Resumo: A glucoamilase é uma enzima hidrolítica que catalisa a liberação sucessiva de β-D-glicose a partir do amido e oligossacarídeos relacionados. Neste trabalho foram estudadas as glucoamilases de Aspergillus awamori expressas em levedura Saccharomyces cerevisiae. Foram utilizadas duas linhagens alteradas denominadas M1 e M2, e uma linhagem selvagem (WT), utilizada como parâmetros na comparação dos resultados. As enzimas foram produzidas em fermentação submersa, e amidos de diferentes origens vegetais foram utilizados como uma fonte extra de carbono na produção das enzimas. O melhor substrato para a produção da glucoamilase selvagem e da mutante M2 foi o amido de batata com 8,2 e 6,6 U/mL, respectivamente. Para a linhagem M1 foi o amido de mandioca com atividade enzimática de 5,9 U/mL. O amido de milho mostrou ser um substrato menos indicado para a produção destas enzimas. Para a purificação foi preparada uma coluna de afinidade com resina sepharoseTM 6B epóxi ativada ligada a acarbose, onde diferentes concentrações do ligante foram avaliadas. A coluna apresentou boa eficiência no processo de purificação conforme análise por eletroforese SDS-PAGE, com massas moleculares estimada em 100 kDa. A temperatura ótima de atividade das enzimas M1 e M2 foi 65 °C, enquanto que a selvagem teve sua atividade máxima em 60 °C. O pH ótimo de atuação das enzimas foi 4,5. As glucoamilases mutantes apresentaram maior termoestabilidade que a glucoamilase selvagem durante o processo de termoinativação, destacando principalmente a glucoamilase M2. A meia vida a 70 °C foi de 8,1 minutos para a enzima mutante M2, 4,1 minutos para a M1 e 3,0 minutos para a enzima selvagem. A energia de ativação para a desnaturação (Ead) foi de 252,9 e 262,8 KJ mol-1 para as enzimas M1 e M2 respectivamente, e de 234,3 KJ mol-1 para a selvagem. A maior energia dos mutantes indica maior resistência... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Glucoamylase is a hydrolytic enzyme that catalyzes the consecutive liberation of β-D-glucose from starch and related oligosaccharides. In this work glucoamylases from Aspergillus awamori expressed in the yeast Saccharomyces cerevisiae were studied. Two mutant strains, denominated M1 and M2, were used and one wild strain (WS) was used as parameter to compare the results. The enzymes were produced in submerged fermentation and starches from different botanical origins were used as extra carbon source for enzyme production. The best substrate for the production of wild glucoamylase and of mutant M2 was potato starch with 8.2 and 6.6 U/mL, respectively. For strain M1 the best substrate was cassava starch with enzymatic activity of 5.9 U/mL. Corn starch revealed to be a less indicated starch for the production of these enzymes. For purification, an affinity column was prepared with activated SepharoseTM 6B epoxy linked to acarbose, and different concentrations of ligand were evaluated. The column exhibited good efficiency during the purification process according to SDS-PAGE analysis, with molecular masses estimated in 100 kDa. Optimum temperature for activities of M1 and M2 enzymes was 65°C, while the wild one exhibited maximum activity at 60°C. Optimum pH for enzyme action was 4.5. Mutant glucoamylases presented higher thermostability than wild glucoamylase during the thermoinactivation process, with M2 standing out. Half life at 70°C was of 8.1 minutes for mutant enzyme M2, 4.1 minutes for M1 and 3.0 minutes for wild enzyme. Activation energy for denaturation (Ead) was 252.9 and 262.8 KJ mol-1 for enzymes M1 and M2 respectively, and 234.3 KJ mol-1 for the wild one. The higher energy of the mutants indicates higher resistance of the protein structure, since more energy is required for the molecule to enter a transition and unfolding state. Thermodynamic parameter ΔG was higher... (Complete abstract click electronic access below) / Orientador: Roberto da Silva / Coorientador: Heloiza Ferreira Alves-Prado / Banca: Maria de Lourdes T. de M. Polizeli / Banca: Fernando Araripe Gonçalves Torres / Banca: Henrique Ferreira / Banca: Eleonora Cano Carmona / Doutor

Submitted by Hellen Luz (hellencrisluz@gmail.com) on 2017-09-20T17:07:27Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_AnaliseCitogeneticaProfissionais.pdf: 405179 bytes, checksum: f5bc835191e2632d4a950f002153256b (MD5) / Rejected by Irvana Coutinho (irvana@ufpa.br), reason: Aguardar as orientações on 2017-10-10T16:50:33Z (GMT) / Submitted by Hellen Luz (hellencrisluz@gmail.com) on 2017-10-17T18:05:13Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_AnaliseCitogeneticaProfissionais.pdf: 405179 bytes, checksum: f5bc835191e2632d4a950f002153256b (MD5) / Approved for entry into archive by Edisangela Bastos (edisangela@ufpa.br) on 2017-11-23T17:00:02Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_AnaliseCitogeneticaProfissionais.pdf: 405179 