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Das Polysaccharid-Glykogen ist aus vielen Bakterien wie auch Eukaryoten bekannt. Es enthält ausschließlich über α1-4 Bindungen verknüpfte Glucoseeinheiten, die über α1-6-Bindungen verzweigt sind. Generell ist es als ein Speichermolekül anzusehen, das sowohl Kohlenstoff- als auch Energiequelle unter Stressbedingungen darstellt. Es ermöglicht die Aufrechterhaltung der Integrität der Zelle und die Erhaltung der notwendigen Stoffwechselvorgänge und führt zum Schutz einiger Zellbestandteile. In Bakterien ist die Regulation der Glykogen-Biosynthese durch die Kontrolle der Expression der Gene glg möglich. Der erste Schritt der Synthese ist die Bildung von ADP-Glucose aus Glucose-1-Phosphat durch ADP-Glucose-Pyrophosphorylase (ADP-Glc-PPase; ATP: α-d-glucose-1-Phosphat adenylyltransferase, EC 2.7.7.27), kodiert vom Gen glgC, gefolgt von den Reaktionen der Glykogen-Synthase (EC 2.4.1.21) und des Verzweigungsenzyms (EC 2.4.1.18), von dem die Genen glgA und glgB Genen kodiert sind. Der entscheidende Regulierungsschritt der Glykogen-Biosynthese in prokaryotischen Organismen, ist die durch ADP-Glc-PPase katalysierte Reaktion, die zur Bildung von ADP-Glukose und Pyrophosphat aus ATP und D-Glucose-1-Phosphat führt. Eine vergleichende Analyse des Glykogen-Biosynthese-Genclusters in Gram-negativen und Gram-positiven Bakterien zeigte, dass einige Gram-positive Spezies aus der Gattung Bacillus und Clostridium und den Milchsäurebakterien zwei Gene (glgC und glgD) besitzen. Sie kodieren für Proteine, die der ADP-Glc PPase ähnlich sind. Es wurde dokumentiert, dass GlgC und GlgD die Untereinheiten eines α2β2-Typ heterotetrameren Struktur bilden. Allerdings ist die Rolle von glgD bei Gram-positiven Bakterien noch unklar. Nur eine regulatorische Rolle des glgD in Bacillus stearothermophilus, ohne erkennbare enzymatische Aktivität des Protein-Produkts von GlgD ist bisher bekannt. In Bacillus subtilis und Streptomyces coelicolor hängt die Glykogen-Synthese mit der Sporulation und der Versorgung mit notwendigen Ressourcen zur Differenzierung zusammen. Die enzymatischen Aktivitäten der Glg Proteine, vor allem die Funktion von GlgD, welches Ähnlichkeiten in der Aminosäurensequenz mit GlgC zeigt, sind nicht charakterisiert. Demzufolge war der Schwerpunkt dieser Arbeit auf die Untersuchung der Funktion des glgC-homologen glgD Gens in einigen Michsäurebakterien (lactic acid bacteria, LAB) gerichtet. LAB sind eine Gruppe von fakultativ anaeroben, nicht pathogenen, nicht sporenbildenden grampositiven Bakterien mit wichtigen Funktionen für die menschliche Gesundheit und die Lebensmittelindustrie. Die vorliegende Arbeit ist auf die detaillierte funktionelle Analyse der beiden Gene glgC und glgD konzentriert, welche in den glgCDAP-B bzw. glgBCDAP Operons von Lactococcus lactis subsp. cremoris MG1363 und Lactobacillus plantarum WCFS1 liegen. Insbesondere war die Untersuchung der Funktion des glgC-homologen glgD Gens in LAB von Interesse für das Verständnis der Funktion des Speicher-Polysaccharids in dieser Organismengruppe. Mehr Informationen über die Funktion von glgD könnten dazu beitragen, den Mechanismus der Synthese und / oder