Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2014 / Made available in DSpace on 2015-02-05T20:57:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 328475.pdf: 3063304 bytes, checksum: c11cc6052fc237214b9f5937ae016e5f (MD5) Previous issue date: 2014 / Os vírus de genoma RNA apresentam uma ampla variabilidade genética, devido à alta taxa de mutação intrínseca associada à polimerase viral. Essas mutações ocorrerem de forma randômica, mas a variabilidade é desigual ao longo do genoma, pois mutações que resultam em efeitos deletérios sobre a aptidão são restritas. Dessa forma, o genoma é marcado por regiões permissivas para múltiplas mutações e locais críticos para estrutura e função viral. Dentre essas regiões críticas, vários trabalhos demonstraram que mutações na proteína do envelope (E) dos Dengue virus (DENV) têm impacto na aptidão e infectividade viral. Além de ser a proteína mais abundante da superfície do virion e seu principal determinante antigênico, a proteína E participa dos processos de adsorção e fusão do virion nas células hospedeiras, sendo essencial para a replicação do vírus. Nesse contexto, o objetivo deste trabalho foi avaliar a conservação e o papel do peptídeo E250-270 na infectividade dos DENV, através da síntese de vírus recombinantes mutantes. Inicialmente uma análise foi feita de modo a desenhar mutações que impactassem a sua estrutura secundária, ou interferissem com possíveis interações entre proteínas. Os fragmentos de DNA contendo essas mutações foram sintetizados e inseridos em um clone infeccioso do DENV-1, sorotipo BR/90, e então testados em ensaios de transfecção. Surpreendentemente, o vírus recombinate vBACMutJ, demonstrou um de nível replicação e espalhamento reduzido, em células de humanos e insetos, quando comparado ao selvagem, sugerindo que as mutações na sequência de E250-270 reduzem a infectividade viral.<br> / RNA viruses exhibit wide genetic variability due to the high intrinsic rate of mutation associated with viral polymerase. These mutations occur randomly, but the variability is uneven along the genome, since mutations that result in deleterious effects on fitness are limited. Thus, the genome is marked by regions permissive for multiple mutations, and critical sites for viral structure and function. Among these critical regions, several studies have shown that mutations in Dengue virus (DENV) envelope protein (E) impair viral fitness and infectivity. Besides it is the most abundant protein on the surface of the virion and its main antigenic determinant, the E protein participate in the process of adsorption and fusion into the host cell, and is essential for virus replication. In this context, the aim of this study was to evaluate the conservation and the role of the peptide E250-270 on DENV infectivity, through the synthesis of mutant recombinant viruses. Initially, an in depth analysis was performed in order to design mutations that would either disrupt its secondary structure or interfere with possible protein/protein interactions. DNA fragments containing these mutations were synthesized and inserted into an infectious clone of DENV-1, serotype BR/90, and then tested in transfection assays. Surprisingly, the recombinant virus vBACMutJ demonstrated a very low level of replication and spread, in human and insect cells, when compared to the wild type, suggesting that mutations in the sequence of E250-270 reduced the viral infectivity.

Made available in DSpace on 2016-08-29T15:34:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_8279_Tese_Clara Fernanda Barbirato.pdf: 794712 bytes, checksum: 13290894bcf3053215336989ea116592 (MD5) Previous issue date: 2015-02-13 / A Osteogênese Imperfeita (OI) é uma doença clínica e geneticamente heterogênea caracterizada, predominantemente, por fragilidade e deformidade ósseas e por fraturas recorrentes. A maioria dos casos de OI resulta de mutações autossômicas dominantes nos genes COL1A1 e COL1A2, que codificam as cadeias formadoras do colágeno tipo I, principal proteína dos ossos. Nos últimos anos, um número crescente de casos decorrentes de mutações recessivas vem sendo relatado em genes associados à biossíntese do colágeno tipo I ou à formação e a mineralização óssea, como os genes LEPRE1, CRTAP, PPIB, FKBP10, SERPINH1 e SERPINF1. Mutações nesses genes, em geral, levam ao desenvolvimento de fenótipos graves e letais de OI. Neste trabalho, foram analisados os genes LEPRE1, CRTAP, PPIB, FKBP10, SERPINH1 e SERPINF1 de 25 pacientes com OI utilizando-se as técnicas