bytes, checksum: f5bc835191e2632d4a950f002153256b (MD5) / Made available in DSpace on 2017-11-23T17:00:02Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_AnaliseCitogeneticaProfissionais.pdf: 405179 bytes, checksum: f5bc835191e2632d4a950f002153256b (MD5) Previous issue date: 2011-05-06 / FAPESPA - Fundação Amazônia de Amparo a Estudos e Pesquisas / Agentes genotóxicos, químicos, físicos (p. ex. raios-x) ou biológicos podem induzir danos genéticos por exposição acidental, ocupacional ou ambiental. Estes agentes podem interferir no correto desenvolvimento celular conferindo grande risco ao desenvolvimento da carcinogênese. Apesar da atuação dos sistema de reparo, muitos danos causados por estes agentes podem levar à formação de aberrações cromossômicas (AC). As aberrações induzidas podem ser: [i] estáveis (referem-se a pequenos danos, translocações recíprocas e algumas aneuploidias, que não impedem a divisão e proliferação celular) e [ii] não-estáveis (referem-se a cromossomos dicêntricos e em anel, grandes deleções e fragmentos). Os últimos, normalmente, são letais à célula. Profissionais que trabalham manuseando aparelhos que produzem radiação X, como ampolas de raios-x, tomógrafos e cintilógrafos pertencem ao grupo de trabalhadores que se expõem à radiação ionizante diariamente. Colheu-se 10 ml de sangue periférico de cada indivíduo por punção venosa utilizando agulhas e seringas descartáveis previamente heparinizadas com Liquemine (Lab. Roche 5.000 UI/ml). Após a coleta, transferiu-se o sangue para tubos de ensaio estéreis, que foram mantidos em repouso por algumas horas à temperatura ambiente, para a sedimentação das hemácias e separação do plasma.Foi realizada a análise de linfócitos do sangue periférico, através de técnicas de cultura temporária de linfócito, segundo Moorhead et al. de 20 trabalhadores (4 mulheres e 16 homens) que lidam com radiação ionizante diariamente, com pelo menos 2 anos de experiência profissional, com intuito de investigar a presença de aberrações cromossômicas nestas células, fazendo uso desta ferramenta citogenética para avaliar e elucidar as consequências da convivência profissional com índices considerados baixos de radiação ionizante. A frequencia de AC avaliada no grupo de trabalhadores foi maior que no grupo controle (P = 0,008 e P=0,001, respectivamente). Estes resultados sugerem uma avaliação mais profunda no impacto da saude destes trabalhadores, utilizando de ferramentas moleculares mais específicas, bem como a conscientização dos mesmos para um cotidiano de proteção radiológica mais eficiente.

Resumo: O gênero Potyvirus é um dos maiores dentre os vírus de planta com genoma composto por RNA. O genoma dos potyvirus codifica um único polipeptídeo que é processado por três proteinases virais que originam todas as proteínas necessárias para complementar o ciclo da infecção. A proteína HC-Pro (Helper Component proteinase) é uma dessas proteínas multifuncionais que está envolvida na amplificação do genoma, transmissão por afídeo, movimento sistêmico e local, supressão do silenciamento gênico e proteólise. Nesse trabalho, foi realizada a substituição funcional de parte da região codificadora da HC-Pro do Lettuce mosaic virus (LMV) com a porção correspondente à HC-Pro do Potato virus Y (PVY), com o objetivo de melhor compreender os papéis dessa proteína no ciclo de infecção dos potyvirus. O LMV e o PVY diferem tanto em patogenicidade quanto em círculo de hospedeiros. O LMV infecta, principalmente, espécies da família Asteraceae (alface) enquanto o PVY infecta Solanaceae. Para avaliar o efeito de tal substituição na infectividade, dois vírus quiméricos foram construídos: um clone infeccioso de LMV contendo a HC-Pro selvagem do PVY (estendendo-se dos aminoácidos 1 a 352) e um segundo clone contendo a HC-Pro de PVY com mutação no motivo conservado IGN (mutado para RPN). Os vírus recombinantes e o LMV selvagem foram inoculados via biobalística em folhas de plântulas de alface cv. Trocadero (suscetível ao LMV). A presença e a natureza das progênies virais... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The genus Potyvirus is one of the largest genera of plant RNA viruses. The potyvirus genome encodes a single polypeptide that is processed by three viral proteinases to yield all viral proteins needed for the infection cycle. One of these proteins is the multifunctional helper component proteinase (HC-Pro), which is involved in genome amplification, aphid transmission, local and systemic movement, suppression of gene silencing and proteolysis. To gain further understanding of the roles of this protein in the Potyvirus life cycle, the functional replacement of the HC-Pro coding region of Lettuce mosaic virus (LMV) with its corresponding counterpart of Potato virus Y (PVY) was performed. These viruses differ both in pathogenicity and in host range. LMV infects mainly Asteraceae