Orientador: Rejane Maria T. Grotto / Coorientador: Maria Inês M. C. Pardini / Banca: Giovanni Faria Silva / Banca: Andre Martins / Resumo: A infecção pelo vírus da hepatite B (VHB) constitui um grave problema de saúde pública mundial, sendo responsável por doenças hepáticas agudas, crônicas, cirrose e hepatocarcinoma. Com o intuito de diminuir a replicação viral e a progressão da infecção pelo VHB, foram aprovadas sete drogas para o tratamento da hepatite B crônica nos últimos 20 anos, sendo que no Brasil, o protocolo de tratamento baseia-se no uso dos fármacos: Interferon-alfa, Inteferon-alfa peguilado, Lamivudina, Tenofovir, Entecavir e Adefovir. No entanto, um obstáculo à utilização das drogas que atuam inibindo enzimas virais é a emergência de variantes resistentes. Desta maneira, sabendo-se que o estudo da variabilidade genética das regiões genômicas do VHB é importante não somente para analisar o perfil de resistência do vírus aos antivirais, mas também para avaliar as variantes virais circulantes no Brasil, a finalidade deste trabalho foi determinar o perfil de mutações de resistência e polimorfismos genéticos em variantes do Vírus da Hepatite B circulantes na região de Botucatu. A região genômica pol do VHB foi amplificada e sequenciada a partir de metodologia in-house, para avaliar o perfil de mutações de resistência e de polimorfismos genéticos. Dados clínicos e laboratoriais foram coletados do prontuário médico dos pacientes. Os resultados obtidos demonstraram a presença das mutações de resistência rtM204V, rtM204I e rtL180M, que conferem resistência cruzada à Lamivudina e Telbivudina e, podem ocasionar resistência cruzada ao Entecavir quando na presença de mutação adicional. Em relação aos polimorfismos, 37 substituições foram encontradas, das quais várias já foram associadas à resistência primária ou secundária ao tratamento antiviral pelo VHB, sendo que 4 ainda não foram relatadas pela literatura, sendo elas Q262E, Q139H, W79C e W257H, o que demonstra que estas subststituições ... / Abstract: Hepatitis B virus (HBV) infection is a serious global public health problem, being responsible for acute and chronic liver diseases, cirrhosis and hepatocellular carcinoma. In order to reduce viral replication and progression of HBV infection, seven drugs for the treatment of chronic hepatitis B have been approved in the past 20 years, and in Brazil, the treatment protocol is based on the use of the drugs: Interferon-alpha, pegylated Interferon-alfa, Lamivudine, Tenofovir, Entecavir and Adefovir. However, an obstacle to the use of drugs that act by inhibiting viral enzymes is the emergence of resistant variants. Therefore, the study of the variability of HBV genome is important not only to assess the resistance profile of the virus to antivirals, but also to evaluate the circulating viral variants in Brazil. Thus, the purpose of this study was to evaluate the profile of resistance mutations and genetic polymorphisms in Hepatitis B virus variants circulating in Botucatu. HBV pol genomic region was amplified and sequenced by in-house methodology, to evaluate the profile of resistance mutations and genetic polymorphisms. Additional clinical and laboratory parameters were collected from the medical records of patients. The results showed the presence of rtM204V, rtM204I and rtL180M resistance mutations, which confer cross-resistance to Lamivudine and Telbivudine and, may cause cross-resistance to Entecavir in the presence of additional mutation. Regarding polymorphisms, 37 substitutions were found, including those associated to primary and secondary resistance to HBV treatment, and of these four substitutions have not been reported in the literature, which were Q262E, Q139H, W79C and W257H, demonstrating that these substitutions may be characteristic of HBV viral variants found in our region / Mestre

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, 2011. / Submitted by Suelen Silva dos Santos (suelenunb@yahoo.com.br) on 2011-06-28T17:49:21Z No. of bitstreams: 1 2011_RafaelaCesareParmezanToledo.pdf: 689527 bytes, checksum: 94da9c149705926f4a0b862b4232701a (MD5) / Approved for entry into archive by Elna Araújo(elna@bce.unb.br) on 2011-07-06T22:36:38Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_RafaelaCesareParmezanToledo.pdf: 689527 bytes, checksum: 94da9c149705926f4a0b862b4232701a (MD5) / Made available in DSpace on 2011-07-06T22:36:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_RafaelaCesareParmezanToledo.pdf: 689527 bytes, checksum: 94da9c149705926f4a0b862b4232701a (MD5) / Kimura propôs que o principal fator evolutivo na evolução humana foi a deriva genética. Porem, nos últimos anos diversos trabalhos tem indicado que a seleção natural também pode ter tido um papel importante na evolução da espécie. Nesse trabalho foi avaliado se há forças evolutivas atuando sobre a região 3´UTR do HLA-G em duas populações do Centro-Oeste brasileiro, Distrito Federal e Kalunga, cujas histórias demográficas são bem conhecidas. O Distrito Federal apresenta uma população que foi recentemente formada pela migração de pessoas advindas de várias regiões do Brasil, tornando-se uma região urbana geneticamente representativa do país. Kalunga é uma população semi-isolada rural formada basicamente por escravos fugidos e abandonados. O HLA G apresenta baixo nível de polimorfismo, distribuição e expressão restrita a tecidos/órgãos específicos