techniques for the identification of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH) and their alkylated derivatives. Limeira presented the highest concentration of TPS (99.0 µg/m3), followed by Kyoto (28.0 µg/m3) and Stockholm (6.2 µg/m3). Although the TPS concentration in Limeira was 16-fold higher than in Stockholm and 3.5-fold higher than in Kyoto, the percentage of extracted organic material (EOM) obtained was 9, 15 and 5%, respectively. The extracts from the TPS samples collected in the three cities presented mutagenic activity for all strains, both in the absence and presence of S9, except for TA102 that did not detect the mutagenic activity in any of the extracts, and for YG7108 in the presence of S9, only for the Limeira sample. Despite the differences in meteorological and climatic conditions of these cities, their mutagenicity profiles were similar. The lower mutagenic potency for YG7108 in the absence of S9 and the non-mutagenicity in the presence of S9 reveals the lower contribution of alkylating agents to the mutagenicity of the Limeira sample in relation to the other cities. Considering the selectivity of the strains used, we can also observe a greater contribution of compounds that cause DNA oxidative damage and of alkylating agents for the mutagenicity of the Kyoto sample. However, according to the responses of the strains that have increased activity of the nitroreductase (NR) and/or O-acetyltransferase (OAT) enzymes, YG1021, YG1024 and YG1041, show the highest contribution of nitroarenes and aromatic amines for the mutagenicity of the three cities, with emphasis on those mutagens that depend on OAT activation. The mutagenic potencies expressed as a function of EOM mass (rev./µg EOM) were similar for all samples. When expressed by air volume (rev./m3), the mutagenic potencies were proportional to TPS concentrations of the three cities (Limeira> Kyoto> Stockholm). When applying the diagnostic ratios, it was possible to verify a mixture of sources of pollution in Limeira and Stockholm. The diagnostic ratios of the PAH indicate that Limeira sample is composed of fresh particles with a slight predominance of combustion sources. The Stockholm sample present aged particles with a predominance of petrogenic sources. This result was unexpected, since Limeira\'s atmospheric conditions are more favorable to particle aging than Stockholm\'s. The study of the transport of air masses explains, at least in part, the presence of aged particles in the Stockholm sample. It also suggests that the reduction of PAH concentrations in Limeira depends on the control of local sources, while in Stockholm control of local sources would not be efficient in reducing these pollutants. In parallel to the evaluation of the TPS samples, a new miniaturized protocol of the Salmonella/microsome assay in microsuspension was also developed. The protocol using 12-well microplates was validated by employing thirteen mutagenic compounds tested with three selected Salmonella strains based on their different spontaneous reversion frequencies (low, medium and high). Both the miniaturized microplate agar (MPA) and the microsuspension assay presented similar sensitivities, concluding that MPA is a promising tool and can be particularly suitable for environmental studies such as effect-directed analysis (EDA) or monitoring programs.

A natureza das ligações de hidrogênio e a influência destas interações na estrutura eletrônica de complexos neutros, catiônicos, aniônicos e radicalares foi estudada utilizando-se análises geométricas, energéticas, eletrônicas e topológicas. Inicialmente, verificaram-se alterações na aromaticidade do cátion pirílio após a complexação com uma a três moléculas de água. Tais complexos foram ainda estudados em meio reacional com constante dielétrica igual a da água com o emprego do modelo PCM (Polarizable Continuum Model). Adicionalmente, os efeitos da hidroxilação na estrutura eletrônica dos cátions benzopirílio e flavílio foram considerados. Posteriormente, analisaram-se os efeitos das fortes ligações de hidrogênio na ressonância do grupo carboxila em complexos formados entre o radical hidroperoxil e os ácidos fórmico, acético e trifluoroacético. Como extensão desse trabalho, estudos envolvendo complexos obtidos com e sem restrições na otimização de geometria possibilitaram obter informações a respeito da ressonância dos grupos carboxila e carboxilato quando o fluoreto de hidrogênio interage linear ou perpendicularmente com todos os átomos do ácido fórmico e do ânion formiato. O desenvolvimento das atividades supracitadas compreendeu a análise da função de onda pelos métodos NBO (Natural Bond Orbital), NSA (Natural Steric Analysis), NRT (Natural Resonance Theory) e AIM (Atoms in Molecules). As alterações em parâmetros geométricos e nas cargas atômicas foram consideradas. Uma análise