while PVY infects Solanaceae. To assess the functional requirement of a homologous HC-Pro in infectivity, two different chimeric viruses were constructed i. e: a full-length LMV containing a wild type PVY HC-Pro (1aa to 352aa) and a full-length LMV containing a PVY HC-Pro with a mutation in the IGN motif (exchanged to RNP). The chimeras, and wild type LMV, were inoculated by biolistic in young lettuce plants. The presence and nature of viral progenies were checked by RT-PCR amplification followed by sequencing. All recombinant viruses were infectious and displayed systemic infection although the symptoms were weak when compared to the wild type LMV. The viruses accumulation were evaluated by differential cycles in the RT-PCR. The LMV wild type was amplified by 30 cycles while the chimerics viruses needed 40 cycles. Therefore this result indicating that the chimeric viruses titer were lower than LMV wild type. The results 4 described here demonstrated that the main biological functions of HC-Pro can be accomplished by heterologous protein. / Orientador: Marcelo Agenor Pavan / Coorientador: Ivan de Godoy Maia / Banca: Renate Krause Sakate / Banca: José Osmar Gaspar / Banca: João Roberto Spotti Lopes / Banca: Addolorata Colariccio / Doutor

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:34:59Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-11-29Bitstream added on 2014-06-13T19:24:02Z : No. of bitstreams: 1 frangioni_dss_dr_botfca.pdf: 2302780 bytes, checksum: a3bab8cdfaa8a760d70900c13de09d8d (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O gênero Potyvirus é um dos maiores dentre os vírus de planta com genoma composto por RNA. O genoma dos potyvirus codifica um único polipeptídeo que é processado por três proteinases virais que originam todas as proteínas necessárias para complementar o ciclo da infecção. A proteína HC-Pro (Helper Component proteinase) é uma dessas proteínas multifuncionais que está envolvida na amplificação do genoma, transmissão por afídeo, movimento sistêmico e local, supressão do silenciamento gênico e proteólise. Nesse trabalho, foi realizada a substituição funcional de parte da região codificadora da HC-Pro do Lettuce mosaic virus (LMV) com a porção correspondente à HC-Pro do Potato virus Y (PVY), com o objetivo de melhor compreender os papéis dessa proteína no ciclo de infecção dos potyvirus. O LMV e o PVY diferem tanto em patogenicidade quanto em círculo de hospedeiros. O LMV infecta, principalmente, espécies da família Asteraceae (alface) enquanto o PVY infecta Solanaceae. Para avaliar o efeito de tal substituição na infectividade, dois vírus quiméricos foram construídos: um clone infeccioso de LMV contendo a HC-Pro selvagem do PVY (estendendo-se dos aminoácidos 1 a 352) e um segundo clone contendo a HC-Pro de PVY com mutação no motivo conservado IGN (mutado para RPN). Os vírus recombinantes e o LMV selvagem foram inoculados via biobalística em folhas de plântulas de alface cv. Trocadero (suscetível ao LMV). A presença e a natureza das progênies virais... / The genus Potyvirus is one of the largest genera of plant RNA viruses. The potyvirus genome encodes a single polypeptide that is processed by three viral proteinases to yield all viral proteins needed for the infection cycle. One of these proteins is the multifunctional helper component proteinase (HC-Pro), which is involved in genome amplification, aphid transmission, local and systemic movement, suppression of gene silencing and proteolysis. To gain further understanding of the roles of this protein in the Potyvirus life cycle, the functional replacement of the HC-Pro coding region of Lettuce mosaic virus (LMV) with its corresponding counterpart of Potato virus Y (PVY) was performed. These viruses differ both in pathogenicity and in host range. LMV infects mainly Asteraceae while PVY infects Solanaceae. To assess the functional requirement of a homologous HC-Pro in infectivity, two different chimeric viruses were constructed i. e: a full-length LMV containing a wild type PVY HC-Pro (1aa to 352aa) and a full-length LMV containing a PVY HC-Pro with a mutation in the IGN motif (exchanged to RNP). The chimeras, and wild type LMV, were inoculated by biolistic in young lettuce plants. The presence and nature of viral progenies were checked by RT-PCR amplification followed by sequencing. All recombinant viruses were infectious and displayed systemic infection although the symptoms were weak when compared to the wild type LMV. The viruses accumulation were evaluated by differential cycles in the RT-PCR. The LMV wild type was amplified by 30 cycles while the chimerics viruses needed 40 cycles. Therefore this result indicating that the chimeric viruses titer were lower than LMV wild type. The results 4 described here demonstrated that the main biological functions of HC-Pro can be accomplished by heterologous protein.