e propriedades biológicas que levam a tolerância imunológica. O maior conhecimento atual sobre o HLA-G em comparação aos demais genes de classe Ib deve-se à observação de associação de alelos e padrões de expressão com abortos espontâneos recorrentes e diversas doenças. Devido à associação do gene HLA-G com várias doenças e por ele produzir respostas diferentes a cada doença, é possível pensar que esteja sob direta influência da seleção natural, sendo que no caso da região 3´UTR do HLA-G, acredita-se que esteja sob seleção balanceadora. A hipótese desse trabalho é que a região 3´UTR do gene HLA-G deve apresentar uma série de mutações, várias ainda desconhecidas, e que essa região genômica possa estar sob pressão seletiva. Para testar essa hipótese novas mutações foram buscadas e oito SNPs (single nucleotide polymorphisms) foram avaliados na região 3´UTR do gene HLA-G a partir do seqüenciamento total do éxon 8 de 61 indivíduos de Kalunga e 72 do Distrito Federal. Com os dados levantados foram avaliados parâmetros de genética de populações e a ocorrência de seleção utilizando os Teste D de Tajima, Teste F de Fu & Li e Teste D de Fu & Li, utilizando o DNASP v5.10.01 e o teste de neutralidade de Ewens–Watterson com o Pypop v0.7.0. Como resultado, uma mutação nova foi identificada na população Kalunga. As populações não mostraram diferenças significativas, para os oito loci avaliados, quanto as freqüências gênicas e genotípicas. Ambas se adequaram ao equilíbrio de Hardy-Weinberg. Foi observado forte desequilíbrio de ligação. Foram observados 11 haplótipos diferentes no Distrito Federal e na população Kalunga oito. As populações não diferiram quanto as freqüências haplotípicas. O teste F de Fu & Li e o teste de Ewens-Watterson foram significativos para ambas as populações, o teste D de Tajima foi significativo para o Distrito Federal e o teste D de Fu & Li não foi significativo para nenhuma das populações. É possível perceber que apesar de todas as diferenças contidas na história demográfica das duas populações, para a região 3´UTR do HLA-G há forças evolutivas mantendo essa região semelhante nas duas populações. Pelo teste F de Fu & Li e pelo teste de Ewens- Watterson é visto que provavelmente houve atuação de seleção balanceadora desde muito tempo até hoje. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Kimura proposed that the main evolutionary factor in human evolution is genetic drift. However, in recent years several studies have shown that natural selection may also have played an important role in the evolution of species. In this study, we assessed whether there are evolutionary forces acting on the 3'UTR region of the HLA-G in two populations of the Brazilian Center-West, Federal District and Kalunga, whose demographic histories are well known. The Federal District has a population that was recently formed by the migration of people from many different regions of Brazil, becoming an urban region genetically representative of the country. Kalunga is a semiisolated rural population basically formed by runaway and abandoned slaves. HLA G shows a low level of polymorphism, distribution and expression restricted to tissues / organs and specific biological properties that lead to immunological tolerance. The most current knowledge on the HLA-G in comparison with other class Ib genes is due to the observation of association of alleles and patterns of expression with recurrent miscarriages and various diseases. Due to the association of HLA-G gene with various diseases and for him to produce different answers to different disease it is possible to think that this region is under the direct influence of natural selection. The case of the 3'UTR of the HLA-G, it is believed that is under balancing selection. The hypothesis of this study is that the 3'UTR of the gene HLA-G should present a series of mutations, several still unknown, and that this genomic region may be under selective pressure. To test this hypothesis were sought new mutations, one InDel and seven SNPs (single nucleotide polymorphisms) were evaluated in the 3'UTR of the HLA-G gene from the total sequencing of exon 8 of 61 individuals and 72 Kalunga of the Federal District. With the data collected were evaluated parameters of population genetics and the occurrence of selection using the Tajima D test, Fu &Li F test, and Fu & Li D test, using the DNASP v5.10.01 and the test of neutrality of Ewens-Watterson with Pypop v0.7.0. As a result, a new mutation was identified in the population Kalunga. The populations showed no significant differences for the eight markers examined for allele frequency and genotype. Both fitted the Hardy-Weinberg. We observed strong linkage disequilibrium. We observed 11 different haplotypes in the Federal District and the population Kalunga eight. The populations did not differ in haplotype frequencies. The Fu &Li F test and Ewens-Watterson test were significant for both populations, the test was significant Tajima D for the Federal District and the Fu & Li D test was not significant for any population. It is possible to verify that despite all the differences included in demographic history between populations, to the 3'UTR of the HLA-G is evolutionary forces maintaining this region similar in both populations. The Fu & Li F test and the Ewens-Watterson test is seen that there was likely action of balancing selection for a long time until today.