de SSCP e sequenciamento. Ao todo, 29 variações genéticas foram detectadas, entre mutações e polimorfismos. Das onze variações encontradas no gene LEPRE1, estão a já bem descrita c.1080+1G>T e as mutações potencialmente deletérias c.2024G>A / p.Lys363Glu e c.1501C>T / p.Arg501Trp. No gene FKBP10, foi encontrada a também descrita duplicação c.831dupC, além da c.1546G>A / p.Leu516Phe, predita como causadora da doença. Observou-se que os genes FKBP10 e LEPRE1 contêm as principais mutações encontradas neste trabalho e sugere-se que os mesmos sejam preferencialmente analisados em estudos de triagem e identificação de mutações em OI. Até o momento, não existem relatos de mutações nos genes LEPRE1, CRTAP, PPIB, FKBP10, SERPINH1 e SERPINF1 em pacientes brasileiros e este trabalho fornece novas informações sobre os aspectos genéticos da OI recessiva / Osteogenesis Imperfecta (OI) is a clinically and genetically heterogeneous disease predominantly characterized by bone fragility and deformity and recurrent fractures. Most cases of OI result of autosomal dominant mutations in COL1A1 and COL1A2 genes that encode the chains forming type I collagen, the main protein in bones. In the past few years, an increasing number of cases due to recessive mutations has been reported in genes associated with the biosynthesis of type I collagen or to the formation and bone mineralization, such as LEPRE1, CRTAP, PPIB, FKBP10, SERPINH1 and SERPINF1. Mutations in these genes, in general, lead to the development of severe and lethal OI phenotypes. In this work, LEPRE1, CRTAP, PPIB, FKBP10, SERPINH1 and SERPINF1 of 25 OI patients were analyzed using SSCP and automated sequencing. Altogether, 29 genetic variations were detected, mutations and polymorphisms. Among the eleven variants found in LEPRE1 gene, there are the already well described c.1080 + 1G> T and the potentially deleterious mutations c.2024G> A / p.Lys363Glu and c.1501C> T / p.Arg501Trp . In FKBP10 gene, the previously described duplication c.831dupC, and c.1546G>A / p.Leu516Phe, predicted to be disease causing, were detected. It was observed that FKBP10 and LEPRE1 contain the most important mutations found in the patients studied in this work and it is suggested that LEPRE1 and FKBP10 should be preferably analyzed in studies of screening and identification of mutations in patients with OI. To date, there are no reports of mutations in LEPRE1, CRTAP, PPIB, FKBP10, SERPINH1 and SERPINF1 genes in Brazilian patients and this study provides new information on the genetic aspects of recessive OI.

Orientador: Denise Bevilaqua / Banca: Ana Teresa Lombardi / Banca: Paulo Teixeira Lacava / Resumo: Com o advento dos bens de consumo industrializados, tornou-se maior a demanda por compostos minerais, sendo o cobre um dos metais mais utilizados para a produção de componentes tecnológicos, o que confronta a atual capacidade das mineradoras, uma vez que as jazidas vem se esgotando progressivamente e portanto apresentam teores cada vez menores. Neste contexto, a Biohidrometalurgia, processo que utiliza micro-organismos que promovem a dissolução de minérios sulfetados para otimização da extração do metal de interesse, apresenta-se como alternativa promissora e mais ambientalmente adequada para a recuperação de metais a partir de minérios de baixo teor. A maior parte do cobre presente na natureza encontra-se na forma de calcopirita, mas esse sulfeto mineral é altamente refratário ao ataque químico e biológico. Atualmente não há processo biohidrometalúrgico comercial em operação para a extração do cobre da calcopirita. A maior limitação para isso não está nos aspectos operacionais do processo, mas nos micro-organismos envolvidos nele. Desta maneira, o objetivo deste trabalho foi obter novas linhagens mutantes utilizando técnicas da genética clássica (radiação ultravioleta) a partir de uma das principais bactérias envolvida neste processo a Acidithiobacillus ferrooxidans e disponível em nosso banco de linhagens e avalia-las quanto à alguns dos parâmetros envolvidos no processo. Por meio da aplicação de radiação ultravioleta em diferentes tempos (0, 10, 15, 30, 60, 120, 300, 600, 1800 e 7200 segundos) na linhagem selvagem de A. ferrooxidans foram obtidos dezoito linhagens mutantes para cada fonte energética. Estes mutantes foram avaliados quanto à capacidade de produção de ácido na presença de enxofre elementar e quanto às velocidades iniciais (v0) na cinética de oxidação dos íons ferrosos. As linhagens mutantes que se destacaram nestes aspectos