Orientadores: Maricilda Palandi de Mello, Celso Eduardo Benedetti, Fernanda Caroline Soardi / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-15T21:27:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 CunhaJunior_JoseLuizRosenberis_M.pdf: 3002580 bytes, checksum: 1980aba7f72fdfd74e758a924771c055 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: A expressão do gene SRY (Sex Determining Region in chromosome Y) é responsável por desencadear a determinação testicular durante o desenvolvimento embrionário, a partir das gônadas ainda indiferenciadas. Mutações nesse gene são encontradas em muitos casos de anomalias do desenvolvimento gonadal. O projeto teve por objetivo principal a análise funcional do efeito de uma mutação na região promotora do gene SRY, sendo que essa mutação consiste em uma deleção de 3 pares de base em um dos sítios consenso de ligação do fator de transcrição Sp1 ao promotor do gene. O portador dessa mutação é um indivíduo com disgenesia gonadal pura 46,XY, sendo que outros membros da família apresentavam ambiguidade genital e o pai, também portador da mutação, possuía grave hipospadia ao nascimento. Para tentar esclarecer os efeitos desta mutação nos mecanismos moleculares de regulação da expressão do gene SRY, este trabalho primeiramente analisou a interação da proteína Sp1 com os sítios localizados na região promotora de SRY e o efeito da mutação nesta interação, através de ensaios de EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay). Concluiu-se que os sítios Sp1A e Sp1B se ligam a duas moléculas de Sp1 e que a mutação no Sp1A praticamente abole esta ligação. Possivelmente a ausência dessa ligação impediu a formação de um complexo de transcrição, causando uma diminuição na expressão do gene SRY e levando à ausência de formação dos testículos e reversão sexual completa na paciente. Complementando, foi analisado o efeito dessa mutação na expressão através de ensaio de expressão com gene repórter, no qual o promotor normal se mostrou em média duas vezes mais eficiente na ativação da expressão da luciferase que o promotor mutante. Entretanto, mais experimentos de transfecção, inclusive com outras linhagens celulares, devem ser realizados para confirmação desse resultado. Além disso, foi analisado o efeito de uma nova mutação (localizada na região codificante do gene SRY) na ligação da proteína SRY com o DNA, através de ensaios de EMSA. Concluiu-se que a mutação E89K, associada com disgenesia gonadal pura 46,XY, reduziu em alto nível a atividade de ligação in vitro da proteína SRY mutante ao DNA, o que representa um forte indício de que atividade reduzida da proteína mutante não foi suficiente para desencadear o processo de determinação testicular. Paralelamente, foi feito o rastreamento de mutações no gene SRY e sua região promotora em novos casos de disgenesia gonadal, não tendo sido encontradas, porém, alterações nos pacientes analisados / Abstract: The SRY (Sex Determining Region in chromosome Y) gene expression is responsible for testicular determination during embrionary development. Mutations in SRY are found in many cases of anomalies of gonadal development. This project analyzed the functional effect of a mutation in SRY promoter region; the mutation is a 3-bp deletion in a consensus binding site for Sp1 transcription factor. The patient presented 46,XY pure gonadal dysgenesis, and a family history of relatives with different levels of genital ambiguity. Her father shares the same mutation in the SRY promoter region. In order to investigate the effects of the mutation upon the molecular mechanisms that regulate SRY gene expression, the interaction of the Sp1 transcription factor with normal and mutant binding sites was analyzed by EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay). Each of Sp1A and Sp1B normal sites binds to a single Sp1 molecule, whereas the 3-bp deletion in Sp1A abolishs the binding to this site. Probably, the lack of Sp1 binding to the Sp1A site prevented the formation of a stable transcription complex, reducing the level of SRY expression and leading to the absence of testicles and complete sex reversal in the patient. Parallely, the effect of the mutation was analyzed by a reporter gene assay, indicating that the normal promoter is almost two times more efficient than the mutant promoter in the activation of luciferase gene expression using HeLa cells. However, further transfection experiments with other cell lineages must be performed to confirm this result. In addition, the effect of a new mutation (E89K, located in the SRY gene coding region) was analyzed by testing the ability of the SRY mutant protein to bind its DNA consensus sequence. EMSA assays revealed that the E89K mutation, which is associated with 46,XY pure gonadal dysgenesis, strongtly reduced the SRY protein binding activity in vitro. This result is a strong evidence that the reduced activity of SRY mutant protein was not sufficient to trigger the testicular determination in the patient, leading to the pure gonadal dysgenesis phenotype. Screening of mutations in the SRY gene coding and promoter regions was also performed in six diferent patients with 46,XY gonadal dysgenesis. However, other mutations have not been identified / Mestrado / Genetica Animal e Evolução / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Orientadores: Hyun Mo Yang, Norberto Anibal Maidana / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Matemática, Estatística e Computação Científica / Made available in DSpace on 2018-08-20T00:06:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Malaquias_AngeloMiguel_D.pdf: 3743949 bytes, checksum: d321f27ce84d0589990109a3ee8d2ab3 