Orientadores: Christine Hackel, Juergen K. V. Reichardt, Maricilda P. Mello / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-10T00:27:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ferraz_LucioFabioCaldas_D.pdf: 2604031 bytes, checksum: c313be68a5b9599e035866a8ee12ef8c (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: O hormônio androgênico di-hidrotestosterona (DHT) possui fundamental importância na diferenciação sexual masculina e no desenvolvimento e manutenção da próstata. Duas enzimas atuam diretamente na concentração deste andrógeno nas células: 1) com uma função anabólica, a enzima 5α-redutase tipo 2 (gene SRD5A2) é responsável pela síntese de DHT ao converter testosterona (T) em 5α-di-hidrotestosterona e 2) com uma função catabólica, a enzima 3β- hidroxi desydrogenase/Δ5-Δ4-isomerase de esteróides tipo 2 (gene HSD3B2) é responsável pela degradação do DHT, além de contribuir para síntese indireta de testosterona por uma via anabólica. Isto exposto, cenários distintos se apresentam considerando as atividades deficientes dessas enzimas: i) a deficiência congênita da enzima 5a-redutase tipo 2 conduz a uma forma específica de pseudohermafroditismo masculino (PHM) no qual a conversão de T em DHT está nula ou defeituosa, inviabilizando a virilização normal da genitália externa em indivíduos com cariótipo 46,XY e ii) em razão das propriedades bifuncionais da enzima 3β-HSD2, tanto na via de síntese quanto de degradação de andrógenos, sua deficiência congênita pode conduzir a quadros clínicos distintos de ambigüidade genital. No adulto, mutações somáticas que afetem sua atividade enzimática podem contribuir para a manifestação do câncer de próstata, pelo acúmulo do DHT. O presente trabalho aborda as duas enzimas esteroidogênicas envolvidas com o metabolismo da DHT, buscando caracterizar mutações germinativas e/ou somáticas que conduzem a deficiências enzimáticas relacionadas a diferentes condições clínicas. Com relação à deficiência em 5a-redutase tipo 2, investigou-se a presença de mutações germinativas no gene SRD5A2 em amostras de DNA 20 pacientes de sexo genético masculino com suspeita de deficiência em 5α-redutase tipo 2, pertencentes a 18 famílias brasileiras, por meio de sequenciamento direto dos produtos de PCR dos cinco exons do gene e de suas regiões flanqueadoras. Foram identificadas alterações moleculares em 18 desses pacientes, compreendendo tanto mutações não anteriormente referidas na literatura (G158R, del642T, 217_218insC e IVS3+1G>A), como mutações recorrentes já descritas em outros grupos étnicos ou em indivíduos de outras regiões geográficas. Os resultados detalhados, bem como a discussão, acham-se apresentados no Capítulo III.1, sob a forma de artigo publicado. (...continua) / Abstract: The androgenic hormone dihydrotestosterone (DHT) has fundamental relevance in normal male sexual differentiation and in prostate development and maintenance. Two enzymes act directly on the regulation of DHT concentration at cellular level: 1) with an anabolic function the steroid 5α-reductase type 2 enzyme (SRD5A2 gene) leads to DHT synthesis by converting testosterone (T) in 5α-dihydrotestosterone and 2) with a catabolic pathway the 3β-hydroxysteroid dehydrogenase/Δ5-Δ4-isomerase type 2 enzyme (HSD3B2 gene) is responsible for DHT degradation, besides contributing to indirect synthesis of testosterone in an anabolic pathway. Thus, different scenarios can be considered regarding the deficiencies in the activities of these enzymes: i) congenital steroid 5α-reductase type 2 enzyme deficiency leads to a specific form of male pseudohermaphroditism (MPH), where the conversion of T into DHT is defective or inexistent, preventing normal virilization of the external genitalia in individuals with a 46,XY karyotype; and ii) due to the bi-functional properties of the 3β-HSD2 enzyme, either at synthetic or degradation androgen pathways, its congenital deficiency can lead to distinct manifestations of genital ambiguity. Furthermore, in the adult, somatic mutations that affect 3β-HSD2 enzymatic activities could contribute to prostate cancer manifestation, due to DHT accumulation. The present work approaches these two steroidogenic enzymes involved with the DHT metabolism, aiming to characterize germinal and/or somatic mutations leading to enzymatic deficiencies related to different clinical conditions. Concerning the steroid 5α- reductase type 2 deficiency, we screened for germinal mutations on SRD5A2 gene in DNA samples of 20 patients from 18 Brazilian families with suspected SRD5A2 deficiency, by directly sequencing of the PCR products from the five exons and flanking regions of the gene. Molecular alterations were detected in 18 of these patients, comprising either mutations not previously reported in the literature (G158R, del642T, 217_218insC e IVS3+1G>A) as well as recurring mutations already described in other ethnical groups or in individuals from other geographical regions. The detailed results and corresponding discussion are presented at Chapter III.1, as a published paper. (¿to be continued) / Doutorado / Genetica Animal e Evolução / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientador: Liana Maria Cardoso Verinaud / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-06T19:49:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Souto_PaulaCristinadeSouza_D.pdf: 7669317 bytes, checksum: eeec29689d95e50ddec45928c2c76343 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: O Paracoccidioides brasiliensis é um fungo dimórfico que cresce na forma miceliar a temperatura ambiente e na forma de levedura a 35-37ºC. Recentemente, no laboratório de Imunopatologia do Departamento de Microbiologia e Imunologia do Instituto de Biologia da Unicamp, foi observado que uma amostra da cepa virulenta Pb18 crescia de forma diferente das outras. A análise preliminar desta cultura mostrou que o fungo se apresentava, exclusivamente, em formas intermediárias entre levedura e micélio. Assim, este trabalho teve como objetivo a caracterização parcial deste isolado atípico através da comparação com a cepa selvagem. Para tanto, foram analisados: a morfologia do isolado a 25 e 37ºC; a composição de proteínas de parede celular; o desenvolvimento da doença e a resposta imunológica adaptativa em camundongos BALB/c. Os resultados mostraram que este isolado não alterou a sua forma de crescimento, independente da temperatura de cultivo ou da passagem por