Regulierung von Glykogen in dieser Bakteriengruppe zu verstehen und möglicherweise intrazelluläre Polysaccharidbildung (IPS) mit probiotischen Eigenschaften bestimmter Arten von LAB zu verknüpfen. Versuche zur funktionellen Charakterisierung dieser Gene schlossen derer Expression in verschiedenen E. coli Stämmen ein, dies gelang für alle Zielproteine in Form von unlöslichen Inclusion-bodies. Es wurden verschiedene Versuche unternommen, um die Bildung von Inclusion-bodies zu verhindern und eine größere Menge an löslichem Protein zu erhalten. Verschiedene Ansätze, wie Expression bei niedrigen Temperaturen, Wachstum unter Stress und Co-Expression mit verschiedenen Chaperonen sowie die Rückfaltung des Proteins aus Inclusion-bodies, waren nicht erfolgreich. Es war jedoch möglich, mittels einer Fusionsexpressionsuntersuchung der Gene glgC und glgD von Lb. plantarum WCFS1zu zeigen, dass es unter speziellen Wachstumsbedingungen eine Zunahme der Löslichkeit der Proteinfraktion um bis zu 50% im Vergleich zu den Standard-Zustand gab. Experimentell wurde nachgewiesen, dass die Proteine GlgC und GlgD stark miteinander interagieren. Beide Proteine scheinen Untereinheiten zu sein, die das voll aktive Enzym bilden. Das führt zum Modell bei dem α-und β-Untereinheiten eine heterotetrameren Struktur bilden, wie es schon zuvor im Gram-positiven Bakterium Bacillus stearothermophilus beschrieben worden ist. In dieser Studie konnte erstmals gezeigt werden, dass die GlgC und GlgD Proteine von Milchsäurebakterien miteinander interagieren. Außerdem wurde in dieser Studie auch eine niedrige, ATP-abhängige enzymatische Aktivität der GlgD Protein in Abwesenheit von GlgC beobachtet. Die Fähigkeit des GlgD Proteins ADP-Glc zu produzieren deutet auf eine mögliche auch katalytische und regulatorische Funktion des Proteins hin. Die ADP-Glc-PPase Aktivität wird offenbar in bestimmten LAB durch einen Protein-Komplex gebildet, der durch die Gene glgC und glgD kodiert wird. Diese Gene sind in folgenden LAB-Stämmen konserviert: Lactococcus lactis subsp. cremoris MG1363 und Lactobacillus plantarum WCFS1. Darüber hinaus weisen erfolglose Versuche zur von glgD getrennten Expression von glgC auf die Wichtigkeit von GlgD für die stabile und lösliche Expression von GlgC hin, der genaue Grund dafür ist unbekannt. Weitere Untersuchungen sind notwendig, um die vielen regulatorischen Aspekte des Glykogen Metabolismus in LAB sowohl auf Transkriptions- wie auch auf Translationsebene zu verstehen. Es könnte auch möglich sein, dass diese beiden Gene essentiell für das Wachstum dieser Arten sind, da sie trotz verschiedener Versuche mit verschiedenen Vektoren nicht deletiert werden konnten. Eine weitere wichtige Beobachtung dieser Studie wies darauf hin, dass UTP als Substrat für das gereinigte GlgD ist, ein Anzeichen für eine alternative Reaktion zur Produktion von UDP-Glucose. Dies könnte ein Hinweis für einen alternativen Weg der Glykogen-Biosynthese sein. Die Beobachtung, dass die glgC- und glgD-Gene offenbar essentiell sind und dass es möglicherweise einen alternativen Weg für die Glykogen-Biosynthese gibt, deutet darauf hin, dass Glykogen eine wichtige Rolle für das Überleben dieser LAB-Stämme spielt.