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Esta tese tem como objetivo abordar, matematicamente, a mutação do vírus da imunodeficiência humana (HIV) por meio de um processo de difusão e advecção. é dividida em três partes: estudo e compreensão do fenômeno biológico; formulação e análise de um primeiro sistema de equações diferenciais ordinárias para estudar o tema e, finalmente, construção e análise de um modelo de equações diferenciais parciais envolvendo a mutação. Os modelos são formulados com base em características biológicas, e procurando, sempre que possível, estabelecer um paralelo entre Biologia e Matemática. Com o modelo de equações diferenciais ordinárias mostrou-se que um sistema imunológico que perde sua capacidade de resposta permite a persistência do vírus HIV no organismo infectado. Também, do modelo com equações diferenciais parciais, concluímos que usar as próprias mutações para combater o vírus pode ser uma alternativa, assim como na idéia de mutagênese letal / Abstract: The aim of this thesis is to study mathematically the mutation of the human immunodeficiency virus (HIV) taking into account the process of diffusion and advection. The thesis is divided in three parts: the current understand of the HIV biology; formulation and analysis of a system of ordinary differential equations to understanding the persistent HIV infection; and, finally, construction and analysis of a model of partial differential equations considering the mutation. The models are formulated based on biological characteristics and whenever it is possible, a parallel between biology and mathematics was established. From system of ordinary differential equations, the persistent HIV infection can be explained by exhausting immune system response. From partial differential equations, the main conclusion is that mutations themselves can be used to fight the virus based on the idea of lethal mutagenesis / Doutorado / Matematica Aplicada / Doutor em Matemática Aplicada

Orientador: Mônica Barbosa de Melo / Dissertação (mestrado - Universidade Estadual de Campinas, Intituo de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-20T18:09:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Braghini_CarolinaAyumi_M.pdf: 2316733 bytes, checksum: 1031a8585bbf2541b2b39db621d9f45d (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: O glaucoma compreende um grupo heterogêneo de neuropatias ópticas, caracterizadas pela escavação do disco óptico e perda progressiva do campo visual, representando uma das maiores causas mundiais de perda irreversível da visão. Em 1997, o gene Myocilin (MYOC) foi descoberto, e mutações neste gene foram envolvidas no desenvolvimento do glaucoma primário de ângulo aberto (GPAA) e do GPAA do tipo juvenil (GPAA-J). No Brasil, 35,7% e 3,85% dos pacientes com GPAA-J e GPAA, respectivamente, são portadores de mutações no gene MYOC. O gene citocromo P450, família 1, subfamília B, polipeptídeo 1 (CYP1B1), primeiramente associado ao glaucoma congênito primário, tem sido apontado como modulador do fenótipo do GPAA na presença de alterações no gene MYOC. Recentemente, observaram-se mutações no gene CYP1B1 associadas ao GPAA e GPAA-J, independentemente da presença de alterações estruturais no gene MYOC, em diferentes populações. Este projeto se propôs a avaliar mutações nos genes MYOC e CYP1B1, utilizando técnicas de PCR e sequenciamento direto, em 100 indivíduos pertencentes a famílias com GPAA ou GPAA-J e 43 pacientes não relacionados portadores de GPAA-J, bem como avaliar a possível modulação do gene CYP1B1 no fenótipo da doença. Uma nova mutação no gene MYOC, c.1187_1188insCCCAGA, foi identificada segregando com a doença em três gerações de uma família. De acordo com análises in silico, esta mutação pode alterar os contatos internos da proteína, além de comprometer um sítio de fosforilação de caseína quinase II. Nas demais três famílias foi detectada a mutação C433R, já descrita anteriormente. Como os membros das famílias apresentavam fenótipos bastante variados, foi realizada a análise da possível modulação do fenótipo da doença pelo gene CYP1B1. Contudo, as análises mostraram a não associação de variantes deste gene na modulação do fenótipo do glaucoma nestas famílias. Nos casos não relacionados de GPAA-J, foram observadas as mutações P370L, Q368X e C433R. Nenhuma mutação no gene CYP1B1 foi identificada nestes casos, mas somente polimorfismos: R48G, A119S, V243V, V432L, A443G, D449D e N453S. De acordo com este e outros estudos, é possível concluir que mutações no gene MYOC tem papel importante no desenvolvimento do GPAA e GPAA-J, sendo a mutação C433R a mais frequente na população brasileira. Além disso, o gene CYP1B1 parece ter menor contribuição no desenvolvimento destes tipos de glaucoma em nossa população / Abstract: Glaucoma comprises a group of heterogeneous optic neuropathies characterized by excavation of the optic disc and progressive loss of visual field, representing a major global cause of irreversible blindness. In 1997, the Myocilin gene (MYOC) was discovered, and mutations in this gene were involved in the development of primary open-angle glaucoma (POAG) and juvenile-onset of POAG (JOAG). In Brazil, 35.7% and 3.85% of patients with POAG and JOAG, respectively, are carriers of mutations in the MYOC gene. The gene cytochrome P450, family 1, subfamily B, polypeptide 1 (CYP1B1), primarily associated with primary congenital glaucoma, has been related to phenotypic modulation of POAG in the presence of MYOC gene mutations. Recently, mutations in the CYP1B1 gene associated with POAG and JOAG were observed, regardless the presence of structural alterations in