animal. Através da análise das proteínas de parede celular observou-se ausência de expressão de algumas proteínas e baixa concentração da glicoproteína 43 (gp43) no fungo atípico quando comparado com o selvagem. A infecção causada por este isolado atípico foi mais branda do que aquela observada com a cepa virulenta Pb18, com completa resolução das lesões de disseminação. Entretanto, não foi possível determinar diferenças na avaliação da resposta imune adaptativa dos animais infectados com os diferentes isolados. Apesar da necessidade de mais estudos, estes resultados indicam que o isolado atípico pode vir a ser uma importante ferramenta para o estudo da biologia do fungo e sua relação com o hospedeiro / Abstract: P. brasiliensis is a dimorphic fungus that grows in mycelial phase at room temperature and in yeast form at 35-37°C. Recently, in the Immunopathology Laboratory of the Department of Microbiology and Immunology (Biology Institute/Unicamp), it was observed that a sample of the virulent strain Pb18 grew in a different way from other ones. Preliminary analysis of this culture showed that the isolated exhibited, exclusively, an intermediate form of pseudohyphae. That way, the objective of this work was the partial characterization of the atypical isolated (Pb18PH) through the comparison with the wild strain Pb18. For this, there were analyzed: the morphology of the isolated to 25 and 37ºC; the composition of cell wall proteins; the disease development and the adaptative immune response in BALB/c mice. The results showed that Pb18PH didn't alter their growth form, independently of the cultivation temperature or the passage through animal. By the analysis of the cell wall proteins, it was observed that Pb18PH didn't express some proteins and presented low concentration of the glicoprotein 43 (gp43) when compared with the wild one. The infection caused by this atypical isolated was softer than that observed with the virulent strain Pb18. Besides, it was noted the complete resolution of disseminated lesions. However, it was not possible to determine differences in the adaptative immune response evaluation of the animais infected with the different isolated. To despite the need of more studies about this atypical isolated, our results indicate that Pb18PH would come to be an important tool for the study of the fungus biology and their relationship with the host / Doutorado / Imunologia / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientadores: Edi Lucia Sartorato, Andrea Trevas Maciel-Guerra / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-15T16:54:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Miranda_PauloMauriciodoAmorDivino_M.pdf: 2620124 bytes, checksum: aacc629866a9ff7880f48f266f4f3743 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Nos seres humanos, a visão é o sentido que retrata com melhor fidelidade o ambiente que os cerca. A ausência do sentido da visão é definida como cegueira. As conseqüências da cegueira são problemas de saúde pública importantes, pois têm um impacto significativamente negativo sobre o desenvolvimento econômico e social dos indivíduos afetados. A perda visual pode ser resultado de lesão nos centros nervosos superiores, nas vias ópticas ou em estruturas do próprio olho. As causas vão desde traumas oculares até doenças congênitas, como: glaucoma congênito, catarata congênita e Neuropatia Óptica Hereditária de Leber (LHON). A LHON é uma doença, causada por alterações no DNA mitocondrial, caracterizada pela perda repentina da visão em ambos os olhos, devido a uma degeneração do nervo óptico. Atualmente, 17 principais mutações associadas à LHON foram registradas, onde três dessas mutações representam 95% dos casos (mutações primárias) e as 14 mutações subseqüentes representam apenas 5% do total (mutações secundárias). Não foram relatados, até o momento, estudos que definam a freqüência das mutações ou estudos populacionais de prevalência no Brasil. Desta forma, o presente estudo teve como principal objetivo definir a freqüência das mutações da LHON em pacientes brasileiros. Foram avaliados 55 pacientes com hipótese diagnóstica de LHON ou neuropatia óptica adquirida de origem desconhecida. Mutações primárias (G11778A, T14484C e G3460A) e mutações secundárias nos genes MT-ND1, MT-ND4, MT-ND4L, MT-ND5, MT-ND6 e MT-CYB foram rastreadas em todos os indivíduos estudados. O rastreamento das mutações primárias foi realizado pelo método de restrição enzimática. Para os pacientes que não apresentaram mutações primárias procedeu-se o seqüenciamento direto para rastrear mutações secundárias. O método de DHPLC foi padronizado para o rastreamento de mutações primárias. Mutações primárias foram encontradas em 19 pacientes, ou seja, em 38,2% dos casos. A freqüência dessas mutações ficou definida como: 67% da mutação G11778A (13 casos), 28% da mutação T14484C (5 casos) e 5% da mutação G3460A (apenas 1 caso). A mutação G11778A apresentou números próximos aos encontrados nas populações estudadas em outras partes do mundo, confirmando ser a principal causa de LHON também em pacientes brasileiros. A mutação T14484C, como na maioria das populações mundiais, mostrou-se como a segunda maior causa da LHON, porém mostrou uma freqüência quase duas vezes maior que o descrito na literatura. Enquanto que a mutação G3460A apresentou freqüência muito baixa se comparada as das demais populações estudadas. Não foram encontradas mutações secundárias. A ausência dessas mutações pode ser atribuída à possibilidade de haver mutações em regiões do DNA mitocondrial não rastreadas no presente estudo. Há também a possibilidade de os pacientes em que não foram localizadas mutações não serem portadores da LHON, apresentando outra anomalia com dados clínicos semelhantes. No presente estudo também foi possível, a partir do teste molecular a confirmação da hipótese diagnóstica de LHON em alguns pacientes / Abstract: The vision is the sense that best expresses the environment surrounding the mankind. The term blindness is used to define the absence of the vision. The consequences of blindness are important problems of public health concern as they cause a negative impact on the economic and social development of the affected individuals). The visual loss is characterized by congenital deprivation and it can be total or partial, permanent or temporary. Furthermore, visual loss may result from superior nerve centers damage, optic pathways lesions or physic