foram utilizadas em ensaios de frascos agitados... / Abstract: Recent industrialization has demanded great amounts of mineral compounds copper is one of the most utilized in technological components manufacturing. The large increase in mining activities has resulted in lower grade mineral deposits. As a consequence, the demand for technical and economical solutions became critical. In this context, biohydrometalurgy, a process that uses microorganisms to perform mineral sulphide dissolution for improving metal extraction, has been pointed as a promising and environmentally safer solution for metal recovery from low grade mineral deposits. In its natural conditions most of copper is found as chalcopyrite, but this mineral sulphide is recalcitrant to chemical and biological dissolution. Nowadays, there is no commercial biohydrometalurgic processes for extracting copper from chalcopyrite. The biggest issue for this is not in the operational aspects of the process, but the microrganisms involved in it. The aims of this study were to obtain new mutant strains of Acidithiobacillus ferrooxidans, the main bacterium involved in this process, (available in our strains collection) using classical genetics tools (ultraviolet radiation) and study some parameters involved. By means of ultraviolet radiation directed to the wild strain of Acidithiobacillus ferrooxidans in different exposure periods (0, 10, 15, 30, 60, 120, 300, 600, 1800 and 7200 seconds), eighteen mutant strains were obtained for each energy source. These strains were evaluated regarding their capacity of acid production in the presence of elemental sulphur and initial velocities in the kinetics of ferrous ions oxidation. The cell suspensions with higher performances were submitted to shake flasks experiments in the presence of chalcopyrite. The selective pressure of UV radiation over the wild strain resulted in mutant bacteria that presented different behaviors towards kinetics consumption of its energetic sources. Nine strains from ferrous ions... / Mestre

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2008. / Submitted by Suelen Silva dos Santos (suelenunb@yahoo.com.br) on 2009-10-19T16:55:50Z No. of bitstreams: 1 2008_SyomaraHakikoMatusitaSoaresRezende.pdf: 2481803 bytes, checksum: 686b92c7e5facc7b3520a55d4d76d3d6 (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2009-12-03T18:32:54Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008_SyomaraHakikoMatusitaSoaresRezende.pdf: 2481803 bytes, checksum: 686b92c7e5facc7b3520a55d4d76d3d6 (MD5) / Made available in DSpace on 2009-12-03T18:32:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008_SyomaraHakikoMatusitaSoaresRezende.pdf: 2481803 bytes, checksum: 686b92c7e5facc7b3520a55d4d76d3d6 (MD5) Previous issue date: 2008 / Baculovírus são vírus de inseto com grande potencial de uso em programas de controle biológico principalmente devido ao seu apelo ecológico, uma vez que são altamente específicos ao inseto alvo e não apresentam toxicidade ao homem e ao meio ambiente. Sua produção tem sido feita basicamente pela sua multiplicação no inseto hospedeiro. Porém, a produção de baculovírus em cultivos celulares oferece vantagens em relação à multiplicação in vivo por ser um sistema controlável, estéril, com alta pureza do produto e por dispor de centenas de linhagens de células de inseto estabelecidas. No entanto, sucessivas passagens do vírus em cultura de células podem resultar em alterações genéticas levando à perda de virulência. A alteração mais comum refere-se à formação de mutantes FP (Few Polyhedra) devido a mutações no gene 25k fp. O baculovírus Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) vem sendo utilizado com sucesso como agente de controle da lagarta da soja (A. gemmatalis). Entretanto, sua produção tem sido feita in vivo e pouco se conhece sobre sua produção em cultivos celulares. Nesse trabalho, os efeitos causados pela passagem do vírus AgMNPV em células BTI-Tn-5B1-4 foram estudados. A porcentagem de células contendo muitos poliedros manteve-se alta e constante até a quinta passagem. A partir desse ponto houve uma redução significante na quantidade de células com muitos poliedros com concomitante aumento na quantidade de células com poucos poliedros. Em paralelo, houve um dramático aumento no título viral pela produção de vírus extracelulares (budded virus). Todos esses parâmetros associados à análise ultraestrutural caracterizam a geração de mutantes FP durante a passagem serial do vírus em cultura de células. Adicionalmente, os