the MYOC gene in different populations. This project proposed to evaluate mutations in the MYOC and CYP1B1 genes using PCR and direct sequencing, in 100 individuals belonging to families with JOAG or POAG and 43 unrelated JOAG patients, and assess the possible role of the CYP1B1 gene in modulating the disease phenotype. A novel mutation in the MYOC gene, c.1187_1188insCCCAGA, was detected, segregating with the disease in three generations of one family. According to in silico analysis, this mutation can change the internal contacts of the protein, and has altered a phosphorylation site of casein kinase II. In the other three families the C433R mutation was detected, as described earlier. As family members presented with very different phenotypes, the CYP1B1 gene was evaluated as a possible modulator of the disease. However, the analysis showed no association of variants in CYP1B1 gene in modulating the glaucoma phenotype in these families. In unrelated cases of JOAG, the mutations P370L, Q368X and C433R were detected. No mutation in the CYP1B1 gene was observed in these cases, but only polymorphisms: R48G, A119S, V243V, V432L, A443G, D449D, and N453S. According to the present and other studies, we conclude that mutations in the MYOC gene play an important role in the development of POAG and JOAG, and the C433R mutation is the most frequent MYOC alteration in the Brazilian population. Furthermore, the CYP1B1 gene seems to have less contribution to the development of these types of glaucoma in our population / Mestrado / Genetica Animal e Evolução / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Orientadores: Maricilda Palandi de Mello, Monica Barbosa de Melo, Fernanda Caroline Soardi / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-14T10:51:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Franca_EmersonSalvadordeSouza_M.pdf: 3804995 bytes, checksum: 694d80ade56340a0a1125338c03238ad (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: O gene PAX6 é o principal gene para o controle da organização do sistema ocular durante a embriogênese. Este gene pertence a uma família de reguladores de transcrição denominada PAX, sendo que seus membros compartilham um domínio funcional de 128 aminoácidos chamado de paired domain. O PAX6 é o mais bem estudado dessa família. O gene PAX6 está localizado na banda 13 do braço curto do cormossomo11 em humanos, e apresenta 14 exons sendo que os três primeiros e parte do quarto exon não são traduzidos. A proteína do PAX6 possui dois domínios funcionais: o paired domain e o homeo domain, que são separados por um segmento de ligação denominado LNK e seguidos por uma região com importante função na ativação transcricional denominada PST. A proteína do gene PAX6 é um fator de regulação transcricional altamente conservado com funções importantes para o desenvolvimento normal dos olhos e do sistema nervoso. Alterações no gene PAX6 em humanos foram associadas ao fenótipo de aniridia, da síndrome de Morning Glory (MGS) e também de doenças associadas ao desenvolvimento ocular. A aniridia é um defeito congênito raro, a qual provoca uma formação incompleta ou a ausência da íris. Embora seus efeitos variem entre os indivíduos, pode causar perda de visão. A doença pode ser de herança autossômica dominante ou de manifestação esporádica. MGS é uma anomalia congênita do nervo óptico, comumente unilateral, podendo encontrar-se associada estrabismo, ambliopia e nistagmo. Freqüentemente essa síndrome pode encontrar-se associada a anomalias endócrinas, renais e do sistema nervoso central. Sendo assim, o projeto teve por objetivos a análise molecular do gene PAX6 através de seqüenciamento e da técnica de MLPA em pacientes com aniridia e pacientes portadores da síndrome de MGS, a fim de se detectar mutações e/ou polimorfismos que pudessem estar ligados ao quadro clínico dos indivíduos. A casuística do projeto foi de três famílias com segregação aniridia, um indivíduo esporádico com aniridia e quatro indivíduos portadores da síndrome de Morning Glory. O grupo controle consistiu de 50 indivíduos triados como não tendo alterações oftalmológicas. Foi encontrada uma mutação p.R240X no gene PAX6, que causa uma troca de uma arginina por um stop codon, segregando nos indivíduos afetados da Família 1 e assim explicando o fenótipo dos indivíduos. Essa mutação é a mais freqüente associada à aniridia, porém é a primeira vez que ela foi descrita na população brasileira. Também foram encontradas diversas alterações descritas e não descritas que necessitam de mais estudos para que possam ser associadas à manifestação do fenótipo dos indivíduos afetados. Além disso, foi observada pela técnica de MLPA, uma possível micro-deleção ou alteração nucleotídica no exon 1 do gene RCN1 encontrada nos filhos das Famílias 1 e 3 podendo estar envolvida na regulação 5' do gene PAX6. Outra possível micro-deleção ou alteração nucleotídica foi também observada no exon 9 do gene ELP4, que pode estar associada a regulação 3' do gene PAX6. Esse estudo demonstrou que para a etiologia de aniridia e síndrome Morning Glory devem existir outros genes cuja expressão possa estar alterada durante o desenvolvimento. / Abstract: PAX6 gene is the major gene in the control of eye organization during development. It belongs to a family of transcription regulators called PAX, formed by several members which share a 128 aminoacid functional domain called paired domain. PAX6 is best studied within this family. In humans, it is located on chromosome 11p13 and is formed by 14 exons; the first three and part of the fourth are not translated. PAX6 protein comprises two functional domains: the paired domain and the homeo