damage of the eye itself. Thus, the visual loss causes range from trauma to ocular congenital diseases such as congenital glaucoma, congenital cataract and Leber Hereditary Optic Neuropathy (LHON). LHON is a mitochondrial disease characterized by sudden loss of vision in both eyes, due to an optic nerve degeneration. Currently, 17 main LHON associated mutations were published, three of which account for 95% of the cases (primary mutations) and the subsequent fourteen account for only 5% of the total (secondary mutations). The frequencies of mutations envolved in LHON in Brazilian patients have not been reported so far. Therefore, the aim of this study was to define the LHON mutations frequency in Brazilian patients. We evaluated 55 patients with LHON diagnosis or acquired optic neuropathy of unknown origin. Primary mutations (G11778A, T14484C and G3460A) and secondary mutations in the genes MT-ND1, MT-ND4, MT-ND4L, MT-ND5, MT-ND6 and MT-CYB were screened in all individuals studied. Screening of primary mutations was performed by the method of enzyme restriction. Patients who did not have primary mutations were screened for secondary mutations by direct sequencing. The DHPLC method was used for primary mutations screening. Primary mutations were found in 19 patients, ie 38.2% of cases. The frequency of these mutations was defined as 67% for the G11778A mutation (13 cases), 28% for the T14484C mutation (5 cases) and 5% for the G3460A mutation (only 1 case). The mutation G11778A showed numbers similar to those found in the populations studied in other parts of the world, confirming that the main cause of LHON also in Brazilian patients. The T14484C mutation, as in most world populations, showed up as the second leading cause of LHON, but it showed a frequency almost twice that reported. While the G3460A mutation frequency showed very low compared to the other populations studied. No secondary mutation was found. The absence of these mutations can be attributed to the possibility of mutations in mitochondrial DNA regions not screened in this study. There is also the possibility that patients in whom no mutations were not found to be carriers of LHON, with another anomaly with similar clinical data. This study evaluated the situation of primary and secondary mutations associated with LHON in a sample of Brazilian individuals. It was also possible, from the molecular testing to confirm the diagnosis of LHON in some patients / Mestrado / Genetica Animal e Evolução / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Orientador: Edi Lucia Sartorato / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-22T12:01:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva-Costa_SueliMatildeda_D.pdf: 3629847 bytes, checksum: 5dcc278ff8f0cd9eda6627d011e23a06 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: A deficiência auditiva é dos defeitos sensoriais o mais comum, afetando cerca de um em cada quinhentos recém-nascidos. Mais de 60% dos casos de perda auditiva congênita são causadas por fatores genéticos. Apesar da grande heterogeneidade da perda auditiva genética, mais de 50% estão associadas a mutações no locus DFNB1 no cromossomo 13q12. Este locus contém os genes GJB2 e GJB6 que codificam as proteínas conexina 26 e 30 respectivamente. A alta prevalência de indivíduos com perda auditiva apresentando mutações recessivas no locus DFNB1 em apenas um alelo tem dificultado o diagnóstico molecular e consequentemente o aconselhamento genético. Portanto, o principal objetivo deste trabalho foi elucidar a causa genética da perda auditiva em quarenta e oito indivíduos monoalélicos para mutações recessivas no gene GJB2 (46) ou no gene GJB6 (2). Prováveis novas deleções no locus DFNB1 foram encontradas em quatro indivíduos heterozigotos para mutações no gene GJB2. Além disso, entre os quarenta e oito indivíduos estudados foram detectadas duas mutações no gene SLC26A4 (p.V609G, p.C282Y) em três deles e ainda, duas mutações no gene CDH23, p.R1746Q e p.R301Q, em dois indivíduos. As mutações, p.V609G, p.C282Y e p.R1746Q, foram encontradas em heterozigose e, portanto, não é possível afirmar que, de fato, essas alterações sejam a causa da surdez. Contudo, a mutação p.R301Q, encontrada em homozigose em um dos pacientes estudados, trata-se de uma mutação missense e poderia explicar o fenótipo. Entre os quarenta e oito indivíduos estudados foram ainda detectadas oito alterações mitocondriais em dezoito casos. Quatro delas podem estar envolvidas com a perda auditiva justificando assim a surdez. Quanto a análise do cluster miR-183, nenhuma mutação patogênica foi encontrada em nenhum dos quinhentos e vinte e um indivíduos analisados, o que corrobora com dados da literatura onde mutações nos microRNAs, miR-96-183-182 não são uma causa comum de surdez. Concluiu-se que, a pesquisa de mutações em outros genes diminui o número de casos com diagnóstico inconclusivo. Entretanto, devido à grande heterogeneidade genética e clínica da perda auditiva muitos permanecem ainda com diagnóstico indefinido / Abstract: Hearing impairment is the most common sensory impairment, affecting approximately one in five hundred newborns. More than 60% of the congenital hearing loss cases are caused by genetics factors. Despite the enormous heterogeneity of genetic hearing loss, up to 50% of the cases are associated with mutations in the DFNB1 locus on chromosome 13q12. This locus contains the GJB2 and GJB6 genes, which code for the gap junction (GJ) proteins connexin 26 (Cx26) and connexin 30 (Cx30) respectively. A large number of affected individuals carry only a single identified recessive mutation in locus DFNB1, making the molecular diagnostic and genetic counseling difficult. The aim of this study was to elucidate the genetic cause of hearing loss in forty eight individuals monoallelic for recessive mutations in the GJB2 gene (46) or in GJB6 gene (2). Probable new DFNB1 locus deletions were found in four individuals heterozygous for mutations in GJB2 however. Moreover, among the forty eight heterozygous individuals studied, two mutations were detected in the SLC26A4 gene (p.V609G, p.C282Y) in three of them and two mutations in CDH23 gene (p.R1746Q p.R301Q) were identified in two individuals. Mutations, p.V609G, and p.C282Y p.R1746Q were found in heterozygous and therefore could not be considered the cause of deafness in the patients studied. However, the mutation p.R301Q was present as homozygous in one individual. This alteration is a missense mutation, and may explain the deafness in this patient. Among the forty eight subjects studied, we detected eight mitochondrial alterations in eighteen cases. Four of them may be involved with hearing loss, thus justifying deafness. As the analysis of the miR-183 cluster, no pathogenic mutation was found in any of the five hundred twenty-one individuals analyzed, which agrees with literature data where mutations in microRNAs, miR-96-183-182 are not a common cause of deafness. We conclude that the detection of mutations in other genes reduces the number of cases with inconclusive diagnostic. However, due to high clinical and genetic heterogeneity of hearing loss with many still remains undefined diagnosis / Doutorado / Genetica Animal e Evolução / Doutora em Genética e Biologia Molecular