perfis de restrição do DNA viral obtido em diferentes passagens mostraram similaridade revelando a ausência de grandes modificações genéticas, como deleções e inserções no genoma do vírus. A indicação da presença de alterações menores como mutações pontuais no locus do gene 25k fp foi comprovada pela determinação da sequência nucleotídica deste gene nos mutantes selecionados (sobrenadante da sétima passagem). Mutações pontuais foram detectadas em três clones (FP1, FP3, FP4) na região do gene 25k fp, incluindo sua região promotora, sendo que apenas um clone (FP5) não apresentou qualquer alteração nesse gene. Com base na cinética de síntese de proteínas utilizado marcação radioativa, uma redução na síntese da poliedrina (principal componente protéico dos corpos de oclusão) foi também observada em todos os clones do tipo FP em comparação com o vírus padrão. Além disso, a análise ultraestutrural dos clones FP revelou características típicas de formação de mutantes FP como células com poucos ou nenhum poliedro, produção de poliedros amorfos com baixo número de virions e formação de estroma virogênico com intensa produção de nucleocapsídeos. Finalmente, variantes Many Polyhedra (MP), apresentando um maior número de poliedros por célula e um título de budded virus similar ao vírus parental, foram selecionados como parte de uma estratégia para produção do vírus em escala maior em cultivos celulares (biorreatores). _________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Baculovirus are insect viruses with great application potential for biological control programs due mainly to their ecological appeal, once they are highly specific to the host insect and do not present toxicity to man and to the environment. Their production has been made basically by their multiplication in host insects. Nevertheless, baculovirus production in cell cultures offers advantages over the in vivo multiplication for being a controllable, sterile, high pureness product yield process besides the fact of hundreds of cell lines being already established. However, successive passages of the virus in cell culture result in genetic alterations leading to loss of virulence. The most common alteration is the FP (Few Polyhedra) mutants formation due to mutations in the 25k fp gene. Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) baculovirus is being used successfully as control agent of the soybean caterpillar (A. gemmatalis). However, its production has been made in vivo and little is known on its production in cell cultures. In this work, the effects caused by the passage of the AgMNPV in BTI-Tn-5B1-4 cells was studied. The percentage of cells containing many polyhedra remained high and constant until the fifth passage. From this point on there was a significant reduction in the amount of cells with many polyhedra with concomitant increase in the amount of cells with few polyhedra. In parallel, there was a dramatic increase in the viral titer by production of extracellular virus (budded virus). All these parameters associated to the ultra structural analysis characterize the FP mutants generation during serial passage of the virus on cell culture. Additionally, there was similarity in the viral DNA restriction endonuclease digestion profile of different passages reveling no significant genetic modifications, such as deletions and insertions. The indication that small alterations, such as point mutations, present in the 25k fp gene locus was confirmed by this gene nucleic sequence determination in the selected mutants (seventh passage of supernatant). Point mutations in the 25k fp gene region were detected in three clones (FP1, FP3 and FP4), including its promoter region, and only one clone (FP5) did not present any alteration in this gene. Based on the protein synthesis kinetics using radioactive labeling, a reduction in the polhyedrin synthesis (the main component of the occlusion bodies) in all FP clones was also observed in comparison to the standard virus. Moreover, the ultra structural analysis of the FP clones disclosed typical characteristics of FP mutants formation such as cells with few or no polyhedra, amorphous polyhedra production with low virions number and virogenic stroma formation with intense nucleocapsid production. Finally, Many Polyhedra (MP) variants, presenting a larger number of polyhedra per cell and a similar to the parental virus budded virus titer, were selected as part of a strategy for a larger viral scale up production in cell culture (bioreactors).