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Ziel der vorliegenden Arbeit war die Erstellung einer Übersicht über alle monogenen Erbkrankheiten und -Merkmale bei Hunden, deren molekulargenetische Ursachen bisher (Stand: Oktober 2007) identifiziert werden konnten. Ein besonderer Schwerpunkt lag dabei auf der Darstellung der verfügbaren Genotypisierungsmethoden.Im Vergleich zu anderen Spezies herrscht auf dem Gebiet der Genomanalyse bei Hunden eine auffallend hohe Forschungsaktivität. Die erste Kopplungskarte wurde 1997 veröffentlicht und ist seitdem stetig erweitert worden. Seit 2001 steht eine integrierte Kopplungskarte zu Verfügung. Ein weiterer Meilenstein war die erste Assemblierung der Sequenz des gesamten caninen Genoms CanFam1.0 im Juli 2004. Seit Mai 2005 ist eine überarbeitete Version (CanFam2.0, Mai 2005) verfügbar. Das große Interesse an der Spezies Canis familiaris in diesem Zusammenhang ist vor allem durch die besondere Eignung des Hundes als Modelltier für humane Erbkrankheiten und -merkmale begründet. Die relativ starke Inzucht innerhalb von Rassen führt zum Auftreten zahlreicher monogener Erbkrankheiten, die phänotypisch und, wie die Forschungsergebnisse der letzten Jahre zeigen, häufig auch genotypisch homolog zu Erkrankungen des Menschen sind. Die Zahl der beim Hund im Zusammenhang mit Erbkrankheiten oder bestimmten morphologischen Merkmalen identifizierten Genmutationen ist in den letzten Jahren rapide angestiegen.Die Nutzung der ständig wachsenden Menge an Daten, die sich aus der beschriebenen Entwicklung ergeben, ist nicht nur für die humanmedizinische Forschung von Interesse, sondern bietet Hundezüchtern die Möglichkeit, über den Einsatz molekulargenetischer Genotypisierungsmethoden mit einer hohen Effizienz gegen Erbkrankheiten und unerwünschte morphologische Merkmale zu selektieren.Inzwischen konnten 86 pathogene Mutationen in 64 Genen als Ursache für bestimmte canine Erbkrankheiten identifiziert werden. Für 66 Mutationen sind DNA-Tests etabliert worden. Ein weiterer DNA-Test zum Nachweis einer pathogenen Mutation beruht auf der Assoziation eines Haplotyps mit der nachzuweisenden Erkrankung. Außerdem sind neun Polymorphismen in fünf Genen beschrieben worden, die mit bestimmten Farbvarianten des Fells und der Nase assoziiert sind. Für sieben dieser Polymorphismen sind DNA-Tests entwickelt worden. (Stand: Oktober 2007)Trotz zahlreicher Quellen (OMIA, Liste der Universität Bern: Gentests beim Hund , Internetseiten verschiedener Firmen und Einrichtungen, die Gentests anbieten und Patentschriften) sind die wesentlichen Detailinformationen oft erst nach längerem Suchen auffindbar. Die vorliegende Arbeit bietet die Grundlage für die Erstellung eines Handbuches, um Tierärzten und Hundezüchtern den Zugang zu verfügbaren DNA-Tests bei Hunden zu erleichtern.

The ability to adapt to changing environments is a key feature of living cells which is usually mediated by signal transduction pathways. One of these pathways in Saccharomyces cerevisiae maintains the proper cell wall composition under cell wall remodeling and stress conditions which ensures cell shape and integrity. The pathway is hence commonly referred to as cell wall integrity (CWI) pathway. Five plasma membrane sensors detect surface stress and activate a conserved MAPK cascade through Rom2, Rho1 and Pkc1. Downstream of the cascade, Slt2 activates the transcription factors Rlm1 and SBF. These regulate the expression of genes which are involved in cell wall synthesis and cell cycle control, respectively. The sensors can be grouped into two protein families with Wsc1, Wsc2 and Wsc3 on the one hand and Mid2 and Mtl1 on the other hand. They all contain a highly mannosylated extracellular serine/threonine-rich region (STR), a single transmembrane domain and a cytoplasmic tail. Whereas Wsc-family sensors carry an additional cysteine-rich domain (CRD) headgroup, Mid2 and Mtl1 are N-glycosylated at an asparagine (Kock et al., 2015). A strain deleted in all five sensor genes is not viable and WSC1, WSC2 and MID2 are the main sensor genes to mediate the stress response. Wsc1 and Mid2 show non-overlapping spot-like and network-like localization patterns in the plasma membrane, respectively, whose formation is not governed by their transmembrane domains. Colocalization studies with marker proteins of the known yeast plasma membrane domains “membrane compartment occupied by Can1” (MCC), “membrane compartment occupied by Pma1” (MCP) and the “membrane compartment of the TOR2 complex” (MCT) revealed that Wsc1 forms a distinct plasma membrane domain which is here introduced as “membrane compartment occupied by Wsc1“ (MCW). This microcompartment depends on the cysteine-rich domain (CRD) as sensors mutated in this headgroup accumulate in the vacuole. Blocking endocytosis either by an end3 deletion or by mutation of the NPFDD endocytosis signal in the cytoplasmic tail of Wsc1 restores its signaling function but displays an altered pattern of membrane distribution, changing from spot-like in wild-type to network-like in the mutants. This indicated that clustering may protect the sensor from endocytosis. In addition, Wsc1 has amyloid-like properties suggesting a role in clustering. Accordingly, protein aggregation (clustering) is lost in a mutant of a predicted amyloid motif within the CRD, which also impairs Wsc1 signaling.

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