Orientadores: Marcos Antônio Machado, Alessandra Alves de Souza / O último capítulo está em inglês / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-21T01:07:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_MarianadeSouzae_D.pdf: 4833630 bytes, checksum: 8baede33597b26761daf544db4af1291 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Xylella fastidiosa é o agente causal da clorose variegada dos citros (CVC), da doença de Pierce em videiras e doenças em muitas outras culturas. Com o seqüenciamento completo do genoma de várias linhagens deste organismo, a função de cada gene , principalmente os ligados à virulência ainda estão pouco caracterizados. A fixação da X. fastidiosa nos vasos do xilema e no canal alimentar dos insetos vetores, cigarrinhas, é necessária para a virulência, formação de biofilme e transmissão desta bactéria. Uma vez que o gene pilC esta envolvido na formação do pili tipo IV e este por sua vez é importante na motilidade e formação do biofilme, neste presente trabalho é mostrado dados fenotípicos obtidos com a interrupção de pilC na linhagem J1a12 de X. fastidiosa. A interrupção do gene pilC na linhagem J1a12 foi obtida por recombinação homóloga utilizando o plasmídeo pUCBM21oriC. Reação de polimerase em cadeia (PCR) e análises por Southern blot dos mutantes indicaram que o gene cromossômico foi substituido pelo gene truncado e com isso a produção da proteína correspondente, PilC, não foi indicada pelo Westen blot. Microscopia eletrônica de varredura transmissão revelou que o tamanho e o número das fímbrias foi reduzido para os mutantes de pilC de X. fastidiosa. Esses mutantes não mostraram capacidade de colonização das regiões acima do ponto de inoculação dos vasos do xilema da planta de laranja Pêra e, além disso, não apresentaram formação de biofilme. No estudo da formação do biofilme, a caracterização da expressão de proteínas foi realizada através do uso da eletroforese de primeira e segunda dimensão e a espectrometria de massa encontramos um total de 456 proteínas expressas na condição de biofilme maduro e 387 proteínas no crescimento planctônico, sendo que, o biofilme apresentou 37% (ou 144 proteínas) diferencialmente expressas em relação ao crescimento planctônico. As alterações encontradas no estado fisiológico das células em biofilme podem ser explicadas pela diferença no padrão de proteínas encontrado. Essas proteínas são produtos correspondentes à 31 genes presentes no biofilme maduro da linhagem isolada de citros 9a5c, esses foram envolvidos na adaptação, no metabolismo e na adesão dessa bactéria. Foi observado superexpressão de genes relacionados ao quorum sensing, comprovando a existência da comunicação entre células e com isso, o desenvolvimento da estruturação do biofilme (biofilme maduro) levando à obstrução dos vasos e desenvolvimento da doença / Abstract: Xylella fastidiosa is the causal agent of citrus variegated chlorosis (CVC), Pierce's disease in grapevines and other diseases in many crops. With the full genome sequencing of several strains of this organism, the function of each gene, particularly those related to virulence are still poorly characterized. The setting of X. fastidiosa in xylem vessels and the alimentary canal of insects, leafhoppers, is required for virulence, biofilm formation and transmission of this bacterium. Once the gene is involved in the formation pilC of type IV pili and this in turn is important in motility and biofilm formation, this work is shown in this phenotypic data obtained with the interruption in the strain of pilC J1a12 X. fastidiosa. The interruption of the gene pilC in the strain J1a12 was obtained by homologous recombination using the plasmid pUCBM21oriC. Polymerase chain reaction (PCR) and Southern blot analysis of mutants indicated that the chromosomal gene was replaced by the truncated gene and thereby producing the corresponding protein, PilC was not indicated by Western blot. Scanning transmission electron microscopy revealed that the size and number of fimbriae was reduced for the mutants of pilC X. fastidiosa. These mutants showed no ability to colonize the region above the inoculation of the plant xylem vessels of Pera and, moreover, did not show biofilm formation. In the study of biofilm formation, the characterization of protein expression was performed by using electrophoresis of first and second dimension and mass spectrometry we found a total of 456 proteins expressed in condition of mature biofilm and 387 proteins in planktonic growth, and , the biofilm showed 37% (or 144 proteins) differentially expressed in relation to planktonic cells. The changes found in the physiological state of cells in biofilm can be explained by the difference in the pattern of proteins found. These proteins are products corresponding to 31 genes present in the mature biofilm of strain isolated from citrus 9a5c, they were involved in the adaptation, metabolism and adhesion of bacteria. We observed overexpression of genes related to quorum sensing, proving the existence of communication between cells and thus, the development of the biofilm structure (mature biofilm) leading to obstruction of vessels and development of disease / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Maria Beatriz Puzzi / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-07T22:49:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Souto_MariamPatriciaAuada_D.pdf: 7783740 bytes, checksum: ba776e2125f132647d619bed067b9da5 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: A síndrome de Sjögren-Larsson (SSL) é uma ictiose congênita com alterações