Orientador: Carmen Silvia Bertuzzo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-21T17:46:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Parizotto_EneidaAbreu_M.pdf: 2181551 bytes, checksum: e328e2d73756eb3e85624dd438e919b8 (MD5) Previous issue date: 1996 / Mestrado / Genetica / Mestre em Ciências Biológicas

Orientador: Fernando F. Costa / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-22T05:43:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Szajner_Patricia_M.pdf: 8780724 bytes, checksum: aa9936632c1e0298e53db8392b37b06a (MD5) Previous issue date: 1997 / Resumo: A hemofilia B é uma doença hemorrágica hereditária caracterizada pela deficiência ou anormalidade da atividade coagulante do fator IX (FIX:C). O gene que controla a produção do fator IX está localizado no cromossomo X, na posição Xq27.1. É constituído por oito exons e sete íntrons abrangendo uma região de aproximadamente 33,5 kb que origina um mRNA de 2,2 kb. A análise do gene do fator IX de hemofílicos indica que cerca de 95% das alterações moleculares são identificadas nas seqüências correspondentes à região promotora, regiões codificadoras e sítios de excisão de íntrons. A maioria das mutações apresenta origem independente. As mutações de ponto são as alterações moleculares descritas em aproximadamente 85% dos casos de hemofilia 8, sendo o restante devido a perdas ou inserções gênicas. A análise do polimorfismo de conformação de hélices simples de DNA (SSCP) possibilita o rastreamento rápido e eficaz de mutações. A identificação das mutações pelo seqüenciamento direto do DNA permite a determinação precisa da portadora, diagnóstico pré-natal e viabiliza o aconselhamento genético. A comparação das mutações e quadros clínicos dos pacientes estudados neste trabalho com aqueles descritos em publicações anteriores também permitem a avaliação do efeito destas alterações na atividade do fator IX. Neste estudo foi realizada a análise das alterações moleculares no gene do fator IX de 29 pacientes portadores de hemofilia 8. A metodologia consistiu na amplificação das regiões codificadoras e promotora do gene do fator IX pela reação em cadeia da polimerase (PCR) e posterior análise do SSCP radioativo e não-radioativo, este último em um sistema automático de eletroforese (Phastsystem® Pharmacia), corado com nitrato de prata. A identificação das mutações foi realizada pelo seqüenciamento direto do fragmento do DNA com padrão anormal no SSCP. Com o emprego destas técnicas foi possível o reconhecimento de alterações moleculares em todos os pacientes analisados. Cinco mutações de ponto foram detectadas apenas na análise de SSCP radioativo. O seqüenciamento dos fragmentos com padrão de migração anormal permitiu a detecção de 31 mutações de ponto no gene do fator IX. Destas alterações, 22 representavam mutações diferentes, das quais 6 ainda não descritas na literatura. Em um paciente foram encontradas três alterações nucleotídicas, uma delas uma mutação silenciosa na posição 31.093. A análise dos haplótipos indica que 24 mutações identificadas neste estudo apresentam origem independente. Quatro pacientes originários do Estado do Pará apresentam mesma mutação e haplótipo idêntico evidenciando a ocorrência de um possível efeito do fundador. O estudo das mutações no gene do fator IX apresenta-se como um modelo para a determinação do padrão das alterações moleculares em linhagens de células germinativas. O padrão de mutações identificado no gene do fator IX é semelhante entre Caucasóides, Asiáticos, e pequenos grupos de Hispânicos e Negróides. A população brasileira apresenta origem étnica bastante heterogênea e é representada por imigrantes provenientes da Europa, África, Ásia e pelas populações indígenas residentes mostrando-se, desta forma, distinta das demais populações previamente analisadas. O padrão de mutação verificado neste estudo é semelhante àquele observado em outras populações o que sugere a predominância dos processos endógenos na determinação das mutações espontâneas em células germinativas / Abstract: Hemophilia B is a common hereditary bleeding disorder resulting from a deficiency of functional factor IX. The gene of factor IX spans about 33,5 kilobases and is situated on the distal portion of the long arm of X-chromosome at band Xq27.1. The gene is composed of eight exons and seven introns. Around 95% of mutations leading to hemophilia B occur in the 2,2 kilobases of the factor IX gene that included the promotor region, coding sequences, and splice junctions. Most are independent mutations. Point mutations account for about 85% of independent mutations. Deletions, insertions, and more complex gene rearrangements account for the remainder of the molecular mechanisms responsible for hemophilia B. The Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP) analysis is a rapid and sensitive technique that can be used to detect single base substituions. Direct Sequencing of amplified genomic DNA defines the location and nature of