domain which are separated by a linker called LNK and followed by an important region with trancriptional activity called PST. The PAX6 protein is a highly conserved transcriptional regulator factor that is important for normal ocular and neural development. Mutations on human PAX6 gene were associated to aniridia, Morning Glory Syndrome and other ocular diseases. Aniridia is rare birth defect which leads to an incomplete formation or the absence of the iris. Although their effects vary between individual, aniridia can cause loss of vision. The disease may be autosomal dominant or sporadic event. The Morning Glory Syndrome (MGS) is a congenital optic disk dysplasia, generally unilateral, which can be associated with strabismus, amblyopia and nystagmus. This syndrome may be often associated with endocrine, renal and central nervous system abnormalities. Thus the aim of this investigation was to evaluate the molecular composition of PAX6 gene using direct sequencing and MLPA technique in patients with Aniridia and Morning Glory Syndrome, to detect mutations and/or polymorphisms associated with the patient's phenotypes. Were included in the study 1 family with segregation of aniridia, 1 family with Axenfeld-Rieger Syndrome, 1 sporadic individual with aniridia and 4 individuals carrying MGS. The control group comprised 50 individuals considered ophthalmologically normal. The nonsense mutation p.R240X was found in the PAX6 gene, segregating with the affected members in family 1, what explains their phenotypes. This mutation is one of the most frequent nonsense mutations associated with the aniridia, however this is the first report on a PAX6 gene mutation familial case of aniridia in Brazil. Several described and non-described nucleotide variations were found, but additional studies are required to correlate them to the phenotype of affected individuals. Furthermore, the MLPA technique showed possible micro-deletions or mutations in exon 1 of RCN1 gene, located 5' to PAX6. This result was observed in both male children of families 1 and 3. Other possible micro-deletion or mutation was observed in exon 9 of ELP4 gene, which can be associated to 3' regulation of PAX6 gene. This study demonstrated that the involvement of other gene whose expressions may be altered during the development cannot be excluded for the etiology of aniridia and Morning Glory Syndrome. / Mestrado / Genetica Animal e Evolução / Mestre em Genética e Biologia Molecular

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Os operadores da área da radiologia em hospitais são a classe de trabalhadores que está exposta de forma mais direta e, portanto, são alvos de investigações que podem auxiliar no entendimento da interação das RI com o material biológico, além de auxiliar a estes profissionais no requisito de proteção radiológica. Foram coletadas 75 amostras de indivíduos que trabalham em vários departamentos da radiologia em 5 hospitais de 4 Estados diferentes no Brasil (São Paulo, Minas Gerais, Rio Grande do Sul e Pará). Os critérios de seleção para a participação foram: ter ao menos 18 anos de idade e 2 anos de profissão, não ser etilista ou tabagista, não estar tomando medicamentos. Para análise citogenética, foram realizados os testes do cometa e Micronúcleo, assim como estudo de aberrações cromossômicas. Este estudo foi avaliado e aprovado por comitê de ética. Todos as amostras foram comparadas com indivíduos do mesmo gênero e idade que não tenham passado por qualquer tipo de exame radiológico nos últimos 6 meses.Quando comparados com o controle, os testes de MN e AC demonstraram uma totalidade de danos, usando o teste T, o banco de dados SPSS e bioestat. O teste do cometa mostrou um nível de danos maior se comparado aos controles (0,84 0,47). Foi estabelecida a média de idade e feita relação entre gênero e idade dos participantes, sendo os níveis de danos maiores para o gênero feminino em relação ao masculino. Individuos com idades acima dos 45 anos também demonstraram um nível de dano maior quando comparados com idades inferiores. Um fator a ser levado em consideração é de que a população de Porto alegre apresentar um nível de dano menor se comparado aos outros grupos, sendo muito provável este evento por conta da utilização de equipamentos DR de conversão direta. Os equipamentos de Belo Horizonte e Ribeirão Preto utilizam CR e os de Belém, convencionais. / Ionizing radiation (IR) are present in most of the early diagnosis of a multitude of diseases, many cancers are included, and have the characteristic of a quick and accurate diagnosis, and often cheaper. The use of this type of energy but requires specific care protection, since the IR has a characteristic of altering the genetic material through mutations. The radiology area operators in hospitals are the class of workers who are exposed more directly and thus are targets of investigations that may assist in understanding the interaction of IR with the biological material, in addition to assisting these professionals in requirement radiological protection. We collected 73 samples of individuals working in various radiology departments in five hospitals in four different states in Brazil (São Paulo, Minas Gerais, Rio Grande do Sul and Pará). The selection criteria for participation were: at least 18 years old and 2 years in the profession, not alcoholic or smoker, not taking drugs. For cytogenetic analysis were performed the comet test and micronucleus, and chromosome aberration study. This study was approved by ethics committee. All the samples were compared to individuals of the same age and gender who have not gone through any kind of radiological examination in the last 6 meses.Quando compared with the control, MN tests and AC showed a total damage, using the t test, the database and SPSS BioEstat. The comet assay showed a higher level of damage compared to controls (0.84 0,47). The average age was established and made relationship between gender and age of the participants, the more damage levels in females compared to males. Individuals aged over 45 years also showed a higher level of damage when compared with the age. A factor to be taken into consideration is that the population of Porto Alegre present a lower level of damage compared to other groups, and most likely this event due to the use of DR equipment Direct conversion. The Belo Horizonte and Ribeirão Preto equipment using CR and Belém, conventional.