neurológicas decorrentes da deficiência enzimática da enzima aldeído graxo desidrogenase (FALDH). Mutações no gene ALDH3A2 são responsáveis pela doença. A proposta foi estudar os aspectos clínicos, histológicos, estruturais e moleculares de dez pacientes com SSL. Métodos: Foram selecionados dez pacientes com SSL de quatro famílias distintas. Foi realizada ressonância magnética cerebral (RM) em oito pacientes e, em sete destes, também espectroscopia de prótons; os resultados foram comparados com a espectroscopia de sete voluntários sadios. Foram coletadas biópsias de pele de cada paciente e pele sã de 17 voluntários. Os espécimes foram corados com hematoxilina-eosina e imagens digitais foram adquiridas a partir do exame histológico de rotina; a luminância em escala de cinza foi analisada utilizando método quantitativo de análise de textura de imagem digital: transformada rápida de Fourier, calculada a partir dos valores do momento de inércia (função harmônica) das frequências espaciais nas direções vertical e horizontal da camada espinhosa da epiderme. Amostras de pele de nove pacientes com SSL também foram obtidas para cultura de fibroblastos utilizando método padrão para dosagem da enzima FALDH. Para a extração de DNA genômico foi coletado sangue total periférico de nove pacientes. Os fragmentos foram amplificados por PCR. Os resultados obtidos foram analisados e comparados com a seqüência normal de DNA. Resultados: A mutação encontrada foi a 1108-1G?C no intron 7/exon 8. Os pacientes exibiram diferenças na presença e intensidade dos sinais e sintomas da doença (prurido, retardo mental, espasticidade, fotofobia e alterações da retina). No exame de RM dos pacientes com SSL foi observada desmielinização da substância branca profunda; na espectroscopia, presença de pico anormal de lípídios. O estudo da textura da camada espinhosa da epiderme, sob a Transformada de Fourier, mostrou amplitudes de função harmônica mais largas no grupo com SSL na direção vertical e não na direção horizontal, correspondendo a núcleos e nucléolos maiores e ao espessamento focal da carioteca dos ceratinócitos. Conclusões: As manifestações clínicas e histológicas da SLS não são exclusivamente decorrentes da mutação c.1108-1G>C, mas também expressão de outras modificações genéticas e influências ambientais. A mutação descrita pode ser classificada como uma causa comum da doença no Brasil. Os achados de textura podem ser explicados pela maior síntese de DNA na epiderme na SSL, tendo sido descrita, também, uma produção mais rápida da camada córnea e uma renovação celular 3,5 vezes o normal / Abstract: Background: Sjögren-Larsson syndrome (SLS) is an autosomal recessive disorder characterized by ichthyosis, mental retardation, and spasticity. Various mutations in the ALDH3A2 gene that codes for fatty aldehyde dehydrogenase (FALDH) are responsible for the disease but the genotype-phenotype relationships are undefined. Objectives: The purpose of this study was to describe ten individuals with Sjögren-Larsson syndrome from four families representing the first cohort of Brazilian patients defined at the molecular level and investigate whether image analysis of routine H&E skin sections using fast Fourier transformation (FFT) could detect structural alterations in SLS. Patients and methods: A 5-mm punch biopsy for histologic analysis was obtained under local anesthesia from each patient. Similar biopsies were obtained from age- and anatomical site-matched from 17 controls. The samples were stained with haematoxylin and eosin and observed under a light microscope. Digital images of routine histologic sections were taken and their gray scale luminance was analyzed by FFT. The inertia values were determined for different ranges of the spatial frequencies in the vertical and horizontal directions. Skin biopsies were also obtained from nine patients with SLS for establishing fibroblast cultures using standard methods to determine FALDH enzyme activity. MR imaging was performed in eight patients. Singel-voxel proton MR spectra were acquired from cerebral white matter in seven patients with SLS and in seven controls. Total genomic DNA was extracted from peripheral blood of nine patients using standard methods. ALDH3A2 exons and their flanking sequences were amplified by PCR and sequenced. Results: All patients were homozygous for a unique c.1108-1G>C splice-site mutation and displayed a profound reduction in fatty aldehyde dehydrogenase enzyme activity. The patients exhibited a moderate-to-severe form of Sjögren-Larsson syndrome with respect to mental retardation, spastic diplegia and ichthyosis. Within this phenotypic context, patients varied, even within a family, in the presence of pruritus, thickness of the epidermal granular layer, retinal glistening white dots and photophobia. Brain MR imaging revealed retardation of myelination. Proton MR spectroscopy of white matter revealed abnormal high-lipid peak. The study of epidermal spinous layer texture by Fast Fourier Transform showed higher amplitudes in the vertical direction in SLS patients, corresponding to greater nuclei and nucleoli, higher number of nucleoli and focal thickening of keratinocytes¿ carioteca. Conclusion: We concluded that the latter clinical features are not strictly determined by the c.1108-1G>C mutation, but are subject to modification by other genetic/environmental factors. The c.1108-1G>C mutation may be classified as a common cause of Sjögren-Larsson syndrome in Brazil. The textural findings are in keeping with higher DNA synthesis and a 3.5x turn over that were demonstrated in SLS epidermis / Doutorado / Clinica Medica / Doutor em Clínica Médica