any mutation and is a necessary final step of any detection method. The SSCP analysis followed by DNA sequencing allows accurated carrier detection and prenatal diagnosis, eliminating the need for informative segregetion of markers. Hemophilia B is a good model for deducing the underlying pattern of spontaneous germ-line mutation in humans. In addition, the study of naturally occurring mutations, combined with the study of genetically engineered mutant recombinant proteins, has yielded a wealth of information regarding structure-function relationships of factor IX. The pattern of mutation is similar among .Caucasians, Asians, and small groups of Blacks and Hispanics. The ethnic origin of Brazilian population is highly. heterogeneous (imigrants from Europe, Africa, Asia and, also, Indigenous) and different from previous populations studied. In order to elucidate the genetic basis of a distinct population and to perform a precise carrier detection, we carried out a study of 29 patients with hemophilia B of Brazilian origino The screening protocol consisted of amplification of coding and promoter regions of factor IX gene by PCR, followed by a radioactive and non-radiactive analysis of single-strand conformation polymorphisms (SSCP) on the PhastSystem Df Pharmacia®. The confirmation of the molecular defect was done by sequencing of the exon with abnormal electrophoretic mobility on SSCP. The results of SSCP revealed abnormal mobility in ali 29 patients and 31 point mutations were determined by direct sequencing of DNA. Twenty-two diferent single base pairs were identified: fifteen in exon 8, three in exon 6, and two in exon 4. Six non previously described point mutation were identified. Three point mutations were found in patient HB31, one of them silent. Haplotype analysis determined that at least twenty-four point mutations could be considered of indenpendent origino Our results shown that this methodology has the potential of detecting ali genetic defects in patients of Brazilian origin with hemophilia B. A large number of recurrent mutations described here is in accordance with data from distinct patients from around world and suggest that the mutation in the factor IX gene is likely the result of endogenous process rather than enviromental mutagens / Mestrado / Genetica / Mestre em Ciências Biológicas

Orientadores: Carmen Silvia Bertuzzo, Ilma Aparecida Paschoal / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-23T15:52:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Serra_HelianeGuerra_D.pdf: 6438255 bytes, checksum: f5a26f3b246cd061ab412d6654d9cd87 (MD5) Previous issue date: 1998 / Doutorado / Genetica / Doutor em Ciências Biológicas

Orientadores : Edi Lucia Sartorato, Denise Yvone Janovitz Norato / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-07-31T15:03:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Caldas_HeloisaCristina_M.pdf: 16831040 bytes, checksum: 18bbddcc1afb7e9b973df9e22e2bc68b (MD5) Previous issue date: 2001 / Resumo: As doenças de depósito de glicogênio (GSD) incluem aproximadamente 12 tipos, onde existe falta de uma ou de diversas enzimas que metabolizam o glicogênio normal e são também chamadas de glicogenoses. Os acúmulos intracelulares do glicogênio afetam principalmente células hepáticas, renais, músculo cardíaco e esquelético. As diferentes formas de GSD foram classificadas de acordo com a ordem cronológica em que os defeitos enzimáticos foram identificados. A GSDI compreende um grupo de doenças raras, com padrão de herança autossômico recessivo apresentando grande heterogeneidade clínica e bioquímica. Existem dois principais subgrupos, GSDIa e Ib, confirmados em nível molecular. O subtipo Ia se refere à deficiência da enzima glicose-6-fosfatase (G6Pase), enzima responsável pela manutenção da glicose sanguínea; a GSDIb relacionada à deficiência da glicose-6-fosfato translocase (G6PTl) responsável pelo transporte da glicose-6-fosfato para o lúmen do retículo endoplasmático, onde a unidade catalítica da G6Pase está situada. Outros subgrupos menos comuns foram também identificados, tais como o subgrupo Ic que envolve o transporte de fosfato e pirofosfato e, finalmente, Id que envolve a enzima responsável pelo retomo da glicose do lúmen do retículo para o citosol, existindo, no entanto, controvérsia com relação à classificação desses últimos subtipos. A GSDID é causada pela deficiência da enzima bifuncional AGL, uma proteína monomérica com dois sítios catalíticos diferentes: oligo-l, 4-1,4 glucontransferase e amilo-1,6-glucosidase, e para o funcionamento normal, ambas as atividades são requeridas. A enzima AGL combinada à ação da fosforilase é responsável pela completa degradação do glicogênio. Devido à heterogeneidade clínica dos tipos I e m, durante a infância é difícil se diferenciar clinicamente as duas formas, ambas apresentando sintomas similares de hepatomegalia, hipoglicemia, hiperlipidemia,retardo de crescimento entre outros. Neste trabalho foram estudados 14 