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / In an attempt to solve the drought problem which causes the loss of agricultural productivity in the Brazilian semiarid zone, leading to starvation, unemployment and rural exodus, the Federal Government has deployed several public irrigated perimeters. In the State of Sergipe, we highlight the Irrigated California Area, which was intended to be the model of rational exploitation of soil and water in the northeast semi-arid. The main crops grown in this perimeter are acerola, banana, guava, mango, soursop, pumpkin, cassava, peanut, cowpea, maize, okra and tomato, with an average annual production of 12,682, 34 tons. Aiming to fulfill this agricultural demand, the use of pesticides and fertilizers is given in excess and without any technical support. This Perimeter is located in the surroundings of the Monumento Natural Grota do Angico a conservation unit. The excessive use of pesticides in this region can contaminate the environment, cause serious harm to human health, putting endangered the local wild species and those that inhabit the conservation area, can cause the loss of biodiversity and as a last destination can reach the water bodies near the plantations. Based on these data, we aimed in the present study to investigate the presence of pesticides with mutagenic effects in temporary water bodies in the Irrigated California Area by 2 tests: the SMART in the wings of D. melanogaster, in which the larvae were treated with water samples from 6 different points and the Micronucleus test, applied in erythrocytes of Hypsiboas creptans tadpoles collected in 3 water bodies between 2013 and 2014. The micronucleus test showed significantly higher frequency of micronuclei in tadpoles collected in one of the temporary water bodies in the Irrigated California Area (CD2) than the ones in the reference area (MNGA). In SMART Test we observed an increase in the frequency of mutant spot cells in the wings of D. melanogaster only in one of the water bodies (CD5), the one with no pesticides detected. The data presented here are pioneers in the evaluation of pesticides mutagenic effect in the semiarid irrigation areas of Sergipe and allow us to conclude that there are different sources of genotoxins presented in the Irrigated California Area, impacting the water and the resident biota, bringing huge risk for farmers and their families who live in that environment. / Na tentativa de resolver o problema das secas, que causam a perda da produtividade agrícola na zona semiárida brasileira, gerando fome, desemprego e êxodo rural, o Governo Federal tem implantado diversos perímetros irrigados públicos. No Estado de Sergipe, destaca-se o Perímetro Irrigado Califórnia, que foi planejado para ser o modelo de exploração racional de solo e água no semiárido nordestino. As principais culturas exploradas neste Perímetro, são acerola, banana, goiaba, manga, graviola, abóbora, aipim, amendoim, feijão de corda, milho, quiabo e tomate, com uma média de produção anual de 12.682, 34 toneladas. Visando atender essa demanda agrícola, agrotóxicos e fertilizantes são usados em excesso e sem qualquer acompanhamento técnico. Este Perímetro localiza-se no município de Canindé de São Francisco, no entorno da unidade de Conservação Monumento Natural Grota do Angico. O uso excessivo de agrotóxicos nesta região pode contaminar o meio ambiente, causar sérios danos à saúde humana, colocar em risco de extinção as espécies selvagens do local e aquelas que habitam a unidade de conservação, podendo causar a perda da biodiversidade e, como último destino, podem alcançar os corpos de água próximos às plantações. Baseando-se nestes dados, o objetivo geral do presente estudo foi investigar a presença de agrotóxicos com efeitos mutagênicos em corpos de água temporários do Perímetro Irrigado Califórnia por meio de 2 testes: Teste SMART de asa em D. melanogaster, onde larvas foram tratadas com amostras de água de 6 diferentes pontos e o Teste do Micronúcleo, aplicado em eritrócitos de girinos da espécie Hypsiboas creptans, coletados em 3 corpos de água, entre 2013 e 2014. O Teste do micronúcleo mostrou frequência significativamente maior de micronúcleos nos girinos coletados em um dos corpos de água temporários do Perímetro Irrigado Califórnia (CD2) que da área de referência (Monumento Natural Grota do Angico). No Teste SMART observou-se aumento na frequência de manchas mutantes em células da asa de D melanogaster somente para um dos corpos de água (CD5). Os dados aqui apresentados são pioneiros na avaliação de efeito mutagênico de agrotóxicos em áreas de irrigação do semiárido sergipano e nos permitem concluir que há genotoxinas de diferentes fontes presentes no ambiente do Perímetro Irrigado Califórnia, com impacto sobre a água e a biota residente, trazendo enorme risco para os agricultores e suas famílias que convivem nesse ambiente.