energética foi realizada com o emprego do método de decomposição de energia proposto por Xantheas. As freqüências vibracionais e a intensidade das bandas do estiramento do grupo X-H, doador da ligação de hidrogênio, foram analisadas. As densidades de spin para os complexos radicalares também foram obtidas. A influência das ligações de hidrogênio e o efeito do substituinte na aromaticidade dos cátions foram verificados com o emprego dos métodos e índices NICS (Nucleus Independent Chemical Shifts), HOMA (Harmonic Oscillator Model of Aromaticity), HOSE (Harmonic Oscillator Stabilization Energy) e PDI (para-Delocalization Index). Os cálculos foram efetuados com os modelos B3LYP/6-31+G(d,p), B3LYP/6-311++G(3df,3pd) e UB3LYP/6-311++G(3df,3pd). Ocasionalmente, outras funções de base (EPR-III e cc-pVDZ), assim como o método MP2, foram utilizados para testar a confiabilidade dos resultados obtidos. As interações intermoleculares pouco alteraram a estrutura eletrônica e a aromaticidade do cátion pirílio. Analogamente, a substituição de um átomo de hidrogênio por um grupo hidroxila em diversas posições dos cátions benzopirílio e flavílio também não provocou modificações muito significativas na estrutura eletrônica desses cátions, embora tenha se verificado uma dependência da aromaticidade com a posição da hidroxila. Por outro lado, a distorção geométrica associada às ligações de hidrogênio foram responsáveis pelo incremento ou diminuição da ressonância do grupo carboxila nos ácidos fórmico, acético, trifluoroacético e do grupo carboxilato no ânion formiato. Os efeitos dos grupos doador e sacador de elétrons na estabilização dos complexos radicalares foram evidenciados. Adicionalmente, pode-se atribuir um caráter covalente parcial em algumas ligações de hidrogênio. / The nature of hydrogen bonds and their influence on electronic structure of neutral, cationic, anionic, and radical complexes was studied by using geometric, energetic, electronic, and topological analysis. The changes in aromaticity of the pyrylium cation upon complexation with one up to three water molecules were investigated. The PCM (Polarizable Continuum Model) model was employed to study the pyrylium-water complexes in a water reaction medium. In addition, the effects of hydroxylation on electronic structure of the benzopyrylium and flavilium cations were also considered. In addition, the effects of strong hydrogen bonds on carboxyl group resonance in the complexes formed between the hydroperoxyl radical and formic, acetic, and trifluoroacetic acids were analyzed. In extension of this work, studies including complexes, obtained with and without geometric restrictions, provided information about the resonance of the carboxyl and carboxylate groups when the hydrogen fluoride interacts, linear or perpendicularly, with all atoms of formic acid and formate anion. The analysis of the wavefunction by using NBO (Natural Bond Orbital), NSA (Natural Steric Analysis), NRT (Natural Resonance Theory), and AIM (Atoms in Molecules) methods was necessary to the development of the above mentioned activities. The changes in geometric parameters and atomic charges were also considered. An energetic analysis of complexes was done with the energy decomposition method proposed by Xantheas. The vibrational frequencies and the intensity of the X-H (hydrogen bond donor group) stretching bands were studied. The spin densities for the radical complexes were also obtained. The Nucleus Independent Chemical Shifts (NICS), Harmonic Oscillator Model of Aromaticity (HOMA), HOSE (Harmonic Oscillator Stabilization Energy), and PDI (para-Delocalization Index) aromaticity criteria were employed to verify the hydrogen bond influence and the effect of hydroxylation in the aromaticity of the cations. The calculations were carried out by using B3LYP/6-31+G(d,p), B3LYP/6-311++G(3df,3pd), and UB3LYP/6-311++G(3df,3pd) models. Occasionally, other basis set (EPR-III and cc-pVDZ), as well as the MP2 method, were applied to test the accuracy of the results. The intermolecular interactions lead to small alterations in the electronic structure and aromaticity of pyrylium cation. Similarly, the substitution at different positions of the benzopyrylium and flavilium cations by a hydroxyl group does not cause significant changes in the electronic structure of these cations. However, a dependence of the hydroxyl group position on aromaticity was observed. On the other hand, for formic, acetic, trifluoroacetic acids, as well as for the formate anion, the resonance of the carboxyl and carboxylate groups is affected not only by the geometric distortions but also by the hydrogen bonds. The effects of the electron-donating and electron-withdrawing groups in the stabilization of radical complexes were characterized. Furthermore, a partial covalent character can be attributed to some hydrogen bonds.