indivíduos com sinais clínicos sugestivos de GSDI onde não foram encontradas alterações no gene da G6Pase, responsável pelo subtipo Ia, esses pacientes são, portanto classificados como tipo I non-Q. O gene G6PTl foi seqüenciado completamente em todos os pacientes estudados e dois deles foram diagnosticados em nível molecular como sendo na verdade GSDIb. Foram estudados 6 exons do gene AGL, onde estão localizadas a maioria das mutações descritas até o momento no gene, e somente foram detectados polimorfismos em todos os indivíduos estudados. O protocolo molecular desenvolvido no presente trabalho mostrou-se adequado para o rastreamento de mutações, apesar de terem sido diferenciados molecularmente somente dois indivíduos com subtipo Ib / Abstract: There are 12 types of glycogen storage disease (GSD). There disease are characterized by the absence of one or many of enzymes called glycogenoses, which are responsible for normal glycogen metabolismo The intracelular increase of glycogen mainly affects hepatic, kidney, cardiac and squeletic muscle cells. GSDs have been classified according to the cronological order in which enzymatic defects were identified. GSDI includes a group of rare disease of autosomal recessive disorders and clinical and biochemical heterogeneity. There are two main subgroups GSDIa and Ib. A diagnosis can only be confirmed by molecular studies. Subtype Ia is caused by a deficiency glucose-6-phosphatase (G6Pase), is responsible for the mantainance of blood glucose homeostasis. Subtype Ib results trom a deficiency of the glucose-6-phosphate translocase enzyme. This enzyme transports glucose-6-phosphato into the lumen ofthe endoplasmic reticulum, where the G6Pase catalitic site situated. Such as Ic and Id have also been identified. Subtype Ic is related to phosphate and pyrophosphate transporter and Id is related to the enzyme responsable for glucose transport trom lumen to cytosol. GSDm is caused deficiency of bifunctional enzyme (AGL) is a monomeric protein, with both amylo-l,6-glucosidase and 0Iigol,4-1,4 glycosyl transferase activity at two separate catalytic sites. The AGL enzyme, together with phosphorylase, is responsible for degradation of glycogen. During infancy, type m disease may be almost indistinguishable from type I disease, as hepatomegaly, hypoglycemia, hyperlipidemia, and growth retardation are similar predominant features. In the present study, we report molecular and clinical finding in 14 patients with suggestive clinical symptoms of GSDI which didn't be found mutations in the G6Pase gene, responsable by subtype Ia, these patients are thus, classifieds as type I non-a. DNA sequencing of the exons ofthe G6PTl in 14 patients mutations in the G6PTl gene were found in two patients. Six exons of AGL gene were studied, which are found the majority of describe mutation, and just be found polymorphism in all studieds individuals. The molecular protocol that was studied, showed suitable to mutation screemng, whowever to be were find only two individuals with subtype Ib / Mestrado / Ciencias Biomedicas / Mestre em Ciências Médicas

Orientador : Fernando F. Costa / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-01T12:39:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Shitara_EdsonShusaku_M.pdf: 13377377 bytes, checksum: 8ddc98862559481b7bfb0bb363d2deb2 (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo:O mieloma múltiplo (MM) é uma doença neoplásica maligna que se desenvolve em células linfocitárias de linhagem B, em sua fase mais evoluída, chamada de plasmocitária. Ele é caracterizado pela tríade formada por infiltração plasmocitária de medula óssea (MO), produção de imunoglobulinas (Igs) monoclonais e lesões osteolíticas. O MM não tem ainda bem esclarecida sua patogênese e etiologia. Fatores diversos são relacionados para justificar a carcinogênese nesta patologia. Mutações no gene N-ras estão presentes em aproximadamente 20 a 30 % dos pacientes com esta doença ao diagnóstico, além de acometimento maior quando de atividade do MM. Neste trabalho, investigamos mutações no proto-oncogene N-ras em 44 pacientes com diagnóstico de MM. A metodologia utilizada foi a de amplificação do fragmento do gene N-ras através de PCR e determinação da seqüência por meio de seqüenciamento automatizado. Em nossa investigação não encontramos nenhuma mutação do gene em qüestão. Concluímos que a ausência de mutações no gene N-ras indica, aparentemente, que seu papel não é fundamental na etiopatogenia desta população brasileira avaliada. Este resultado pode sugerir também uma peculiaridade quanto ao uso da terapia gênica que aborde N-ras nestes pacientes / Abstract: Various authors met gene ras mutation in MM patients, mainly at N- and K-ras. The incidence is variable, but a median result is 30-40% at presentation, and until 70% in cases of relapse. The aim of this study was the determination of the frequency of mutation of the hot-spots codons 12,13 and 61 N-ras proto-oncogene. We studied the bone marrow DNAfrom 44 patients with multiple myeloma. We used DNA sequencing methodology for identification of mutations at N-ras gene. The positive-control was a patient with mutation at codons 12 and 13 of N-ras gene from a previous investigation in our laboratory. We didn't find oncogenic mutational alterations. The result suggests that the mutations of N-ras gene are not fundamental importance for pathogenesis of multiple myeloma in the Brazilian population avalied. / Mestrado / Patologia Clinica / Mestre em Ciências Médicas