Orientador: Vitor Barbanti Pereira Leite / Banca: Jorge Chahine / Banca: Luis Gustavo Dias / Banca: Nelson Augusto Alves / Banca: Pedro Geraldo Pascutti / Resumo: As interações eletrostáticas desempenham um papel crucial no enovelamento de proteínas. Além disso, essas interações entre resíduos carregados são fundamentais para a estabilidade proteica e para que as proteínas realizem suas funções biológicas. A distribuição de carga nessas macromoléculas é definida pelos tipos de resíduos que as compõem e pelas condições do ambiente a que elas estão sujeitas, como, por exemplo, concentração de sal e pH. Compreender como esses aspectos podem governar a estabilidade e o enovelamento de proteínas é de fundamental importância no desenvolvimento racional de aplicações biomédicas e biotecnológicas. No presente estudo, utilizou-se modelos computacionais simplificados visando investigar esses efeitos eletrostáticos nos processos de enovelamento, na estabilidade térmica e na presença e ausência de mutações do seguinte conjunto de proteínas: o domínio N-terminal da proteína ribossomal L9 (NTL9); a variante da proteína G (1PGB-QDD), a proteína Cold Shock A (CspA); e a proteína 5 do ácaro Blomia tropicalis (Blo t 5). A partir desses modelos computacionais, buscou-se avaliar os efeitos causados pelas mutações, pelo pH e pela concentração de sal na dinâmica e na estabilidade proteica. Os resultados obtidos via simulações foram comparados com dados experimentais e obtiveram uma excelente concordância, tendo em vista a simplicidade dos modelos utilizados. Além disso, os resultados computacionais permitiram obter uma enorme gama de informações sobre o... / Abstract: Eletrostatic interactions play a crucialrole in protein folding. In addition, these interactions between charged residues are fundamental for protein stability and for proteins to perform their biological functions. The charge distribution in these macromolecules is defined by the types of residues composing them and by the conditions of the environment to which they are subject, such as salt concentration and pH. Understanding how these aspects can govern protein folding and stability is of fundamental importance in the rational development of biomedical and biotechnological applications. In the present study, simplified computational models to investigate these electrostatic effects in the folding processes ... / Doutor

Orientador: Edi Lúcia Sartorato / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-27T14:38:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Svidnicki_MariaCarolinaCostaMelo_D.pdf: 3787463 bytes, checksum: 29bd7c40aa78f66813f8c5ccbd4806be (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: A perda da audição é uma doença sensorial comum, que pode ser causada por fatores genéticos ou ambientais. Os recentes avanços na biologia molecular têm permitido a determinação das causas genéticas da perda auditiva, e mais de 100 genes já foram relacionados com este fenótipo. Devido à elevada heterogeneidade genética envolvida, um grande número de pacientes permanece sem diagnóstico molecular, pois apenas um pequeno conjunto de genes é geralmente analisado. Isso indica a necessidade de novas estratégias metodológicas para o rastreamento simultâneo de mutações em múltiplos genes. Neste trabalho, um painel para genotipagem utilizando o sistema de espectrometria de massa iPLEX MassARRAY® (Sequenom Inc.), contendo 86 alterações em 17 genes, foi otimizado e testado, visando sua aplicação no diagnóstico molecular de indivíduos com perda auditiva. Inicialmente, um teste com indivíduos controles mostrou falha em 20% das alterações. Na tentativa de se obter uma maior taxa de genotipagem, os primers das alterações que falharam foram redesenhados e ressintetizados. Novos testes com 25 indivíduos controles mostraram um significativo aumento na taxa de genotipagem, e a especificidade e sensibilidade da técnica foram estimadas em mais de 95%. Após a otimização dos ensaios, um grupo de 180 indivíduos, com perda auditiva não-sindrômica com causa presumidamente genética, foi rastreado utilizando o painel desenvolvido, e a validação das mutações identificadas foi realizada por sequenciamento de DNA ou PCR seguido de análise de restrição enzimática. Alterações genéticas foram confirmadas em 31% dos indivíduos, sendo que em 20,6% dos casos analisados foi possível esclarecer a etiologia da perda auditiva. Alterações no gene GJB2 foram as mais prevalentes, porém outras mutações também foram identificadas nos genes SLC26A4, CDH23, MT-RNR1, MT-TS1, MYO15A e OTOF. A genotipagem de mutações usando o sistema iPLEX MassARRAY® mostrou melhor custo-benefício em comparação com as técnicas convencionais, e permitiu rastrear um conjunto mais abrangente de genes do que aqueles atualmente analisados. Portanto, o painel desenvolvido é viável para o rastreamento inicial de mutações envolvidas com a perda auditiva não-sindrômica e poderá auxiliar no diagnóstico dos pacientes afetados / Abstract: Hearing loss (HL) is a common sensorial disorder, which can be caused by genetic or environmental factors. Recent advances in molecular biology have allowed the determination of the genetic causes of HL, and more than 100 genes have been linked to the phenotype. Due to the extraordinary genetic heterogeneity involved in HL a large percentage of patients remain without any molecular diagnosis. This indicates the need for new methodological strategies for simultaneously screening for mutations in multiple genes. In this work, we optimized and tested a panel of 86 mutations in 17 different genes, screened using the mass spectrometry system, iPLEX MassARRAY® (Sequenom Inc.), in order to determine the molecular etiology of hearing loss. An initial genotyping of control subjects, showed failures in 20% of the selected alterations. In an attempt to achieve greater genotyping rates, the tests that failed were redesigned and new primers were synthesized. Further tests with 25 control subjects were then performed and showed significant increase in genotyping rate. The sensitivity and specificity of the technique showed average values above 95%. Additionally, a group of 180 individuals, with nonsyndromic hearing loss with presumably genetic causes, was tested using the developed panel, and the validation of the identified mutations was performed by DNA sequencing or PCR followed by restriction enzyme analysis. Genetic alterations were confirmed in 31% of patients, and in 20.6% of the individuals was possible to elucidate the etiology of HL. Mutations in the GJB2 gene were the most prevalent, but other mutations in the SLC26A4, CDH23, MT-RNR1, MYO15A, and OTOF genes were also identified. Genotyping of mutations using iPLEX MassARRAY® Spectrometry System proved to be faster and more cost-effective, compared to conventional techniques, and enabled the screening of a broader set of genes and mutations than those currently analyzed to establish the molecular etiology of hearing loss. Hence, the developed panel is feasible for the initial screening mutations involved in non-syndromic hearing loss and may aid in the diagnosis of affected patients / Doutorado / Genetica Animal e Evolução / Doutora em Genética e Biologia Molecular