Nesta pesquisa, calculou-se, por meio da modelagem molecular, parâmetros físico-químicos importantes à capacidade anti-radicalar de compostos fenólicos extraídos de plantas da flora nacional, Chimarrhis turbinata e Arrabidaea samydoides. As propriedades eletrônicas também podem ser analisadas por meio de superfícies representadas por legendas de cores no campo 3D. Mapa de potencial eletrostático, distribuição orbitalar de HOMO e de LUMO e densidade de spin foram superfícies avaliadas neste trabalho. Em adição, estudos de QSAR (Quantitative Structure-Activity Relationships), cálculos de descritores moleculares holísticos por meio dos programas DRAGON e VOLSURF, cálculos estatísticos incluindo algoritmo genético e PLS (Partial Least Squares), demonstraram a influência de determinadas características moleculares como fundamentais à atividade biológica. A pesquisa concluiu que o grupo farmacofórico favorável à atividade antioxidante é estrutura que apresenta predominantemente características hidrofílicas, grupos hidroxila como substituintes, características eletrônicas favoráveis à doação de elétron e à estabilização do radical fenóxi formado, além de reduzido comprometimento estérico. Consideramos que os métodos empregados no trabalho podem ser considerados como abordagem inovadora para a Ciência Cosmética, indicando potencial ação antioxidante, que poderá ser utilizada em formulações antienvelhecimento. / In this research, the calculated physico-chemical parameters, by molecular modelling, have been reported in the literature for supplying important information about the antiradicalar behavior of phenolic compounds, as the studied herein from Chimarrhis turbinata sp. and Arrabidaea samydoides sp. The electronic properties also can be analyzed by means of surfaces represented by legends of colors in the 3D field. Map of electrostatic potential, HOMO and LUMO distribution orbitalar and spin density have been used in this work. In addition, QSAR studies (Quantitative Structure-Activity Relationships), calculations of holistic molecular descriptors by softwares DRAGON and VOLSURF, statistical analysis including genetic algorithm and PLS (Partial Least Squares), demonstrate the influence of the molecular structure in the biological activity. Therefore, pharmacofor favorable to the antioxidant activity structure that presents predominantly characteristic hydrophilic, groups hydroxyl as substituintes, electronic characteristics favorable to the donation of electron and the stabilization of the radical formed, besides reduced inibition esteric. These recent methods can be considered as an innovative approach for Cosmetic Science toward antioxidant action that could be used in antiaging products.

Neste trabalho é apresentado o desenvolvimento de instrumentação eletrônica para controle e automação de um sistema de crescimento de semicondutores por Epitaxia por Feixes Moleculares. Envolve uma variedade de circuitos analógicos e digitais como: um módulo de aquisição de dados e controle baseado em uma UCP Z-80, contendo algumas interfaces digitais e analógicas multiplexadas, e comunicando-se com um microcomputador através de uma interface serial. Envolve ainda o desenvolvimento de controladores de temperatura analógicos tipo P.I.D., atuação por motores de passo e circuitos de condicionamento de sinal. / In this work is presented the development of electronic instrumentation for automation and control of a Molecular Beam Epitaxy semiconductor growth system. A variety of analog and digital instrumentation circuits have been designed and implemented, including a data acquisition and control system based on a Z-80 CPU, which controls some multiplexed digital and analog interfaces and talks to a microcomputer using serial communication. Other circuits have been also developed, including analog temperature controllers, stepper motor actuators and circuits for signal conditioning.