Orientador: Joyce Maria Annichino-Bizzacchi / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-02T08:19:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rodrigues_DalvaNery_M.pdf: 16457240 bytes, checksum: efaa7db9002ceb22a6effb7c5b8cd9a2 (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: O fator VII humano é uma glicoproteína dependente da vitamina K que tem a função de iniciar a coagulação sanguínea, ao formar um complexo com o fator tissular. O gene do fator VII está localizado no cromossomo 13q34, é composto por 9 exons e 8 introns, e possui 12,8 kb. A deficiência do fator VII é transmitida por herança autossômica recessiva, e os aspectos clfnicos são muito variáveis, nem sempre havendo uma correlação entre a atividade do fator VII e a tendência hemorrágica. Apenas um estudo, em 705 doadores de sangue de origem inglesa, determinou que a prevalência da deficiência de fator VII foi de 2,1%. A origem étnica da população brasileira é muito diferente, sendo altamente heterogênea e composta de imigrantes da Europa, África, Ásia e indígenas. Neste estudo a prevalência da deficiência de fator VII em 267 pacientes brasileiros acompanhados no Ambulatório de Hemostasia do Hemocentro-Unicamp, por alteração laboratorial do tempo de protrombina, ou quadro clínico hemorrágico foi de 3,7%. A análise das mutações no gene do F7 em seis pacientes não relacionados, permitiram a identificação de um defeito genético em todos os pacientes, incluindo uma nova mutação de ponto. O rastreamento das alterações moleculares foi realizado pelos métodos de SSCP e CSGE, que se mostraram complementares. O método de SSCP evidenciou um padrão anormal em dois pacientes não relacionados, referente a mutação G10828A no exon 8, levando a substituição R304Q. O CSGE revelou quatro padrões anormais referentes a três mutações no exon 8 (G10846T que corresponde a C310F; G10828A que corresponde a R304Q; e G10909A que corresponde a G331D) e uma mutação no exon 6 (G8926T que corresponde a 11405), esta a única ainda não descrita anteriormente. A atividade plasmática do fator VII varia significativamente inter e intraindividualmente. Essas variações podem ser decorrentes de fatores adquiridos e genéticos. Assim determinamos cinco polimorfismos no gene do fator VII (5'F7, IV57, R353Q, -401GIT e --402G/A), mas apesar do pequeno número de pacientes analisados, não se detectou nenhuma relação entre os genõtipos e a atividade do fator VII / Abstract: Factor VII is a vitamin K-dependent glycoprotein with a pivotal role in the initiation of the blood coagulation, following interaction with tissue factor. The Factor VII gene is located on chromosome 13q34 and is consist of nine exons and eight introns spanning 12,8Kb. Factor VII deficiency is transmitted as an autossomal recessive trait, the incidence of the disorder in the general population being 1 in 500.000. The clinical manifestations of Factor VII deficiency are variable, and there is no correlation between coagulation activity and tendency to bleed. A prevalency of 2,1% was reported for Factor VII deficiency in a series of 705 English blood donors. In the present study, the prevalence of. Factor VII deficiency based on na altered prothrombin time or hemorrhagic state 267 brazilian patients attended at the Hemostasis Ambulatory of Hemocentre at UNICAMP was 3,7%. Analysis of the Factor VII gene in six unrelated patients revealed a genetic defect in ali cases, including a new point mutation. The screening for molecular alterations was done using SSCP and CSGE, which gave complementary result.s. SSCP gave an abnormal pattern in two unrelated patients in which the mutation G10828A in the exon 8,resulted in the substituation R304Q. CSGE identified four abnormal patterns resulting from three mutations in exon 8 (G10846T corresponding to C310F; G10828A corresponding to R304Q; and G10909A corresponding to G331D) one mutation in exon 6 (G8926T corresponding to 1140S), the only one of these mutations not already described. Plasma Factor VII activity showed considerable inter-and intra-individual variation which may have resulted from acquired or genetic factors. Five polymophisms in the Factor VII gene, which can contribute to Factor VII levei variation were described (5'F7, IVS7, R353Q, -401GIT and -402G/A). However, the study of these patients with FVII deficiency demonstrated no relationship between the genotypes and Factor VII activity / Mestrado / Mestre em Farmacologia